CN115141110A - 一种l-缬氨酸发酵液的连续脱色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种L‑缬氨酸发酵液的连续脱色方法，包括如下步骤：取灭菌后的L‑缬氨酸发酵液，通过陶瓷膜和纳滤膜除杂，得到过滤清液，调节过滤清液pH至酸性，置于由活性炭柱和吸附树脂柱串联的连续脱色系统中分离，得到脱色清液，再蒸发浓缩、析晶、离心、洗涤、干燥后，得到纯度大于99％的L‑缬氨酸晶体。本发明选择膜处理、活性炭、离子交换树脂的联合处理方式，使得脱色清液透光率≥99％，得到纯度大于99％的L‑缬氨酸晶体。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种L-缬氨酸发酵液的连续脱色方法。
背景技术
微生物发酵法制备氨基酸，是以葡萄糖为原料，经微生物发酵，制得氨基酸发酵液。氨基酸发酵液中含有色素杂质，主要为氨基酸发酵液原料本身带来的色素、发酵中微生物代谢和羰氨反应生成的色素、发酵过程中产生的前体物质在重结晶等热处理过程中进一步转化生成的色素。这些色素若不加以去除，会造成发酵液颜色深，影响产品品质。
现有技术中主要通过对氨基酸发酵液进行活性炭脱色等工艺来降低色素含量，但上述工艺无法去除发酵液中生成色素的前体物质，致其脱色效率有限，且无法实现连续化脱色处理，且脱色效果不佳。需要研究一种L-缬氨酸发酵液的连续脱色方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度L-缬氨酸发酵液的连续脱色方法，包括如下步骤：取灭菌后的L-缬氨酸发酵液，通过陶瓷膜和纳滤膜除杂，得到过滤清液，调节过滤清液pH至酸性，置于由活性炭柱和吸附树脂柱串联的连续脱色系统中分离，得到脱色清液，再蒸发浓缩、析晶、离心、洗涤、干燥后，得到纯度大于99％的L-缬氨酸晶体。
本发明的优选技术方案，所述L-缬氨酸发酵液的制备方法为，将氨基酸生产菌接种到发酵培养基中，发酵培养至OD值不低于3，加入抗氧化剂，至发酵结束，获得发酵液。
本发明的优选技术方案，所述抗氧化剂选自VC、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸镁、亚硫酸钾、草酸、亚硫酸铵、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述抗氧化剂的加入量为0.1-1g/L。
本发明优选的技术方案，所述抗氧化剂经过灭菌处理。
本发明优选的技术方案，加入抗氧化剂时OD值不低于5，优选OD 值不低于10。
本发明的优选技术方案，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸中的任一种。
本发明的优选技术方案，所述氨基酸生产菌的接种量为1-10％，优选为1-5％，还优选为2-3％。
本发明优选的技术方案，发酵结束时，发酵液中葡萄糖含量≤5g/L，优选≤3g/L。
本发明优选的技术方案，发酵温度为30-35℃。
本发明优选的技术方案，发酵体系pH控制为6-7。
本发明优选的技术方案，所述L-缬氨酸发酵液经灭菌处理。
本发明优选的技术方案，所述灭菌为80-100℃灭菌10-30分钟，优选为85-95℃下灭菌15-25分钟。
本发明优选的技术方案，所述膜选自陶瓷膜、纳滤膜、超滤膜的任一种或其组合，优选陶瓷膜、纳滤膜的组合。
本发明优选的技术方案，所述陶瓷膜的孔径为10-70nm，优选为 20-60nm，更优选为30-50nm。
本发明优选的技术方案，陶瓷膜进膜压力为0.1-0.3MPa，通量为 4-6L/min/m2，物料温度为30-35℃。
本发明优选的技术方案，所述纳滤膜的截留分子量为500-5000道尔顿，优选为700-4000道尔顿，更优选为800-3000道尔顿。
本发明优选的技术方案，纳滤膜的进膜压力为0.5-0.6MPa，通量为 0.4-0.6L/min/m2，物料温度为30-37℃。
本发明的优选技术方案，所述过滤清液的pH为2-6，优选为4-5。
本发明的优选技术方案，调节过滤清液pH的酸选自硫酸、磷酸、乙酸、盐酸、硝酸中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述活性炭柱内填充颗粒状活性炭、柱状活性炭、活性炭纤维中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述活性炭柱的柱内填充物的高径比为 (3-10):1，优选为(6-8):1。
本发明的优选技术方案，所述活性炭柱至少2根，优选为2-5根，更优选为2-3根。
本发明的优选技术方案，所述活性炭柱通过并联，或，并联和串联的组合连接。
本发明优选的技术方案，活性炭粒径为75-80um的粉末活性炭。
本发明优选的技术方案，活性炭脱色温度为30-35℃。
本发明优选的技术方案，所述吸附树脂柱内填充ADS-17、HPD-100、 HPD-750中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述吸附树脂柱的高径比为(3-10):1，优选为(6-8):1。
本发明的优选技术方案，所述吸附树脂柱的柱内填充物的高径比为 (3-10):1，优选为(6-8):1。
本发明的优选技术方案，所述吸附树脂柱至少2根，优选为2-5根，更优选为2-3根。
本发明的优选技术方案，所述吸附树脂柱通过并联，或，并联和串联的组合连接。
本发明的优选技术方案，所述活性炭柱并联连接，吸附树脂柱并联连接，并联连接的活性炭柱再与并联连接的吸附树脂柱串联连接。
本发明的优选技术方案，所述连续脱色系统包括1号活性炭柱、2 号活性炭柱、3号吸附树脂柱、4号吸附树脂柱；1号-4号柱的顶部分别设有料液入口，1号-4号柱的底部分别设有料液出口，各料液入口和料液出口所在管道上分别设有截止阀；各料液入口还与再生液入口连通，各料液出口还与再生液出口连通，再生液入口和再生液出口所在管道上分别设有截止阀；1-2号活性炭柱的料液出口与3-4号吸附树脂柱的料液入口连通。
本发明的优选技术方案，所述脱色系统的工作温度为25-55℃，优选为30-50℃，更优选为35-45℃。
本发明的优选技术方案，所述过滤清液的流速为2-5柱体积/h，优选为3-4柱体积/h。
本发明的优选技术方案，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述浓缩温度≥60℃，优选为65-70℃。
本发明的优选技术方案，所述浓缩倍数为5-10倍，优选为7-8倍。
本发明的优选技术方案，浓缩后还可经析晶步骤。
本发明的优选技术方案，所述析晶选自自然冷却降温析晶、强制冷却降温析晶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述析晶温度为10-15℃，析晶时间为1-2 小时。
本发明的优选技术方案，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述干燥温度不低于80℃，优选为 100-110℃。
本发明优选的技术方案，所述脱色清液透光率不低于90％，优选为不低于95％，更优选不低于97％。
本发明优选的技术方案，所述L-缬氨酸晶体纯度不低于99.3％，优选为不低于99.5％，更优选不低于99.9％。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
1、本发明针对L-缬氨酸发酵液，采用活性炭柱、吸附树脂柱的联合处理方式，得到透光率高、纯度高的氨基酸产品。
2、本发明通过向处于发酵培养状态的溶液中添加抗氧化剂，抑制或减少了色素和色素前体物质的生成，降低了后续脱色的难度，提高了发酵液的整体脱色效率、减少了产品损失，提高了生产效率。
3、本发明避免采用传统的活性炭分批脱色方法，实现了连续化操作，极大程度的缩短了脱色周期，缩短生产周期，降低生产成本，且操作简便，脱色效率高，适宜工业化生产。
附图说明
图1为本发明连续脱色系统的结构示意图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于说明性目的，而并非用于限制本发明的范围。
具体实施方式中所用的培养基包括：
LB培养基组成为：8-10g/L蛋白胨，5-10g/L酵母粉和8-10g/L氯化钠，121℃灭菌30min。
合成培养基组成为：甘油8-10g/L，磷酸二氢钾18-21g/L，硫酸铵 5-7g/L，硫酸镁1-2g/L，酵母粉1.0-1.2g/L，维生素B1为0.002-0.004g/L，灭菌前用氨水调pH7.3-7.5，121℃灭菌30min。
发酵培养基的组成为：葡萄糖100-150g/L，磷酸二氢钾18-22g/L，硫酸铵5-6g/L，VB1为0.010-0.012g/L，七水硫酸镁2-3g/L，硫酸铜 0.03-0.05g/L，七水硫酸亚铁0.02-0.04g/L，聚醚消泡剂0.2mL/L，0.1MPa、 121℃灭菌30min。
种子培养液的制备方法：
(1)1mL甘油管保藏的黄色短杆菌HHVLA-002(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2019496，保藏日期：2019年6 月26日，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，中国典型培养物保藏中心，分类学命名为：黄色短杆菌HHVLA-002(Brevibacteriumflavum HHVLA-002))接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为3-4，获得LB种子液；
(2)取5mL LB种子液，将其接种到200mL合成培养基中，再将其置于37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.4-6.6、OD值为3-4，获得种子培养液。
L-缬氨酸发酵液的制备方法：
按接种量2％将种子培养液接种到50L发酵培养基中，在35℃、pH6-7 条件下发酵培养至溶液OD值为3，加入0.75g灭菌过的异抗坏血酸钠，继续培养，当检测到发酵液中葡萄糖含量为1.3g/L时停止发酵，得到50L L-缬氨酸发酵液。
参考例1连续脱色系统
一种连续脱色系统，参见图1，包括1号活性炭柱10、2号活性炭柱 20、3号吸附树脂柱30、4号吸附树脂柱40，其中，1号活性炭柱10和2号活性炭柱20并联，3号吸附树脂柱30和4号吸附树脂柱40并联，活性炭柱和吸附树脂柱串联；1号-4号柱的顶部分别设有料液入口(11、21、31、 41)，1号-4号柱的底部分别设有料液出口(12、22、32、42)，各料液入口(11、21、31、41)和料液出口(12、22、32、42)所在管道上分别设有截止阀；各料液入口(11、21、31、41)还与再生液入口(13、 23、33、43)连通，各料液出口(12、22、32、42)还与再生液出口连通(14、24、34、44)，再生液入口(13、23、33、43)和再生液出口 (14、24、34、44)所在管道上分别设有截止阀；1-2号活性炭柱(10、 20)的料液出口(12、22)与3-4号吸附树脂柱(30、40)的料液入口(31、 42)连通；所述连续脱色系统与PLC程序控制系统连接，PLC程序控制截止阀的开启或关闭，所述料液为经过灭菌和除菌处理，处于待脱色状态的氨基酸发酵液。所述1-2号活性炭柱(10、20)内填充通过商购途径获得的颗粒状活性炭、柱状活性炭、活性炭纤维中的任一种或其组合；所述3-4号吸附树脂柱(30、40)内填充通过商购途径获得的ADS-17、HPD-100、HPD-750型树脂中的任一种或其组合；所述1-4号柱(10、20、 30、40)的柱外高径比均为8：1，柱内填充物的高径比为6:1。
连续脱色系统的工作方法是：
打开1号活性炭柱(10)和3号吸附树脂柱(30)料液入口(11、 31)和料液出口(12、32)上的截止阀，关闭2号活性炭柱(20)和4 号吸附树脂柱(40)料液入口(21、41)和料液出口(22、42)上的截止阀，待脱色的氨基酸发酵液经管路连续输送进入1号活性炭柱(10) 和3号吸附树脂柱(30)，在3号吸附树脂柱(30)的料液出口(32) 端收集到氨基酸脱色清液。
当1号活性炭柱(10)料液出口(12)端的料液透光率≤85％时，关闭1号活性炭柱(10)的料液入口(11)和料液出口(12)上的截止阀，同时打开1号活性炭柱(10)的再生液入口(13)和再生液出口(14) 上的截止阀，以及打开2号活性炭柱(20)的料液入口(21)和料液出口(22)上的截止阀，使待脱色的氨基酸发酵液经管路连续输送进入2 号活性炭柱(20)和3号吸附树脂柱(30)。
当3号吸附树脂柱(30)的料液出口(32)端的料液透光率≤95％时，关闭3号吸附树脂柱(30)的料液入口(31)和料液出口(32)上的截止阀，同时打开3号吸附树脂柱(30)的再生液入口(33)和再生液出口(34)上的截止阀，以及打开4号吸附树脂柱(40)的料液入口(41) 和料液出口(42)上的截止阀，使待脱色的氨基酸发酵液经管路连续输送进入2号活性炭柱(20)和4号吸附树脂柱(40)。
1号活性炭柱(10)和2号活性炭柱(20)交替再生重复使用；3 号吸附树脂柱(30)和4号吸附树脂柱(40)交替再生重复使用，实现连续脱色。
参考例2静态吸附试验
分别精确称取ADS-17、HPD-100、AB-8、D101、HPD-750和HPD-400A 6种型号树脂各10g，用滤纸吸干树脂表面水分，放于1000mL 玻璃容器中，再分别向容器中加入处理好待脱色的发酵液500mL(硫酸调pH至5.0)。将其放入40℃恒温水浴中，搅拌状态下脱色2-3h。脱色结束，静置离心，得到滤液测其透光率，结果如表1所示。从表1中可以看出，HPD-750、HPD-100和ADS-17三种树脂脱色效果最佳，且对L-缬氨酸截留率最低。
表1
| 树脂型号 | 脱色透光率/％ | L-缬氨酸截留率/％ |
| ADS-17 | 82.3 | <0.1 |
| HPD-100 | 85.6 | <0.1 |
| AB-8 | 49.8 | 0.3 |
| D101 | 43.1 | 6.8 |
| HPD-750 | 81.9 | 0.2 |
| HPD-400A | 82.1 | 8.1 |
实施例1
(1)收取L-缬氨酸发酵液8L，在90℃下灭菌20分钟，之后依次经过30～50nm孔径的陶瓷膜和1000道尔顿的纳滤膜进行膜过滤，收集过滤清液6L，经检测，过滤清液中L-缬氨酸含量为48.5g/L，透光率35.6％；
(2)用浓硫酸调节过滤清液pH为5.0，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号活性炭柱、2号活性炭柱、3号吸附树脂柱、4号吸附树脂柱，所述1号和2号活性炭柱内填充颗粒活性炭，所述3号和4号吸附树脂柱内填充HPD-100型树脂，工作温度为40℃，活性炭柱和吸附树脂柱的高径比均为8：1，柱内填充物的高径比为6:1，收集流出液，透光率为99.6％；
(3)将流出液泵入旋转蒸发仪中，在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下，真空浓缩至浓缩液为800mL，在10-15℃水浴环境下，对浓缩液进行搅拌1.5h，对冷却液进行离心处理，离心过程中用200mL纯水淋洗，得到L-缬氨酸湿品238.3g，置于105℃条件下干燥5h，得到L-缬氨酸干品216.1g，经检测，水分为0.18％，纯度为99.8％，白色粉末状晶体。
实施例2
(1)收取L-缬氨酸发酵液8L，在90℃下灭菌20分钟，之后依次经过30～50nm孔径的陶瓷膜和1000道尔顿的纳滤膜进行膜过滤，收集过滤清液6L，经检测，过滤清液中L-缬氨酸含量为48.5g/L，透光率35.6％；
(2)用浓硫酸调节过滤清液pH为5.0，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号活性炭柱、2号活性炭柱、3号吸附树脂柱、4号吸附树脂柱，所述1号和2号活性炭柱内填充颗粒活性炭，所述3号和4号吸附树脂柱内填充ADS-17型树脂，工作温度为40℃，活性炭柱和吸附树脂柱的高径比均为8：1，柱内填充物的高径比为6:1，收集流出液，透光率为97.8％；
(3)将流出液泵入旋转蒸发仪中，在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下，真空浓缩至浓缩液为800mL，在10-15℃水浴环境下，对浓缩液进行搅拌1.5h，对冷却液进行离心处理，离心过程中用200mL纯水淋洗，得到L-缬氨酸湿品233.9g，置于105℃条件下干燥5h，得到L-缬氨酸干品209.8g，经检测，水分为0.16％，纯度为99.3％，白色粉末状晶体。
实施例3
(1)收取L-缬氨酸发酵液8L，在90℃下灭菌20分钟，之后依次经过30～50nm孔径的陶瓷膜和1000道尔顿的纳滤膜进行膜过滤，收集过滤清液6L，经检测，过滤清液中L-缬氨酸含量为48.5g/L，透光率35.6％；
(2)用浓硫酸调节过滤清液pH为5.0，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号活性炭柱、2号活性炭柱、3号吸附树脂柱、4号吸附树脂柱，所述1号和2号活性炭柱内填充颗粒活性炭，所述3号和4号吸附树脂柱内填充HPD-750型树脂，工作温度为40℃，活性炭柱和吸附树脂柱的高径比均为8：1，柱内填充物的高径比为6:1，收集流出液，透光率为97.4％；
(3)将流出液泵入旋转蒸发仪中，在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下，真空浓缩至浓缩液为800mL，在10-15℃水浴环境下，对浓缩液进行搅拌1.5h，对冷却液进行离心处理，离心过程中用200mL纯水淋洗，得到L-缬氨酸湿品231.6g，置于105℃条件下干燥5h，得到L-缬氨酸干品210.1g，经检测，水分为0.21％，纯度为99.2％，白色粉末状晶体。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高纯度L-缬氨酸发酵液的连续脱色方法，其特征在于，包括如下步骤：取灭菌后的L-缬氨酸发酵液，通过陶瓷膜和纳滤膜除杂，得到过滤清液，调节过滤清液pH至酸性，置于由活性炭柱和吸附树脂柱串联的连续脱色系统中分离，得到脱色清液，再蒸发浓缩、析晶、离心、洗涤、干燥后，得到纯度大于99％的L-缬氨酸晶体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-缬氨酸发酵液的制备方法为，将氨基酸生产菌接种到发酵培养基中，发酵培养至OD值不低于3，加入抗氧化剂，至发酵结束，获得发酵液。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂选自VC、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸镁、亚硫酸钾、草酸、亚硫酸铵、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的任一种或其组合。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂的加入量为0.1-1g/L。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，加入抗氧化剂时OD值不低于5，优选OD值不低于10。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述活性炭柱通过并联，或，并联和串联的组合连接。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述吸附树脂柱内填充ADS-17、HPD-100、HPD-750中的任一种或其组合。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述连续脱色系统包括1号活性炭柱、2号活性炭柱、3号吸附树脂柱、4号吸附树脂柱；1号-4号柱的顶部分别设有料液入口，1号-4号柱的底部分别设有料液出口，各料液入口和料液出口所在管道上分别设有截止阀；各料液入口还与再生液入口连通，各料液出口还与再生液出口连通，再生液入口和再生液出口所在管道上分别设有截止阀；1-2号活性炭柱的料液出口与3-4号吸附树脂柱的料液入口连通。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述脱色清液透光率不低于90％，优选为不低于95％，更优选不低于97％。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述L-缬氨酸晶体纯度不低于99.3％，优选为不低于99.5％，更优选不低于99.9％。
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