CN115128261A - 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒 - Google Patents

一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115128261A
CN115128261A CN202210704056.XA CN202210704056A CN115128261A CN 115128261 A CN115128261 A CN 115128261A CN 202210704056 A CN202210704056 A CN 202210704056A CN 115128261 A CN115128261 A CN 115128261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coupling
antibody
magnetic bead
magnetic
beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210704056.XA
Other languages
English (en)
Inventor
龚秀清
祝言言
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei Guoyan Hanyin Testing Technology Co ltd
Original Assignee
Hefei Guoyan Hanyin Testing Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei Guoyan Hanyin Testing Technology Co ltd filed Critical Hefei Guoyan Hanyin Testing Technology Co ltd
Priority to CN202210704056.XA priority Critical patent/CN115128261A/zh
Publication of CN115128261A publication Critical patent/CN115128261A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/99—Isomerases (5.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于单分子免疫技术领域，具体公开了一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒，其中磁珠偶联方法包括以下步骤：S1、活化；S2、偶联；S3、封闭。本发明提供的磁珠偶联方法主要应用于单分子免疫检测，具有精确度高、无污染、检测速度快、高灵敏度的特点，能实现飞克级别的检测。基于上述磁珠偶联方法开发的检测试剂盒，可实现对前列腺癌病人的早期筛查和诊断，能够提高对前列腺特异性抗原(PSA)灰区(4‑10ng/mL)病人的诊断率。

Description

一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于单分子免疫技术领域，尤其涉及一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒。
背景技术
磁微粒在化学发光免疫分析中应用广泛，其常见的表面活性基团有羧基和氨基等，在一定条件下，通过中间体活化，可与抗体或抗原上的氨基或羧基偶联，用于检测抗原或抗体。
常见羧基磁珠的偶联方法具体如下：(1)活化：将羧基磁珠放在活化缓冲液中活化；(2)偶联：在活化后的磁珠中，加入交联剂和抗体，孵育后得到抗体-磁珠偶联物。
现有技术中的偶联方法存在以下问题：
(1)偶联效率低，偶联效果差。
羧基磁珠在中性至碱性pH 7.0-8.0的缓冲液中进行第二步偶联反应，高pH条件加上磷酸盐的共同作用，通常会导致1-乙基-3-(二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)活化效率降低，偶联率只能达到66.7％，影响最终试验结果的准确性，难以获得预期的偶联效果。
(2)在低pH条件下偶联的磁珠通常容易发生聚集。
目前市面上的试剂盒多采用固相载体的方法，然后将抗原或抗体结合到固相载体，但蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，容易造成制备的试剂盒差异性比较大。
发明内容
本发明提供一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒，以至少解决上述技术问题之一。
为了达到上述目的，本发明一方面提供一种磁珠偶联方法，包括以下步骤：
S1、活化：采用磁珠偶联缓冲液重悬磁珠，取抗体磁珠交联剂EDC和Sulfo-NHS加入磁珠中，于10℃以下活化；
S2、偶联：将S1得到的磁珠用磁珠偶联缓冲液重悬，加入抗体，置于混匀仪中，于10℃以下混匀偶联；
S3、封闭：对S2得到的磁珠中进行封闭，得到抗体磁珠复合物。
优选地，S1的活化温度和S2的混匀偶联温度均为4℃。
优选地，所述磁珠偶联缓冲液的pH值为4-6。
优选地，所述抗体磁珠交联剂的浓度为5-30mg/mL。
优选地，还包括S4、染色：向S3得到的磁珠中加入染料原液，置于混匀仪中，室温(25℃)——反应，得到荧光免疫磁珠。
优选地，所述染料原液为琥珀酰亚酯。
本发明另一方面在于提供一种用于前列腺癌检测的检测试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明第一方面所述的磁珠偶联方法制备的荧光免疫磁珠。
优选地，所述检测试剂盒还包括EPCA-2捕获抗体、EPCA-2抗原质控品、抗体生物素复合体、链霉亲和素-β-半乳糖苷酶偶联物、底物试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。EPCA-2捕获抗体和抗体生物素复合体主要作用是识别抗原，抗原质控品用于测试仪器检测的准确性，链酶亲和素-β-半乳糖苷偶联物主要起连接和级联放大的作用，底物试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷主要与β-半乳糖苷酶反应，用于最终的检测。
优选地，在使用所述检测试剂盒时，向所述荧光免疫磁珠中加入所述EPCA-2捕获抗体，置于4℃，混匀孵育2h。
优选地，在使用所述检测试剂盒时，将所述抗体生物素复合体加入所述荧光免疫磁珠中，室温(25℃)孵育1h。
该用于前列腺癌检测的检测试剂盒包括以下检测步骤：
第一步、向荧光免疫磁珠中加入EPCA-2捕获抗体，混匀孵育后，清洗封闭后弃上清；
第二步、向荧光免疫磁珠中加入待检样品和EPCA-2抗原质控品，清洗封闭后弃上清；
第三步、将检测抗体进行生物素化，形成抗体生物素复合体，将抗体生物素复合体加入荧光免疫磁珠中，混匀孵育后加入链霉亲和素-β-半乳糖苷酶偶联物；
第四步、加入底物试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷；
第五步、信号读取。
优选地，第一步混匀孵育条件：置于4℃中，混匀孵育2h。
优选地，第三步混匀孵育条件：室温(25℃)孵育1h。
本发明的有益效果：
本发明提供的磁珠偶联方法主要应用于单分子免疫检测，精确度高，灵敏度高，能实现飞克级别的检测，检测下限能够达到0.05pg/mL。
1、磁珠偶联捕获抗体采用EDC/Sulfo-NHS(EDC为1-乙基-3-(二甲胺丙基)碳二亚胺，Sulfo-NHS为磺基-NHS N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)两步法，可以防止蛋白的羧基基团活化以及蛋白交联的可能性，有助于更换缓冲液，提高偶联效率，并且该方法对于高密度和低密度的羧基修饰的磁珠均适用。
2、本发明提供的荧光免疫磁珠经过琥珀酰亚酯染料标记，标记后，直接就可在荧光显微镜观察其所在的位置，协助定位，节省实验时间和成本；还可直接通过荧光观察捕获抗体是否成功连接到磁珠上，保证磁珠偶联实验结果的可靠性。
3、单分子免疫检测技术采用新型工具酶β-半乳糖苷酶作为反应物，干扰小，底物无致癌性，显色稳定，对单克隆抗体测定非常灵敏。
4、采用固定化酶标抗体(生物素化抗体和链酶亲和素-β-半乳糖苷酶)，可以提高单个抗原表面结合的酶标抗体量，从而起到信号放大的作用。
基于上述磁珠偶联方法，本发明还提供一种用于前列腺癌检测的检测试剂盒，实现对病人的早期筛查和诊断，提高对PSA灰区(4-10ng/mL)病人的诊断率。
附图说明
图1为BCA蛋白法测定捕获抗体浓度与OD值的线性曲线；其中，横坐标为捕获抗体浓度mg/mL，纵坐标为OD值；
图2为经过S4染色，在4℃得到的偶联抗体；
图3为经过S4染色，在室温(25℃)得到的偶联抗体；
图4为EPCA-2标准品浓度(pg/mL)；
图5为EPCA-2与PSA联合指标诊断前列腺癌的ROC曲线；
图6为临床样本检测结果；横坐标为全自动化学发光检测设备测得的参考值，纵坐标为检测试剂盒得到的测量值；
图7为试剂盒检测原理图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：一种磁珠偶联方法
1.1主要试剂
表1：主要试剂列表
Figure BDA0003705530790000041
1.2试剂制备
磁珠洗涤液-1(BWB-1)：取50mL 10％Tween-20与250mL 10×PBS加入到500mL容量瓶中，然后加入DEPC水定容至500mL，混合后用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤，最后将过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，4℃保存。
磁珠储存液(BSB)：分别称取50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10mM EDTA和5g BSA，加入DEPC水溶解于烧杯中，再加入5mL TritonX-100，然后用盐酸调节pH至7.8，转至500mL容量瓶中，然后加入DEPC水定容至500mL，混合后用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤，最后将过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，4℃保存。
磁珠偶联缓冲液(BCB)：称取0.025mol MES加入DEPC水溶解于烧杯中，然后用NaOH调节pH至6.0，转移至500mL容量瓶中，加入DEPC水定容至500mL，混合后用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤，最后将过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，4℃保存。
抗体磁珠交联剂：用BCB分别配制5-30mg/mL EDC溶液和Sulfo-NHS溶液，EDC和Sulfo-NHS的浓度均优选为10mg/mL。
1.3实验方法
S1、活化
(1)吸取100μL(约2.3×109个/mL)BWB-1清洗磁珠两次，用磁力架吸附，弃上清；
(2)加入BCB清洗一次，磁力架吸附，弃上清；
(3)取475μL BCB溶液重悬磁珠，分别取25μL EDC溶液和25μL Sulfo-NHS溶液加入到磁珠中，将磁珠置于混匀仪上，于10℃以下(例如10℃、8℃、4℃)活化，本实施例优选在4℃混匀活化30min；
本步骤中，还可以仅将25μL EDC溶液加入到磁珠中，将磁珠置于混匀仪上，4℃混匀活化30min。本实施例优选加入EDC溶液和Sulfo-NHS溶液，EDC/Sulfo-NHS形成的中间体更稳定，与抗体氨基的反应会更好，磁珠偶联效果更佳。
(4)活化结束后，用BCB溶液清洗一次，磁力架吸附，弃上清。
S2、偶联
将活化好的磁珠用BCB重悬，加入0.1mg/mL的抗体，置于混匀仪中，于10℃以下混匀偶联，本实施例优选于4℃混匀偶联2h。
S3、封闭
(1)将S2得到的磁珠，用BWB-1清洗两遍，磁力架吸附，将上清吸出放入离心管中储存，后续使用。
(2)向磁珠中加入3％乙胺醇，涡旋震荡30min，终止磁珠反应。
(3)用磁珠封闭液(1％BSA)重悬，置于混匀仪中，室温(25℃)混匀2h，得到抗体磁珠复合物。
S4、染色
(1)配制10mg/mL染料原液：将1mg琥珀酰亚酯溶于100μL DMSO中。琥珀酰亚酯是一种绿色染料(Alexa FluorTM488 NHS Ester(Succinimidyl Ester))。
(2)在S3得到的抗体磁珠复合物中加入600μL，0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)，再加入10mg/mL染料原液，置于混匀仪中，室温(25℃)反应2h。
(3)结束后用PBST洗涤5次，磁力架吸附，弃上清。
(4)将抗体磁珠复合物保存在BSB中，得到荧光免疫磁珠。
实验一：温度对磁珠偶联的影响
1、实验设计
现有技术中的磁珠偶联多在室温条件下进行。本实验比较了4℃和室温(25℃)对磁珠偶联的影响。
2、实验方法：
按照上述S1，吸取100μL(约2.3×109个/mL)磁珠装入标记有4℃和室温的离心管中，用BWB-1清洗磁珠两次，用磁力架吸附，弃上清；加入磁珠偶联缓冲液(BCB)清洗一次，磁力架吸附，弃上清；取475μL BCB溶液重悬磁珠，分别取25μL EDC溶液和25μL Sulfo-NHS溶液加入到磁珠中，将磁珠置于混匀仪上，4℃和室温混匀活化30min；活化结束后，用BCB溶液清洗一次，磁力架吸附，弃上清。
按照上述S2-S3，得到抗体磁珠复合物。
采用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定4℃和室温(25℃)捕获抗体剩余量，试剂盒产品编号为P0010。标准品为蛋白浓度测定试剂盒(增强型)中的蛋白浓度标准品。
3、实验结果：
实验结果如表2、图1、图2和图3所示，图1为BCA蛋白法测定捕获抗体浓度与OD值(optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度)的关系；其中，横坐标为捕获抗体浓度mg/mL，纵坐标为OD值；图2为经过S4染色，在4℃得到的偶联抗体；图3为经过S4染色，在室温(25℃)得到的偶联抗体。
通过BCA蛋白测定可以获得4℃和室温(25℃)偶联结束后，剩余捕获抗体的浓度分别为0.0048mg/mL和0.04mg/mL，剩余量分别为2.4μg和20μg，通过计算可以得出在4℃条件下进行偶联，其偶联率可以达到95.2％，而室温条件下偶联率仅有60％。
表2：BCA蛋白法测定4℃和室温(25℃)捕获抗体剩余量
Figure BDA0003705530790000061
备注：OD值1和OD值2同一个样本做的重复孔。
实验二：在不同pH值的磁珠偶联缓冲溶液中偶联结果分析
1、实验方法
按照上述步骤S1，分别吸取100μL(约2.3×109个/mL)磁珠装入标记有不同pH值(pH4、5、6、7、8和9)的离心管中，用BWB-1清洗磁珠两次，用磁力架吸附，弃上清；加入不同pH值(pH4、5、6、7、8和9)的磁珠偶联缓冲液(BCB)清洗一次，磁力架吸附，弃上清；取475μL BCB溶液重悬磁珠，分别取25μL EDC溶液和25μL Sulfo-NHS溶液加入到磁珠中，将磁珠置于混匀仪上，4℃混匀活化30min。活化结束后，用不同pH值的BCB溶液清洗一次，磁力架吸附，弃上清。
采用不同pH值(pH4、5、6、7、8和9)的磁珠偶联缓冲液(BCB)进行上述S2-S3，得到抗体磁珠复合物。
2、实验结果
从表3中可以得出，在对抗体磁珠复合物进行修饰时，磁珠偶联缓冲液pH值为4-7时对抗体磁珠复合物的修饰中，均表现出较高的偶联率，CV(变异系数)值小于3；磁珠偶联缓冲液pH值4-6，活化效率高，酰胺键生成率高，磁珠偶联的抗体越多，尤其是在磁珠偶联缓冲液pH值为6时，偶联率最高且CV值小于1，明显提高了磁珠的偶联效率，并且重复性好。
表3：抗体磁珠复合物偶联方法在不同pH的磁珠偶联缓冲液中偶联结果分析
Figure BDA0003705530790000071
实验三：不同浓度的抗体磁珠交联剂对抗体磁珠复合物偶联抗体的结果分析
1、实验方法
按照上述步骤S1，分别吸取100μL(约2.3×109个/mL)磁珠装入标记有不同浓度(5、10、15、20、25和30mg/mL)的离心管中，用磁珠洗涤液-1(BWB-1)清洗磁珠两次，用磁力架吸附，弃上清；加入磁珠偶联缓冲液(BCB)pH6清洗一次，磁力架吸附，弃上清；取475μL BCB溶液重悬磁珠，分别取25μL EDC溶液和25μL Sulfo-NHS溶液加入到磁珠中，将磁珠置于混匀仪上，4℃混匀活化30min；活化结束后，用不同pH值的BCB溶液清洗一次，磁力架吸附，弃上清。
按照上述步骤S2-S3，得到抗体磁珠复合物。
2、实验结果
表4：不同浓度的抗体磁珠交联剂对抗体磁珠复合物偶联抗体的结果分析
Figure BDA0003705530790000081
从表4中可以得出，对抗体磁珠复合物进行抗体偶联，在相同的pH值的溶液中，浓度为5-30mg/mL抗体磁珠交联剂中，均表现出较高的偶联率，尤其是在浓度为10mg/mL的抗体磁珠交联剂，明显提高了抗体磁珠复合物的偶联效率，并且重复性好。
EDC溶液活化磁珠上的羧酸基团，形成O-酰基异尿中间体，该中间体能迅速与蛋白质上的伯胺反应形成酰胺键，使得磁珠与抗体紧密结合。但O-酰基异尿中间体在水溶液中不稳定，容易发生水解，因此需要在Sulfo-NHS存在下反应形成稳定且具有羧基反应活性的中间体Sulfo-NHS酯，再与伯胺反应形成稳定的酰氨键。反应体系中，低pH时，EDC与羧基形成的O-酰基异尿中间体极不稳定，容易水解失去偶联的能力，水解反应能够竞争性得分解活化中间体并重新形成羧基，从而影响磁珠与抗体的偶联；pH过高时，不稳定的中间体可能会水解或者使Sulfo-NHS酯中间体产量减少，从而造成反应速率降低，导致抗体偶联量下降。同理，在相同的PH值溶液中，抗体磁珠交联剂的浓度较低时，羧酸官能团得不到充分活化，使得目标胺在水解前找不到活性羧酸盐，无法发生偶联，当浓度过高时，不稳定的中间体可能会水解或者使Sulfo-NHS酯中间体产量减少，从而造成反应速率降低，导致抗体偶联量下降。
实施例2：一种用于前列腺癌检测的试剂盒
1、试剂盒成分
表5：试剂盒成分
Figure BDA0003705530790000091
EPCA-2是一种与前列腺癌相关的核基质蛋白，有研究表明它能较病理切片提早5年或更多时间准确的诊断出前列腺癌。本实施例提供的试剂盒采用化学发光法，将抗体同样本中的EPCA-2结合，然后由荧光免疫磁珠捕获形成双抗夹心复合物，再加入发光促进剂，加大反应物发光的速度和强度，用发光信号测量光子数量，据此诊断。试剂盒的检测原理具体如图7所示。
2、试剂配制
磁珠洗涤缓冲液2(BWB-2)：取5mL 10％Tween-20与250mL 10×PBS加入到500mL容量瓶中，然后加入DEPC水定容至500mL，混合后用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤，最后将过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，4℃保存。
样本稀释液：分别取2.5mL FBS、50mL 10×PBS和0.5mL10％Tween-20加入到500mL容量瓶中，混合后用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤，最后将过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，4℃保存。
3、试剂盒的检测步骤
第一步、取100μL荧光免疫磁珠(实施例1的步骤S4获得)，加入50μg EPCA-2捕获抗体，置于4℃中，混匀孵育2h，用BWB-1清洗三遍，磁力架吸附，弃上清；用2％BSA封闭1h，清洗3遍，弃上清，将荧光免疫磁珠储存在PBS中。
第二步、在荧光免疫磁珠中加入待检样品(血清、血浆或尿液样本)和用样本稀释液将EPCA-2抗原浓度分别稀释为0、0.025、0.5、0.1、0.5、1、5、10、50以及100pg/mL的质控品，置于混匀仪中，室温(25℃)孵育1h，用BWB-2清洗5次，磁力架吸附，弃上清。质控品主要是用来检查仪器的性能，成分是EPCA-2抗原。
第三步、将检测抗体进行生物素化，形成抗体生物素复合体。具体地，是将抗体和NHS-PEG4-生物素，用DMSO溶解生物素，加入到抗体中反应，然后纯化就可以使用了。具体方法如下：
(1)将待修改的抗体以2mg/ml的浓度溶解在PBS中；
(2)将NHS–PEG4-生物素化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为15mM；
(3)在混合时，向蛋白质溶液中加入等量的生物素化原液，在室温下温和混合30分钟；
(4)使用透析或凝胶过滤(脱盐树脂)从过量的试剂和反应副产品中纯化生物素化蛋白。
将抗体生物素复合体加入荧光免疫磁珠中，置于混匀仪中，室温(25℃)孵育1h；结束后用BWB-2清洗5次，加入链霉亲和素-β-半乳糖苷酶偶联物，置于混匀仪中，室温(25℃)孵育30min，结束后用BWB-2清洗5次，用样品稀释液重悬。
第四步、加入底物：
在样品稀释液中加入底物试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)，将磁珠装载到阵列(一种芯片)中，室温(25℃)孵育15min；
第五步、信号读取：
将待检样品置于荧光显微镜下进行单分子计数和荧光强度积分模式，完成后续的单分子计数统计和分析。每组六个重复，根据结果绘制标准曲线，计算每个点的％CV值。
检测结果如图4所示，选择0、0.025、0.5、0.1、0.5、1、5、10、50以及100pg/mL不同浓度的EPCA-2质控品与空白对照组(不加入EPCA-2抗原)进行分析，可以看出CNP值(单分子信号数)与EPCA-2质控品的浓度呈正相关，其检测下限为0.05pg/mL，本实施例提供的检测试剂盒的精确度高，灵敏度高，能实现飞克级别的检测。
实验四：EPCA-2与PSA联合诊断
目前对前列腺癌的诊断依据病史、直肠指诊、前列腺特异性抗原(PSA)检测、经直肠超声检查、磁共振检查等，确诊主要依靠前列腺穿刺活检或病理学检查。随着研究的深入，临床单一检测PSA常发生不必要的误诊和漏诊，检测结果容易受到其他疾病或检测的影响，特别是对PSA值在4-10ng/mL的灰区患者，诊断结果缺乏特异性。前列腺穿刺活检为创伤性检查，可能并发感染、出血、肿瘤种植及迷走精神反射等并发症。
本实验采用实施例二提供的检测试剂盒测试了30个临床血液样本，实验结果如图5、图6和表6所示。由图5可以看出，将EPCA-2与PSA联合诊断前列腺癌特异性可达到92.89，灵敏度可以达到95.78，可以显著提高PSA灰区前列腺癌患者的早期诊断率。如图6为临床样本检测结果，横坐标为全自动化学发光检测设备测得的参考值，纵坐标为检测试剂盒得到的测量值。图6说明实施例二提供的检测试剂盒能对患者进行检测，且效果佳。
表6：30个临床血液样本的测试结果
Figure BDA0003705530790000111
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种磁珠偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、活化：采用磁珠偶联缓冲液重悬磁珠，取抗体磁珠交联剂EDC和Sulfo-NHS加入磁珠中，于10℃以下活化；
S2、偶联：将S1得到的磁珠用磁珠偶联缓冲液重悬，加入抗体，置于混匀仪中，于10℃以下混匀偶联；
S3、封闭：对S2得到的磁珠进行封闭，得到抗体磁珠复合物。
2.根据权利要求1所述的磁珠偶联方法，其特征在于，S1的活化温度和S2的混匀偶联温度均为4℃。
3.根据权利要求1所述的磁珠偶联方法，其特征在于，所述磁珠偶联缓冲液的pH值为4-6。
4.根据权利要求1所述的磁珠偶联方法，其特征在于，所述抗体磁珠交联剂的浓度为5-30mg/mL。
5.根据权利要求1所述的磁珠偶联方法，其特征在于，还包括S4、染色：向S3得到的抗体磁珠复合物中加入染料原液，置于混匀仪中，室温反应，得到荧光免疫磁珠。
6.根据权利要求5所述的磁珠偶联方法，其特征在于，所述染料原液为琥珀酰亚酯。
7.一种用于前列腺癌检测的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括根据权利要求1-6任一项所述的磁珠偶联方法制备的荧光免疫磁珠。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括EPCA-2捕获抗体、EPCA-2抗原质控品、抗体生物素复合体、链霉亲和素-β-半乳糖苷酶偶联物、底物试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，在使用所述检测试剂盒时，向所述荧光免疫磁珠中加入所述EPCA-2捕获抗体，置于4℃，混匀孵育2h。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，在使用所述检测试剂盒时，将所述抗体生物素复合体加入所述荧光免疫磁珠中，室温孵育1h。
CN202210704056.XA 2022-06-21 2022-06-21 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒 Pending CN115128261A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210704056.XA CN115128261A (zh) 2022-06-21 2022-06-21 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210704056.XA CN115128261A (zh) 2022-06-21 2022-06-21 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115128261A true CN115128261A (zh) 2022-09-30

Family

ID=83379620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210704056.XA Pending CN115128261A (zh) 2022-06-21 2022-06-21 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115128261A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104614535B (zh) 甲状腺微粒体抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
US20190219569A1 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
CN112730839B (zh) 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
WO2019148753A1 (zh) 一种thsd7a抗体的检测试纸条及检测方法
JPS63229366A (ja) 凝集反応免疫分析及び緩衝塩洗浄液を使用する多価免疫種測定用キット
US20180231540A1 (en) Reagent kit used for detecting gastrin-17, and preparation method and application for reagent kit
JPS63229367A (ja) 免疫反応性試薬、その製造法及び免疫反応性種を測定するためのその用途
CN110806487A (zh) 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法
CN111381027A (zh) 免疫捕获组合物及其制备方法和应用、免疫检测试剂盒
CN111089958A (zh) 一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒
KR20040010589A (ko) 면역 분석법
CN202916286U (zh) 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
US4828978A (en) Agglutination reagent and method of preparing same
EP0679892A1 (en) Microparticle immunoassay reagents, sensitive and specific immunoassay reagents and immunoassay methods using these reagents
CN112625145A (zh) 1,3-β-D葡聚糖衍生物、试剂盒及制备方法及测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法
CN113376378A (zh) 一种d-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途
CN115128261A (zh) 一种磁珠偶联方法及其检测试剂盒
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN112007620A (zh) 一种链霉亲和素磁性微球的制备方法
CN115236341A (zh) 一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法及用途
CN114965986A (zh) 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒
US6927071B2 (en) Method for reducing non-specific aggregation of latex microparticles in the presence of serum or plasma
CN112485419A (zh) 一种锌转运体8抗体检测试剂盒
CN112763724A (zh) 同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒
EP0280561B1 (en) Agglutination reagent and method of preparing same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination