CN115125669B - 一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜及其制备方法，涉及生物医药材料技术领域。本发明所述方法是利用N,N’‑二仲丁基‑N,N’‑二亚硝基‑1,4‑苯二胺和静电纺丝用高分子聚合物制成胶状水溶液，并进行电纺制成一定厚度的电纺膜。本发明是将超声响应性一氧化氮供体与电纺膜相结合从而实现了电纺膜对一氧化氮气体的定时定量的可控释放。本发明的电纺膜超声的穿透性更强，可适用于内部脏器的使用，应用范围更广。本发明制备的电纺膜纤维均匀、厚薄适中，可根据具体应用场景灵活调整厚度、载药量。

Description

一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜及其制备方法。
背景技术
心血管疾病是一组心脏和血管疾患，包括心肌梗死、冠心病、脑血管疾病、先天性心脏病、风湿性心脏病、主动脉夹层等。心脏补片在心血管疾病，尤其心肌梗死，是一种很有前景的治疗方法，成年人心肌细胞一旦损伤、坏死便很难再生，坏死的心肌会逐渐被纤维瘢痕组织替代，心脏跳动过程中很容易形成室壁瘤甚至心脏破裂，使用心脏补片可以为梗死区域提供很好的机械支撑，同时现有的基础研究可在补片中携载各种药物、细胞，辅助心肌梗死的治疗，从而减少心肌细胞的凋亡，维持血管功能、改善心室重塑，维持心脏功能，但是现有的心脏补片本身无生物活性功能，无法促进血管生成，也无法改善心肌功能。
一氧化氮(NO)作为一种多功能信号分子，在调节心血管稳态中发挥着关键作用。一氧化氮信号通路功能障碍与心肌梗死发病率增加相关。外源性补充一氧化氮可以放松血管张力、维持血管功能、抑制血小板聚集和调节炎症反应减少心肌细胞凋亡，从而保护心肌功能。
目前NO供体药物已经在临床广泛应用(如硝酸甘油、硝苯地平的等药物)，其治疗心血管疾病的疗效具有可靠性和稳定性。但是一氧化氮作为一种活泼的化学分子，其疗效与剂量息息相关，高剂量一氧化氮会诱发氧化应激反应导致细胞死亡，过低剂量则无法发挥治疗作用。
基础研究在控制NO的释放方面做了大量的探索，目前常用的一氧化氮控制释放方法是制备各种刺激响应性的一氧化氮供体药物，如pH响应性一氧化氮供体、谷胱甘肽响应性一氧化氮供体、以及光响应性一氧化氮供体等，但是以上几种响应性供体都存在可控性不强的缺点，如pH响应性、谷胱甘肽响应性都取决于体内pH值和谷胱甘肽含量，这存在很大的不可控性，并且有的病人后续恢复良好，可能不需要一氧化氮的持续释放，光响应性一氧化氮电纺膜虽然可以满足“随时启停”的优势。但其最大的缺点是光的穿透性不足，不适用与深部组织器官(如心脏、腹主动脉等)。
在心脏补片方面的研究，目前已有研究制备了可释放NO的心脏补片用于心肌梗死等疾病的治疗，但目前仍存在NO释放可控性不强、无法根据患者个体情况调整NO剂量等问题。因此设计可控性好的一氧化氮心脏补片非常有意义，可以根据病人具体情况定时定量的释放一氧化氮，并且适用于多种组织器官。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜及其制备方法，该方法所制备的电纺膜(心脏补片)是基于超声响应释放一氧化氮，具有穿透能力强、适应范围广且可根据患者个体差异和病情进展人为控制NO的释放，重复性好的特点。
本发明所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法包括以下步骤：
(1)将N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺和静电纺丝用高分子聚合物按质量比为1:0.001-0.01混合，溶解在由氯仿和丙酮构成的混合溶剂中，制成无色透明的胶水状溶液，所述胶水状溶液中所述高分子聚合物的质量体积比为15-25％，并4℃避光保存备用；
(2)将所述胶水状溶液进行电纺，并制成电纺膜，本发明所述电纺膜的厚度可根据实际需要进行调节；所述电纺条件是：注射速度3-5mL/h，直流电源压力为15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为12-15cm，针头以0.8-1.2cm/s往复运动，避光，温度为25℃。
优选的，所述高分子聚合物的平均分子量为50000-80000，包括但不限于聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
优选的，所述混合溶剂中氯仿和丙酮的体积比为4～6：1。
优选的，所述N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺的制备方法如下：
S1、将2mL N,N'-二仲丁基氨基对苯二胺稀释到20mL乙醇中,在氮气保护下不断搅拌；
S2、将煮沸的超纯水置于真空瓶中将溶液中的空气抽出，制备脱气水；
S3、用所述脱气水配置2-6M的NaNO2水溶液；
S4、在氮气保护下将15-25mL所述NaNO2水溶液倒入步骤S1制备的溶液中，静置30min；
S5、然后滴加12-25mL浓盐酸，反应溶液从红色逐渐变为橙色，同时产生米黄色沉淀，搅拌2-4h；
S6、离心过滤，收集固体产物，并先用水洗涤，再用乙醇洗涤，干燥后得到N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺。
优选的，步骤S5所述浓盐酸的浓度为12M。
优选的，步骤S5所述浓盐酸的滴加速度为15-20滴/min。
优选的，步骤S6所述乙醇浓度为50wt％。
本发明的另一目的是提供了一种利用本发明所述方法制备的超声响应性释放一氧化氮电纺膜，该电纺膜可以作为心血管修复用心脏补片材料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明是将超声响应性一氧化氮供体与电纺膜相结合，与传统的一氧化氮药物释放电纺膜相比：本发明能更好的实现NO气体的定时定量的可控释放，可根据患者个体差异和病情进展人为控制NO的释放，可重复性好；本发明的电纺膜超声的穿透性更强，可适用于内部脏器的使用(如心脏、腹主动脉等)，应用范围更广；本发明制备的电纺膜纤维均匀、厚薄适中，可根据具体应用场景灵活调整厚度、载药量。
附图说明
图1为实施例1制备的电纺膜SEM图；
图2为实施例1、实施例2和对比例1、对比例2、对比例3、对比例4制备的电纺膜体外一氧化氮累积释放浓度图；
图3为利用实施例1制备的电纺膜治疗心肌梗死的效果图；
图4为对比例5制备的电纺膜SEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法如下：
将N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺和聚-ε己内酯(平均分子量为80000)按质量比为1:0.01混合，溶解在由氯仿和丙酮(体积比为5：1)构成的混合溶剂中，制成无色透明的胶水状溶液，所述胶水状溶液中聚-ε己内酯的质量体积比为20％，并4℃避光保存备用；
将所述胶水状溶液进行电纺，并制成厚度为300μm的电纺膜；所述电纺操作如下：用注射器吸取所述胶水状溶液，在注射泵的驱动下以4mL/h的流速通过18G的平针头，设置针头与接收铝箔纸的距离为15cm，直流高压电源加压15kV，电流1mA，用电极夹持接针头并将铝箔纸接地，保存环境温度25℃，避光条件下，通过电动位移台以带动针头以1cm/s往复运动，得到厚度为300μm的电纺膜。
分别将电纺膜剪裁至质量为2mg，并放置在孔板中，每个孔中添加1mL超纯水；实验组为使用超声转染仪进行超声响应，超声波参数为1W/cm2，占空比50％，探头频率为1MHz；超声探头与孔板底部添加耦合剂，超声累计不同时间(30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)点取样并测量溶液中产生的NO浓度。
实施例2
一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法如下：
将N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺和聚-ε己内酯(平均分子量为80000)按质量比为1:0.005混合，溶解在由氯仿和丙酮(体积比为5：1)构成的混合溶剂中，制成无色透明的胶水状溶液，所述胶水状溶液中聚-ε己内酯的质量体积比为20％，并4℃避光保存备用；
将所述胶水状溶液进行电纺，并制成厚度为300μm的电纺膜；所述电纺操作如下：用注射器吸取所述胶水状溶液，在注射泵的驱动下以4mL/h的流速通过18G的平针头，设置针头与接收铝箔纸的距离为15cm，直流高压电源加压15kV，电流1mA，用电极夹持接针头并将铝箔纸接地，保存环境温度25℃，避光条件下，通过电动位移台以带动针头以1cm/s往复运动，得到厚度为300μm的电纺膜。
分别将电纺膜剪裁至质量为2mg，并放置在孔板中，每个孔中添加1mL超纯水；实验组为使用超声转染仪进行超声响应，超声波参数为1W/cm2，占空比50％，探头频率为1MHz；超声探头与孔板底部添加耦合剂，超声累计不同时间(30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)点取样并测量溶液中产生的NO浓度。
实施例3
按照实施例1的制备方法，将聚-ε己内酯替换为聚乳酸(平均分子量为60000)，其他工艺不变，获得一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜。
实施例4
按照实施例1的制备方法，将聚-ε己内酯替换为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(平均分子量为80000)，其他工艺不变，获得一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜。
对比例1
将实施例1的电纺膜剪裁至质量为2mg，并放置在孔板中，每个孔中添加1mL超纯水；不使用超声，在间隔30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)后取溶液并测量NO浓度。
对比例2
将实施例2的电纺膜剪裁至质量为2mg，并放置在孔板中，每个孔中添加1mL超纯水；不使用超声，在间隔30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)后取溶液并测量NO浓度。
对比例3
一种超声响应性释放NO的药物制备方法如下：
(1)将2mLN,N'-二仲丁基氨基对苯二胺稀释到20mL乙醇中；
(2)将煮沸的超纯水置于真空瓶中将溶液中的空气抽出，制备脱气水；
(3)用上述(2)制备的脱气水配置2-6M浓度的NaNO2；
(4)将20mL脱气的NaNO2水溶液入(1)中溶液，整个装备应在氮气保护下；
(5)30分钟后，使用分液漏斗滴加20mL浓盐酸，反应溶液从红色逐渐变为橙色，同时产生米黄色沉淀；
(6)搅拌2-4小时后，将(5)中的液体通过离心收集固体产物，并先用水洗涤，然后再用50％的乙醇洗涤收集的沉淀以除去残留的反应物，避光条件冷冻干燥过夜获得黄色粉末BNN6；
(7)制备BNN6溶液，摩尔质量与1％电纺膜所含BNN6质量相同，进行体外超声响应实验，超声波参数为1W/cm2，占空比50％，探头频率为1MHz；超声探头与孔板底部添加耦合剂，超声累计不同时间(30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)点取样并测量溶液中产生的NO浓度。
对比例4
一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法如下：
将聚-ε己内酯溶解在由氯仿和丙酮(体积比为5：1)构成的混合溶剂中，制成溶液，所述溶液中聚-ε己内酯的质量体积比为20％，并4℃避光保存备用；
将所述溶液进行电纺，并制成厚度为300μm的电纺膜；所述电纺操作如下：用注射器吸取所述胶水状溶液，在注射泵的驱动下以4mL/h的流速通过18G的平针头，设置针头与接收铝箔纸的距离为15cm，直流高压电源加压15kV，电流1mA，用电极夹持接针头并将铝箔纸接地，保存环境温度25℃，避光条件下，通过电动位移台以带动针头以1cm/s往复运动，得到厚度为300μm的电纺膜。
分别将电纺膜剪裁至质量为2mg，并放置在孔板中，每个孔中添加1mL超纯水；实验组为使用超声转染仪进行超声响应，超声波参数为1W/cm2，占空比50％，探头频率为1MHz；超声探头与孔板底部添加耦合剂，超声累计不同时间(30s、1min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min)点取样并测量溶液中产生的NO浓度。
对比例5
一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法如下：
将N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺和聚-ε己内酯按质量比为1:0.01混合，溶解在由氯仿和丙酮(体积比为5：1)构成的混合溶剂中，制成无色透明的胶水状溶液，所述胶水状溶液中聚-ε己内酯的质量体积比为20％，并4℃避光保存备用；
将所述胶水状溶液进行电纺，并制成厚度为300μm的电纺膜；所述电纺操作如下：用注射器吸取所述胶水状溶液，在注射泵的驱动下以4mL/h的流速通过18G的平针头，设置针头与接收铝箔纸的距离为15cm，直流高压电源加压15kV，电流1mA，用电极夹持接针头并将铝箔纸接地，保存环境温度25℃，避光条件下，通过电动位移台以带动针头以1cm/s往复运动，得到厚度为300μm的电纺膜。
1、SEM检测：
将实施例1以及对比例5制备的电纺膜进行检测，如图1所示，本发明的电纺膜丝粗细均匀，而对比例5所制备的电纺膜粗细不均(图4)。
2、从图2中可以看出，结果显示在相同的超声波参数条件下，实施例1和实施例2制备的电纺膜释放的NO浓度相似，NO的释放与超声累积时间之间具有良好的规律性，可通过计算方程进行预测；而无超声组则不会产生NO，提示超声是NO产生的前提条件，并且可以根据调整超声时间来控制NO的释放量；而对比例3尽管可以在超声作用下产NO，但是所产生的NO的释放与超声累积时间之间不具有良好的规律性；对比例4则不产生NO，提示单纯的无BNN6的电纺膜本身是无法产生NO的。
4、电纺膜治疗心肌梗死的疗效验证(应用举例)
(1)准备体重25g左右的C57小鼠，注射戊巴比妥麻醉后胸口脱毛并固定，气管插管并上呼吸机，开胸分离肋骨，暴露心脏左室前壁以及冠脉左前降支；
(2)使用8-0缝线结扎左前降支，实验组在开胸左前降支结扎后在前壁梗死区域缝合实施例1制备的电纺膜；另一组只结扎冠脉左前降支则不缝合电纺膜，作为对照；
(3)实验组在术后1/3/7天进行胸部超声5min；超声时将小鼠麻醉并固定；
(4)第28天取心脏做masson染色判断心肌梗死面积，相较于对照组(图3A)，实验组的心肌梗死面积(图3B)明显减少，表明实施例1的电纺膜结合本发明所制备的电纺膜和超声联合超声可改善心肌梗死后心肌重塑，减少心肌梗死面积。
本发明电纺膜可支撑心肌梗死后纤维化的左室前壁，改善心室重塑，而超声可以使该电纺膜释放一氧化氮，根据超声的参数调节NO的释放量，促进局部血管新生，维持血管功能，减少心肌细胞凋亡，从而减少心肌梗死面积。
本发明通过采用N,N'-二仲丁基氨基对苯二胺与聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物等静电纺丝用聚合物作为静电纺丝溶液，经过静电纺丝技术制成电纺膜，经检测，实施例3电纺膜的机械性能高于其他实施例。实施例4电纺膜的降解速率要高于其他实施例。本发明实施例1-4制备的电纺膜超声响应性释放NO的性能无明显差异。
需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将N，N’-二仲丁基-N，N’-二亚硝基-1，4-苯二胺和静电纺丝用高分子聚合物按质量比为1∶0.001-0.01混合，溶解在由氯仿和丙酮构成的混合溶剂中，制成无色透明的胶水状溶液，所述胶水状溶液中所述高分子聚合物的质量体积比为15-25％，并4℃避光保存备用；
(2)将所述胶水状溶液进行电纺，并制成电纺膜；所述电纺条件是：注射速度3-5mL/h，直流电源压力为15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为12-15cm，针头以0.8-1.2cm/s往复运动，避光，温度为25℃；
所述高分子聚合物为聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种；
所述混合溶剂中氯仿和丙酮的体积比为4～6∶1。
2.根据权利要求1所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法，其特征在于，所述N，N’-二仲丁基-N，N’-二亚硝基-1，4-苯二胺的制备方法如下：
S1、将2mL N，N′-二仲丁基氨基对苯二胺稀释到20mL乙醇中，在氮气保护下不断搅拌；
S2、将煮沸的超纯水置于真空瓶中将溶液中的空气抽出，制备脱气水；
S3、用所述脱气水配置2-6M的NaNO2水溶液；
S4、在氮气保护下将15-25mL所述NaNO2水溶液倒入步骤S1制备的溶液中，静置30min；
S5、然后滴加12-25mL浓盐酸，反应溶液从红色逐渐变为橙色，同时产生米黄色沉淀，搅拌2-4h；
S6、离心过滤，收集固体产物，并先用水洗涤，再用乙醇洗涤，干燥后得到N，N’-二仲丁基-N，N’-二亚硝基-1，4-苯二胺。
3.根据权利要求2所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法，其特征在于，步骤S5所述浓盐酸的浓度为12M。
4.根据权利要求2所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法，其特征在于，步骤S5所述浓盐酸的滴加速度为15-20滴/min。
5.根据权利要求2所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的制备方法，其特征在于，步骤S6所述乙醇浓度为50wt％。
6.一种超声响应性释放一氧化氮电纺膜，其特征在于，利用权利要求1～5任意一项所述方法制备而成。
7.根据权利要求6所述超声响应性释放一氧化氮电纺膜的应用，其特征在于，将所述电纺膜作为心血管修复用心脏补片材料。
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