CN117679356A - 一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针、制备及应用 - Google Patents

一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针、制备及应用 Download PDF

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Abstract

一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针、制备及应用，属于药物技术领域。将蚕茧经过煮丝、溶丝、透析以及定浓度之后制备成丝蛋白溶液，将金属有机框架负载在针尖部位，制备出一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针贴片，其具有优秀的机械性能以及溶解性能，通过超声作用产生羟基自由基诱发DNA损伤和细胞焦亡，在48h的释药率可以达到65％以上，浅表肿瘤治愈率高达90％。

Description

一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针、制备及 应用
技术领域
本发明属于纳米药物递送系统搭建领域，具体涉及一种生物降解的有机框架丝蛋白微针贴片。
背景技术
癌症是一种高度复杂和异质性的疾病，在全球内死亡率最高。目前，最常见的治疗策略包括手术、放疗和化疗。然而，一旦肿瘤转移将无法进行这些治疗。声动力疗法(SDT)是一种非侵入性但能深入组织、无创、具有高度靶向性的癌症治疗方法，利用超声增敏剂与低强度超声协同相互作用产生活性氧(ROS)，导致肿瘤细胞死亡。解决了以上治疗方法的痛点。理想的声敏剂应具有光敏性弱、高选择性及安全易给药等优点。而就目前所研发出的声敏剂在某些方面还不够完善，声敏剂对正常组织的有害影响和较短的生物半衰期限制了声动力疗法(SDT)的应用。
作为新兴的一类多孔材料，金属有机框架(MOFs)由于其优越的设计灵活性而获得了大量的关注，金属有机框架材料由有机基团和无机成分构成。分子水平上设计更加活的MOFs，可以使纳米粒子的核心功能大大多样化。金属有机框架与其他材料相比，具有更大的比表面积、更高的声稳定性、可调和的孔以及更容易修饰各种官能团。研究表明，MOFs的整体尺寸可以缩小到纳米级，并且所获得的纳米MOFs通常在实际应用中表现出比相应的大块晶体更加显著的性能。此外，二维金属有机框架纳米片在声动力学方面具有比传统声敏剂更高的效率，主要原因如下：与传统声敏剂相比，二维材料具有更多的响应面积，因此可以更好地捕获声波信号；二维材料具有高的机械强度和韧性，能够抵抗大的声压，使其表现出良好的稳定性和耐久性，而传统声敏剂则容易被声波破坏；二维材料中大量的界面会增加声子界面散射的机会，从而增加声子声波的能量流动，相比于传统声敏剂，二维材料的能量转换效率更高。这些因素使得二维材料对声波的响应更加灵敏、快速和准确，使其在声学传感器等应用中得到广泛应用。此外，配位作用可以增强卟啉分子在二维平面方向上的π共轭作用，使其在二维平面上形成分子间π-π堆积，增加了声敏剂的吸收和响应能力。铜离子可以增强声敏剂的光物理性能，对声波信号的响应时间也有很大的影响。铜的3d电子轨道中含有未配对的电子，与卟啉周围的基团相互作用导致卟啉分子的激发态有更高的发射量，进一步增加了声敏剂的吸收能力和响应能力。通过复合形成二维结构可以有效防止声波的散射和衰减，从而进一步提高声敏剂的灵敏度。综上所述，铜和卟啉通过配位形成的二维声敏剂材料可以充分利用二者之间的协同作用，从而提高声敏剂的灵敏度和响应能力。
微针是一种新型的微米级别的针，它可以在皮肤上创造微米级别的药物输送通道，可输送大分子药物，微针给药作为一种将传统注射给药和透皮给药结合的新型给药方式，不仅具有无痛、给药方便、疗效稳定、操作便利等优点，而且运用物理手段可大幅度提高大分子甚至纳米级药物的透皮定点、定时给药。丝蛋白微针较PVP、PVA、HA等材料制作的微针具有更好的生物相容性，不但能够做到更快速度的无毒降解，还可以通过乙醇蒸汽或水蒸气处理改变丝蛋白二级结构从而使蛋白改性，从而做到对药物的缓释。
因此丝蛋白微针允许药物(包括有机金属框架)有效地输送到目标区域，而不会造成创伤或组织损伤。在那里它们可以快速释放，比瘤旁注射更有效地与肿瘤细胞相互作用。这种直接递送可提高有机金属框架的生物利用度和治疗效果。因此，本研究合成了一种含有四羧基苯基卟啉(TCPP)、Cu2+的增敏剂(Cu-tcpp)，其具有二维结构，与传统声敏剂相比具有更大的响应面积以及超声后产生大量羟基自由基，能够用于更精确和有效的SDT。总的来说，将CuT载入丝蛋白微针为肿瘤治疗提高安全性、有效性和便利性。然而，还需要进一步的研究来充分评估微针给药在癌症治疗中的安全性和有效性。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种适用于金属有机框架与丝蛋白结合的技术，解决现有声敏剂半衰期短、生物利用率低以及微针刺穿性能弱、药物速释的缺点。采用该方法可获得低成本高性能的复合微针，它可以通过金属配位作用整合无机材料与有机分子，将两种组分的优势巧妙融合，实现高效低毒的肿瘤治疗。
一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针，其特征在于，在丝蛋白微针的针尖端部负载有铜配位卟啉金属有机框架材料CuT，进一步所述的铜配位卟啉金属有机框架材料CuT是掺杂包覆在丝蛋白微针的针尖中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤和工艺条件：
步骤1)将蚕茧剪开，取出蚕蛹，将剪开的蚕茧放入煮沸的碳酸钠溶液中，并将丝抻开，将煮好的丝放在室温下阴干；
步骤2)将阴干后的丝放入预热好的溴化锂溶液中溶解，然后倒入透析袋进行透析，然后离心，除去部分杂质得到丝蛋白溶液；然后放入冰箱保存。
步骤3)将制备好的CuT分散液载入微针模具内，然后对微针模具抽滤，使得CuT达到微针模具对应的针尖部位；
步骤4)将丝蛋白溶液滴加在步骤3)所得的微针模具内并抽滤使得丝蛋白溶液达到针尖部位并进一步抽走溶剂，在一定湿度、温度下干燥，得到微针；
步骤5)将步骤4)所得的微针从微针模具上取下，放在冰箱密封保存。
根据上述的制备方法，其具体工艺参数如下：
上述步骤1)室温阴干的温度为20～25℃；
上述步骤2)中的溴化锂要在55～65℃的恒温箱中预热；且预热后每隔0.5～1h搅拌溶解的丝；1g丝用4mL的9.3M的溴化锂溶液在60摄氏度下溶解。
上述步骤2)中透析袋的分子量要在3KDa～5KDa，且每隔2～4h换一次透析的去离子水；离心次数为2～3次，离心的参数为6000～8000rpm，离心温度为4℃；
上述步骤2)中制备好的丝溶液放入4℃冰箱保存；丝溶液的质量百分比浓度为5％～6％；CuT采用溶液或分散液的形式，抽滤的过程使得溶剂抽走；
步骤3)且抽滤丝蛋白的时间为10～15min；
根据步骤3)中CuT载入针尖的量以及步骤4)中丝蛋白溶液的浓度来调整CuT的负载量。
上述步骤中4)制备好的微针要在通风橱进行干燥，且干燥温度在20～25℃，湿度为18％～25％。
本发明所得负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的应用，同时作为声敏剂和治疗浅表肿瘤的纳米药物递送剂，可用于治疗浅表性肿瘤。所述的声敏剂为超声声敏剂，在超声的条件下更加有效杀死癌症。其具有优秀的机械性能以及溶解性能，通过超声作用产生羟基自由基诱发DNA损伤和细胞焦亡，在48h的释药率可以达到65％以上，浅表肿瘤治愈率高达90％。
有益技术成果
(1)本发明成功提供一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备方法，制作方法简单，可操作性强。
(2)本发明成功提供一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备方法，可有效递送声敏剂到达皮肤深处。更有效根治肿瘤。
(3)本发明成功提供一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备方法，可以有效释放声敏剂，从而按需给药。
(4)本发明成功提供一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备方法，作用病灶部位后通过声动力治疗可在肿瘤微环境下产生羟基自由基，有效杀死癌症。
附图说明
图1为CuT的扫描电镜图。
图2为CuT的紫外分析结果图。
图3为CuT、TCPP、H2O在超声条件下产羟基自由基的ESR图谱。
图4为CuT在超声条件下降解亚甲基蓝的数据分析图。
图5为为CuT MN的光学显微镜图。
图6为CuT MN的SEM图。
图7为丝蛋白微针与CuT MN的力学性能数据图。
图8为CuT MN刺穿鼠皮的HE染色图。
图9为丝蛋白微针以及CuT MN的溶解可视图。
图10为CuT MN的体外模拟释放实验结果处理图。
图11为CuT MN溶解前后CuT在超声条件下产羟基自由基的ESR图谱。
图12为细胞MTT测定图。
图13为不同给药方式的肿瘤积聚图。
图14为不同给药方式的器官药物分布图。
图15为不同组别的抑瘤实验小鼠肿瘤变化分析图。
图16为不同组别的抑瘤实验小鼠肿瘤体重分析图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细的说明，但这些例举实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
CuT材料的合成：
将四羧酸苯基卟啉(10mg)、二水氯化铜(6.4mg)和聚乙烯吡咯烷酮(5mg)倒入100mL的圆底烧瓶中，再向其中加入15mL的N，N-二甲基甲酰胺溶液和5mL的乙醇，将圆底烧瓶置于超声清洗剂中震荡溶解后，将圆底烧瓶置于通风处内加入20μL的三氟乙酸溶液，静置反应10min后在烧瓶中放入磁子，然后在90℃水浴锅上搅拌反应3h，搅拌速度为200rpm。反应完成后离心15min得到初步产物，然后用N，N-二甲基甲酰胺溶液、乙醇和水(体积比为1:1:1)洗涤三次，即为CuT材料。
丝溶液的制备：
煮丝
将蚕茧剪成碎片，称取10g的蚕茧碎片，将4L水煮沸，加入8.48g的碳酸钠，搅拌均匀后，加入10g蚕茧碎片至煮沸的碳酸钠溶液中，煮30min，该期间水一直保持沸腾状态。煮好后，将脱胶丝取出用流水冲洗后，泡在去离子水里，重复冲洗过程，并换水2-3次(每隔1h)。将洗好的丝拧干水分，置于室温下晾干。
溶丝
155g溴化锂缓慢加入到128mL水中(边加溴化锂边搅拌)，至最终溶液体积为192mL的9.3M的溴化锂溶液，放在室温备用。(放热反应，注意高温)；1g脱胶丝用4mL的9.3M的溴化锂溶液在60℃下溶解；例如：在每次溶解前，先将20mL 9.3M的溴化锂溶液加热至60℃。将5g脱胶丝加入至60℃的20mL 9.3M的溴化锂溶液，溶解4h。每隔1h搅拌一次；一共放置4h。
透析
将溶好的丝蛋白溶液倒入3KDa的透析袋中，用夹子夹住两端并用橡皮筋固定；将装好丝的透析袋放入装有2000mL的烧杯中，并置于4℃冰箱中的涡旋器上。前6h小时每隔1、2、3h换一次水，其余时间每隔半天换一次。共透析2.5天。
去除杂质
将透析好的丝溶液倒入50mL离心管中离心，离心条件为10000rpm,4℃，20min，取上清，去杂质。重复两次。
定浓度
取三个1.5mL离心管，用分析天平测空管质量X1,用移液枪取100μL去除杂质后的丝溶液至离心管中，并称其质量X2,将离心管中的丝溶液放到烘箱里烘干，称得质量为X3。
计算丝溶液含量公式如下：含量＝(X2-X1)/(X3-X1)100％。
负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的制备:
首先，将抽水泵打开，将微针模具(10×10阵列)放置到抽水泵的载模具台上，将制备好的CuT分散溶液(溶剂为乙醇水溶液，40μg/mL)滴加到模具的针尖部位，将1mL注射器的针剪掉针尖，将针体掰弯作为药物铺平器。用铺平器铺平CuT溶液，并时刻观察药物的聚集程度，及时用铺平器铺均匀。视加药量以及药物的体积大小调整抽真空时间(此实施例CuT溶液为40μL)，CuT被抽到模具针尖部位后，大多数水分都被抽去，将400-500μL丝蛋白溶液(质量百分比浓度6％)加载到模具的patch部分，枪头抵住模具角落缓慢加入丝蛋白溶液且不要有气泡。再抽10-20min后，过夜干燥(8h以上)。即得到了负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针。
下面结合附图进行分析：
本发明成功合成了一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针。该微针可以有效递送二维声敏剂到肿瘤部位，结合声动力治疗产生羟基自由基从而杀死肿瘤，并且具有较低的细胞毒性，同时制备方法简单，可操作性强，具有一定的实际意义。
采用透射电镜对CuT进行表征，将CuT用乙醇分散后滴加到钼网上进行透射电镜拍摄，结果如图1所示，CuT呈二维片状结构，这表明其具有更大的声响应面积以及更好的耐久性和稳定性。
采用紫外分析对TCPP和CuT进行表征，用乙醇将合成CuT的原材料TCPP以及CuT配制成浓度为10μg/mL的液体进行紫外光谱测定，结果如图2所示，TCPP和CuT在420nm出有着相同的特征峰，表明Cu2+与TCPP成功配位。
采用CuT、TCPP、H2O在超声条件下产羟基自由基的ESR图谱。用乙醇将CuT、TCPP配制为浓度为100μg/mL的溶液，分别取1mL的CuT溶液、TCPP溶液、H2O加入二甲基吡啶N-氧化物(DMPO:细胞渗透性亲水自旋诱捕剂，用于超氧化物检测)，将DMPO和待测液混匀后进行超声，超声参数设置为1Mhz、5min。超声后分别测定三组液体超声的产羟基自由基的情况。结果如图3所示，ESR图谱可以明显看出CuT超声后产羟基自由基的峰比TCPP更加剧烈，峰幅比TCPP超声组高出15％。因此CuT相较于TCPP具有更好的产生羟基自由基的效果，可以更大程度诱发细胞损伤与细胞凋亡。
通过CuT在超声条件下降解亚甲基蓝的实验来测定其氧化能力。用去离子水将亚甲基蓝配制成10mg/mL的溶液，取1mL配制好的溶液装入1.5mL的离心管中，并向其中加入适量CuT使每管溶液中的CuT浓度保持一致，设置不同的超声时间后取2μL对应离心管中的溶液，利用其在610nm处的紫外吸收峰来探究亚甲基蓝降解情况。每个超声时间设置三组平行。结果图如4所示，已知MB可以被羟基自由基降解，MB+CuT+US组中MB的紫外吸收强度随着超声时间的变化明显减弱，当单独CuT处理或单独US处理时，MB的吸光度均无明显变化。因此，CuT可以通过Cu2+介导有效产生羟基自由基从而降解亚甲基蓝。
采用光学显微镜以及扫描电镜对CuT MN进行表征，本研究制备的微针参数为10×10阵列，针尖高度为1200μm、针与针的距离为1000μm。结果如图5、图6所示，CuT MN由针尖和衬底部分构成，由于CuT的存在，CuT MN的贴片尖端为紫红色，CuT均匀负载在丝蛋白微针的针尖上，这表明微针给药时，药物能够最先接触到病灶部位发挥疗效。
通过断裂力实验检测微针的刺穿性能，将微针剪成5×5阵列进行力学性能测定，结果如图7所示，MN(纯丝蛋白针)、CuT MN(本发明负载CuT的丝蛋白针)在针体300μm处(从针尖到衬底方向)的断裂力分别为0.40、0.46N/针，均大于报道的最小插入力(0.1N)，此外，通过刺穿后皮肤的HE染色情况(结果如图8所示)，CuT MN的刺穿深度可达到300um(表皮厚度平均在200um)，这表明丝蛋白微针能够有效刺穿表皮层且载入CuT明显增加了微针的机械性能，因此CuT MN能够更好的穿透皮肤实现药物更精准有效的递送。
通过丝蛋白微针和CuT MN的溶解光学显微镜图检测其溶解情况。将微针分别刺入小鼠背部皮肤不同时间来观察微针溶解情况，结果如图9所示，纯丝蛋白微针针尖在1min后溶解完全，CuT MN针尖在5min后溶解完全，该结果表明丝蛋白微针具有较好的溶解性能，能够将药物有效释放，且载入CuT后微针具有缓释功能，能够起到更好的药物保留作用。
通过体外模拟实验探究微针的药物释放性能，将CuT MN(1个10×10阵列的微针)放入装有2mL Hepes缓冲液的离心管中，利用微量法测定溶液中不同时间CuT的紫外吸收强度，再通过紫外/浓度标准曲线实时定量并计算的释放率。每个时间点设置三组平行。结果如图10所示，在Hepes缓冲液(模拟体液)的条件下，CuT MN随着时间变化而溶解，且在48h后释药率可以达到65％以上，表明CuT MN具有很好的药物释放的性能。
通过对CuT MN溶解前后CuT产羟基自由基的性能测定CuT载入微针后对CuT的性能影响，将CuT MN用Hepes缓冲液(模拟体液)溶解完全，通过溶解液的紫外吸收定量CuT的浓度，接着配制一组与其浓度相同的CuT溶液。将两组溶液加入DMPO后超声进行ESR测定。结果如图11所示，CuT MN溶解后的CuT性能变化到了之前的85％左右，这表明该纳米药物递送体系对CuT的性能几乎没有影响。
测定CuT MN在超声前后的细胞活性(可通过MTT测定)，将培养在12孔板的鼠系乳腺癌细胞加入不同浓度的CuT MN，待其溶解完全后一组进行MTT实验，另一组进行超声操作，超声参数为0.1Mhz、1min。超声后进行MTT实验。每组实验设置三组平行。结果如图12所示，未超声组的细胞随着加药浓度的增加，细胞活性几乎未受到影响，表明药物本身的细胞毒性较低(或在未加超声的情况下不具备癌症细胞杀伤性)；而超声组随着加药浓度的增加，在药物浓度达到30μg/mL时，细胞活性明显降低，表明药物在超声作用下产生了对癌细胞杀伤的能力。
通过活体成像探究不同的给药方式药物的肿瘤积聚效果。给药方式分别为微针给药(CuT MN)、瘤内注射(i.t.)以及静脉注射组(i.v.)，经细胞实验结果表明30μg/mL CuT经超声后就已经具备很好的杀伤性能，经预实验结果确定肿瘤积聚实验的CuT浓度为40μg/mL，将Balb/c小鼠腿上侧背部建立浅表乳腺癌肿瘤模型，将CuT用Cy5.5标记，通过不同方式给药后在不同时间利用三维小动物成像系统测定此时CuT-Cy5.5的信号。每组实验设置三组平行。结果如图13所示，微针给药、瘤内注射以及静脉注射组的荧光信号均随着时间变化而减弱，其中，微针组的肿瘤积聚效果最持久，信号最强。表明在给药量相同的情况下，且CuT MN的治疗效果更好，具有一定的参考意义。
通过活体成像探究不同给药方式对器官的毒性。将图13的小鼠成像48后进行解剖，取下心肝脾肺肾以及肿瘤部位，利用三维小动物成像系统测定此时CuT-Cy5.5的信号。每组实验设置三组平行。结果如图14所示，CuT MN组的肿瘤积聚效果最好，器官毒性最低，其他给药方式对肿瘤没有明显的积聚效果。
通过浅表肿瘤模型探究CuT MN的治疗效果。该浅表肿瘤模型所用细胞为鼠系乳腺癌细胞。分别设置空白对照组、空白对照超声组、瘤内注射组、CuT微针组、瘤内注射超声组以及CuT微针超声组(CuT MN+US)。模型建立好后根据不同组别给药方式给药，CuT浓度为40μg/mL，给药频率为2天一次，超声参数为0.1Mhz、1min。结果如图15、16所示，CuT MN+US组的肿瘤尺寸最小、肿瘤重量最轻，表明该组抑瘤效果最好，CuT MN+US组成功触发细胞焦亡从而抑制肿瘤增殖。
以上对本发明进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想，在不脱离本发明原理的情况下，还可对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针，其特征在于，在丝蛋白微针的针尖端部负载有铜配位卟啉金属有机框架材料CuT。
2.按照权利要求1所述的一种负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针，其特征在于，所述的铜配位卟啉金属有机框架材料CuT是掺杂包覆在丝蛋白微针的针尖中。
3.制备权利要求1或2所述的负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)将蚕茧剪开，取出蚕蛹，将剪开的蚕茧放入煮沸的碳酸钠溶液中，并将丝抻开，将煮好的丝放在室温下阴干；
步骤2)将阴干后的丝放入预热好的溴化锂溶液中溶解，然后倒入透析袋进行透析，然后离心，除去部分杂质得到丝蛋白溶液；然后放入冰箱保存。
步骤3)将制备好的CuT分散液载入微针模具内，然后对微针模具抽滤，使得CuT达到微针模具对应的针尖部位；
步骤4)将丝蛋白溶液滴加在步骤3)所得的微针模具内并抽滤使得丝蛋白溶液达到针尖部位并进一步抽走溶剂，在一定湿度、温度下干燥，得到微针；步骤5)将步骤4)所得的微针从微针模具上取下，放在冰箱密封保存。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，上述步骤1)室温阴干的温度为20～25℃。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，上述步骤2)中的溴化锂要在55～65℃的恒温箱中预热；且预热后每隔0.5～1h搅拌溶解的丝；1g丝用4mL的9.3M的溴化锂溶液在60摄氏度下溶解。
上述步骤2)中透析袋的分子量要在3KDa～5KDa，且每隔2～4h换一次透析的去离子水；离心次数为2～3次，离心的参数为6000～8000rpm，离心温度为4℃；
上述步骤2)中制备好的丝溶液放入4℃冰箱保存；丝溶液的质量百分比浓度为5％～6％；CuT采用溶液或分散液的形式，抽滤的过程使得溶剂抽走。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)且抽滤丝蛋白的时间为10～15min。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，根据步骤3)中CuT载入针尖的量以及步骤4)中丝蛋白溶液的浓度来调整CuT的负载量。
8.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，上述步骤中4)制备好的微针要在通风橱进行干燥，且干燥温度在20～25℃，湿度为18％～25％。
9.权利要求1或2所述的负载铜配位卟啉金属有机框架的丝蛋白微针的应用，同时作为声敏剂和治疗浅表肿瘤的纳米药物递送剂。
10.按照权利要求9所述的应用，所述的声敏剂为超声声敏剂，在超声的条件下更加有效杀死癌症。
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