ES2856406T3 - Polímero de carbonato con un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral y su aplicación - Google Patents

Polímero de carbonato con un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral y su aplicación Download PDF

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Abstract

Un polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral, que se prepara a partir de una unidad monomérica de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional disulfuro de cinco miembros, caracterizado porque la estructura química de dicho polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral es una de las siguientes fórmulas: **(Ver fórmula)** (i) en donde m=113,6 y n=14,6; **(Ver fórmula)** (ii) en donde m=113,6, x=34,2, y=13,0 y n=47,2; o m=113,6, x=122,8, y=19,8 y n=142; o m=43,2; x=33,3, y=20,3 y n=53,6; (iii) en donde x=4,2, y=80,7 y n=84,9; **(Ver fórmula)** (iv) en donde m=113,6, x=16,7, y=10,2 y n=26,9; **(Ver fórmula)** (v) en donde m=113,6, x=25,5, y=186,3 y n=211,8; o m=136,4, x=24,8, y=188,4 y n=213,2; o m=136,4, x=24,0, y=178,8 y n=202,8; **(Ver fórmula)** (vi) en donde m=113,6, x=122,2, y=8,9 y n=131,1; **(Ver fórmula)** (vii) en donde m=11,4, x=6,3, y=43,9, n=51,2.

Description

DESCRIPCIÓN
Polímero de carbonato con un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral y su aplicación. Campo técnico
La invención se refiere a un material polimérico biodegradable y a su aplicación, en particular a un polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral y a su aplicación, perteneciente al campo de material médico.
Técnica anterior
Los polímeros biodegradables tienen propiedades muy únicas, como su biocompatibilidad y capacidad de degradación en el cuerpo generalmente buenas, los productos de degradación pueden ser absorbidos por el cuerpo o excretados por la vía fisiológica normal del cuerpo, y se utilizan ampliamente en varios campos médicos, como suturas quirúrgicas, dispositivos de fijación ósea, materiales de andamiaje para bioingeniería de tejidos y vehículos de liberación controlada de fármacos. Entre ellos, los polímeros biodegradables sintéticos son de particular interés, debido a su baja inmunogenicidad, sus propiedades tales como propiedades de degradación y mecánicas, y similares, se pueden controlar fácilmente. Los polímeros biodegradables sintéticos son principalmente poliéster alifático, policarbonato, poliaminoácido, polifosfato, polianhídrido, poliortoéster, etc. Entre ellos, los policarbonatos tales como carbonato cíclico politrimetileno (PTMC), poliéster alifático tal como poliglicólido (PGA), poliláctido (PLA), copolímero de lácticoglicólido (PLGA), policaprolactona (PCL), etc. son los polímeros biodegradables más comúnmente utilizados, y cuentan con la autorización de la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (US Food and Drug Administration o FDA). Los documentos CN102090392 y CN101239966 describen polímeros biodegradables que se pueden utilizar como materiales de biomedicina.
Problema técnico
No obstante, los polímeros biodegradables existentes tales como PTMC, PCL, PLA y PLGA, tienen estructura simple, carecen de grupos funcionales utilizados para modificación y por lo general es difícil proporcionar un ciclo estable de los nano-vehículos o un recubrimiento de modificación de superficie estable.
Los productos de degradación de policarbonato son principalmente dióxido de carbono y glicol neutro, no producen productos de degradación ácidos. El monómero de carbonato cíclico funcional se puede copolimerizar con muchos monómeros de éster cíclico tales como GA, LA y s-CL, y otros monómeros de carbonato cíclico para obtener polímeros biodegradables con distintas propiedades.
Además, en la técnica anterior, en el proceso de polimerización de apertura de anillos, los grupos reactivos en la estructura del monómero de carbonato cíclico reaccionan fácilmente, y por lo tanto, la preparación del polímero funcional del monómero de carbonato cíclico y la etapa de desprotección, resultan en un procedimiento de preparación engorroso.
Medios para resolver el problema
Soluciones técnicas
El objeto de la invención es proporcionar una clase de polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral.
Con el fin de lograr el objeto antes mencionado, una solución técnica específica de la presente invención es la siguiente: Un polímero que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral, cuya estructura química es una de las fórmulas que se definen en la reivindicación 1.
En particular, la estructura química de dicho polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral es una de las siguientes fórmulas:
(i)
Figure imgf000002_0001
en donde m=113,6 y n=14,6;
(ii)
Figure imgf000003_0001
en donde m=113,6, x=34,2, y=13,0 y n=47,2, o m=113,6, x=122,8, y=19,8 y n=142; o m=43,2, x=33,3, y=20,3 y n=53,6; (iii)
Figure imgf000003_0002
en donde x=4,2, y=80,7 y n=84,9;
(iv)
Figure imgf000003_0003
en donde m=113,6, x=16,7, y=10,2 y n=26,9;
(v)
Figure imgf000003_0004
en donde m=113,6, x=25,5, y=186,3 y n=211,8; o m=136,4, x=24,8, y=188,4 y n=213,2; o m=136,4, x=24,0, y=178,8 and n=202.8;
(vi)
Figure imgf000003_0005
en donde m=113,6, x=122,2, y=8,9 y n=131,1;
(vii)
Figure imgf000003_0006
en donde m=11,4, x=6,3, y=43,9, n-51,2.
Dicho polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral se puede preparar en presencia de un iniciador en el disolvente, a partir del monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros a través de una polimerización de la abertura del anillo, o por polimerización de la abertura del anillo entre el monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros y otro monómero de carbonato cíclico/monómero de éster cíclico, en donde dichos otros monómeros de carbonato cíclico incluyen carbonato cíclico de trimetileno (TMC), en donde dichos monómeros de éster cíclicos incluyen caprolactona (s-CL) y láctico (LA) o glicólido (GA).
La estructura química del monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros es la siguiente:
Figure imgf000004_0001
Se puede preparar mediante las siguientes etapas:
(1) Se disolvió monohidrato de hidrosulfuro sódico (NaSH-H2Ü) en N,N-dimetilformamida (DMF) y se añadió lentamente dibromo-ne neopentil glicol gota a gota con un embudo de adición a presión constante. La reacción se llevó a cabo a 50°C durante 48 horas, cuando la reacción se completó, los reaccionantes se evaporaron a presión reducida para eliminar DMF del disolvente, y luego se diluyó con agua destilada, se extrajo cuatro veces con acetato de etilo y finalmente la fase orgánica se evaporó por rotación para dar un compuesto viscoso amarillo A.
La estructura química del compuesto A es la siguiente:
Figure imgf000004_0002
(2) El compuesto A se conserva en disolución de tetrahidrofurano, se oxida en aire durante 24 horas para dar el compuesto B, en donde la estructura química del compuesto B es la siguiente:
Figure imgf000004_0003
(3) En atmósfera de nitrógeno, el compuesto B y cloroformiato de etilo se disolvieron en tetrahidrofurano seco. Se añadió gota a gota y lentamente trietilamina con un embudo de adición a presión constante y se sometió a reacción en un baño de agua con hielo durante 4 horas. Cuando la reacción se completó, la mezcla de reacción se filtró y la mezcla del filtrado se concentró por evaporación rotatoria y recristalizó a partir de éter dietílico por 3-5 veces para dar un cristal amarillo, que es el monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros.
El monómero de carbonato cíclico antes mencionado se puede polimerizar en la forma de polietilenglicol como el iniciador y zinc bis [bis(trimetilsilil)amida] como el catalizador para formar el polímero de bloques. La fórmula de reacción es la siguiente:
Figure imgf000004_0004
El polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral anteriormente descrita posee biodegradabilidad, se puede preparar en nanopartículas (tamaño de partícula 20-250 nm), que se puede cargar con fármacos antineoplásicos; las nanopartículas poliméricas se pueden catalizar con agente reductor en cantidad catalítica tal como ditiotreitol o glutatión para formar una reticulación química estable, larga circulación en el cuerpo; pero al ingresar en la célula en el entorno en presencia de un gran número de sustancias reductoras, las nanopartículas poliméricas liberarán rápidamente la reticulación, para liberar fármacos y destruir de manera eficiente las células cancerosas. El polímero obtenido en la presente invención, que se prepara por primera vez, tiene buena biocompatibilidad, cuando se usa como vehículo de fármaco puede aumentar el tiempo de circulación del fármaco antitumoral en el cuerpo, aumentar la tasa de enriquecimiento del fármaco en el sitio del tumor y evitar el daño al tejido normal provocado por el medicamento, y puede destruir eficazmente las células tumorales con pocos efectos sobre las células normales.
La presente invención proporciona por lo tanto un uso del polímero biodegradable anteriormente descrito, que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral, en la preparación de un vehículo de liberación controlada de fármacos.
Al mismo tiempo, el polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral se reticula químicamente para obtener un nanovehículo reticulado, y la superficie del nanovehículo reticulado se puede acoplar con las moléculas diana específicas de las células tumorales tales como polipéptidos RGD, aptámeros, anticuerpos, ácido fólico o lactosa, etc., para aumentar en gran medida la absorción de los nanofármacos en las células cancerosas.
El polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral descrito anteriormente posee biodegradabilidad, y se puede usar para preparar andamios de tejidos biológicos, reduciendo las sustancias en las que se usan los polímeros en cantidades catalíticas, por ejemplo en el entorno con presencia de ditiotreitol o glutatión, puede promover el polímero después de la reticulación reversible para preparar fibras por electrohilado, en donde dichas fibras, cuando se modifican, poseen buena adhesión a las células, a través de la reticulación se puede potenciar en gran medida la estabilidad de la fibra, de manera de que sea más estable en el sitio de tejido y evite la inestabilidad y la fácil disociación del andamio. La presente invención proporciona entonces un uso del polímero biodegradable anteriormente descrito, que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral, en la preparación de material de andamiaje para ingeniería de tejidos biológicos.
La presente invención también reivindica la solicitud del polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral en la preparación de un recubrimiento de biochip. Los polímeros biodegradables anteriormente mencionados que contienen un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral utilizados como recubrimiento de biochip son similares al andamio de tejido biológico, cuando se catalizan con una cantidad catalítica de un agente reductor tal como ditiotreitol o glutatión, los polímeros pueden formar reticulación química estable para potenciar el recubrimiento de biochip en el cuerpo para ser más estable, reducir la adsorción no específica y reducir el ruido en la determinación del contenido de componente biológico.
Efectos de la invención
Efectos beneficiosos
Como resultado del esquema anteriormente mencionado, la invención presenta las siguientes ventajas en comparación con la técnica anterior:
1. La invención utiliza el monómero de carbonato cíclico que contiene el grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros por primera vez para obtener el polímero biodegradable en el que el peso molecular es controlado, la distribución de peso molecular se reduce mediante la actividad de homopolimerización o copolimerización de la abertura del anillo controlable con otros monómeros de carbonato y monómeros de éster cíclico. Dado que el grupo de anillo azufre-azufre de cinco miembros no afecta la polimerización de la abertura del anillo del monómero de carbonato cíclico, el proceso de polimerización no requiere los procedimientos de protección y desprotección de la técnica anterior y simplifica los pasos de la operación.
2. El polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral posee excelente biodegradabilidad, se puede usar para controlar sistemas de liberación de fármacos y para preparar vehículos de nanofármacos dirigidos al tumor que es sensible a reducción y reticulación reversible, puede tolerar larga circulación en el cuerpo, en alta concentración de células cancerosas puede liberar rápidamente la reticulación en las células cancerosas para liberar fármacos y destruir las células cancerosas con gran eficiencia y especificidad.
3. El monómero de carbonato cíclico descrito en este documento se puede preparar fácilmente, y conveniente comprende la polimerización de la abertura del anillo para obtener un polímero biodegradable que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral; el polímero se puede utilizar además para autoensamblaje en los sistemas de liberación controlada de fármacos, ingeniería de tejidos y recubrimiento de biochips, y tiene buen valor de aplicación en los materiales biológicos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un espectro de RMN de hidrógeno del polímero PEG5k-P (CDC2.5k-co-CL3.9k) en el Ejemplo 2;
La Fig. 2 es un espectro de RMN del polímero P(CDC-co-CL)(6.21 k)-PEG(0.5k)-P(CDC-co-CL)(6.21 k) en el Ejemplo 15; La Fig. 3 es un diagrama de la distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas de micelas poliméricas PEG5k-b-PCDC2.8k en el Ejemplo 16;
La Fig. 4 es un gráfico que muestra el cambio en el diámetro de partícula de las nanopartículas de micelas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k a alta dilución en el Ejemplo 17;
La Fig. 5 es un gráfico que muestra el cambio en el diámetro de partícula de las nanopartículas de micelas reticulada PEG5k-¿>-PCDC2.8k en presencia de la sustancia reductora glutatión en el Ejemplo 17;
La Fig. 6 es un gráfico que muestra la toxicidad de las nanopartículas de micelas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k para células Raw264.7 y MCF-7 en el Ejemplo 17;
La Fig. 7 es un gráfico que muestra los resultados de la liberación in vitro de DOX cargada con nanopartículas de micelas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k en Ejemplo 18;
La Fig. 8 es un gráfico que muestra la toxicidad de DOX cargada con nanopartículas de micelas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k para células Raw264.7 y MCF-7 en el Ejemplo 18;
La Fig. 9 es un gráfico que muestra la distribución del tamaño de partícula y un microscopio de proyección de electrones de la nanopartícula de vesículas de polímero reticulado PEG5k-P (CDC4.9k-co-TMC19k) en el Ejemplo 19; La Fig. 10 es un gráfico que muestra la toxicidad de las nanopartículas de vesículas reticuladas dirigidas cRGD-PEG6k-P (CDC4.6k-co-TMC18.6k) / PEG5k-P (CDC4.9k-co-TMC19k) para células U87MG en el Ejemplo 19;
La Fig. 11 es un gráfico que muestra la toxicidad de DOX cargada con nanopartículas de vesículas reticuladas dirigidas para células U87MG en el Ejemplo 19;
La Fig. 12 es un gráfico que muestra la circulación sanguínea en ratones de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k en el Ejemplo 20;
La Fig. 13 es un gráfico que muestra los resultados de la biodistribución de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k en ratones con melanoma en el Ejemplo 21;
La Fig. 14 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-¿>-PCDC2.8k en ratones con melanoma en el Ejemplo 22;
La Fig. 15 es un diagrama de circulación sanguínea en un ratón de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas en el Ejemplo 23;
La Figura 16 es el perfil de biodistribución de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas en ratones con glioma maligno de cerebro humano en el Ejemplo 24;
La Fig. 17 es un gráfico que muestra el efecto terapéutico de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas a ratones con glioma maligno de cerebro humano en el Ejemplo 25;
La Fig. 18 es un gráfico que muestra el efecto terapéutico de DOX cargada con vesículas dirigidas en ratones con melanoma en el Ejemplo 26;
La Fig. 19 es un gráfico que muestra la biodistribución de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas en ratones con cáncer de pulmón en el Ejemplo 27;
La Fig. 20 es una imagen TEM de varillas de nano-oro modificadas en la superficie de PEG5k-PLGA7.8k-PCDC1.7k en el Ejemplo 28;
La Fig.21 es una fotografía del polímero PCL y P (CDC0.8k-co-CL92k) cuando se le da forma de película y se sumerge durante dos semanas en disolución salina fisiológica en el Ejemplo 30.
Descripción detallada de las realizaciones
La presente invención se describirá en detalle a continuación con referencia a los siguientes Ejemplos y figuras: Ejemplo 1 Síntesis del monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros (CDC)
Figure imgf000007_0001
1. Se disolvió monohidrato de hidrosulfuro de sodio (28,25 g, 381,7 mmol) en 400 ml de N,N-Dimetilformamida (DMF), luego se calentó a 50^ hasta disolución completa; se añadió gota a gota dibromo-ne neopentil glicol (20 g, 76,4 mmol), luego la reacción procedió durante 48 h. El disolvente de DMF se eliminó por destilación a presión reducida de los reaccionantes, luego se diluyó con 200 ml de agua destilada y se extrajo cuatro veces con 250 ml de acetato de etilo, y finalmente la fase orgánica se evaporó rotando para dar el compuesto A amarillo viscoso, rendimiento: 70%;
2. El compuesto A se disolvió en 400 ml de disolución de tetrahidrofurano, se oxidó en el aire durante 24 h, cuando el sulfhidrilo entre las moléculas se oxidó a enlace disulfuro para dar el compuesto B, rendimiento: >98%;
3. Bajo atmósfera de nitrógeno, el compuesto B (11,7 g, 70,5 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (150 ml) seco, se agitó hasta disolver por completo. Luego a 0^, se añadió cloroformiato de etilo (15,65 ml, 119,8 mmol), luego se añadió gota a gota EfeN (22,83 ml, 120,0 mmol). Al completar la adición, la reacción procedió en un baño de hielo seco durante 4 h. Cuando la reacción se había completado, la mezcla de reacción se filtró para eliminar el Et3N-HCl y la mezcla del filtrado se concentró por evaporación rotatoria y recristalizó a partir de éter dietílico varias veces para dar un cristal amarillo que es un monómero de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros (CDC), rendimiento: 64%.
Ejemplo 2 Síntesis de copolímero de bloques doble PEG5k-b-PCDC2.8k que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadieron, 0,3 g (1,56 mmol) de monómero CDC, 2 ml de diclorometano en un reactor sellado, luego se añadieron 0,5 g (0,1 mmol) de polietilenglicol cuyo peso molecular es 5000 y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, luego el reactor se selló y quitó de la caja de guantes, y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción se precipitó en éter dietílico frío y se filtró y secó al vacío para dar el producto PEG5k-b-PCDC2.8k.
11H NMR (400 MHz, CDCta): 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH3), 4,05 (s, -CH2OCOCHCH2-), 4,07 (s, -OCH2CCH2O-), 4,31 (m, -CCH2).
Figure imgf000007_0002
en la fórmula, m=113,6, n=14,6.
Ejemplo 3 Síntesis de copolímero de bloques doble PEG5k-P(CDC2.5k-co-CL3.9k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,28 g (1,46 mmol) de monómero CDC y 0,4 g (3,51 mmol) de caprolactona (s-CL) en 3 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, luego se añadieron 0,5 g (0,1 mmol) de polietilenglicol cuyo peso molecular es 5000 y 0,1 mol/l de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, después se selló el reactor, se retiró de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla precipitó en éter etílico frío, se filtró y secó al vacío para dar el producto PEG5k-P(CDC2.5k-co-CL3.9k). Peso molecular de GPC:14,0 kDa, distribución de peso molecular: 1,56.
Figure imgf000007_0003
en la fórmula, m=113,6, x=34,2, y=13,0,n=47,2.
La Fig. 1 es un espectro de RMN de dicho polímero. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): 1,40 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-),1,65(m,-COCH2CH2CH2CH2CH2-), 2,30(t,-COCH2CH2C H2CH2CH2-), 3,08(s,-CCH2), 3,30(m,-OCH3), 4,03(t, -COCH2CH2CH2CH2CH2O-), 4,05 (s, -CH2OCOCHCH2-), 4,07 (s, -OCH2CCH2O-), 4,31 (m,-CCH2).
Ejemplo 4 Síntesis del copolímero de bloques doble PEG5k-P(CDC3.8k-co-CL14k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,5 g (2,6 mmol) de monómero CDC y 1,5 g (13,2 mmol) de caprolactona (s-CL) en 10 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, luego se añadieron 0,5 g (0,1 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 5000, y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, después el reactor se selló, se quitó del a caja de guantes y se dispuso en un baño de aceite a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción se cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y secó al vacío para dar el producto PEG5k-P(CDC3.8k-co-CL14k). Peso molecular de GPC: 30,6 kDa, distribución de peso molecular: 1,34.
Figure imgf000008_0001
en la fórmula, m=113,6, x=122,8, y=19,8,n=142.
Ejemplo 5 Síntesis del copolímero de bloques doble PEG1.9k-P(CDC3.9k-co-CL3.8k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,4 g (2,1 mmol) de monómero de CDC y 0,4 g (3,51 mmol) de caprolactona (s-CL) en 3 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor de sellado, luego se añadieron 0,4 g (0,21 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 1900, y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, después se selló el reactor, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de aceite a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción se cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto PEG1.9k-P(CDC3.9k-co-CL3.8k). Peso molecular de GPC:0,96 kDa, distribución de peso molecular: 1,35.
Figure imgf000008_0002
en la fórmula, m=43,2, x=33,3, y=20,3,n=53,6.
Ejemplo 6 Síntesis del homopolímero Alk-PCDC2.8k que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,3 g (1,6 mmol) de monómero CDC en 1 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 1 mmol/l de disolución de alcohol propargílico refinado y 1 ml de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, después el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el productoAlk-PCDC2.8k.
Ejemplo 7 Síntesis de polímero de carbonato iPr-P(CDC0.8k-co-CL92k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,1 g (0,52 mmol) de monómero CDC y 10 g (87,7 mmol) de s-CL caprolactona (CL) en 10 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 6 mg (0,1 mmol) de alcohol isopropílico y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 2 días, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto iPr-P(CDC -co-CL)(0,8k-92k). Peso molecular de GPC: 102,3 kDa, distribución de peso molecular: 1,36.
Figure imgf000009_0001
en la fórmula, x=4,2, y=80,7,n=84,9.
Ejemplo 8 Síntesis del copolímero de bloques triple PEG5k-PCDC1.0k-PCL3.2k que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,12 g (1,5 mmol) de monómero CDC en 2 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 0,5 g (0,31 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 5000, y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, después el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego, bajo atmósfera de nitrógeno, se añadieron 0,35 g (0,31 mmol) de caprolactona (s-CL) en la caja de guantes, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto de copolímero de bloques triple PEG5k-PCDC1.0k-PCL3.2k. Peso molecular de GPC: 10,4 kDa, distribución de peso molecular: 1,45.
1H NMR (400 MHz, CDCta): 1,40 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 1,65 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 2,30 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH3), 4,03 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2O-), 4,05 (s, -CH2OCOCHCH2-), 4,07(s, -OCH2CCH2O-), 4,31 (m, -CCH2).
Ejemplo 9 Síntesis del copolímero de bloques doble PEG5k-P(CDC3.2k-co-TMBPEC3.5k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,4 g (2,1 mmol) de monómero CDC y 0,4 g (1,2 mmol) de 2,4,6-trimetoxi bencilidenopentaeritritol carbonato (TMBPEC) en 5 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 0,5 g (0,1 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 5000, y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto PEG5k-P(CDC3.2k-co-TMBPEC3.5k). Peso molecular de GPC:12,4 kDa, distribución de peso molecular: 1,47.
Figure imgf000009_0002
en la fórmula, m=113,6, x=16,7, y=10,2, n=26,9.
Ejemplo 10 Síntesis del copolímero de bloques triple PEG1.9k-PCL1.8k-PCDC0.7k que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,2 g (1,76 mmol) de caprolactona (s-CL) en 2 ml de diclorometano, se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 0,19 g (0,1 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 1900, y 1 ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego, bajo atmósfera de nitrógeno, se añadieron 80 mg (0,42 mmol) de monómero de CDC a la caja de guantes, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto de copolímero de bloques triple PEG1.9k-PCL1.8k-PCDC0.7k. Peso molecular de GPC: 0,64 kDa, distribución de peso molecular: 1,32.
1H NMR (400 MHz, CDCh): 1,40 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 1,65 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 2,30 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH3), 4,03 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2O-), 4,05 (s, -CH2OCOCHCH2-), 4,07 (s, -OCH2CCH2O-), 4,31 (m, -CCH2).
Ejemplo 11 Síntesis del copolímero de bloques doble PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) que contiene anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,1 g (0,52 mmol) de monómero CDC y 0,4 g (3,85 mmol) de carbonato cíclico de trimetileno (TMC) en 3 ml de diclorometano, se añadieron a un reactor sellado, luego se añadieron 0,1 g (0,02 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 5000, y 0,1 mol/l de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, luego el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40°C, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19.0k). Peso molecular de GPC: 34,5 kDa, distribución de peso molecular: 1,48.
1H NMR (400 MHz, CDCh): 2,08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH),3,65(t, -OCH2 CH2O-),4,28 (t, -COCH2CH2CH2O-), 4,31 (m, -CCH2).
Figure imgf000010_0001
en la fórmula, m=113,6, x=25,5, y=186,3, n=211,8.
Ejemplo 12 Síntesis del copolímero dirigido de bloques doble iRGD-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) con el polipéptido iRGD que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
El polímero iRGD-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) se sintetizó a través de dos etapas, la síntesis de polímero funcionalizado por maleimida Mal-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) como la primera etapa, que es la misma que en el ejemplo 11, excepto que el mPEG de peso molecular 5000 se reemplazó con Mal-PEG de peso molecular 6000Da, como el iniciador de la polimerización. 1H NMR (400 MHz, CDCh): 2,08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH3),3,65 (t,-OCH2 CH2O-), 4,28 (t, -COCH2CH2CH2O-), 4,31 (m, -CCH2), 6,70 (s, Mal). Peso molecular de GPC: 38,6 kDa, distribución de peso molecular: 1,42.
Figure imgf000010_0002
en la fórmula, m=136,4, x=24,8, y=188,4, n=213,2.
Reacción de adición Michael entre el polipéptido iRGD y el polímero como anteriormente, como la segunda etapa. Se disolvió el polímero Mal-PEG6k-P (CDC4.8k-co-TMC19.2k) en DMF, luego se convirtió a las nanopartículas con la adición gota a gota de disolución tampón PB, después se quitó el disolvente orgánico por diálisis, luego se añadieron dos veces el peso molar de iRGD, la reacción procedió a 30^ durante 2 días, después el iRGD libre, que no se había unido, se eliminó por diálisis, se liofilizó para dar el producto final iRGD-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k). La relación de injerto de iRGD fue 92%, por el análisis magnético nuclear y el kit de proteína BCA.
Ejemplo 13 Síntesis del copolímero dirigido de bloques doble cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k) con el polipéptido cRGD que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Hubo dos etapas para la síntesis del polímero cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k), que fue similar al del ejemplo 12, la síntesis de polímero funcionalizado por N-hidroxisuccinimida NHS-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k) como la primera etapa, que fue igual al ejemplo 11, excepto que el mPEG, cuyo peso es 5000Da, se reemplazó por NHS-PEG, cuyo peso molecular es 6000Da, como el iniciador de la polimerización. 1H NMR (400 MHz, CDCh): 2,08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m,-OCH3), 3,65 (t, -OCH2 CH2O-), 4,28 (t, -COCH2CH2CH2O-), 4,31 (m, -CCH2), 2,3 (s, NHS). Peso molecular de GPC: 37,6 kDa, distribución de peso molecular: 1,38.
Figure imgf000010_0003
en la fórmula, m=136,4, x=24,0, y=178,8, n=202,8.
Reacción de amida para unión del polipéptido cRGD y el polímero anteriormente mencionado como la segunda etapa. El polímero antes mencionado se disolvió en DMF, luego se añadieron dos veces el peso molar de cRGD, la reacción procedió a 30^ durante 2 días, luego el cRGD libre, que no se había unido, se eliminó por diálisis, se liofilizó para dar el producto final cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k). La relación de injerto de cRGD fue 88%, por análisis magnético nuclear y kit de proteínas BCA.
Ejemplo 14 Síntesis del copolímero de bloques triple PEG5k-PLA7.8k-PCDC1.7k que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 0,45 g (3,13 mmol) de láctido (LA) en 3 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 0,25 g (0,05 mmol) de polietilenglicol, cuyo peso molecular es 5000, y 1ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l en diclorometano como el catalizador, luego el reactor se selló, se quitó de la caja de guantes y se dispuso en un baño de hielo a 40^, la reacción procedió durante 1 día, luego, en atmósfera de nitrógeno, se añadieron 100 mg (0,52 mmol) de monómero CDC en la caja de guantes, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto de copolímero de bloques triple PEG5k-PLA7.8k-PCDC1.7k. Peso molecular de GPC: 16,8 kDa, distribución de peso molecular: 1,47.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1,59 (m, -COCH(CHs)O-), 3,08 (s, -CCH2), 3,30 (m, -OCH3), 3,65 (m, -OCH2CH2O-), 4,07 (s, -OCH2CCH2O-), 5,07 (m, -COCH(CH3).
Figure imgf000011_0001
en la fórmula, m=113,6, x=122,2, y=8,9, n=131,1.
Ejemplo 15 Síntesis del copolímero de bloques triple P(CDC-co-CL)(6.21 k)-PEG(0.5k)-P(CDC-co-CL)(6.21 k) que contiene un anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral
Bajo una atmósfera de nitrógeno, se disolvieron 1,5 g (13,2 mmol) de s-CL y 0,0625 g (0,325 mmol) de CDC en 8 ml de diclorometano, luego se añadieron a un reactor sellado, después se añadieron 0,05 g (0,01 mmol) de PEG500 y 1ml de disolución de zinc bis[bis(trimetilsilil)amida] (0,1 mol/l) en diclorometano como el catalizador, la reacción procedió durante 1 día, luego la reacción cesó por adición de ácido acético glaciar, la mezcla de reacción precipitó en éter etílico frío, se filtró y se secó al vacío para dar el producto copolímero de bloques triple P(CDC-co-CL)(6.21k)-PEG(0.5k)-P(CDC-co-CL)(6.21 k). Peso molecular de GPC:14,6 kDa, distribución de peso molecular: 1,38.
La Fig. 2 es un espectro de RMN de dicho polímero: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1,40 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 1,65 (m, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 2,30 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2-), 3,08 (s, -CCH2), 4,03 (t, -COCH2CH2CH2CH2CH2O-), 4,05 (s, -CH2OCOCHCH2-), 4,07 (s, -OCH2CCH2O-), 4,31 (m, -CCH2).
Figure imgf000011_0002
en la fórmula, m=11,4, x=6,3, y=43,9, n=51,2.
Se supo, a partir de los resultados anteriormente expuestos, que la homopolimerización o copolimerización de la abertura del anillo de CDC fue controlable, y los pesos moleculares correctos según lo esperado, y la distribución de peso molecular del polímero se redujo, por la caracterización de los polímeros.
Ejemplo 16 Preparación de las nanopartículas de micelas poliméricas PEG5k-b-PCDC2.8k
Se empleó diálisis para la preparación de las nanopartículas de micelas poliméricas. Se añadieron gota a gota 200 pl de disolución en DMF de PEG5k-b-PCDC2.8k (2 mg/ml) a 800 pl de tampón de fosfato (10 mM, pH 7,4, PB), luego la disolución obtenida se dispuso en una bolsa de diálisis (MWCO 3500 Da), se dializó contra PB (10 mM, pH 7,4) durante una noche, y se cambió el agua cinco veces. El tamaño de las nanopartículas de micelas obtenidas fue 173 nm por analizador de tamaño de partículas de dispersión de luz dinámica (DLS), y la distribución del tamaño de partícula fue estrecha, lo cual se muestra en la fig. 3.
Ejemplo 17 Reticulación, desrreticulación y citotoxicidad de las nanopartículas de micelas poliméricas PEG5kb-PCDC2.8k
Para aclarar el aire, se burbujeó nitrógeno en el agua de las nanopartículas micelares durante 20 min, y se añadieron 10 gl de agua secundaria de ditiotreitol (DTT)(0,007 mg, 4,67x10-5 mmol, grupo de ácido lipoico 10% en moles) a la disolución de nanopartículas (1 ml, 0,25 mg/ml,3,21x10-5 mmol) en el reactor sellado, la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 día con agitación. El tamaño de las partículas medidas fue 150 nm después de la diálisis durante 1 día, 15% más pequeño que el tamaño de las partículas no reticuladas. El tamaño de las partículas y la distribución del tamaño de las partículas prácticamente no cambiaron cuando la concentración de nanopartículas reticuladas se diluyó debajo de CMC; en cuanto a la estabilidad del entorno fisiológico, se puede observar que la estabilidad de las nanopartículas mejoró ampliamente con la reticulación de disulfuro, que se muestra en la fig. 4.
El enlace disulfuro se rompió bajo la acción de agente reductor tal como glutatión (GSH) o DTT. Bajo una atmósfera de nitrógeno y a 37^, se burbujeó nitrógeno en la disolución de nanopartículas de reticulación durante 10 min, luego se añadió GSH, cuya concentración final era 10mM en la disolución de nanopartículas de reticulación. El cambio del tamaño de las nanopartículas de desrreticulación fue seguido por DLS, que se muestra en la fig. 5, la destrucción del tamaño de las nanopartículas de reticulación se tomó gradualmente con el transcurso del tiempo después de GSH 10mM, que demostró que el anillo disulfuro en el polímero se rompió en agente reductor. Entonces los nanofármacos preparativos son estables en la circulación y pueden liberar rápidamente la reticulación para liberar fármacos cuando ingresan en las células, debido a la alta concentración de GSH en el citoplasma.
La toxicidad de la nanopartícula reticulada se ensayó por MTT. Se usaron células MCF-7 (célula de cáncer de mama humano) y Raw 264.7 (macrófagos de ratón). Se dispusieron en placas de 96 pocillos células HeLa o Raw 264.7 por 1 x104 células/ml, 100 gl por pocillo. Se añadió cultivo de distintas concentraciones de nanopartículas micelares como el grupo de experimentos, y se ajustaron los pocillos que contenían solamente las células y los pocillos que contenían solamente el medio de cultivo (hueco paralelo cuadruplicado) después de la adhesión de las células. Se extraen de la placa de 96 pocillos una vez que se cultivan las células por 24 h, se añaden 10 gl MTT (5,0 mg/ml). Las células se cultivan durante 4 h más, luego se añaden 150 gl de Cristal Violeta de disolución de DMSO, y se mide la absorbancia (A) a 492 nm usando una lectora de microplacas. Se determina la viabilidad celular comparando la absorbancia con los pocillos control que contienen solamente el medio de cultivo.
A t
Viabilidad celular (%) -------x l 0 0 %
A c...........
en la fórmula, At fue la absorbancia del grupo de experimentos a 492 nm, Ac fue la absorbancia del grupo control a 492 nm. La concentración de polímero fue 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 mg/ml. La Fig. 6 muestra la toxicidad de la nanopartícula, que exhibe que la viabilidad celular de Raw 264.7 y MCF-7 fue superior a 85% cuando la concentración de nanopartículas micelares fue de 0,1 a 0,5 mg/ml, lo que demuestra que la nanopartícula de micelas de PEG5k-b-PCDC2.8k tiene buena biocompatibilidad.
Ejemplo 18 Fármaco cargado, liberación in vitro y citotoxicidad de la nanopartícula reticulada PEG5k-b-PCDC2.8k
Se usó doxorrubicina(DOX) como fármaco, y toda la operación procedió bajo condiciones de oscuridad. El desalado del hidrocloruro de hidrocloruro de doxorrubicina se usó como la primera etapa, que procedió como: 1,2 mg (0,002 mmol). Se disolvió DOX en 225 gl de DMSO, luego se añadieron 0,58 ml (m = 0,419 mg, 0,004 mmol) de trietilamina y se agitó durante 12 h, luego se absorbió el procedimiento anterior. La concentración de disolución de DMSO de DOX fue 5,0 mg/ml. Se disolvió PEG5k-b-PCDC2.8k en DMF, que se mezcló con disolución de DMSO de DOX de acuerdo con la relación de calidad predeterminada para el fármaco y el polímero, luego se añadió agua secundaria cuadruplicada con agitación, luego se efectuó diálisis en agua.
La reticulación para el fármaco cargado con nanopartículas fue la misma que el método de reticulación en el Ejemplo 17. Se liofilizaron 100 gl del fármaco cargado con nanopartículas micelares reticuladas y se disolvió en 3,0 ml de DMSO, se calcularon la eficiencia de la carga del fármaco de acuerdo con espectroscopia de fluorescencia y la curva estándar de DOX.
Se calcularon el contenido de la carga del fármaco (DLC) y la eficiencia de la carga del fármaco (DLE) de conformidad con la siguiente fórmula:
Contenido de carga del fármaco (% en peso) = (peso del fármaco cargado/peso del polímero) x 100%
Eficiencia de carga del fármaco (%) = (peso del fármaco cargado/peso del fármaco en alimentación) x 100%
El resultado de la carga de nanopartícula micelar PEG5k-b-PCDC2.8k a DOX se presenta en la Tabla 1 y muestra el efecto de la carga eficiente.
Tabla 1 Contenido de carga del fármaco y eficiencia de carga del fármaco de Doxorrubicina cargada con nanopartículas de polímero reticuladas
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Los estudios de liberación in vitro de DOX se llevaron a cabo en un agitador termostático (200 rpm) a 37°C, muestras por doble duplicado por grupo. La DOX de nanopartículas micelares reticuladas liberada en PB (10 mM, pH 7,4) de GSH 10 mM imitó el entorno de reducción intracelular como el primer grupo; y la DOX cargada con nanopartículas micelares reticuladas liberada en PB (10 mM, pH 7,4) fue el segundo grupo. La concentración de fármaco cargado con nanopartículas micelares fue 25 mg/l, y 0,5 ml de diálisis de medio liberado contra 25 ml de disolvente de diálisis o tubo en la bolsa de diálisis (MWCO: 12.000-14.000). En intervalos de tiempo deseados, se tomaron 5 ml de medio de liberación y se reabastecieron con un volumen equivalente de medio fresco de 5 ml. La concentración de fármaco en la disolución se determinó usando fluorometría EDINBURGH FLS920. La Fig. 7, que muestra los resultados de liberación in vitro de la DOX con el tiempo, demostró la liberación más rápida con GSH, que imita el tumor intracelular añadido, que el grupo control sin GSH. Los resultados demostraron que el fármaco cargado con nanopartículas micelares reticuladas puede liberar el fármaco eficazmente en presencia de GSH 10 mM.
La toxicidad de la DOX cargada con nanopartículas reticuladas de PEG5k-b-PCDC2.8k a macrófagos de ratón Raw 264.7 y células de cáncer de mama humano MCF-7 se ensayó por MTT, y fármaco cargado con nanopartículas micelares desrreticuladas y fármaco libre como el grupo control. Se toman células Raw 264.7 como ejemplo, se disponen células Raw 264.7 en una placa de 96 pocillos por 1x104 células/ml, 100 pl por pocillo. Después de la adherencia de las células, se añadieron cultivo fresco que contenía 0,01, 0,1,1,5, 10, 50 y 100 pg/ml disolución de DOX cargada con nanopartículas reticuladas y DOX libre como los grupos de experimento. Se toman las placas de 96 pocillos después de cultivar las células durante 48 h en una incubadora, se añaden 10 pl de MTT (5,0 mg/ml). Las células se cultivan durante 4 h más, luego se añaden 150 pl de cristal violeta de disolución de DMSO, y se mide la absorbancia (A) a 492 nm usando una lectora de microplacas. La viabilidad de las células se determinó comparando la absorbancia con los pocillos control que contenían solamente medio de cultivo.
La Fig.8 muestra la toxicidad de dicho fármaco cargado con nanopartículas micelares reticuladas de PEG5k-b-PCDC2.8k para Raw 264.7 y MCF-7, que demostró DOX cargada con nanopartículas micelares reticuladas con una concentración inhibidora media máxima de 4,89 pg/ml para Raw 264,7 y 2,31 pg/ml para MCF-7. Por consiguiente, la DOX cargada con nanopartículas reticuladas puede liberar fármacos intracelulares para destruir las células cancerosas con gran eficiencia.
Ejemplo 19 Preparación de nanopartículas de vesículas poliméricas reticuladas PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) y su biocompatibilidad, y toxicidad del fármaco cargado con vesículas reticuladas para MCF-7, U87MG y A549
Del mismo modo que en el ejemplo 16, el polímero PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) se puede transformar en nanopartículas y tener la estructura de vesícula mediante TEM y CLSM, como se muestra en la fig. 9. Se observa en la fig. 9A que el tamaño de la vesícula fue 100 nm por DLC y la distribución del tamaño de partícula fue estrecha. Se muestra en la fig. 9B que la vesícula presentaba una estructura hueca por TEM. Al igual que en el ejemplo 17, la vesícula puede reticularse y desrreticularse en el entorno reductor. La prueba de toxicidad del fármaco cargado con vesículas reticuladas para la célula de cáncer de mama humano MCF-7, células de glioma humano U87MG y células de cáncer de pulmón A549 fue la misma que para el ejemplo 18. La viabilidad celular de MCF-7, U87MG y A549 osciló entre 85% y 110% cuando la concentración de nanopartículas micelares fue de 0,3 mg/ml a 1,5 mg/ml después de la incubación durante 24 h. Se demostró en la fig. 10 que la nanopartícula micelar de PEG5k-b-PCDC2.8k posee buena biocompatibilidad. La toxicidad del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigido a cRGD para células de glioma humano U87MG se muestra en la fig. 11, donde se observa que la concentración inhibidora media máxima de 3,57 pg/ml se redujo a 1,32 pg/ml cuando la proporción de polímero dirigido a cRGD era de 10% a 30%, cercana o debajo del fármaco libre, y se redujo de 2,3 a 6,4 veces al fármaco cargado con vesícula reticulada.
Se cargó DOXHCl por gradientes de pH, y se cargó DOX hidrófila debido al pH diferente entre la parte interior y exterior de la vesícula. El fármaco cargado con vesícula reticulada se preparó con una proporción distinta del inventario del fármaco de 10% a 30%, luego el fármaco libre no cargado se expulsó por diálisis, y el tamaño de la vesícula reticulada fue 105 a 124 nm por DLS, la distribución del tamaño de partícula de 0,10 a 0,15 fue estrecha, y la eficiencia de la DOX hidrófila cargada fue alta (63% a 77%).
Ejemplo 20 Circulación sanguínea en ratones del fármaco cargado con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de vida, con un peso de 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron de manera uniforme en grupos después del pesaje. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas del fármaco cargado con nanopartículas y del fármaco libre, y DOX 10 mg/kg. Se tomaron muestras de 10 gl de sangre en distintos puntos de tiempo de 0, 0,25, 0,5, 1,2, 4, 8, 12 y 24 h, y se calculó el peso de la sangre con el método de equilibrio. Las muestras de sangre se disolvieron inmediatamente después de la extracción en 100 gl de 1% triton y 500 gl de disolución de extracción de DMF (que contenía HCl 1M y DTT 20 mM). Se recogió el sobrenadante por centrifugación (20000 rpm, 20 min). Se determinó el nivel de DOX en el sobrenadante cada una de las veces mediante fluorometría.
La Fig. 12 es un gráfico que muestra la circulación sanguínea en ratones de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k, y el tiempo en la línea horizontal y la proporción de DOX en sangre por gramo de DOX inyectada (ID %/g) en la línea vertical. Los resultados obtenidos demuestran que el tiempo de circulación de DOX fue corto y no puede detectarse a las 2 horas, pero hubo 4 ID %/g para las nanopartículas reticuladas después de 24 horas. Las semividas de eliminación en ratones fueron 4,67 h para nanopartículas reticuladas y 0,21 h para DOX. Por consiguiente, el fármaco cargado con nanopartículas reticuladas fue estable en ratones y el tiempo de circulación fue más largo.
Ejemplo 21 Biodistribución del fármaco cargado con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k en ratones que portan tumores melanoma
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron en forma uniforme en grupos después del pesaje. Se generaron tumores de melanoma B16 de 1x 106 células por inyección subcutánea en el flanco trasero de los ratones. Los ratones recibieron una inyección intravenosa del fármaco cargado con nanopartículas y DOX (DOX 10 mg/kg) cuando el volumen del tumor había alcanzado 100-200 mm3 aproximadamente a las dos semanas. Los ratones fueron sacrificados a las 6, 12 o 24 h y se extirparon el tumor y los órganos como corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón, se pesaron en húmedo, luego se añadieron 500 gl de 1 % triton, se homogeneizaron y extrajeron con 900 gl de disolución de DMF (que contenía HCl 1 mM y DTT 20 mM). Se recogió el sobrenadante por centrifugación (20000 rpm, 20 min). Se determinó el nivel de DOX cada una de las veces por medición de fluorescencia.
La Fig. 13 es un gráfico que muestra los resultados de biodistribución de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k en ratones con melanoma, y los órganos en la línea horizontal y la proporción de DOX en órganos o tumor por gramo a la DOX inyectada (ID %/g) en la línea vertical. La acumulación de fármaco cargado con nanopartículas en el tumor fue 3,12, 2,93, 2,52 ID %/g a las 6, 12, 24 h, lo cual aumenta de 3 a 12 veces hasta la acumulación de DOX que fue 1,05, 0,52 y 0,29 ID%/g. Los resultados demostraron que la tasa de enriquecimiento del fármaco cargado con nanopartículas reticuladas en el sito del tumor fue alta y dura más según EPR.
Ejemplo 22 Eficacia terapéutica del fármaco cargado con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k en ratones que portan tumores melanoma
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron en forma uniforme en grupos después del pesaje. Se generaron tumores melanoma B16 de 1x106 células por inyección subcutánea en el flanco trasero de los ratones. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas del fármaco cargado con nanopartículas y DOX el día 0, 2, 4, 6, 8 cuando el volumen del tumor había alcanzado 30-50 mm3 en aproximadamente una semana, en donde la proporción de DOX del fármaco cargado con nanopartículas fue 10, 20, 30 mg/kg y DOX fue 10 mg/kg. El tamaño del tumor se midió a diario usando calibradores del día 0 al 15. El tamaño del tumor se calculó por V=(L*W*H)/2(L es la longitud del tumor, W es el ancho del tumor, H es el espesor del tumor). Se siguió observando la supervivencia de los ratones hasta el día 46.
La Fig. 14 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de DOX cargada con nanopartículas reticuladas PEG5k-b-PCDC2.8k en ratones que portan melanoma, fig. A para supresión de crecimiento del tumor, fig. B para cambio de peso corporal de ratones que portan el tumor, fig. C para tasas de supervivencia de ratones que portan el tumor. Los resultados de la fig. 14 demostraron que se inhibió el crecimiento del tumor eficazmente con 20 mg DOX equiv./kg después del tratamiento con DOX cargada con nanopartículas durante 16 días, mientras que DOX pudo inhibir el crecimiento del tumor con grandes efectos secundarios para los ratones. Los ratones tratados con el fármaco cargado con nanopartículas experimentaron poco cambio de peso corporal, incluso cuando la proporción de DOX del fármaco cargado con nanopartículas era 30 mg/kg, lo que indica que causan pocos efectos colaterales, mientras que el peso corporal de los ratones tratados con DOX se redujo 23% en el día 7, indicando que DOX causa muchos efectos colaterales. Se observó una tasa de supervivencia de 100% en un período experimental de 46 días con 30 mg DOX equiv./kg de nanopartículas, mientras que se observó tasa de supervivencia 0 con 10 días de DOX, incluso esta tasa de supervivencia 0 se observó con 35 días de PBS como grupo control. Como resultado, las nanopartículas cargadas con fármaco pueden inhibir eficazmente el crecimiento del tumor y causar pocos efectos colaterales, además de prolongar el tiempo de supervivencia de los ratones con carga tumoral.
Ejemplo 23 Circulación sanguínea del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k)
Se obtuvieron ratones Balb/C de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se distribuyeron en forma uniforme en grupos después del pesaje. La vesícula se formó con relación diferente de cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k) y PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k). Los resultados del experimento demostraron que el tamaño de la vesícula reticulada era 100 nm y la distribución del tamaño de partícula era 0,10 cuando la proporción de cRGD era 20%, lo cual tuvo la mejor focalización. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas del fármaco cargado con vesículas dirigidas cRGD20/CLPs, fármaco cargado con vesículas c Lps, vesícula desrreticulada dirigida cRGD20/PEG-PTMC y DOXHCl como control (DOX 10 mg/kg). Se extrajeron 10 gl de sangre en distintos puntos de tiempo de 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 y 24 h, y se calculó el peso de la sangre con el método de equilibrio. Tras la extracción, las muestras de sangre se disolvieron inmediatamente en 100 gl 1% triton y 500 gl de disolución de extracción de DMF (que contenía HCl 1M y DTT 20 mM). Se recogió el sobrenadante por centrifugación (20000 rpm, 20 min). El nivel de DOX en el sobrenadante se determinó cada una de las veces por fluorometría.
La Fig. 15 es un gráfico que muestra la circulación sanguínea en ratones del grupo DOX cargado con vesículas reticuladas dirigidas, y el tiempo en la línea horizontal y la proporción de DOX en sangre por gramo de DOX inyectada (ID %/g) en la línea vertical. Los resultados demuestran que el tiempo de circulación de DOXHCl fue corto y no se puede detectar a las 2 h, pero se detectó 8 ID %/g para la vesícula reticulada después de 24 h. Las semividas de eliminación en los ratones fueron 4,49 h, 4,26 h y 1,45 h para fármaco cargado con vesícula reticulada, fármaco cargado con vesícula desrreticulada y vesícula desrreticulada dirigida, mientras que DOXHCl fue 0,27 h solamente. Por ende, el fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas fue estable en los ratones, y el tiempo de circulación fue más prolongado.
Ejemplo 24 Biodistribución del fármaco de vesículas reticuladas dirigidas cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) en ratones que portan células de glioma humano
Se obtuvieron ratones Balb/C de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron en forma uniforme en grupos después del pesaje. Se generaron células de glioma humano U87MG de 5x 106 células por inyección subcutánea en el flanco trasero de los ratones. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas de cRGD20/CLPs, CLPs y DOXHCl (DOX 10 mg/kg) cuando el volumen del tumor había alcanzado 100 a 200 mm3 aproximadamente a las 3 o 4 semanas. Los ratones fueron luego sacrificados a las 4 h, y se extirparon los órganos como corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón, se pesaron en húmedo, luego se añadieron 500 gl de 1% triton, se homogeneizó y se extrajo con 900 gl de disolución de DMF (que contenía HCl 1 mM y DTT 20 mM). Se recogió el sobrenadante por centrifugación (20000 rpm, 20 min). Se determinó el nivel de DOX cada una de las veces por medición de fluorescencia.
La Fig. 16 es el perfil de biodistribución de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas para ratones que portan glioma maligno de cerebro humano, y los órganos en la línea horizontal y la proporción de DOX en los órganos o el tumor por gramo a DOX inyectada (ID %/g) en la línea vertical. Los resultados demuestran que la acumulación de DOX en el tumor fue 6,78, 2,15, 0,82 ID %/g a las 4 h para cRGD20/CLPs, CLPs y DOXHCl, y la acumulación para cRGD20/CLPs fue 3 veces para CLPs y 12 veces para DOX HCl. Los resultados demuestran que la tasa de enriquecimiento del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas en el sitio del tumor fue alta por focalización activa.
Ejemplo 25 Eficacia terapéutica de aplicación del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) en ratones que portan células de glioma humano
Se obtuvieron ratones Balb/C de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g Balb/C (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron uniformemente en grupos después del pesaje. Se generaron células de glioma humano U87MG de 5x 106 células por inyección subcutánea en el flanco trasero de los ratones. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas de cRGD20/CLPs, CLPs, vesícula de nanopartículas desrreticuladas dirigidas (cRGD20/PEG--PTMC), DOXHCl y PBS en los días 0, 4, 8, 12 cuando el volumen del tumor había alcanzado 30 a 50 mm3 aproximadamente en dos semanas, en donde la proporción de DOX fue 10 mg/kg. El tamaño del tumor se midió cada dos días usando calibradores de 0 a 18 días. El tamaño del tumor se calculó por V= (L*W*H)/2(L es la longitud del tumor, W es el ancho del tumor, H es el espesor del tumor). Se siguió observando la supervivencia de los ratones hasta el día 45.
La Fig. 17 es un gráfico que muestra el efecto terapéutico de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k)/PEG5k-P(CDc4.9k-co-TMC19k) sobre ratones que portan glioma maligno de cerebro humano, fig. A para supresión de crecimiento del tumor, fig. B para cambio de peso corporal de ratones que portan tumores, fig. C para tasas de supervivencia de ratones que portan tumores. Los resultados de la fig. 17 demostraron que el crecimiento del tumor se inhibió eficazmente después del tratamiento con cRGD20/CLPs durante 18 días, y el crecimiento del tumor después de CLPs y cRGD20/PEG-¿>-PTMC, mientras que DOXHCl pudo inhibir el crecimiento del tumor con el 21% de reducción del peso corporal en los ratones en el día 12, lo que indica que DOXHCl causa muchos efectos colaterales. Los ratones tratados con cRGD20/CLPs, CLPs y cRGD20/PEG-¿>-PTMC tuvieron pocos cambios en el peso corporal, lo que indica que causan pocos efectos colaterales. Se observó una tasa de supervivencia de 100% en un período experimental de 45 días de cRGD20/CLPs, mientras que se observó una tasa de supervivencia 0 de 13 días de DOXHCl, incluso se observó esa tasa de supervivencia 0 de 28 días en el grupo de disolución salina normal. En consecuencia, el fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas puede inhibir eficazmente el crecimiento del tumor y causar pocos efectos colaterales, además de prolongar el tiempo de supervivencia de los ratones con carga tumoral.
Ejemplo 26 Eficacia terapéutica del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas iRGD-PEG6kp"(CDC4.8k-co-TMC19.2k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) en ratones que portan tumores melanoma
La vesícula se formó con diferente relación de iRGD-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) y PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k). El tamaño de la vesícula era 110 nm y la distribución del tamaño de partícula era 0,12 cuando la proporción de polímero iRGD (RGD de internalización) era 0, 25% y 50%. La función del iRGD era dirigirse a la célula tumoral y penetrar en la célula tumoral y la histamina, y una determinada cantidad de iRGD libre potenció la función de la nanopartícula para penetrar en la histamina del tumor. Se usó el método de gradiente de pH para cargar DOXHCl, que tenía una eficiencia de 60 a 80%.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de vida, peso 18 a 20 g (Shanghai Institutes for Biological Sciences Laboratory Animal Center). Se dividieron en forma uniforme en grupos después del pesaje. Se generaron tumores melanoma B16 de 1x106 células por inyección subcutánea en el flanco trasero de los ratones. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas con fármaco cargado con vesículas reticuladas con polímero que contenían 0, 25%, 50% o 100% iRGD, DOXHCl y PBS los días 0, 3, 6, 9, 12 cuando el volumen del tumor había alcanzado 30 a 50 mm3 en aproximadamente una semana, en donde DOXHCl fue 10 mg/kg. El tamaño del tumor se midió a diario usando calibradores del día 0 al 20. El tamaño del tumor se calculó por V= (L*W*H)/2(L es la longitud del tumor, W es el ancho del tumor, H es el espesor del tumor). Se siguió observando la supervivencia de los ratones hasta el día 46.
La Fig. 18 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de DOX cargada con vesículas dirigidas iRGD-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) en ratones que portan melanoma, fig. A para supresión de crecimiento del tumor, fig. B para cambio de peso corporal de ratones que portan tumores, fig. C para tasas de supervivencia de ratones que portan tumores. Los resultados de la fig. 18 demostraron que se inhibió eficazmente el crecimiento del tumor después del tratamiento de iRGD50/CLPs durante 20 días cuando la proporción de iRGD fue 50%, mientras la absorción de nanopartículas afectaría la histamina del tumor. DOXHCl puede inhibir el crecimiento del tumor con 20% de reducción del peso corporal de los ratones en el día 8, indicando que DOXHCl causa muchos efectos colaterales. Los ratones tratados con fármaco cargado con vesículas reticuladas que contienen cualquier iRGD tuvieron pocos cambios en el peso corporal, lo que indica que causa pocos efectos colaterales. Se observó una tasa de supervivencia de 100% en un período experimental de 43 días de iRGD50/CLPs, mientras que se observó una tasa de supervivencia 0 con 10 días de DOXHCl debido a los efectos colaterales, se osbservó una tasa de supervivencia 0 en 29 días con el grupo de PBS. En consecuencia, el fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas puede inhibir eficazmente el crecimiento del tumor y causar pocos efectos colaterales, además de prolongar el tiempo de supervivencia de los ratones con carga tumoral.
Ejemplo 27 Circulación sanguínea, biodistribución e inhibición del crecimiento del tumor del fármaco cargado con vesículas diana dirigidas cNGQ-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k) en ratones que portan células cancerosas de pulmón
La síntesis del polímero cNGQ-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) fue similar a la del ejemplo 13, que fue la síntesis de NHS-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k) como la primera etapa. La reacción de amida para enlace del péptido cNGQ y el polímero se describió anteriormente como la segunda etapa. La relación de injerto de cRGD fue 87%, por análisis magnético nuclear y kit de proteínas BCA. La vesícula se formó con relación diferente de cNGQ-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k)/PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k). Se usó un método de gradiente de pH para cargar DOX HCl que tuvo una eficiencia de 60 a 80%. Los resultados del experimento in vitro para las células demostraron la mejor focalización cuando la producción de cNGQ fue 20% en la vesícula. Las semividas de eliminación en ratones del fármaco cargado con vesículas reticuladas dirigidas (cNGQ20/CLPs), que se preparó a partir de las vesículas con la proporción de cNGQ, fue 20% a 4,78 h. El modelo de cáncer de pulmón se construyó subcutáneamente en los ratones por inyección de cNGQ20/modificación de CLPs por espectroscopia del infrarrojo cercano en el flanco trasero de los ratones, al igual que en el ejemplo 24. Los resultados de las imágenes in vivo confirmaron que la concentración de cNGQ20/CLPs para cáncer ocurría rápidamente, y la fluorescencia de cNGQ20/CLPs se mantuvo fuertemente en el sitio del tumor después de 48 h. Los resultados de la biodistribución confirmaron que la acumulación de cNGQ20/CLPs fue 9 iD %/g en el sitio del tumor a las 8 h, superior a la acumulación de cRGD20/CLPs, CLPs y DOXHCl, incluso en otras vísceras. La Fig. 19 es un gráfico que muestra la biodistribución de DOX cargada con vesículas reticuladas dirigidas en ratones con cáncer de pulmón.
El modelo de cáncer de pulmón A549 y el tumor de pulmón A549 ortotópico con el modelo de bioluminiscencia que puede observar el crecimiento del tumor por bioluminiscencia a partir de imágenes in vivo se adquirieron por inyección subcutánea a los ratones. Después de inyectar el fármaco en el flanco trasero de los ratones los días 0, 4, 8 y 12, la bioluminiscencia de las imágenes in vivo demostró menos fluorescencia del pulmón de los ratones tratados por cNGQ20/CLPs. Esto confirma que cNGQ20/CLPs puede dirigirse a cáncer de pulmón e inhibir el crecimiento del tumor.
Ejemplo 28 Varillas de nano-oro modificadas en la superficie de DOX cargada con PEG5k-PLGA7.8k-PCDC1.7k y liberación de fármaco por NIR
Síntesis de varillas de nano-oro modificadas de nanopartículas de copolímero de bloques triple PEG5k-PLGA7.8k-PCDC1.7k: la disolución de polímero de DMSO (2 ml, 5 mg/ml) se añadió gota a gota a una dispersión de varillas de nano-oro (5 ml, 0,1 mg/ml) con agitación vigorosa, luego se agitó 4 h. El polímero libre se eliminó por centrifugación dos veces y se dispersó en tampón de fosfato. La producción de polímero modificado de varillas de nano-oro se obtuvo por TGA y tuvo 80% carga para el polímero libre (el polímero de alimentación era 100%).
El fármaco de carga de varillas de nano-oro modificadas de polímero:DMSO que contenía 10%, 20% o 30% DOX se añadió gota a gota a dichas varillas de nano-oro modificadas de disolución de polímero, luego se agitó durante 0,5 h y se incubó durante 12 h. La micromolécula libre se eliminó por diálisis contra tampón de fosfato de pH 7,4 por 12 h. La eficiencia de la carga de DOX osciló entre 70 y 90% por fluorescencia, lo que indica que las varillas de nano-oro modificadas de polímero pueden cargar el fármaco en forma eficiente. La Fig. 20 es una imagen TEM de varillas de nano-oro modificadas en la superficie de PEG5k-PLGA7.8k-PCDC1.7k, que muestra que la longitud de las varillas de nano-oro era 60 nm y que se distribuyeron de manera uniforme.
Liberación de fármaco de varillas de nano-oro modificadas de polímero por NIR: varillas de nano-oro modificadas de polímero se dispersaron en 10 ml de tampón de fosfato y se irradiaron con luz infrarroja de 0,2W/cm2 y 808 nm durante 5 min cada hora. Se recogieron 500 gl de disolución en momentos determinados y se procedió a centrifugar, luego se obtuvo la liberación de DOX por fluorescencia del sobrenadante. La liberación de varillas de nano-oro modificadas de polímero después de irradiar fue 92%, lo cual es más rápido que en el grupo sin irradiar (18% solamente). Por consiguiente, las varillas de nano-oro modificado de polímero se pueden usar para liberar por espectroscopia del infrarrojo cercano.
Ejemplo 29 Se usó el polímero PEG1.9k-PCDC0.8k para la superficie del sensor de resonancia de plasmones de superficie (SPR)
La superficie de oro del sensor SPR se trató previamente con agua regia, luego se lavó con etanol, se secó y se añadió a una disolución de THF del polímero de tribloques PEG1.9k-PCDC0.8k (1 ml, 5 mg/ml). Después de someter a reacción durante 24 h bajo agitación lenta, se extrajo el chip sensor y se lavó tres veces. La densidad superficial de PEG1.9k modificado en la placa de oro del sensor era 20 nmol/cm2 por XPS, eipsómetro y detección SPR. En comparación con el chip tradicional, el chip sensor modificado por el polímero puede reducir la adsorción no específica, mejorar la estabilidad de la medición, etc, y puede usarse ampliamente en biomedicina, etc.
Ejemplo 30 Polímero reticulado P(CDC0.8k-co-CL92k) como material de andamiaje biodegradable
El polímero P(CDC0.8k-co-CL92k) se disolvió en cloroformo (40 mg/ml) y se formó una película en una placa de vidrio de 1x1 cm2 (material de andamiaje). El disolvente se eliminó por completo en un horno de vacío durante 48 h. El anillo disulfuro de cinco miembros para reticulación se calentó durante 10 minutos a 40^ con una pistola de calor, luego se embebió en disolución salina durante dos semanas, todavía estaba intacto en la placa de vidrio, no obstante, la membrana de PCL como el grupo control había estado inactiva, como se observa en la fig.21, una fotografía del polímero PCL y P (CDC0.8k-co-CL92k) cuando se le dio forma de película y se sumergió durante dos semanas en disolución salina fisiológica; por consiguiente, el polímero de carbonato que contenía un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral podría potenciar la estabilidad del material de andamiaje, que podría usarse como material de andamiaje biológico.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral, que se prepara a partir de una unidad monomérica de carbonato cíclico que contiene un grupo funcional disulfuro de cinco miembros, caracterizado porque la estructura química de dicho polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral es una de las siguientes fórmulas:
(i)
Figure imgf000018_0001
en donde m=113,6 y n=14,6;
(ii)
Figure imgf000018_0002
en donde m=113,6, x=34,2, y=13,0 y n=47,2; o m=113,6, x=122,8, y=19,8 y n=142; o m=43,2; x=33,3, y=20,3 y n=53,6;
(iii)
Figure imgf000018_0003
en donde x=4,2, y=80,7 y n=84,9;
(iv)
Figure imgf000018_0004
en donde m=113,6, x=16,7, y=10,2 y n=26,9;
(v)
Figure imgf000018_0005
en donde m=113,6, x=25,5, y=186,3 y n=211,8; o m=136,4, x=24,8, y=188,4 y n=213,2; o m=136,4, x=24,0, y=178,8 y n=202,8;
(vi)
Figure imgf000019_0001
2. Aplicación del polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral según la reivindicación 1, en la preparación de un vehículo de liberación controlada de fármacos.
3. Aplicación del polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral según la reivindicación 1, en la preparación de un material de andamiaje para ingeniería de tejidos biológicos.
4. Aplicación del polímero de carbonato que contiene un grupo funcional de anillo disulfuro de cinco miembros en la cadena lateral según la reivindicación 1, en la preparación de un recubrimiento de biochip.
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