CN1151255C

CN1151255C - 固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的制备方法

Info

Publication number: CN1151255C
Application number: CNB011277505A
Authority: CN
Inventors: 高向阳; 徐凤彩; 詹福建; 陈玉云
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2004-05-26
Anticipated expiration: 2021-08-20
Also published as: CN1334342A

Abstract

本发明以壳聚糖微球为载体，吸附固定蚯蚓血纤蛋白溶酶。再用0.2%的戊二醛在4～8℃下交联2h，所制得的固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶活力和活力回收率较高，分别588U/g载体和57.2%。固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的活力比原蚯蚓血纤蛋白溶酶的性质有明显改善。固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶对底物的亲和力较原蚯蚓血纤蛋白溶酶提高了2.05倍，稳定性也有提高。本发明具有原料来源易、价廉、投资少、工艺可行简便。产品能在一定时间内溶解血块，为医药应用提供了新药物。

Description

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的制备方法

技术领域

本发明涉及到固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶制备，尤其是壳聚糖微球体固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的制备。

背景技术

蚯蚓是世界环保动物。蚯蚓以“地龙”入药已有悠久的历史并沿用至今。已知蚯蚓体内主要有效成分是几种重要酶(系)：蚯蚓血纤蛋白溶酶、蚯蚓血纤蛋白溶酶原激酶、蚯蚓胶原蛋白酶，它们协同作用，能有效地溶解血栓。广泛用来治疗血栓病、心血管疾病。具有稳定性好，在体内半衰期长，不易导致出血，而且价格便宜等特点。目前市售溶栓胶囊、地龙胶囊、“9·12”胶囊等只是蚯蚓冻干粉，未经提取制备，在体内疗效低，易遭受酶、抑制剂等分解、破环和抑制，也不易进入病灶组织，同时具有免疫原性，易引起过敏等不适反应。因此，开发新药物、新剂型势在必行。蚯蚓血纤蛋白溶酶的制备已有报道，如生物化学与生物物理学报1998年第二十卷第一期的第35-41页的周元聪、朱英、陈远聪等发表的赤子爱胜蚯蚓溶纤酶分离纯化等。

酶应用于临床，必须在体内半衰期长(即稳定性高)；易于进入细胞(组织)；无免疫原性。对酶分子进行化学修饰和固定化是目前国内外常用的方法。壳聚糖又称脱乙酰甲壳质，学名为聚-2-氨基-2-脱氧-D-β-1，4-葡萄糖，能溶于稀酸溶液形成凝胶；壳聚糖为阳离子天然高聚物，分子内含有大量游离的氨基和羟基，具有良好的吸附作用，而且亲水、无毒、生物相溶性好、易为生物降解，是酶的良好载体，而被广泛用于生物医学、食品等领域。

发明内容

本发明的目的：对蚯蚓血纤蛋白溶酶通过固定化处理，使处理后的蚯蚓血纤蛋白溶酶具有高效、广效无毒、无副作用、无免疫原性、半衰期长、易进入细胞的新药源。

本发明是这样实现的：

壳聚糖微球体的制备

壳聚糖微球体为载体，吸附蚯蚓血纤蛋白溶酶(EFE)，再用戊二醛交联，得固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶。

称取一定量壳聚糖并溶于体积分数为2％的醋酸溶液，制得质量分数为4％的壳聚糖酸性凝胶。在容器中加入一定量的透平油，搅拌下缓慢加入质量分数为4％的壳聚糖酸性凝胶，搅拌15min，使凝胶均匀分散，然后滴加25％的戊二醛溶液，搅拌10min后，用1mol/L的NaOH溶液将pH调至9～10，于60～70℃水浴中保温2-5小时，静置冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇抽洗，除去透平油。真空干燥后，过筛(80目)，再用蒸馏水抽洗，真空干燥，即为壳聚糖微球体。

酶的固定化

称取壳聚糖微球体，用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液平衡、浸泡、抽干。加入蚯蚓血纤蛋白溶酶，10℃以下吸附完全，并不断搅动。然后滴加0.6％戊二醛，使终浓度为0.2％。用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液洗去多余戊二醛，吸干，得产品。壳聚糖微球与蚯蚓血纤蛋白溶酶的质量比为50-70∶1。

影响固定化效果的几个因素

1.给酶量：

随着给酶量的增加，载体吸附的酶量增多，固定化酶活力增高。当给酶量达到3.413mg酶/g载体(175.1U/ml)时，固定载体结合酶量已趋于饱和，但活力回收率却已下降。结合固定化酶活力和固定化酶回收率两方面的因素，给酶量为1.524mg酶/g载体(123.1U/ml)时固定化效果最佳，固定化酶活力达58.8U/g载体，酶的活力回收达57.3％。

2.吸附时间

随着吸附时间的延长，固定化酶的活力与活力回收率逐渐增加。当吸附时间为10h，两者达到最大，分别为60.8U/g和59.3％。当吸附达到一定程度后开始饱和，既使时间再延长，吸附量也不再增加，而且随着时间的延长，酶逐渐失活，导致固定化酶的活力与活力回收率下降。

3.吸附温度

温度从0-20℃吸附时，固定化酶活力与活力回收率有逐步提高趋势。吸附温度在20℃时，固定化酶活力与活力回收率分别为62.83U/g和61.24％；20℃以后随着温度的上升，固定化酶活力与活力回收率逐步下降；在4-8℃时，固定化酶活力与活力回收率分别为61.36U/g和59.8％，比20℃时稍低，但吸附是一个放热过程，当超过一定温度后，随着温度的升高，载体吸附的酶量下降，同时，温度也影响吸附过程中酶分子的运动、酶活力和稳定性的变化。温度升高，酶分子的布朗运动加快，酶分子易从壳聚糖表面脱出；温度过高，酶变性加剧。虽然吸附温度在20℃时酶活力与活力回收率是最高的，但考虑上述之原因，在生产过程中选择的最佳温度为4-8℃。

3.戊二醛浓度

当戊二醛浓度为0.2％时，固定化酶活力与活力回收率达到最大，分别为60.12U/g和58.6％。这是由于戊二醛使吸附在载体表面的酶分子相互交联，从而更牢固地将酶分子连接到载体上，不易脱落。但随着戊二醛浓度进一步升高时，固定化酶活力与活力回收率都呈减少。这是因为戊二醛浓度过高，会使部分酶分子内交联，从而导致酶变性，活力下降。

4.戊二醛交联时间

随着交联时间的延长，固定化酶的活力与活力回收率逐渐上升。当交联时间为2h时，两者达到最大，分别为59.3U/g和57.8％。之后随着时间的延长，由于戊二醛自身缔合，从而导致酶变性，活力下降。

5.戊二醛交联温度

以0.2％戊二醛在不同温度下交联2h进行固定化。交联温度在4-8℃时，固定化酶的活力与活力回收率达到最大，分别为58.8U/g和56.8％。之后随着交联温度升高，两者开始下降，这是由于温度升高，加快戊二醛的缔合速度，从而影响固定化的效果。

固定化酶活力测定

称取0.1g酪蛋白，加入80ml 0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液小心加热(60℃)溶解，再用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液定容至100ml，0.1g固定化酶，加入1ml 37℃预热的酪蛋白溶液，37℃下，准确保温15min后，立即加入2ml 10％三氯乙酸溶液，静置30min后，过滤，滤液于280nm波长测定光密度(A_280nm)。原酶活力测定是用0.1ml酶液，其余过程同固定化酶的。以每10min增加0.01个A_280nm单位的酶量为1个酶活力单位(U/g载体)。

固定化酶活力回收(％)＝固定化酶活力/原酶活力×100％

蛋白质含量测定

按Bradford(1976)方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白质。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶性质：

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶活力和活力回收分别为588U/g载体以上和57.2％以上。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的Km(底物为酪蛋白)为0.21％，比原蚯蚓血纤蛋白溶酶降低2倍以上。说明它对底物的亲和力比原蚯蚓血纤蛋白溶酶高2倍以上。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶的最适pH为8.6，比原蚯蚓血纤蛋白溶酶的pH8.2有所提高。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶在pH5.8～9.2范围内活力稳定，这与原蚯蚓血纤蛋白溶酶较一致。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶在20-55℃间活力稳定，这与原蚯蚓血纤蛋白溶酶一致。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶在室温下存放2个月酶活力不变。

固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶在常温下对血块能完全溶解，这种溶解血块能力较原蚯蚓血纤蛋白溶酶强。

本发明的优点

1.本发明采用的最基础原料是蚯蚓，原料来源容易、价廉，并有利于带动养殖蚯蚓业的发展，有利于我国扶贫工作的开展。

2.工艺简易，生产设备投资少。

3.固定化酶比原酶的性质有明显的改善，对底物的亲和力比原酶提高了2.05倍，其稳定性也有所提高。

具体实施例

称取0.5g壳聚糖并溶于体积分数为2％的醋酸溶液，制得质量分数为4％的壳聚糖酸性凝胶。在烧杯中加入透平油，搅拌下缓慢加入质量分数为4％的壳聚糖酸性凝胶，搅拌15min，使凝胶均匀分散，然后滴加25％的戊二醛溶液，搅拌10min后，用1mol/L的NaOH溶液将pH调至9～10，于60～70℃水浴中保温3h，静置冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇抽洗，真空干燥后，过筛(80目)，再用蒸馏水抽洗，真空干燥，即为壳聚糖微球体。

称取0.5g壳聚糖微球体，用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24h，抽干加入1.27mg蛋白质/ml的蚯蚓血纤蛋白溶酶6ml，置4-8℃下吸附10h，搅拌。然后在搅拌下滴加0.6％戊二醛(用pH8.0 0.1mol/L硼酸缓冲液配制)3ml，使戊二醛终浓度为0.2％。置4～8℃下交联2h后，用pH7.8 0.1mol/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。吸干，即制得壳聚糖微球固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶。

Claims

1.固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶制备方法，其特征在于将1.27mg蛋白质/ml的蚯蚓血纤蛋白溶酶加入于经用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液平衡、浸泡、抽干的壳聚糖微球体中，在4-8℃吸附完全、搅拌，然后在搅拌下滴加0.6％戊二醛，使最终浓度为0.2％，用0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液洗去多余戊二醛，吸干，得产品，壳聚糖微球体与蚯蚓血纤蛋白溶酶的质量比为50-70∶1。

2.根据权利要求1所说的固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶制备方法，其特征在于壳聚糖微球吸附蚯蚓血纤蛋白溶酶的最适宜的吸附时间为10小时。