CN115119896B - 一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法及其应用，先经pH偏移处理改性亚麻蛋白，再对改性亚麻蛋白进行酶水解处理，能显著提高亚麻蛋白水解率，获得更高得率的支链氨基酸水解物，尤其适用于胃蛋白酶的水解，从而制得纯度更高、质量更优的富含支链氨基酸的产品。该方法步骤简便，对设备要求较低，人力、物力成本低，适于工业化生产。
Description
本申请主张中国在先申请，申请号：202210178548X，申请日2022年2月25日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及支链氨基酸制备技术领域，具体而言，涉及一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法及其应用。
背景技术
异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸统称为支链氨基酸，属于人体必需氨基酸的一种，为人体内主要的骨骼肌功能氨基酸，其氧化功能在氨基酸功能总量占比达到60％，同时也是肝外代谢的唯一一种氨基酸。支链氨基酸的主要功能包括：细胞吸收能量增加，细胞活力提升，延缓细胞衰老，清除自由基，提升组织器官功能，抗疲劳，皮肤美容，提高心肺、心肌能力，提高心脑血管保护作用，降低脂肪，抗心力衰竭，骨骼肌合成以及提高免疫力。研究发现，全球范围内人们普遍缺少的营养氨基酸为支链氨基酸，该氨基酸也可称为最有价值的氨基酸之一。
我国亚麻籽资源丰富，年产量在35万吨以上，种植面积和总产量仅次于加拿大，居世界第二位。但是目前亚麻籽的商品价值主要体现为油用，其潜在价值远没有被开发利用。随着社会的发展和人民生活水平的提高以及科学研究的不断深入，亚麻籽的营养保健功能越来越引起人们的重视。亚麻籽是一种很好的蛋白来源，含有人体所需的全部必需氨基酸，其中支链氨基酸含量在16％左右，是目前所发现的支链氨基酸含量最高的植物。
但是现有方法从亚麻蛋白获取支链氨基酸的水解率普遍不高，获得的支链氨基酸纯度也不高，因此，急需找到一种更高效地制备富含支链氨基酸亚麻蛋白水解物的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法及其应用，先经pH偏移处理制得改性亚麻蛋白，再对改性亚麻蛋白进行酶水解处理，能显著提高水解率，获得更高得率的支链氨基酸亚麻蛋白水解物，方法步骤简便，对设备要求较低，且成本低，适于工业化生产。
一方面，本发明提供了一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备改性亚麻蛋白，所述改性亚麻蛋白为经pH偏移处理后的亚麻蛋白；
(2)酶水解改性亚麻蛋白。
pH偏移处理可显著改善蛋白结构，当蛋白溶于极端pH值溶液中时，其分子侧链上带有大量同种电荷，致使蛋白分子因静电排斥作用而发生结构展开，当pH值调回中性时，随着静电斥力的消失，蛋白分子重新发生折叠。再次折叠后的蛋白结构相较于初始状态较为疏松，功能性质也随之发生变化。
相比其它蛋白，亚麻蛋白富含更多的支链氨基酸，具有保肝护肝的效果，当对亚麻蛋白进行pH偏移处理，氨基酸侧链所带电荷量增多，相互之间的静电斥力增大，经短时间保持后可诱导蛋白结构发生折叠，从而导致性能改变，其改变程度较其它蛋白，如大豆蛋白、豌豆蛋白等经pH偏移处理的程度更加复杂，性能改变更加明显；之后pH值调回中性，体系内静电斥力减弱，蛋白分子重新折叠，但无法再恢复到pH偏移处理前的状态。
本发明创造性地发现，经pH偏移处理后获得的改性亚麻蛋白，不仅能提高亚麻蛋白的酶水解率，而且有利于富含支链氨基酸等活性肽的释放和制备，获得更高得率的支链氨基酸水解物，并降低人力、物力成本。
在一些方式中，步骤(1)所述pH偏移为碱偏移。
进一步地，所述pH偏移处理是指经碱性pH偏移处理。
进一步地，所述碱性pH偏移处理是指pH调至12.0并保持1h。
在一些方式中，所述pH偏移操作方法为：用1mol/L NaOH溶液滴定亚麻蛋白溶液到pH12.0，保持1h。
进一步地，步骤(1)所述改性亚麻蛋白为经pH偏移处理后再经高压处理的亚麻蛋白。
高压处理可诱导蛋白高级结构发生变化，而对一级结构氨基酸排序一般无影响。压力作用下，蛋白结构呈展开趋势，所包含的非共价相互作用等发生改变，进而引起蛋白理化性质改变。高压对蛋白结构变化的影响因素除了取决于高压处理时间、处理温度、压力水平外，还取决于蛋白种类、蛋白浓度、体系pH值及离子强度等。
本发明经研究证明，经高压协同pH偏移处理亚麻蛋白，能进一步改善亚麻蛋白的改性效果，提高亚麻蛋白的水解率，获得更高得率的支链氨基酸水解物。
在一些方式中，经pH偏移后的亚麻蛋白溶液密封后，立即置于高压腔体中进行高压处理。
进一步地，所述高压处理的压力为80～200MPa。
在一些方式中，所述高压处理的压力为100MPa。高压处理效果与压力大小存在密切联系，研究证明，100MPa高压处理制备的亚麻蛋白，更适合制备富含支链氨基酸水解物的。
进一步地，步骤(2)所述酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、复合水解酶中的任意一种。
进一步地，步骤(2)为：先经超声，再采用胃蛋白酶水解，在pH2～4的情况下，水解250～350min。
研究证明，针对改性亚麻蛋白进行水解时，优选采用胃蛋白酶进行水解，从而获得更多的支链氨基酸水解物。
在酶水解前，先进行超声处理，可进一步提高水解度。
在一些方式中，超声频率为1000～7000Hz。
在一些方式中，超声频率为5000Hz。
在一些方式中，采用胃蛋白酶水解，胃蛋白酶添加量为0.8％，在pH2.5，37℃的情况下，水解时间300min。
进一步地，还包括步骤(3)：经纳滤富集制备富含支链氨基酸亚麻蛋白水解物。
在一些方式中，采用截留分子量为500Da的纳滤膜来进一步富集富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物。
另一方面，本发明提供了一种由上所述的方法制备的富含支链氨基酸亚麻蛋白水解物用于制备食品、药品、饲料等用途。
在一些方式中，本发明制备的富含支链氨基酸亚麻蛋白水解物可用作食品添加剂，可加入饮品中制备功能性饮料，提升饮用者的运动能力。
再一方面，本发明提供了改性亚麻蛋白用于制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的用途，所述改性亚麻蛋白为经pH偏移处理后再经高压处理的亚麻蛋白；所述pH偏移处理是指经碱性pH偏移处理；所述高压处理的压力为80～200MPa。
本发明提供的支链氨基酸的亚麻蛋白水解物制备方法具有如下的有益效果：
1、发现经pH偏移处理制得改性亚麻蛋白，能提高亚麻蛋白的水解率，获得更高得率的支链氨基酸水解物；
2、发现经pH偏移处理再经高压处理制得改性亚麻蛋白，能进一步提高亚麻蛋白水解率和支链氨基酸水解物的得率；
3、发现经pH偏移处理再经高压处理制得改性亚麻蛋白，更有利于胃蛋白酶的水解；
4、制得纯度更高、质量更优的支链氨基酸产品；
5、方法步骤简便，过程易控，对设备要求较低，人力、物力成本低，适于工业化生产。
附图说明
图1为实施例7中改性亚麻蛋白溶液经高效液相色谱进行氨基酸分析的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明提供的富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备
本实施例提供的富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法为：
(1)制备改性亚麻蛋白溶液
采用碱溶酸沉法提取亚麻蛋白：取脱脂亚麻粉100g，与15倍的去离子水混合，用2.0mol/L NaOH调pH值至7.5～8.0，搅拌1h后，将其悬浮液在4℃条件下离心。取上清液用2.0mol/L HCl调pH至4.3。静置，4℃条件下离心；取沉淀，蒸馏水洗涤后冻干，制得亚麻蛋白粉。
取亚麻蛋白粉10g，溶于90mL蒸馏水(pH7.0)中，配制成10％的亚麻蛋白溶液，在室温下搅拌2h保证蛋白充分溶解。用1mol/L NaOH溶液滴定亚麻蛋白溶液到pH12.0，保持1h后，再用1mol/L HCl调回pH7.0。经pH偏移后的亚麻蛋白溶液立即置于高压腔体中进行高压处理，压力为100MPa，保压15min后取出，制得改性亚麻蛋白溶液。
(2)酶水解改性亚麻蛋白溶液
取改性亚麻蛋白溶液100mL，先经5000Hz超声20min，再用HCl溶液调节pH到2.5，添加0.8％的胃蛋白酶水解，37℃的情况下，水解300min。
(3)制备富含支链氨基酸液的亚麻蛋白水解物
采用截留分子量为500Da的纳滤膜富集支链氨基酸液的亚麻蛋白水解物，喷雾干燥，制得富含支链氨基酸亚麻蛋白粉。
实施例2pH偏移方式制得的亚麻蛋白溶液对制备富含支链氨基酸水解物的影响
本实施例采用实施例1提供的方法制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，其中制备改性亚麻蛋白溶液时，分成5组：
第1组为不改性的亚麻蛋白溶液；
第2组为经碱性pH偏移处理(用1mol/L NaOH溶液滴定亚麻蛋白溶液到pH12.0，保持1h)的改性亚麻蛋白溶液；
第3组为经酸性pH偏移处理(用1mol/L HCl溶液滴定亚麻蛋白溶液到pH2.0，保持1h)的改性亚麻蛋白溶液；
第4组为先经酸性pH偏移处理1h，再经碱性pH偏移处理1h的改性亚麻蛋白溶液；
第5组为先经碱性pH偏移处理1h，再经酸性pH偏移处理1h的改性亚麻蛋白溶液；
分别对上述5组改性亚麻蛋白溶液(均不进行高压处理)，添加0.8％胃蛋白酶，在pH2.5，37℃的情况下进行酶解300min，得初步酶解液，检测其水解度和支链氨基酸含量，每组重复3次，从而考察pH偏移方式处理亚麻蛋白对支链氨基酸在水解物中含量的影响。
其中水解度的检测方法参照GB/T5009.39-2003，采用甲醛滴定法测定；支链氨基酸含量采用氨基酸自动分析仪检测氨基酸组成，并计算其中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的总含量，即为支链氨基酸的含量，分别计算亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和支链氨基酸得率，各种氨基酸得率＝酶解液体积*酶解液中氨基酸含量/亚麻蛋白粉质量*100。检测结果如表1所示。
表1、pH偏移方式获得的亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸水解物的影响
| 组别 | 水解度(％) | 亮氨酸(％) | 异亮氨酸(％) | 缬氨酸(％) | 支链氨基酸(％) |
| 第1组 | 20.4 | 6.25 | 5.64 | 6.03 | 17.92 |
| 第2组 | 55.3 | 9.32 | 7.86 | 8.24 | 25.42 |
| 第3组 | 25.6 | 7.87 | 5.96 | 5.58 | 19.41 |
| 第4组 | 28.7 | 7.53 | 6.21 | 6.44 | 20.18 |
| 第5组 | 48.7 | 8.37 | 6.67 | 7.61 | 22.65 |
由表1可知，不同方式处理的亚麻蛋白水解度和支链氨基酸含量有显著区别，与第1组的未经改性的亚麻蛋白相比，经pH偏移处理后的亚麻蛋白，蛋白水解度和支链氨基酸在水解物中含量显著提高，可见经pH偏移处理后获得的改性亚麻蛋白，更有利于富含支链氨基酸等活性肽的释放和制备。
比较第2组到第5组的不同改性方法可以看出，不同pH偏移方式处理亚麻蛋白，获得的改性亚麻蛋白的水解度与支链氨基酸含量也完全不同。经碱性pH偏移处理1h获得的改性亚麻蛋白，经胃蛋白酶水解后，水解度最高，支链氨基酸在水解物中含量也最高，因此优选采用经碱性pH偏移处理1h的方法对亚麻蛋白进行改性处理。
实施例3高压处理亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸水解物的影响
本实施例采用实施例1提供的方法制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，其中制备改性亚麻蛋白溶液时，分成以下4组：
第1组为经碱性pH偏移处理1h，不进行高压处理；
第2组为不经pH偏移处理，仅高压(100MPa，保压15min)处理后的改性亚麻蛋白溶液；
第3组为经碱性pH偏移处理1h，再进行高压(100MPa，保压15min)处理后的改性亚麻蛋白溶液；
第4组为先经高压(100MPa，保压15min)处理后，再经碱性pH偏移处理1h，制得改性亚麻蛋白溶液；
分别对上述4组改性亚麻蛋白溶液，添加0.8％胃蛋白酶进行酶解，得初步酶解液，检测其水解度和支链氨基酸含量，检测方法如实施例2所示，每组重复3次，考察高压处理亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸的水解物的影响。检测结果如表2所示。
表2、高压处理亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸水解物的影响
| 组别 | 水解度(％) | 亮氨酸(％) | 异亮氨酸(％) | 缬氨酸(％) | 支链氨基酸(％) |
| 第1组 | 55.3 | 9.32 | 7.86 | 8.24 | 25.42 |
| 第2组 | 20.5 | 6.26 | 5.67 | 6.10 | 18.03 |
| 第3组 | 59.5 | 10.57 | 9.65 | 10.09 | 30.31 |
| 第4组 | 42.7 | 8.29 | 6.08 | 7.01 | 21.38 |
由表2可知，比较第1组和第2组可以看出，单独进行pH偏移处理改性，对亚麻蛋白的水解度和支链氨基酸得率均有显著提高，但单独进行高压处理对亚麻蛋白制备支链氨基酸的水解物无明显差异；第4组先经高压处理后再进行pH偏移处理，相比于第1组，不仅没有进一步提高水解率和支链氨基酸含量，反而出现下降现象；而第3组先经pH偏移处理后再进行高压处理，却能明显提高胃蛋白酶的水解度和支链氨基酸在水解物中的含量。可见高压处理时机非常重要，必须在pH偏移处理亚麻蛋白后再进行高压处理，才能进一步提高改性亚麻蛋白的水解率和支链氨基酸得率。
实施例4高压处理亚麻蛋白时的压力和保压时间对制备富含支链氨基酸水解物的影响
本实施例采用实施例1提供的方法制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，采用经碱性pH偏移处理1h，再进行高压处理制备改性亚麻蛋白溶液，其中高压处理分别按照如表3所示的7种压力或维持时间进行处理；再分别向该7种改性亚麻蛋白溶液添加0.8％胃蛋白酶进行酶解，得初步酶解液，检测其水解度和支链氨基酸含量，检测方法如实施例2所示，每组重复3次，考察高压处理亚麻蛋白对富含支链氨基酸水解物的影响。检测结果如表3所示。
表3、压力处理亚麻蛋白对富含支链氨基酸水解物制备的影响
由表3可知，压力和处理时间对改性亚麻蛋白的水解度和支链氨基酸得率有较大影响。80～200MPa压力处理的改性亚麻蛋白，有利于制备富含支链氨基酸的水解物，但随着压力的继续升高，如达到300MPa后，制备的改性亚麻蛋白的水解度不再继续上升，反而出现下降的趋势，其原因可能是压力过高造成了不利影响。因此最优选的压力为100MPa，处理时间为15min，此时水解度可达到59.5％，支链氨基酸含量达到30.31％。
实施例5酶水解对制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的影响
本实施例采用实施例1提供的方法制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，采用经碱性pH偏移处理1h，再进行高压处理制备改性亚麻蛋白溶液，获得的改性亚麻蛋白溶液分别添加如表4所示的多种酶进行水解，选择合适的pH和酶解温度，酶解300min，得初步酶解液，检测其水解度和支链氨基酸含量，检测方法如实施例2所示，每组重复3次，考察不同酶水解改性亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸的水解物的影响。检测结果如表4所示。
表4、酶水解对制备富含支链氨基酸水解物的影响
由表4可知，针对经pH偏移和高压处理的改性亚麻蛋白溶液，采用不同酶水解，水解度和支链氨基酸得率也存在显著不同，采用胃蛋白酶水解更有利于改性亚麻蛋白溶液的水解，水解度最高，支链氨基酸含量也更高。
实施例6超声处理对制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的影响
本实施例采用实施例1提供的方法制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，采用经碱性pH偏移处理1h，再进行高压处理制备改性亚麻蛋白溶液，获得的改性亚麻蛋白溶液分别按照表5所示方法处理后再进行胃蛋白酶水解(超声时间为20min)，得初步酶解液，检测其水解度和支链氨基酸含量，检测方法如实施例2所示，每组重复3次，考察超声处理改性亚麻蛋白对制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的影响。检测结果如表5所示。
表5、超声处理对制备富含支链氨基酸水解物的影响
由表5可知，酶解前进行超声处理亚麻蛋白更有利于进一步提高水解度和支链氨基酸得率，尤其在超声频率为5000Hz时，水解度更高，支链氨基酸含量也最高。
实施例7富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物中的氨基酸构成
本实施例按照实施例1提供的方法，经纳滤后获得富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物，经高效液相色谱进行氨基酸分析，液相色谱图如图1所示，检测结果如表6所示，并与未经改性的亚麻蛋白酶解后获得的水解物检测结果进行对比。
表6、亚麻蛋白水解物中氨基酸的构成
由表6可知，改性亚麻蛋白溶液经酶解制备的支链氨基酸中，游离氨基酸含量达到10.84mg/mL，其中支链氨基酸含量为3.57mg/mL，支链氨基酸含量占游离氨基酸含量为32.93％；而未经改性的亚麻蛋白经酶解后，游离氨基酸含量仅为3.82mg/mL，其中支链氨基酸含量仅为0.98mg/mL，支链氨基酸含量占游离氨基酸含量为25％。可见pH偏移改性复合高压处理亚麻蛋白能显著促进游离氨基酸的释放，尤其能促进支链氨基酸的释放。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。如根据其在医学上的应用范围均可做扩展。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (6)
1.一种富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备改性亚麻蛋白，所述改性亚麻蛋白为经pH偏移处理后再经高压处理的亚麻蛋白；所述pH偏移处理是指碱性pH偏移处理；所述碱性pH偏移处理是指pH调至12.0并保持1h，再调回pH7.0；
（2）酶水解改性亚麻蛋白，所述酶为胃蛋白酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压处理的压力为80~200MPa。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）为：先经超声，再采用胃蛋白酶水解，在pH2~4的情况下，水解250~350min。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括步骤（3）：经纳滤富集制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物。
5.一种由权利要求1~4任一项所述的方法制备的富含支链氨基酸的亚麻水解物用于制备食品、药品、饲料的用途。
6.一种改性亚麻蛋白用于制备富含支链氨基酸的亚麻蛋白水解物的用途，其特征在于，所述改性亚麻蛋白为经pH偏移处理后再经高压处理的亚麻蛋白；所述pH偏移处理是指碱性pH偏移处理；所述碱性pH偏移处理是指pH调至12.0并保持1h，再调回pH7.0；所述高压处理的压力为80~200MPa；所述亚麻蛋白水解物为酶水解改性亚麻蛋白，所述酶为胃蛋白酶。
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