CN115112619A - 一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，将免疫组织化学双染色检测及荧光原位杂交检测共同应用在同一张切片上，在同一张切片上先进行免疫组织化学双染色，然后进行荧光原位杂交检测，根据免疫组织化学Fastred显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，在荧光原位杂交检测片子上精准定位乳腺浸润癌或微小浸润癌的位置。

Description

一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润 癌及微小浸润癌的方法
技术领域
本发明涉及一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，属于生物技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，15％～20％的乳腺癌患者存在HER-2基因的扩增和(或)蛋白的过表达，近年来，针对HER-2阳性乳腺癌患者的抗HER-2靶向治疗取得了良好疗效，改善了HER-2阳性乳腺癌患者的预后。正确检测和评定乳腺浸润癌的HER2蛋白表达和基因扩增状态，可筛选适合抗HER2靶向治疗的乳腺癌患者。
目前，各个版本的《中国乳腺癌HER-2检测指南》均推荐使用免疫组织化学的方法检测HER-2蛋白的表达，使用荧光原位杂交的方法检测HER-2基因的扩增水平明确浸润癌区域的HER-2基因状态。各类临床实验显示，大约23％的患者导管原位癌与浸润癌的HER-2状态不一致，目前的指南中强调在病理报告中需要报告的是浸润性癌的HER-2状态，而不是乳腺导管原位癌的HER-2状态。
多数情况下，乳腺浸润性癌与导管原位癌在HE切片显微镜明场镜下形态上容易区分。但一些特殊类型的浸润性癌(特别是浸润性筛状癌和腺样囊性癌)以及有些边界清楚或形成圆形细胞巢的浸润性癌，在形态上均类似乳腺导管原位癌。同时，导管原位癌可累及硬化性病变(特别是硬化性腺病)、累及小叶、病变导管的分支、受累导管或腺泡因纤维化而扭曲、炎症导致病变导管或腺泡结构不清、挤压假象、烧灼影响以及先前穿刺操作造成原位癌进入周围间质或脂肪组织内造成的上皮异位等，这些情况均可使导管原位癌在形态上类似浸润性癌(如图1所示)。另外，若浸润性病灶较小，特别是微小浸润性癌与导管原位癌的鉴别在形态上尤为困难(如图5所示)；只有通过免疫组织化学检测，乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞染上颜色，才能明确分辨出导管原位癌(如图2、图6所示)及浸润癌和微小浸润癌。
荧光原位杂交检测需要在荧光显微镜暗视野下观察结果，在荧光显微镜暗视野下组织切片的病理学形态非常不好辨别，与导管原位癌形态上非常相似的浸润癌(如图3所示)及微小浸润癌(如图7所示)在荧光显微镜下更难识别出来。以往的乳腺癌HER-2检测，都是根据免疫组织化学的片子对浸润性癌进行定位，然后在另一张荧光原位杂交的片子上寻找相应的位置进行判读，由于荧光原位杂交的判读需要使用100倍的油镜判读，视野非常小，寻找浸润癌的区域并精准定位是非常困难的；而且不同切片层面会导致导管原位癌与浸润癌的形状、大小和位置都会出现不同程度的改变，这些原因势必造成荧光原位杂交检测中某些特殊类型的乳腺浸润癌及微小浸润癌定位不准确的情况。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，在同一张切片上先进行三种抗体的免疫组织化学双染色，然后再进行荧光原位杂交检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，在同一张切片上先进行免疫组织化学双染色，然后进行荧光原位杂交检测，根据免疫组织化学Fast red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，精准定位乳腺浸润癌或微小浸润癌的位置。
所述免疫组织化学双染色是将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，使用辣根过氧化酶显色系统，选用染色抗体E-Cadherin进行DAB显色，此时乳腺癌细胞浆被染为棕黄色；使用碱性磷酸酶显色系统，选用染色抗体P63、CK5/6进行Fast red显色，此时乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞被染为红色；再用HER-2/CSP17双探针对上述切片进行荧光原位杂交检测。
免疫组织化学双染色的操作步骤为：
(1)将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，切片的厚度为4μm；
(2)于65℃烤箱内烘烤切片1h；
(3)使用全自动免疫组化染色系统进行免疫组织化学双染色，染色抗体分别为：P63、CK5/6、E-Cadherin。
所述全自动免疫组化染色系统的染色步骤为：
1)烤片：于75℃烤片4min；
2)脱蜡：脱蜡试剂为Ventana EZ Prep脱蜡液，脱蜡温度75℃，脱蜡时间20min；
3)抗原修复：采用热修复方式，抗原修复液为Ventana CC1抗原修复缓冲液，抗原修复时间为52min，温度为99℃；
4)孵育：使用内源性过氧化物酶抑制剂，于37℃下，孵育4min后，进行清洗；
5)一抗孵育：滴加E-Cadherin抗体100μL，于37℃孵育28min后，清洗去除未结合的一抗；
6)二抗孵育：滴加100μL连有HRP的二抗，于37℃孵育8min后，清洗去除未结合的二抗；
7)DAB显色：滴加DAB试剂和H2O2试剂各100μL，于37℃显色8min后，进行清洗，终止显色；
8)变性：升温至94℃，并维持4min，对结合在组织上的一抗和二抗进行变性破坏，防止后续产生交叉反应；
9)第二次一抗孵育：滴加抗体CK5/6和P63各100μL，于37℃孵育24min后，清洗去除未结合的一抗；
10)第二次二抗孵育：先滴加100uL Reaction buffer清洗缓冲液后，再滴加100μL连有AP的二抗，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的二抗；
11)Fast red显色：滴加Naphthol试剂和Fast red试剂各100μL，于37℃显色8min，进行清洗，终止显色；
12)复染：滴加苏木素染液100μL，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的苏木素染料；
13)返蓝：滴加返蓝液100μL，于37℃孵育4min后，进行清洗。
所述连有HRP的二抗为ULtraview Universal DAB试剂盒中的MuLtimer试剂；所述连有AP的二抗为ULtraview Universal AP RED试剂盒中的MuLtimer试剂。
所述内源性过氧化物酶抑制剂为ULtraview Universal DAB试剂盒中的Inhibitor试剂；所述DAB试剂和H2O2试剂来自ULtraview Universal DAB试剂盒；所述Naphthol试剂和Fast red试剂来自ULtraview Universal AP RED试剂盒。
清洗时采用喷射式清洗方式，使用pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行清洗。
荧光原位杂交检测的操作步骤为：
(1)将进行过免疫组织化学双染色检测的切片放于荧光显微镜下观察，若细胞间隙有Fast red试剂的非特异性着色，则将切片泡于37℃、体积分数为75％酒精中35～40min，去除Fast red试剂的非特异性着色；所述酒精溶液中含有体积分数为0.1％的盐酸；
(2)将切片浸泡于温度为90℃的通透剂中5min；所述通透剂来自人类HER-2基因扩增检测试剂盒；
(3)使用胃蛋白酶，将切片于37℃消化5～10min；
(4)使用2×SSC缓冲液，将切片于室温洗涤2次，每次5min；
(5)将切片依次浸泡于体积分数为70％乙醇、80％乙醇、100％乙醇中，各2min；
(6)室温晾干切片；
(7)向切片上滴加10μL HER-2/CEP17双探针，加盖盖玻片，使用封边胶封边；所述HER-2/CEP17双探针来自人类HER-2基因扩增检测试剂盒；
(8)将切片放入杂交仪内，85℃变性5min，42℃杂交16h；
(9)去除切片的封边胶，揭掉盖玻片，使用2×SSC缓冲液，室温洗涤切片1min；
(10)使用体积分数为0.3％NP-40/0.4×SSC溶液、pH为7.0，于68℃洗涤切片2min；
(11)使用去离子水，于37℃洗涤切片1min；
(12)室温晾干切片，滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚DAPI，加盖盖玻片；
(13)使用荧光显微镜观察切片，进行精准定位。
所述精准定位的具体方法为：首先在荧光显微镜的明视场下找到细胞浆染为棕黄色的乳腺癌细胞，然后关闭明视场光源，打开暗视野的汞灯；若乳腺癌细胞团周围有明亮的红色荧光，说明有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为导管原位癌；若乳腺癌细胞团周围没有明亮的红色荧光，说明没有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为浸润癌或微小浸润癌。
精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌区，观察明确为浸润癌或微小浸润癌细胞核内荧光原位杂交的信号点，对信号点进行计数得出检测结果。
本发明有益效果：
本发明根据导管原位癌的组织病理学特征，癌细胞巢周围存在肌上皮细胞，但肌上皮细胞个头很小，很难在HE切片上识别，这就需要需免疫组织化学对肌上皮进行染色，使用一种核阳性的肌上皮标记物如p63，搭配一种浆阳性的肌上皮标记物如CK5/6联合使用，通过Fast进行显色；使用浆阳性的乳腺上皮标记物E-Cadherin对乳腺癌细胞进行标记，通过DAB进行显色，三种标记物的联合使用对乳腺癌浸润灶的判断起到重要的辅助作用，若癌细胞巢周围只要存在一个肌上皮细胞，便为导管原位癌(如图2、图6所示)。
本发明方法将免疫组织化学双染色检测及荧光原位杂交检测共同应用在同一张切片上，利用免疫组织化学双染色检测Fast red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，在荧光原位杂交检测片子上精准定位乳腺浸润癌(如图4所示)及微小浸润癌区域(如图8所示)。
本发明方法免疫组织化学双染色Fast red在荧光显微镜下荧光反应非常强，因此不需要很强的Fast red的染色，在第二次二抗孵育前需在切片上滴加100uL Reactionbuffer清洗缓冲液，再滴加连有AP的二抗，进行二抗的稀释，防止过多的Fast red的非特异性着色；经过免疫组织化学双染色的检测的片子，需要在37℃、体积分数为75％酒精(含有体积分数为0.1％的盐酸)中浸泡40min左右，以去除Fast red的非特异性着色；在荧光原位杂交检测步骤中，缩短90℃的通透剂作用时间至5min左右，胃蛋白酶的作用时间根据各实验室的条件进行适当调整，合理设置各步骤参数，最终得到可精确定位的检测方法。
附图说明
图1为HE染色法中导管原位癌在形态上类似浸润性癌的示意图；
图2为免疫组织化学双染色中导管原位癌在形态上类似浸润癌的示意图；
图3为荧光原位杂交检测中导管原位癌在形态上类似浸润癌的示意图；
图4为本发明免疫组化学双染色+荧光原位杂交法对导管原位癌在形态上类似浸润癌的精准定位示意图；
图1-4为采用不同方法对导管原位癌在形态上类似浸润癌的示意图；其中图1、图3中无法分辨出哪些是导管原位癌，哪些是浸润癌。图2中箭头所指为经Fast red显色的肌上皮，这团癌细胞为导管原位癌；可以分辨出哪些是导管原位癌，哪些是浸润癌。图4中箭头所指为在暗视野下呈现明亮红色荧光的肌上皮细胞，这团癌细胞为导管原位癌；可以更加清晰的分辨出哪些是导管原位癌，哪些是浸润癌，区分效果明显优于图3。
图5为HE染色中微小浸润癌在形态上类似导管原位癌的示意图；
图6为免疫组织化学双染色中微小浸润癌在形态上类似导管原位癌的示意图；
图7为荧光原位杂交检测中微小浸润癌在形态上类似导管原位癌的示意图；
图8为本发明免疫组化学双染色+荧光原位杂交法对微小浸润癌在形态上类似导管原位癌的精准定位示意图；
图5-8为采用不同方法对微小浸润癌在形态上类似导管原位癌的示意图；
其中图5、图7无法分辨哪些是微小浸润癌。图6中箭头所指癌细胞团周围无Fastred显色的肌上皮，即为微小浸润癌。图8中乳腺导管原位癌细胞团周围有明亮的红色荧光，箭头所指的癌细胞团周围无明亮红色荧光的肌上皮细胞，即为微小浸润癌；可以更加清晰的分辨出哪些是微小浸润癌，区分效果明显优于图7。说明：图1-8的放大倍数均为400×。图4和图8原图有明亮的红色荧光显示，区分效果明显，变成黑白图后效果不显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法：
在同一张切片上先进行免疫组织化学双染色，使用辣根过氧化酶显色系统，选用染色抗体E-Cadherin进行DAB显色，此时乳腺癌细胞浆被染为棕黄色；使用碱性磷酸酶显色系统，选用染色抗体P63、CK5/6进行Fast red显色，此时乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞被染为红色；然后再进行荧光原位杂交检测，用HER-2/CSP17双探针对上述切片进行荧光原位杂交检测。根据免疫组织化学双染色Fast red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的位置。
其中，免疫组织化学双染色的操作步骤为：
(1)将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，切片的厚度为4μm；
(2)于65℃烤箱内烘烤切片1h；
(3)使用罗氏Benchmark ULtra全自动免疫组化染色系统，进行免疫组织化学双染色，染色抗体分别为：P63、CK5/6、E-Cadherin，染色步骤为：
1)烤片：于75℃烤片4min；
2)脱蜡：脱蜡试剂为Ventana EZ Prep脱蜡液，脱蜡温度75℃，脱蜡时间20min；
3)抗原修复：采用热修复方式，使用抗原修复液(Ventana CC1抗原修复缓冲液)进行抗原修复，时间为52min，温度为99℃；
4)内源性过氧化物酶抑制剂：使用内源性过氧化物酶抑制剂(ULtraviewUniversal DAB试剂盒中的Inhibitor试剂)，于37℃下，孵育4min，采用喷射式清洗方式进行清洗；
5)一抗孵育：滴加E-Cadherin抗体100μL，于37℃孵育28min，采用喷射式清洗方式去除未结合的一抗；
6)二抗孵育：滴加100μL连有HRP的二抗(ULtraview Universal DAB试剂盒中的MuLtimer试剂)，于37℃孵育8min，采用喷射式清洗方式去除未结合的二抗；
7)DAB显色：滴加ULtraview Universal DAB试剂盒中的DAB试剂和H2O2试剂各100μL，于37℃显色8min，采用喷射式清洗方式终止显色；
8)变性：仪器升温至94℃，并维持4min，对结合在组织上的一抗和二抗进行变性破坏，防止后续产生交叉反应；
9)第二次一抗孵育：滴加抗体CK5/6和P63各100μL，于37℃孵育24min，采用喷射式清洗方式去除未结合的一抗；
10)第二次二抗孵育：先滴加100uL Reaction buffer清洗缓冲液后，再滴加100μL连有AP的二抗(ULtraview Universal AP RED试剂盒中的MuLtimer试剂)，于37℃孵育12min，采用喷射式清洗方式去除未结合的二抗；
11)Fast red显色：滴加ULtraview Universal AP RED试剂盒中的Naphthol试剂和Fast red试剂各100μL，于37℃显色8min，采用喷射式清洗方式终止显色；
12)复染：滴加苏木素染液100μL，于37℃孵育12min，采用喷射式清洗方式去除未结合到组织上的苏木素染料；
13)返蓝：滴加返蓝液100μL，于37℃孵育4min，采用喷射式清洗方式进行清洗。
以上染色步骤中，喷射清洗时均采用pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行清洗。
使用武汉康录生物技术股份有限公司的人类HER-2基因扩增检测试剂盒，进行荧光原位杂交检测，操作步骤为：
(1)将权利要求3进行过免疫组织化学双染色检测的切片放于荧光显微镜下观察，若细胞间隙有Fast red的非特异性着色，则将切片泡于37℃体积分数为75％的乙醇(含有体积分数为0.1％的盐酸)中35～40min，去除Fast red的非特异性着色；
(2)将切片浸泡于温度为90℃的通透剂中5min；
(3)使用胃蛋白酶，将切片于37℃消化5～10min；
(4)使用2×SSC缓冲液，将切片于室温洗涤2次，每次5min；
(5)将切片，依次浸泡于体积分数为70％乙醇、80％乙醇、100％乙醇中，各2min；
(6)室温晾干切片；
(7)向切片上滴加10μL HER-2/CEP17双探针，加盖盖玻片，使用封边胶封边；
(8)将切片放入杂交仪内，85℃变性5min，42℃杂交16h；
(9)去除切片的封边胶，揭掉盖玻片，使用2×SSC缓冲液，室温洗涤切片1min；
(10)使用pH7.0、体积分数为0.3％NP-40/0.4×SSC溶液(该溶液的溶质为NP-40，溶剂为0.4×SSC，0.3％是指NP-40所占的体积分数，0.4指的是0.4倍)，于68℃洗涤切片2min；
(11)使用去离子水，于37℃洗涤切片1min；
(12)室温晾干切片，滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚DAPI，加盖盖玻片；
(13)使用荧光显微镜观察切片，进行精准定位。
结果判定：E-Cadherin抗体经免疫组织化学双染色，将乳腺癌细胞将染为棕黄色，P63、CK5/6抗体经免疫组织化学双染色将乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞染为红色，浸润癌及微小浸润癌周围没有肌上皮细胞。Fast red的红色显色在荧光显微镜暗视野的汞灯照射下呈现明亮的红色，DAB的棕黄色显色在荧光显微镜暗视野的汞灯照射下没有荧光反应。
精准定位的具体方法为：首先在荧光显微镜的明视场下找到染为棕黄色的乳腺癌细胞核，然后关闭明视场光源，打开暗视野的汞灯；若乳腺癌细胞团周围有明亮的红色荧光，说明有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为导管原位癌；若乳腺癌细胞团周围没有明亮的红色荧光，说明没有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为浸润癌或微小浸润癌。
观察明确为浸润癌或微小浸润癌细胞核内荧光原位杂交的信号点，即可对荧光原位杂交的信号点进行计数判读。

Claims (10)

1.一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，其特征在于，在同一张切片上先进行免疫组织化学双染色，然后进行荧光原位杂交检测，根据免疫组织化学Fast red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，精准定位乳腺浸润癌或微小浸润癌的位置。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫组织化学双染色是将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，使用辣根过氧化酶显色系统，选用染色抗体E-Cadherin进行DAB显色，此时乳腺癌细胞浆被染为棕黄色；使用碱性磷酸酶显色系统，选用染色抗体P63、CK5/6进行Fast red显色，此时乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞被染为红色；再用HER-2/CSP17双探针对上述切片进行荧光原位杂交检测。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，免疫组织化学双染色的操作步骤为：
(1)将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，切片的厚度为4μm；
(2)于65℃烤箱内烘烤切片1h；
(3)使用全自动免疫组化染色系统进行免疫组织化学双染色，染色抗体分别为：P63、CK5/6、E-Cadherin。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全自动免疫组化染色系统的染色步骤为：
1)烤片：于75℃烤片4min；
2)脱蜡：脱蜡试剂为Ventana EZ Prep脱蜡液，脱蜡温度75℃，脱蜡时间20min；
3)抗原修复：采用热修复方式，抗原修复液为Ventana CC1抗原修复缓冲液，抗原修复时间为52min，温度为99℃；
4)孵育：使用内源性过氧化物酶抑制剂，于37℃下，孵育4min后，进行清洗；
5)一抗孵育：滴加E-Cadherin抗体100μL，于37℃孵育28min后，清洗去除未结合的一抗；
6)二抗孵育：滴加100μL连有HRP的二抗，于37℃孵育8min后，清洗去除未结合的二抗；
7)DAB显色：滴加DAB试剂和H2O2试剂各100μL，于37℃显色8min后，进行清洗，终止显色；
8)变性：升温至94℃，并维持4min，对结合在组织上的一抗和二抗进行变性破坏，防止后续产生交叉反应；
9)第二次一抗孵育：滴加抗体CK5/6和P63各100μL，于37℃孵育24min后，清洗去除未结合的一抗；
10)第二次二抗孵育：先滴加100uL Reaction buffer清洗缓冲液后，再滴加100μL连有AP的二抗，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的二抗；
11)Fast red显色：滴加Naphthol试剂和Fast red试剂各100μL，于37℃显色8min，进行清洗，终止显色；
12)复染：滴加苏木素染液100μL，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的苏木素染料；
13)返蓝：滴加返蓝液100μL，于37℃孵育4min后，进行清洗。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述连有HRP的二抗为ULtraview UniversalDAB试剂盒中的MuLtimer试剂；所述连有AP的二抗为ULtraview Universal AP RED试剂盒中的MuLtimer试剂。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内源性过氧化物酶抑制剂为ULtraviewUniversal DAB试剂盒中的Inhibitor试剂；所述DAB试剂和H2O2试剂来自ULtraviewUniversal DAB试剂盒；所述Naphthol试剂和Fast red试剂来自ULtraview Universal APRED试剂盒。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，清洗时采用喷射式清洗方式，使用pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行清洗。
8.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，荧光原位杂交检测的操作步骤为：
(1)将进行过免疫组织化学双染色检测的切片放于荧光显微镜下观察，若细胞间隙有Fast red试剂的非特异性着色，则将切片泡于37℃、体积分数为75％酒精中35～40min，去除Fast red试剂的非特异性着色；所述酒精溶液中含有体积分数为0.1％的盐酸；
(2)将切片浸泡于温度为90℃的通透剂中5min；所述通透剂来自人类HER-2基因扩增检测试剂盒；
(3)使用胃蛋白酶，将切片于37℃消化5～10min；
(4)使用2×SSC缓冲液，将切片于室温洗涤2次，每次5min；
(5)将切片依次浸泡于体积分数为70％乙醇、80％乙醇、100％乙醇中，各2min；
(6)室温晾干切片；
(7)向切片上滴加10μL HER-2/CEP17双探针，加盖盖玻片，使用封边胶封边；所述HER-2/CEP17双探针来自人类HER-2基因扩增检测试剂盒；
(8)将切片放入杂交仪内，85℃变性5min，42℃杂交16h；
(9)去除切片的封边胶，揭掉盖玻片，使用2×SSC缓冲液，室温洗涤切片1min；
(10)使用体积分数为0.3％NP-40/0.4×SSC溶液、pH为7.0，于68℃洗涤切片2min；
(11)使用去离子水，于37℃洗涤切片1min；
(12)室温晾干切片，滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚DAPI，加盖盖玻片；
(13)使用荧光显微镜观察切片，进行精准定位。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述精准定位的具体方法为：首先在荧光显微镜的明视场下找到细胞浆染为棕黄色的乳腺癌细胞，然后关闭明视场光源，打开暗视野的汞灯；若乳腺癌细胞团周围有明亮的红色荧光，说明有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为导管原位癌；若乳腺癌细胞团周围没有明亮的红色荧光，说明没有肌上皮细胞的存在，这团乳腺癌细胞则为浸润癌或微小浸润癌。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌区，观察明确为浸润癌或微小浸润癌细胞核内荧光原位杂交的信号点，对信号点进行计数得出检测结果。
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