CN115103695A - 胶原蛋白支架的稳定 - Google Patents

Abstract

公开了形状稳定的胶原蛋白支架和获得此类支架的方法。基质可以例如从人或猪角膜基质中采集并在切除期间或在切除后的单独步骤中成形。所述支架可以通过以下来压紧：从所述支架中去除一些或全部的水并且以受控方式(例如，在模具或其它受限空间中)使所述支架再水合，使得所述支架具有期望的压紧形状；以及然后使所述支架的至少一部分交联以机械地加强所述支架并抑制随后的溶胀。可以采用各种能量源来诱导胶原蛋白的交联，包含例如紫外(UV)辐射。也可以选择性地将所述支架致密化或图案化。本发明特别适用于形成作为用于附加眼科外科手术中的角膜内植入的具有增强刚度和足够光学清晰度的稳定微透镜的支架。

Description

胶原蛋白支架的稳定

背景技术

由异常屈光病状引起的视力障碍，例如屈光不正对于所有年龄段的患者来说可能是一个严重的问题，并且通常但并非总是可以通过减影激光手术进行治疗。最近，已经开发了附加技术，所述技术涉及在切开瓣并折回以暴露角膜的基质内区域之后将微透镜移植到患者的角膜中。微透镜的形状通过改变其曲率来改变患者角膜的光学能力。然后可以在微透镜顶部更换瓣。在如圆锥角膜等其它情况下，植入的微透镜可以机械地稳定或规范异常基质并减缓疾病进展。在圆锥角膜病例中，更常形成基质袋而不是瓣。

然而，若干问题限制了附加(微透镜)技术的广泛接受。首先，供体人类角膜形成微透镜的可用性非常有限。另外，当从非人来源获得微透镜时，必须对微透镜进行脱细胞以最小化免疫反应。此外，由于微透镜(胶原蛋白的结构层)的性质，它们很脆弱并需要特殊处理。通常，脱细胞进一步削弱结构和/或改变渗透特性，使得脱细胞的微透镜易于发生术后溶胀，从而在外科手术时的适当屈光矫正可能无法如此保持。因此，需要更好的方法来稳定可植入微透镜和其它基于胶原蛋白的支架。

胶原蛋白广泛存在于人体内。例如，胶原蛋白存在于肠、静脉、关节、皮肤、内膜、心室瓣膜以及角膜中。

然而，角膜中的基质胶原蛋白在许多方面都是独特的。除了水，胶原蛋白构成角膜基质的主要组分。基质的其它组分包含葡糖氨基葡聚糖(GAG)和蛋白聚糖。活细胞仅占角膜基质的约1％到4％。人体基质由约100个到150个薄片组成，每个薄片含有平行的胶原蛋白原纤维。为了透明，胶原蛋白原纤维层表现出平面内对准，其中层或薄片之间具有接近理想的间距分布。没有其它器官含有以这种方式布置的胶原蛋白原纤维。

基质胶原蛋白在平面内方向上表现出高拉伸强度，但在垂直于平面方向上明显较弱。脱细胞的基质表现出进一步的弱点。如果要将此类脱细胞的基质胶原蛋白用作支架，则需要更佳的增强其机械强度的方法。

发明内容

公开了稳定胶原蛋白支架的方法，由此可以采用水提取和/或压缩(或干燥和受控再水合)以及交联来使所述支架成形、机械地加强所述支架并抑制其在水性环境中溶胀的趋势。所述方法在制备作为微透镜的胶原蛋白支架时可能特别有用，所述微透镜用于作为附加屈光外科手术的一部分的基质内或角膜内植入。

由胶原组织形成的支架可以为角膜提供机械优势。然而，由于支架通常由于脱细胞过程而被机械地削弱，所以其需要在被放置到所述基质中或所述基质上之前被加强和定向。在本发明的一方面，公开了由供体胶原组织形成支架并且加强所述支架的方法，所述方法包含以下步骤：从供体胶原组织源(例如，供体角膜基质)的中心区域切除一部分组织；使所述组织部分成形以提供第一期望形状的支架；使所述支架脱细胞；压紧所述支架(例如，在通常垂直于所述支架的板层结构的方向上)以去除所述支架中存在的过量流体并提高胶原蛋白密度；以及使所述支架的至少一部分交联以机械地加强所述支架并且当所述支架暴露于水性环境时抑制随后的溶胀。

可替代地，本发明的方法可以通过以下来实践：从供体胶原组织源(例如，供体角膜基质)的中心区域切除一部分组织；任选地使所述组织部分成形以提供第一期望形状的支架；使所述支架脱细胞；通过从所述支架中去除一些或全部的水并且以受控方式(例如，在模具或其它受限空间中)使所述支架再水合，使得所述支架具有期望的压紧形状来压紧所述支架；以及然后，再次使所述支架的至少一部分交联以机械地加强所述支架并且当所述支架暴露于水性环境时抑制随后的溶胀。

重要的是，本发明的方法可以增强胶原蛋白支架的机械强度和化学稳定性。当旨在用作角膜内可植入微透镜时，也可以使用交联来恢复和/或保持所述支架的光学清晰度(例如，透明度)。

在某些实施例中，所述切除和所述初始成形的步骤可以同时进行。所述使所述支架脱细胞的步骤可以进一步包含用洗涤剂或表面活性剂裂解细胞并从所述微透镜中去除细胞碎片；并且任选地可以进一步包含从所述微透镜酶促地去除至少一个免疫原性表位。一种可用于使所述支架脱细胞的溶液可以包括水、乙醇和甘油。所述脱细胞溶液也可以用于压紧所述支架，尤其是在采用受控再水合步骤时。可替代地，脱细胞之后可以进行干燥。也可以操纵所述支架的朝向。只要可行，本文所述的方法步骤可以以任何顺序执行。

在不受任何特定操作理论的束缚的情况下，所述胶原蛋白支架的机械加强不仅是交联的结果，而且也是胶原蛋白原纤维压紧(或受限)成更紧密束的结果。致密化的原纤维束的交联可以使得材料强度的改善超出单独交联可实现的改善。

在本发明的方法中，所述交联步骤可以进一步包含将压缩的支架的至少一部分暴露于交联剂或能量介导剂或将所述压缩(或受限)的支架的至少一部分暴露于辐射，以在有或没有能量介导剂的协助下通过胶原蛋白原纤维之间的肽键形成诱导交联。还公开了化学交联和光交联的组合，由此化学试剂可以诱导不同的化学键并在所述胶原蛋白原纤维之间物理地形成机械桥。

所述交联步骤可以通过将压缩的(或以其它方式压紧的)支架的至少一部分暴露于辐射来进行，所述暴露通过直接暴露或通过以掠射角或通过耦接到所述支架表面的消散波导暴露于此类辐射来进行。所述交联可以进一步包含将所述压缩的支架的表面部分暴露于辐射，使得表面部分表现出比所述支架的本体区域更大的交联和更高的胶原蛋白密度。

优选地，所述压缩/压紧和交联的步骤使得所述支架的至少一部分具有大于初始脱细胞的支架片段的胶原蛋白组成或密度。例如，所述压缩的和交联的支架的至少一部分可以具有至少20％的胶原蛋白组成，优选地超过35％的胶原蛋白组成。

可以实践本发明的方法，使得所述支架被配置成用作具有微透镜主体、定向前表面和后表面的可植入角膜内微透镜，并且所述方法进一步包括用交联剂或通过选择性地施加图案化辐射来促进所述微透镜与基质床的粘附来处理所述微透镜的所述后表面的至少一部分。在某些实施例中，所述方法可以包含以下步骤：由供体基质形成微透镜，通过微透镜提取从供体基质的中心区域去除一部分组织，将所去除的组织部分成形为具有第一期望形状的微透镜，所述微透镜具有微透镜主体、前表面和后表面，从所述微透镜中去除细胞材料；去除存在于所述微透镜中的过量流体(例如，最初存在于所述基质中的水和在脱细胞期间可能已经引入所述微透镜中的任何其它流体)；以及使所述微透镜的至少一部分交联以限定最终期望的形状并当所述微透镜暴露于水性体内环境时抑制随后的溶胀。可以通过用角膜刀或飞秒激光或准分子激光或水射流进行的微透镜切除或提取来进行微透镜形成。

本文公开和要求保护的微透镜制造方法不是通过外科手术或疗法治疗人体或动物体的方法。相反，本文公开的方法是在已经从人或动物来源切除的供体角膜基质组织上进行的。类似地，虽然通过所公开的方法形成的微透镜可以用作角膜内植入物，但实际植入对于实践本文要求保护的制造方法不是必需的。

所述微透镜的交联可以通过将所述压缩的支架的至少一部分暴露于交联剂或能量介导剂或通过将所述压缩的支架的至少一部分暴露于辐射以在有或没有能量介导剂的协助下通过胶原蛋白原纤维之间的肽键形成诱导交联来进行。例如，微透镜的交联可以包含通过直接暴露或通过以掠射角或通过耦接到所述支架表面的消散波导暴露来将所述压缩的支架的至少一部分暴露于辐射。在某些应用中，紫外辐射是优选的能量源。

也可以采用胶原蛋白交联的化学方法。这些方法可以包含使用化学试剂(例如，京尼平(genipin))或光化学试剂。例如，美国专利申请公开第2017/0119928号公开了通过使心包组织脱细胞以获得胶原基质材料来形成心脏瓣膜假体的方法，所述胶原基质材料可以与含戊二醛的溶液交联并成形为用于植入的期望的结构。

辐射交联可以比化学交联更有利，因为所得微透镜通常更透明，使得在植入受体角膜中后视敏度更佳。

所述压紧的支架的辐射交联可以用比非压紧(流体负载)支架所需的能量少得多的能量来实现。例如，对于压紧后的典型微透镜，可以通过积分通量小于约15焦耳/cm²或在一些情况下小于约2500焦耳/cm²的紫外辐射来实现交联。更通常地，期望的积分通量的范围为约15焦耳/cm²到约600焦耳/cm²。可用于使胶原蛋白支架交联的一个特定波长范围通常对应于“UV-C”波长带的一部分，例如从约185nm到约280nm。在一些情况下也可以使用其它UV波长带(范围从约280nm到约315nm(或320nm)的UV-B带或从约315nm(或320nm)到约400nm的UV-A带)以及X射线、γ辐射或电子束来诱导所述支架的至少部分交联和/或灭菌。

因为脱细胞的胶原蛋白支架表现出一定量的“形状记忆”或“压缩滞后”，所以可以单独将其压缩，然后将其交联，而不再受所述压缩模具的约束。此分离(顺序)是一种替代制造过程。然而，在大多数情况下，优选的方法是在所述支架在所述模具中保持压缩/压紧的同时诱导交联。在任一种情况下，压紧的胶原蛋白束的交联与分散的胶原蛋白原纤维布置的交联相比产生更大的强度。

在本发明方法的另一方面，所述交联步骤可以进一步包含将所述压缩的支架的表面部分暴露于辐射，使得表面部分表现出比所述支架的本体区域更大的交联和更高的胶原蛋白密度的步骤。此外，所述交联步骤还可以包含施加足够的辐射以使任何微生物剂灭活并对所述微透镜进行灭菌。在某些实施例中，所述使所述支架脱细胞的步骤可以涵盖用洗涤剂或表面活性剂从所述微透镜中去除细胞碎片；并且任选地进一步包括从所述微透镜酶促地去除至少一个免疫原性表位。

另外，所述压缩和交联的步骤可以使得所述支架的至少一部分具有大于初始胶原组织片段的胶原蛋白密度。所述交联步骤可以进一步包含选择性地向所述前表面施加辐射，使得前表面区域表现出比所述微透镜主体的本体区域更大程度的交联或更大的胶原蛋白密度。

在本发明的另一方面，交联还可以有利地改变由本教导形成的微透镜和支架的“刚度”。在哺乳动物角膜组织中，大多数胶原蛋白原纤维“水平”对准(或可替代地表达，与所述角膜表面相切)。原纤维由缠绕在初级、次级和/或三级线圈中的非常长的胶原蛋白分子制成。

根据本教导，可以诱导若干种不同类型的交联。例如，可以在胶原蛋白的所述三级线圈内诱导交联，作为一种胶原蛋白-胶原蛋白桥。这种交联可以通过使单个线圈更牢固地相互粘附，从而降低胶原蛋白原纤维的纵向弹性(例如，变硬)。这种交联的速率对所述支架压缩不太敏感，因为所述线圈是“水平”定向的，并且所述压缩在很大程度上不会影响单个原纤维的紧密度。这种交联的量通常与累积的辐射剂量成正比，并且压缩/压紧状态的意义有限。第一种类型的交联使所述角膜组织更容易在与所述表面“平行/切向”的方向上拉伸，正如通过眼内流体的IOP拉伸基质的情况。

第二种交联可以发生在属于不同(但相邻的)胶原蛋白链或原纤维的胶原蛋白之间。这种桥通常不涉及直接的胶原蛋白-胶原蛋白键，相反连接由如GAG或蛋白多糖等其它分子介导(桥接)。与第一类型相比，此第二类型的交联对所述支架的压缩/压紧非常敏感，并且可以诱导所述支架的机械特性/行为的三种不同的变化。

二次交联(由原纤维之间的桥分子介导)增加了抗溶胀性。这种抗性是所述微透镜或支架的“竖直”(径向)硬化的直接表现。竖直桥抵抗相邻原纤维之间距离的变化。当植入人体基质中时，二次交联还诱导所述支架对渗透塌陷的抗性。这种抗性是由压紧和随之而来的GAG和蛋白聚糖的更高浓度(每单位体积)导致的，这将表现出比受体的天然基质更高(或至少相等)的渗透压。此外，二次交联将抑制胶原蛋白原纤维层之间的滑动。这种约束使所述支架相对于天然人基质的抗弯曲力增强。

供体组织的脱细胞本身会部分去除(降解)所述组织的GAG和蛋白聚糖，从而使脱细胞的组织表现出比天然人基质(约50到60mm Hg)更低的渗透压，并且可能引起所述支架在植入时塌陷。另一方面，压缩(或压紧)可以恢复所述支架的完全渗透压，但其厚度低于供体的微透镜的原始厚度(脱细胞前)。作为疏水材料的胶原蛋白对渗透特性的贡献很小。然而，GAG和蛋白聚糖的浓度增加(在更小的空间中)增强了其对渗透压的贡献。换言之，压缩/压紧补偿了GAG和蛋白聚糖的脱细胞损失，并恢复了其浓度，但体积更小。

因此，交联可以锁定所述压紧的微透镜的增强的渗透特性，以防止在形成期间的溶胀，同时还防止在植入后在渗透相互作用发挥作用时微透镜在体内的塌陷。换言之：根据本教导的交联在植入前和植入后以两种方式使所述微透镜渗透地稳定。

在本发明的另一方面，通过本教导可以获得刚度增加的微透镜和支架。交联的胶原蛋白的所述刚度可以例如通过称为模量的参数μ来量化。天然人角膜胶原蛋白的模量μ的标称标准值可能因人群而异。例如，对于年轻的人眼，角膜胶原蛋白的平均模量μ可以为约5×10⁴帕斯卡(Pa)。对于老年个体，模量μ可以高达1.2×10⁵Pa。此外，对于猪眼(其可以是可植入微透镜胶原蛋白和支架胶原蛋白的重要来源)，角膜胶原蛋白的平均模量μ可以低至约2×10⁴帕斯卡(Pa)。

作为根据本教导的压紧和交联的结果，可以获得的胶原微透镜和支架表现出大于2×10⁴Pa、或大于8×10⁴Pa、或大于1.6×10⁵Pa、或大于2×10⁵Pa、或大于3×10⁵Pa、或大于5×10⁵Pa、或大于8×10⁵Pa、或大于1×10⁶Pa、或大于3×10⁶Pa、或大于5×10⁶Pa、或大于1×10⁷Pa的模量刚度μ。

例如，根据本教导的微透镜(包含支架)可以表现出范围为1×10⁴Pa到1×10⁷Pa、或2×10⁴Pa到8×10⁶Pa、或1×10⁵Pa到5×10⁶Pa、或3×10⁵Pa到5×10⁶Pa、或1×10⁶Pa到2.6×10⁶Pa的模量值μ。

在本发明的又另一方面，公开了脱细胞的胶原微透镜，所述微透镜具有源自供体组织的微透镜主体，所述微透镜主体具有前表面和后表面，所述前表面和后表面被形成以为所述微透镜提供期望的形状和朝向。例如，所述微透镜可以具有经常但不总是与所述微透镜的所述前表面和所述后表面重合的凸侧和凹侧。所述微透镜主体可以包含胶原蛋白层，所述胶原蛋白层已经脱细胞和压缩/压紧以实现大于15％或25％胶原蛋白的组成并且可以进一步至少部分地交联以抑制轴向溶胀。对于本体交联微透镜，所述组成可以为大于30％的胶原蛋白。此外，如果期望局部致密化层(例如，近似锥形结构，如鲍曼氏膜(Bowman's membrane))，则局部胶原蛋白浓度可以甚至更高(例如，大于35％或大于40％或甚至大于60％的胶原蛋白)。

在某些实施例中，所述微透镜的特征在于通过施加辐射而交联的胶原蛋白层，并且所述微透镜的特征还可以进一步在于胶原蛋白原纤维之间的诱导的肽键。所述微透镜可以是90％到100％，或优选地95％到99.99％不含细胞材料并以期望的形状形成，使得在脱细胞、压缩和交联之后，可以将所述微透镜植入患者的眼中以改变角膜屈光力或替换或加强所述基质的受损或患病区域。

根据本发明的微透镜通常具有弯曲的盘状形状和约0.5mm到约10mm的直径。其通常还具有范围为约600微米到约50微米，更优选地约400微米到约100微米的最大厚度。所述微透镜通常不具有均匀的厚度，并且最小厚度可以小于约50微米，更优选地小于约30微米或小于约15微米。

由于免疫原性表位的降解，所述微透镜应表现出低免疫反应性。在某些实施例中，所述微透镜的至少一个表面进一步包含可变交联的图案，以在基质内植入患者的基质床中时促进所述微透镜与基质床的粘附。所述微透主镜还可以具有前表面，所述前表面的前表面区域具有比所述微透镜主体的本体区域更大的胶原蛋白密度。例如，所述前表面区域的胶原蛋白密度可以是至少约35％或40％或60％的胶原蛋白。

因此，本发明公开了稳定胶原微透镜和支架的形状的方法。胶原组织可以从人或动物来源的任何胶原来源中采集。在某些优选实施例中，所述组织可以从人或猪基质中采集。所述源组织可以在切除期间或在切除后的单独步骤中成形。可以通过各种技术使所述组织成形、脱细胞和稳定，其中若干技术将在下文更详细地描述。在成形和脱细胞之后，使切除的胶原组织片段经受压缩/压紧以减少流体含量并被辐照以诱导胶原蛋白链或原纤维的交联。可以在有或没有化学中间体(例如，交联剂)的情况下诱导交联。在某些优选实施例中，交联是通过暴露于足够高能的辐射而在胶原蛋白原纤维之间形成肽键来实现的。这种高能辐射是期望的，因为在所述胶原蛋白链之间产生肽键通常是吸热反应。可以采用各种能量源来诱导肽键交联。在某些优选实施例中，所述能量通过紫外(UV)辐射递送。

本发明通常特别适用于一般地从分层胶原组织采集并且具体地从角膜基质采集的胶原蛋白支架的空间稳定化。所述源组织的分层胶原蛋白布置可能已经针对光学透明度而自然进化，但当暴露于水性环境时可能导致机械弱点和/或渗透性溶胀趋势。因此，本发明的一个目的是抑制此类溶胀和/或为最终支架提供更大的轴向机械强度。本发明还可以应用于未分层(或混乱)切除的胶原组织片段。

在本发明的另一方面，如果所述支架是用于角膜植入的微透镜，则公开了用于改变所述支架的至少一个表面(例如，所述前表面)上的胶原蛋白密度或平滑度的方法。此类表面改变可以使所述支架在植入后更容易操纵，例如，如果必须重新打开上覆瓣以接近植入物。所述表面改变可以通过辐照和/或化学试剂的应用来实现。

公开了来自同种异体移植物和/或异种移植物来源的脱细胞的和成形的角膜组织微透镜以及获得此类微透镜的方法。所述微透镜特别可用作角膜移植术手术中的基质内或角膜内微透镜植入物，其中在患者的角膜中形成铰链式瓣并将所述铰链式瓣沿其铰链折回以暴露所述角膜的基质床。然后将成形的微透镜应用于所述基质床，并且使所述瓣返回其原始位置，从而赋予所述角膜新的曲率并实现期望的屈光矫正。新屈光力的微调可以通过激光烧蚀来实现，既可以在植入的同时进行，也可以在以后出现退化或紧张性改变的情况下进行。

在本发明的一方面，公开了脱细胞的角膜微透镜和使角膜组织脱细胞以减少患者的部位对植入的微透镜的潜在免疫原性反应的方法。只有约1％到4％的典型角膜是由细胞构成的。其它96％到99％主要是细胞外基质(ECM)，所述细胞外基质主要是胶原蛋白、葡糖氨基葡聚糖(GAG)和蛋白聚糖以及水。在一个优选实施例中，通过用如十四烷基硫酸钠(STS)等表面活性剂处理或通过酶促溶解去除所述微透镜的细胞组分。如果期望，可以采取另外的步骤来进一步降低所述微透镜的免疫原性，特别是如果所述来源是非人(异种)供体。例如，异种组织中可能存在的两个非人表位是neu5GC和α-Gal。这些不期望的表位可能不仅存在于基质细胞内部或表面上；一部分所述表位可能嵌入所述GAG内，所述GAG也称为粘多糖，包裹ECM胶原蛋白原纤维。在此类情况下，此类表位可以通过激酶处理和另外的洗涤至少部分地选择性去除。

本发明的脱细胞的微透镜通常去除了95％到100％的细胞材料。优选地，所述微透镜是95％到99.99％无细胞的。在不列举95％与100％之间的每个可能的子范围的情况下，应该清楚的是，所有此类子范围都被考虑和认为是本发明的一部分。例如，所述微透镜可以95％到97％、97％到99％或98％到99.9％不含细胞材料。

在本发明的另一方面，根据本发明的圆盘形微透镜是通过从供体角膜切割圆盘形组织片段获得的。所述组织片段可以被切片和/或进一步成形或切割，其方式使得在切片程序期间获得期望的形状。切割可以机械地，例如用微型角膜刀等，通过激光加工，例如或通过用飞秒激光的光切割，或通过准分子激光或通过水射流来进行。为了减少不对称的可能性，所述组织片段优选地例如利用保留在所述微透镜的中心处的供体角膜的光轴或几何轴而取自供体角膜的中心部分。所述组织片段的形状将取决于矫正所述患者的屈光不正所需的屈光度变化。例如，为了矫正远视(hyperopia或hypermetropia)和/或老花眼，目标通常是增加角膜的曲率，并且期望的微透镜形状将在至少一侧略微凸出。通常，所述微透镜的最大厚度将小于400微米，或在许多情况下小于200微米，或小于100微米，或小于50微米。几乎所有应用的最大厚度都小于600微米。在一些情况下，如果将所述圆盘微透镜形成为将光重定向到视网膜的不同部分的棱镜，则可以实现患有黄斑变性的患者的视力改善。

圆锥角膜的治疗不仅可以包含减少视觉畸变，还可以包含对患病基质的机械加强。为此目的，优选厚度在50微米与300微米之间的共面圆盘，其中在圆盘周边具有过渡倾斜(楔形)区域。可替代地，用于治疗圆锥角膜的微透镜可以利用从供体角膜继承的自然曲率，或者在压缩/压紧和/或交联期间可以通过使用弯曲模具引入另外的曲率程度。在一些情况下，在治疗圆锥角膜时将微透镜“倒置”植入，例如使得所述微透镜的曲率与受体角膜的曲率相反可能是有利的。

虽然在一些情况下可能期望弯曲模具，但压缩/压紧和交联步骤也可以用平坦模具执行。(平坦模制可以有利于储存和运输或制造效率。)在本发明的另一方面，可密封缩放的模具可以用于压缩/压紧和储存。

施加到所述支架的一个表面的压力也可以用于改变其曲率和/或重新对准胶原蛋白原纤维(或保持其对准)。例如，支架可以固定到室中的开口，所述开口然后填充有加压流体以在所述支架的一侧施加压力，从而向所述支架施加水平/切向力。流体压力将使所述支架膨胀(像气球一样)。压缩板可以任选地施加到相对的表面。例如，可以使用弯曲(拟凹)压缩板来限制所述支架可以拉伸或重新成形的程度。当获得期望的曲率时，可以使用交联来保持期望的形状和/或抑制这样操纵的支架在基质内或角膜内植入时溶胀的趋势。

在一些实施例中，保留顶部基质表面，即所谓的“鲍曼氏膜”，使得所述微透镜的所述前表面将表现出与其它(后)表面不同的纹理可能是有利的，因为角膜的此自然前片段由于基质组织最外层的自然冷凝而更加致密和平滑。可替代地，切除的片段可以取自所述基质的所述中心区域，并且前表面可以在成形和切除后通过选择性交联进行致密化，如下文更详细描述的。所述后表面(与前表面或鲍曼氏膜相对)由于基质组织密度较小以及其是通过所述组织的机械或激光切割形成的事实而将更粗糙。当所述微透镜用于基质内或角膜内植入时，这种粗糙度差异可能特别有利，因为可能非常期望所述微透镜牢固地粘附于所述基质床。如果在手术后观察到低于最佳的屈光结果，则可能需要再次将所述瓣折回以允许通过激光烧蚀等进行进一步的角膜移植术(重新雕刻所述微透镜)。所述微透镜从其在基质床中的原始位置的任何移动都可能损害此角膜移植术的有效性。此外，所述微透镜的所述前表面的平滑度还使得重新打开所述瓣将所述微透镜移出的可能性较小。

在本发明的又另一方面，所述后表面可以在切除、成形和脱细胞之后进行处理，以使所述表面更粘附于所述基质床。例如，可以在灭菌和包装之前应用交联剂。可替代地，临床医生可以在植入前的手术期间应用粘附增强剂。可以对所述前表面进行处理以使其与所述瓣的粘附性降低。

附图说明

图1A是切除的基质组织的示意性横截面图；

图1B是切除的基质组织片段在脱细胞后的示意性横截面图，其示出了组织的溶胀和随之而来的胶原蛋白原纤维的分离；

图1C是根据本发明的切除的基质组织片段在脱细胞、压缩/压紧和交联之后的示意性横截面图；

图2是切除的基质组织片段在前表面区域的脱细胞、压缩/压紧和选择性交联之后的示意性横截面图；

图3是切除的基质组织片段在后表面区域的脱细胞、压缩/压紧和选择性图案化之后的示意性横截面图；

图4A展示了根据本公开的呈扁平形状的微透镜，所述扁平形状是制造和/或运输期间的典型形状；

图4B展示了在准备用于角膜内植入时处于最终弯曲状态的微透镜；

图5A展示了被设计成用于角膜内植入以矫正远视病状的微透镜；

图5B展示了被设计成用于角膜内植入以矫正近视病状的微透镜；

图5C展示了被设计成用于角膜内植入以矫正老花眼病状的微透镜；

图5D展示了被设计成用于角膜内植入以矫正称为圆锥角膜的病状的微透镜；

图6A展示了被制造为具有强交联的局部斑点的微透镜的另一个实施例；

图6B展示了微透镜的又另一个实施例，所述微透镜包含具有中等交联的中央光学活性区和具有强交联的外部或外围区；

图7A展示了将微透镜用于深前板层角膜移植术(DALK)的用途；

图7B展示了被配置成放置在患者完整的鲍曼氏膜顶部的微透镜的用途；

图7C展示了用于穿透性角膜移植术(PK)手术的微透镜的又另一个实施例；

图8A和8B展示了厚微透镜周边的两种替代性设计；

图8A示出了具有简单的，例如圆柱形或圆锥形外围边缘的微透镜；

图8B示出了在外围具有锯齿形或阶梯形边缘的微透镜；

图8C示出了在外围具有“锁和钥匙”边缘的微透镜；

图9是根据本发明的用于压缩胶原蛋白支架并使胶原蛋白支架交联的压力机设备的示意性透视图；

图10A和10B展示了根据本发明的两部分可密封缩放压缩和储存模具；

图10A示出了支架压缩前的模具；

图10B展示了压缩后的模具；

图10C展示了用于压缩/压紧支架的替代模具的分解图；

图10D以组装形式示出了图10C的模具；

图10E是图10D的模具的俯视图；

图10F是图10C到10E的模具的横截面视图；

图11展示了根据本发明的用于拉伸支架的另外的设备；

图12示出了又另一个替代设备，所述设备类似于图11的设备，但增加了压缩施加板元件，用于同时拉伸和压缩支架，以及便于暴露于交联辐射；

图13展示了用于测量根据本公开生产的微透镜的透明度的设备；

图14是用图13等的设备可获得以量化光学清晰度的亮度分布曲线图；

图15A是用于测量根据本公开的平面压缩/压紧和交联的微透镜的刚度(模量，μ)的仪器在其初始无应力状态下的示意性横截面视图；

图15B是图15A的仪器在施加测试力时的示意性横截面视图；

图16A是用于测量根据本公开的非平面、压缩/压紧和交联的微透镜的刚度(模量，μ)的仪器在其初始无应力状态下的示意性横截面视图；

图16B是图16A的仪器在施加测试力时的示意性横截面视图。

具体实施方式

本发明不限于所描述的特定过程、组合物或方法，因为它们可以变化。描述中使用的术语仅用于描述特定版本或实施例，并且不旨在限制本发明的范围。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入。本文中的任何内容均不应被视为承认本发明因现有发明而无权先于此公开内容。

术语“切割”涵盖任何已知的解剖、消融或去除生物材料的方法，例如，通过机械刀片、紫外(UV)激光、飞秒激光或水射流的作用。

术语“压缩(compression)”、“压缩的”和“压缩(compressing)”涵盖通过施加压力或通过如真空或离心力驱动的水提取等其它技术进行的压紧。术语“压缩”也通常用于描述在受限空间中的脱水和受控再水合，使得支架或微透镜具有期望的密度。术语“受限的”和“重构的”也用于描述在限制室中使组织部分脱水(或干燥)和受控再水合(或溶胀)以实现具有期望的形状和密度的微透镜或支架的过程。

术语“辐射”涵盖红外辐射、可见辐射和紫外辐射(例如，从约400nm降到大约193nm或更低)、X射线、γ射线和电子束。

术语“生物样品”是指组织、细胞、细胞提取物、均质组织提取物或一种或多种细胞产物的混合物。生物样品可以在合适的生理上可接受的载体中使用或存在。

除非上下文另有明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，提及“细胞”，即提及本领域的技术人员已知的一种或多种细胞和其等效物，等等。

如本文所使用的，术语“约”意指正被使用的数字的数值的正负10％。因此，约100μm意指在90μm到110μm的范围内。应当理解的是，本公开中给出的每一最大数值限制被认为包含每个和每一较低的数值限制作为替代，如同这种较低的数值限制在本文中明确写出一样。贯穿本公开给出的每一小数值限制被认为包含每个和每一较高的数值限制作为替代，如同这种较高的数值限制在本文中明确写出一样。贯穿本公开给出的每一数值范围被认为包含落在这样的较宽数值范围内的每个和每一较窄数值范围，如同这种较窄数值范围在本文中明确写出一样。

本文使用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包含但不限于人类和非人脊椎动物，如野生动物、家养动物和农场动物。术语“动物”、“患者”或“受试者”也指角膜微透镜移植的受体。术语“异种移植物”是指从动物收集用于捐赠的组织，所述动物包含猪(pig和porcine)、牛、猿、猴子、狒狒、其它灵长类动物和任何其它非人动物。“同种异体移植物”是指取自与受体相同物种的供体的组织。

一般而言，术语“组织”是指在执行特定功能时联合起来的类似特化细胞的任何聚集体。角膜基质是“组织”的实例，尽管其主要是无细胞的(约1％到5％是细胞的)。

术语“干燥”、“干燥的”等是指去除组织部分中一些或全部的水。例如，“干燥”可以去除组织中存在的50％与100％之间的水，优选地在一些情况下60％与95％之间的水。通常，为了实现期望的压紧程度，“干燥”可以通过去除组织部分中至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的水来实践。干燥可以通过化学过程，如乙醇流体交换，或通过物理手段，如真空干燥或冻干(例如，在含有干冰的室或另一种冷冻干燥设备中)来实现。

术语“微透镜”是指准备好植入受体的角膜之中或之上的脱细胞的、加工的供体角膜组织。除非另外指明，否则术语“微透镜”和“支架”在本文中可互换使用。使用时，每个术语旨在涵盖另一个。术语“胶原蛋白浓度”和“胶原蛋白百分比”在本文中可互换使用并且是指存在于微透镜或支架中的胶原蛋白的量。此浓度或百分比可以测量为完全干燥的微透镜，例如，真空干燥的微透镜相对于干燥前微透镜的重量(与水完全平衡)的重量分数。在一些情况下，乙醇可以用于改善干燥。

在微透镜植入的上下文中，术语“角膜内”是指将微透镜放置在角膜中或角膜上的任何手术。一种类型的角膜内植入是“基质内”植入，这是一种例如通过折回前组织的瓣或通过经外侧入路直接插入将微透镜放置于眼基质内，而不切除前鲍曼氏膜或上皮的手术。其它类型的角膜内使用微透镜包含深前板层角膜移植术(DALK)和穿透性角膜移植术(PK)，其中微透镜完全取代眼的前片段，如下文更详细地讨论的。又另一个可应用的“角膜内”手术是所谓的“表层角膜植片术”，其也在下文更详细地讨论。

术语“轴向”是指相对于微透镜或支架的朝向的方向。通常，成形的微透镜将以球形或椭圆盘状的形状弯曲，并且轴向方向或“轴线”将通常垂直于盘的中心。除非另外指明，否则“轴向”通常也几乎平行于或同轴于从中切除组织片段的眼或被设计用于植入微透镜的受体眼的视轴或光轴。(在天然眼中，光轴通常几乎但不完全穿过角膜的中心。)

行星物理学(球面几何学)可以提供方便的命名法来描述基质中胶原蛋白原纤维的空间布置。大多数胶原蛋白原纤维位于高纬度到中纬度轨道上并且只有一小部分位于极地轨道上。出于此原因，基质通常在中心(中间)区域/位置最薄。轴向方向的压缩可以称为极帽压缩或径向压缩。供体基质的中心区域在原纤维对准中表现出强烈的旋转对称性。在植入物被指定不仅在压缩下而且在拉伸应力下工作的情况下，优选从中心基质位置提取的微透镜以赋予植入物旋转对称的拉伸特性。

本公开还涉及来自同种异体移植物来源和/或异种移植物来源的脱细胞的角膜微透镜以及由供体基质形成微透镜的方法。所公开的脱细胞的角膜微透镜可以用于矫正异常屈光病状，如近视、远视、老花眼和散光，以及其它眼科病理。

角膜一般可以被认为由5层构成，从前到后为：角膜上皮、薄而致密的顶部基质层(在人眼中通常称为鲍曼氏膜)、角膜基质、德斯密氏膜(Descemet's membrane)和角膜内皮。角膜上皮由约6层生长快并且易再生的非角化分层鳞状上皮细胞构成。前基质层(例如，鲍曼氏膜)是主要由随机组织、紧密编织的I型胶原蛋白原纤维构成的坚韧的层。角膜基质是一层由以平行层布置的I型胶原蛋白纤维组成的厚而透明的层。德斯密氏膜是一层用作角膜内皮的基底膜并且由刚性较小的IV型胶原蛋白原纤维构成的无细胞薄层。最后，角膜内皮由富含线粒体的简单鳞状或低立方单层构成。

如本文所使用的，术语“鲍曼氏膜”用于描述来自人或供体动物角膜的任何角膜的前基质区域。尽管人角膜的致密化层可能更明显(并且因此，在人角膜中被称为鲍曼氏膜)，但所有角膜在某种程度上都表现出更高的前致密化和平滑度(相对于基质床组织)，这取决于动物物种和年龄。因此，“鲍曼氏膜”是贯穿本申请用于描述此前片段的术语。

如此，供体角膜的采集和加工以及微透镜的生产是矫正视力屈光不正的关键因素。微透镜特别可用作角膜移植术手术中的微透镜植入物，其中在患者的角膜中形成铰链式瓣并沿所述铰链式瓣的铰链折回以暴露角膜的基质床。然后将成形的微透镜应用于基质床，并且使瓣返回其原始位置，从而为角膜产生新的曲率并实现期望的屈光矫正。新屈光力的微调可以通过激光烧蚀来实现，既可以在植入的同时进行，也可以在以后出现退化或紧张性改变的情况下进行。

在本发明的某些实施例中，脱细胞的角膜微透镜可以包含源自供体基质的微透镜主体，所述微透镜主体具有：前表面，所述前表面包含来自供体基质的顶层的至少一部分；以及后表面，所述后表面被形成以为微透镜提供期望的形状；并且其中供体基质是脱细胞的。在其它实施例中，使微透镜成形而不考虑鲍曼氏膜和供体基质的任何顶部部分的保存。例如，微透镜可以通过基质组织片段的基质内切除，例如，通过用飞秒激光脉冲切除来形成。

在某些实施例中，采集供体基质并使其脱细胞，从而产生在患者方面的任何潜在免疫原性反应减少的微透镜。典型角膜的仅约1％到约4％由细胞构成。其它96％到99％主要是细胞外基质(ECM)，所述细胞外基质主要是胶原蛋白以及水、葡糖氨基葡聚糖(GAG)和蛋白聚糖。如上所述，本发明的脱细胞的微透镜通常去除了95％到100％的细胞材料。优选地，所述微透镜是95％到99.99％无细胞的。在不列举95％与100％之间的每个可能的子范围的情况下，应该清楚的是，所有此类子范围都被考虑和认为是本发明的一部分。例如，所述微透镜可以95％到97％、97％到99％或98％到99.9％不含细胞材料。在微透镜中剩余的细胞材料的量可以例如通过残留的DMA或RNA含量来测量。优选地，DNA或RNA含量小于原始DNA或RNA含量的1％重量或小于0.1％重量或小于0.01％重量。

脱细胞，即从供体基质中去除细胞材料，可以使用多种技术来完成。在一个优选实施例中，通过化学处理去除角膜的细胞材料。用于从角膜裂解和去除细胞的化学物质包含如十四烷基硫酸钠(STS)等表面活性剂、酸、碱处理、如十二烷基硫酸钠(SDS)等离子洗涤剂、如Triton X-100等非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。在一些实施例中，使用酶处理去除角膜的细胞材料。脂肪酶、嗜热菌蛋白酶、半乳糖苷酶、核酸酶、胰蛋白酶、核酸内切酶和核酸外切酶用于从角膜去除细胞材料。在一些实施例中，使用物理技术去除角膜的细胞材料。这些物理技术包含用于通过使用温度、力和压力以及电破坏从组织的基质中裂解、杀死和去除细胞的方法。温度方法经常用于快速冻融机制。温度方法保留了ECM支架的物理结构。压力脱细胞涉及在高温下控制使用流体静力学压力，以避免可能损坏支架的未监测的冰晶形成。质膜的电破坏是裂解角膜中细胞材料的另一种选择。

在本文所描述的实施例中，由于免疫原性表位的降解，微透镜可以表现出甚至更低的免疫反应性。在使用异种捐赠时，这可能是重要的步骤。例如，异种组织中可能存在的两个非人表位是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5GC)和半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)。这些不期望的表位可能不仅存在于基质细胞内部或表面上；一小部分表位可能嵌入葡糖氨基葡聚糖(GAG)内，所述GAG也称为粘多糖，包裹ECM胶原蛋白原纤维。在某些实施例中，可以通过酶处理，如通过半乳糖苷酶处理，以及另外的洗涤选择性地去除表位。可替代地，角膜组织可以从缺乏任何免疫原性表位的敲除转基因动物(例如，转基因猪)中采集，因此无需表位降解步骤即可产生非免疫原性微透镜。

在本文所描述的实施例中，脱细胞的微透镜可以结合包装和密封进一步灭菌。可以使用润湿剂、辐射或电子束来完成灭菌。在一个优选实施例中，脱细胞的微透镜的灭菌是使用UV辐射进行的，因为不太可能发生对胶原蛋白支架的损伤。使用UV辐射可以有利于提高微透镜的光学透明度。

在本发明的另一方面，微透镜的形状和朝向是为了最佳结果而设计的。在一些实施例中，微透镜的直径为约0.5毫米(mm)到约10mm、或约3mm到约9mm、或约4mm到约8mm、或约5mm到约7mm。同样，在不列举0.5mm与10mm之间的每个可能的子范围的情况下，应该清楚的是，所有此类子范围都被考虑和认为是本发明的一部分。

供体角膜基质可以被切片和/或进一步成形以获得期望的形状。切割可以机械地，例如用微型角膜刀等，或通过激光加工，例如通过准分子激光进行光消融或用飞秒激光进行光切割进行。为了减少不对称的可能性，角膜组织片段优选地例如利用保留在微透镜的中心处的供体角膜的光轴或几何轴而取自供体角膜的中心部分。角膜组织片段的形状将取决于矫正患者的屈光不正所需的屈光度变化。例如，为了矫正远视(hyperopia或hypermetropia)和/或老花眼，目标通常是增加角膜的曲率，并且期望的微透镜形状将在至少一侧略微凸出。在一些实施例中，微透镜的最大厚度将小于600微米、小于400微米、小于200微米、小于100微米或小于50微米。直径越小且微透镜越薄，其就会越快整合到患者的基质床中。

基质胶原蛋白原纤维是长聚合(多肽)串。它们是三重缠绕的蛋白质。单个胶原蛋白原纤维的长度几乎是肉眼可见的，并且因此原纤维中的每个原纤维都可以单独成为光的强散射体。基质在轴向方向上是透明的事实是所有这些强散射贡献的负总和的结果。也就是说，尽管胶原蛋白原纤维各自是散射的，但其集体促成了总体上接近零的集体散射。如果原纤维平行布置在一个平面中，则可以实现此集体透明性。在角膜基质中，布置平面相对于光轴是竖直的。这种独特的布置存在于角膜中，但在其它器官中没有观察到。在如肠或心肌膜、心室瓣膜等其它器官中，原纤维未精细对准并且因此光被散射。眼的角膜缘胶原蛋白也是如此。

除了透明度之外，自然选择还在强度方面对角膜的结构进行了优化。胶原蛋白原纤维的长度和对准对基质的平面内(切向)拉伸(牵拉)强度也有很大贡献。天然眼的形状是通过对基质施加切向拉伸(牵拉)应力的流体静力学眼内压力来维持的。胶原蛋白原纤维的平面内朝向为角膜增添透明性并提供显著的机械拉伸(牵拉)强度。然而，这种强度在很大程度上限于平面内施加的力。角膜基质在光轴方向上的强度显著较弱。这种轴向强度不足的一个表现是支架在浸入水中，例如浸入缓冲盐溶液(BSS)中时溶胀。溶胀几乎完全是单向的，在光轴的方向上。平面内方向的溶胀可忽略不计。

支架的这种弱点令人担忧，因为光学活性微透镜的形状保真度对于成功的附加屈光外科手术至关重要。支架在轴向方向上的溶胀可以引起屈光不正。

溶胀量通常是浸入流体的函数。当将表面活性剂和/或洗涤剂添加到水中时观察到最高程度的溶胀，即其标称厚度的约250％到400％，BSS通常会引起标称厚度的约150％到250％的溶胀。在醇(轻醇和重醇)中的溶胀通常较小。(标称厚度可以定义为在脱细胞步骤之前，例如当组织样本非常新鲜时，例如切除后少于约60秒左右，或当样本保留上皮细胞和/或内皮细胞时的更长时间，原始切除的基质片段(薄片)的轴向厚度。)

在厚微透镜的情况下，溶胀可能使微透镜太厚以至于难以将瓣放回基质床上。瓣也可能太短而无法覆盖添加的材料(增加上皮生长不足的危险)，并且可能需要将瓣机械拉伸和/或缝合到基质床的另外的手术。

胶原蛋白支架的单向机械弱点以及渗透特性和/或支架的水亲和力的变化(与脱细胞前的基质相比)会在支架厚度方向(即，轴向方向)上引起显著的单向溶胀。

游离水存在于胶原组织内。在完整的天然角膜中，基质的含水量由角膜的整体结构，例如提供角膜边界的上皮和内皮膜控制。然而，在附加屈光外科手术期间植入外源性基质组织时，这种平衡往往会受到干扰，并且植入的微透镜的含水量有增加的趋势并使术后溶胀超过标称厚度。

根据本发明，如果将扁平(圆柱形)胶原组织样本放置在施加稳定压力的两个板之间，则可以减少流体含量(或等效地增加胶原蛋白浓度)。对于经过脱细胞的成形的微透镜也是如此。压力机应提供引流，使得过量的游离流体从组织的侧面流出。(在成形的微透镜的情况下，压力机的板中的至少一个板应该是弯曲的，以适应微透镜厚度的径向变化。)优选地，轻轻地施加压力持续期望的时间。取决于期望的压缩程度，可以在胶原蛋白支架上施加压力持续几秒到几小时的预定持续时间，例如，30秒到一小时，或在一些情况下5分钟到半小时。

压力机的板行进的距离允许计算近似的胶原蛋白浓度。例如，如果切除的平坦组织片段的标称厚度为100微米，并且在脱细胞过程后溶胀为200微米，则组合物的胶原蛋白含量可以为约15％。如果然后将其重新压缩到100微米的厚度，则标称胶原蛋白浓度将恢复到大约30％的水平。如果支架被进一步压缩到50微米的厚度，则胶原蛋白浓度将为大约60％。如果支架被进一步压缩到40微米的厚度，则胶原蛋白浓度将为大约75％。(胶原蛋白含量百分比可以测量为真空干燥的微透镜相对于其在干燥前与水完全平衡时的重量的重量分数。)此值只有在长时间的压力下才能达到，并且接近可合理达到的胶原蛋白浓度的高端。此时剩余的水会例如由于范德华力(Van der Waals forces)而被蛋白质紧紧束缚，并且进一步的压力可能会损害胶原蛋白原纤维的完整性。

如果将支架从压力机中取出并重新浸入流体中，则压缩胶原组织的过程在很大程度上是可逆的。支架再溶胀以接近其预压缩厚度。然而，在本发明的另一个方面，公开了用于通过加强胶原蛋白支架，最显著的是在压制过程期间通过胶原蛋白支架的交联在轴向应变方向上加强胶原蛋白支架来防止再溶胀的方法。支架的压缩和/或过量流体的去除也可以通过例如在离心机中将支架暴露于加速来实现。例如，可以采用从10G到100G(981米/秒²)或更高的加速度。也可以通过将支架暴露于真空或减压来实现或辅助去除过量流体。

在某些实施例中，可以通过化学试剂实现交联。可以以足够的浓度、持续时间和温度添加外部化学分子(主要是在水溶液或一些其它流体中)。所述分子可以被构建为一端与一个胶原蛋白原纤维结合并且另一端与另一个胶原蛋白原纤维结合。键的类型可以是试剂特异性的或不必是肽型键。化学分子以化学键(共价键)作为强附着物创建物理桥。此类桥的足够密集的集合在轴向方向上赋予胶原蛋白支架新的强度和/或刚度。胶原蛋白分子不需要相互接触，而是处于大约为试剂分子大小的距离处。这种宽松的致动要求使交联过程变得容易。化学交联剂的实例是戊二醛、京尼平和单糖。

胶原蛋白原纤维本身就是强的光散射体，但其朝向和统计布置共同消除了散射。交联剂和能量介导分子的潜在缺点是其将外源性材料引入胶原蛋白支架中，当支架用作屈光矫正手术中的可植入微透镜时，所述外源性材料可以充当光散射体并对支架的光学透明度产生不利影响。

在其它实施例中，胶原蛋白原纤维也可以通过在原纤维之间直接建立的稳定化学键来加强。这发生在原纤维相互接触时，但不是自发的。所谓的肽键是吸热的并且需要将外部能量局部且及时地递送到原纤维接触的位置。在一些实施例中，可以采用专门的介导分子，所述介导分子从光量子接收能量。然后介导分子可以提供键合能，或成为交联过程的催化剂，其自身不参与连接结构。因此，光是用于建立稳定键的间接能量源。当暴露于例如来自发光二极管(LED)等的光时，介导分子的一个实例是核黄素。

在又另一种变体方法中，支架的胶原蛋白原纤维可以通过原纤维相互接触的局部吸收的辐射直接相互键合。不需要外源性介导分子来捕获能量的量子(尽管存在于胶原组织中的内源性分子，如葡糖氨基葡聚糖(GAG)可能提供类似的功能)。量子在接触事件的邻接处被直接且及时地吸收。此方法可以利用各种形式的直接辐照，例如，可见、蓝色或UV辐射、γ射线或甚至电子束。一种优选的能量源是能量密度为至少100焦耳/平方厘米、或至少200焦耳/平方厘米、或至少300焦耳/平方厘米的UV光。例如，光化辐射的期望的能量密度可以在约100到约5000、或约200到约1000、或约300到约600焦耳/平方厘米的范围内。

胶原蛋白支架的密度(压缩/压紧)可以影响交联的速度。如果胶原蛋白浓度更高(即，胶原蛋白支架更加压缩或以其它方式压紧)，则交联过程可以进行得更快。

单独的纯辐射诱导交联(没有如核黄素等任何介导剂)所需的临界(阈值)剂量可能是脱细胞过程的函数。非脱细胞的基质的阈值剂量可以比脱细胞的胶原蛋白支架的阈值剂量大3到300倍。(此比率也可以是所应用辐射的波长的函数。)在本发明的另一方面，已经发现，如果脱细胞去除更多存在于基质中的细胞外材料(如GAG)，则胶原蛋白交联的阈值下降。阈值的差异可能变化多达一个数量级，这取决于应用的脱细胞方案和辐射的波长。此交联阈值降低似乎与脱细胞方案的强度相关。

交联可以与压缩/压紧同时进行，或者在随后的步骤中通过专用的UV辐射源(或可替代地通过环境UV辐射，例如，阳光)进行。

如果使用光能诱导交联，则光的吸收可能受比尔定律(Beer's Law)支配，即光照射到的材料表面层会吸收更多的光，而在较深的材料层会吸收更少的光。可用于诱导交联的光量基本上呈指数衰减。如果支架中的光散射分子的量存在差异，这也可能影响能量的分布，因为散射剂会减少可以穿过被辐照的材料下方区域的光量。在本发明中，这些影响可以有利地用于产生分级的交联程度和/或赋予暴露于光化辐射的支架的表面区域不同的特性。

因此，光能的自然吸收曲线单独或与光散射剂的引入(例如，作为表面涂层)一起提供了选择性表面交联和/或胶原蛋白支架的表面以下较低程度交联的选择。微透镜的表面的选择性交联可以有利于赋予表面不同的粘附性、渗透性或平滑度，或有利于植入后受体细胞更多或更少的穿透。例如，如果支架被压缩到约60％的胶原蛋白密度，并在表面上选择性交联到约5微米到10微米的深度，则表面将保持高密度，而支架的其余部分将在脱细胞过程后保持其膨胀状态不变。此类致密化表面可以提供伪鲍曼氏膜。

此外，通过使用光散射器选择性地处理表面的一部分或通过图案化掩模暴露支架，可以使用表面交联将图案化效果赋予前表面、后表面或两者。表面图案化可以选择性地改变表面部分的摩擦或粘附性。

存在三种用于选择性地使支架的表面交联的方法。首先，通过在支架中使用具有强吸收的短波长UV辐射，可以限制渗透深度。在此方法中，优选的波长范围将为约230纳米到约150纳米，更优选地为约215纳米到约193纳米(例如，193nm)。辐射的入射角通常垂直于表面，但相对于表面法线可以在0度到60度之间变化。

可替代地，可以使用更长波长的UV辐射，例如，延伸到约400纳米，并以大于60度，优选地大于75度或更高，例如范围为约80度到约89.9度的掠入射角进入支架。此方法的一个优点是，由于其商业用途，波长约为或高于280纳米的可靠且强烈的UV辐射源很容易获得。也可以优选使用激光辐射作为光源，因为激光的空间相干性允许良好的入射角限定。

在又另一个替代方案中，可以使用消散波平板波导。这允许非常浅的交联深度(约为入射光的波长)。例如，当使用330纳米UV辐射时，交联可以受限在微米或更小的表面层。

重要的是，通过使微透镜的前表面致密化(或更有力地选择性地交联)，所述前表面将表现出与后表面不同的质地，因为鲍曼氏膜由于紧密编织的I型胶原蛋白原纤维而更致密和更光滑。后表面(与前表面相对)将更粗糙，因为微透镜的此部分的密集成分较低(以及其是通过组织的机械或激光切割形成的事实)。当微透镜用于基质内或角膜内植入时，这种粗糙度差异可能特别有利，因为非常期望微透镜牢固地粘附于基质床。如果在手术后观察到低于最佳的屈光结果，则可能需要再次将所述瓣折回以允许通过激光烧蚀等进行进一步的角膜移植术(重新雕刻所述微透镜)。所述微透镜从其在基质床中的原始位置的任何移动都可能损害此角膜移植术的有效性。此外，所述微透镜的所述前表面的平滑度还使得重新打开所述瓣将所述微透镜移出的可能性较小。

在本发明的又另一方面，所述后表面可以在切除、成形和脱细胞之后进行处理，以使所述表面更粘附于所述基质床。例如，可以在灭菌和包装之前应用交联或粘附增强剂。可替代地，临床医生可以在植入前的手术过程期间应用交联或粘附增强剂。

在一些实施例中，标记采集的、成形的和脱细胞的微透镜，其方式使得临床医生可以在重新打开瓣和激光重新雕刻调整期间保持微透镜的适当朝向。标记可以通过多种方式完成，但在所有情况下，一旦微透镜在基质床中就位，所述标记对于患者将是不可见的。在一些实施例中，标记可以是微透镜的顶部前部或底部前部中的微小凹口。在一些实施例中，标记可以是放置在微透镜顶部前部或底部前部的由染料制成的线或点。

本文还公开了由供体基质形成微透镜的方法。在一些实施例中，由供体基质形成微透镜的方法包括从供体角膜的中心区域去除基质的一部分，并且使所述供体基质的后表面成形以提供具有期望的形状的微透镜主体。为了减少不对称的可能性，组织片段优选地例如利用保留在所述微透镜的中心处的供体角膜的光轴或几何轴而取自供体角膜的中心部分。组织片段的形状将取决于矫正所述患者的屈光不正所需的屈光度变化。例如，为了矫正远视(hyperopia或hypermetropia)和/或老花眼，目标通常是增加角膜的曲率，并且期望的微透镜形状将在至少一侧略微凸出。微透镜还可以包含在微透镜周边上的一个或多个不对称标记(如字母“L”)，以标识微透镜的前表面和后表面。

本发明的支架可以进一步提供作为折射(例如，附加)微透镜的优点，因为其可以被设计为具有比天然基质组织更高的折射率。目前，在上皮不稳定或不可接受的上皮侵蚀发生之前，使用植入的微透镜改变角膜曲率通常限于小于约50D(如可在顶点附近测量)的总屈光度(例如，天然角膜和附加微透镜的屈光值的总和)。具有更高折射率的可植入支架提供了更高的远视矫正的可能性。基质组织的标准折射率通常为约1.376。本发明的压缩/压紧技术可以提供具有大于1.377、大于1.378、大于1.379、大于1.38或更高的折射率的支架。微透镜折射率的梯度也可以通过受控交联来实现。(此类的梯度也可以用于校正高阶屈光不正，其术语可以用人眼的高阶泽尼克多项式(Zernike polynomials)来描述。)

在本文所描述的实施例中，所述方法产生具有为最佳结果而设计的形状和密度的微透镜。通过首先以保留鲍曼氏膜作为前表面的方式从供体基质切割盘形组织片段来获得微透镜。在一些实施例中，微透镜的直径为约0.5mm到约10mm、约3mm到约9mm、约4mm到约8mm和约5mm到约7mm。组织片段可以被切片和/或进一步成形或切割，其方式使得在切片程序期间获得期望的形状。切割可以机械地，例如用微型角膜刀等，或通过激光加工，例如通过用飞秒激光的光切割进行。例如，可以使用如标题为“用于从生物组织将板层片段切片的外科手术设备和刀片元件(Surgical Apparatus and Blade Elements for slicing LamellarSegments From Biological Tissue)”的国际专利申请第PCT/IB2016/054793号中所公开的仪器等仪器进行切割，所述文献以全文引用的方式并入本文。

微透镜也可以通过飞秒激光烧蚀、准分子激光烧蚀或通过用水射流切割获得。如果不需要保留前片段，则微透镜也可以通过小切口微透镜提取(SMILE)技术获得，例如在标题为“用于角膜激光外科手术的方法(Method For Conical Laser Surgery)”的美国专利6,110,166中公开的，所述美国专利也以全文引用的方式并入本文。

在本文描述的实施例中，微透镜的最大厚度将小于600微米、小于400微米、小于200微米、或小于100微米或小于50微米。直径越小且微透镜越薄，其就可以越快整合到患者的基质床中。

在某些实施例中，将供体基质脱细胞以产生具有降低的患者对细胞来源的免疫原的不良反应可能性的微透镜。使用本发明的方法产生的脱细胞的微透镜在90％到100％之间，或优选地在95％到99.99％之间，或在98％到99.9％之间不含细胞和/或细胞残留物。(典型角膜的仅约2％是由细胞构成的。)其它98％主要是细胞外基质(ECM)，所述细胞外基质主要是胶原蛋白、水、GAG和蛋白聚糖。在脱细胞过程之后表征细胞残留物量的优选的且最常用的方法是基于对DNA或可替代地RNA残留物的检测。这些方法非常灵敏且特异性高。通常将这些测量值相对于脱细胞步骤之前存在于微透镜中的DNA/RNA的量归一化。在不列举90％与99.99％之间的每个可能的子范围的情况下，应该清楚的是，所有此类子范围都被考虑和认为是本发明的一部分。例如，所产生的微透镜可以90％、95％、99％到99.7％、99.7％到99.9％或更高的不含天然细胞材料(如通过DNA/RNA残留含量测量)。换言之，如通过残留DNA或RNA含量所测量的微透镜中剩余的细胞材料的量可以小于原始DNA或RNA含量的1％重量或小于0.1％重量或小于0.01％重量。(大量的脱细胞可以通过微透镜提取本身发生。多达95％的总角膜细胞含量存在于上皮和内皮中，其可以机械丢弃，从而只留下角膜基质用于进一步脱细胞。)

从供体基质中去除细胞材料(脱细胞)可以使用多种技术来完成。在一个优选实施例中，通过化学处理去除角膜的细胞材料。用于从角膜裂解和去除细胞的化学物质可以包含酸、碱、表面活性剂(例如十四烷基硫酸钠(STS))、离子洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))、非离子洗涤剂(例如，Triton X-100)和两性离子洗涤剂。

可替代地或另外，可以使用酶处理去除角膜的细胞材料。脂肪酶、嗜热菌蛋白酶、半乳糖苷酶、核酸酶、胰蛋白酶、核酸内切酶和核酸外切酶可以用于从角膜去除细胞材料。在一些实施例中，使用物理技术去除角膜的细胞材料。这些物理技术包含用于通过使用温度、压力和/或电破坏从组织的基质中裂解、杀死和去除细胞的方法。基于温度的脱细胞方法可以包含快速冻融方案。此类基于温度的方法保留了ECM支架的物理结构。压力脱细胞涉及在高温下控制使用流体静力学压力，以避免可能损坏支架的未监测的冰晶形成。质膜的电破坏是裂解角膜中细胞材料的另一种选择。

在一些实施例中，由于免疫原性表位的降解，可以进一步处理微透镜以表现出甚至更低的免疫反应性。在使用异种捐赠时，这是重要的步骤。例如，异种移植物组织中可能存在的两个非人表位是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5GC)和半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)。这些不期望的表位不仅存在于基质细胞内部或表面上；一小部分表位可能嵌入葡糖氨基葡聚糖(GAG)内，所述GAG也称为粘多糖，包裹ECM胶原蛋白原纤维。在某些实施例中，此类表位可以通过如激酶或半乳糖苷酶处理等酶处理以及另外的洗涤来去除或构象改变(以中和免疫原)。可替代地，角膜组织可以从缺乏表位的敲除转基因猪中采集，因此无需降解步骤即可产生非免疫原性微透镜。在一些情况下，还可以优选在表位中和之前从微透镜中去除上皮和/或内皮细胞层或残留物。这可以通过例如用手术刀刮擦或通过例如用适当粗糙度的研磨材料摩擦来完成。

在本文所描述的实施例中，产生脱细胞的微透镜的方法可以进一步包含灭菌步骤，所述灭菌步骤可以与包装和密封结合。可以使用润湿剂、γ辐射或电子束来完成灭菌。在一个实施例中，脱细胞的微透镜的灭菌是使用电子束进行的，因为不太可能发生对胶原蛋白支架的损伤。可替代地，用于诱导交联的辐射也可以为微透镜的灭菌提供足够的能量。

在一些实施例中，采集、成形和脱细胞的微透镜的制备将包含以使得临床医生可以在重新打开瓣和激光调整期间保持微透镜的适当朝向的方式标记微透镜的步骤。标记可以通过多种方式完成，但在所有情况下，一旦微透镜就位，所述标记对于患者将是不可见的。在一些实施例中，标记可以是微透镜的顶部前部或底部前部中的微小凹口。在一些实施例中，标记可以是放置在微透镜顶部前部或底部前部的由染料制成的线或点。这些方法还可以包含在微透镜周边上雕刻一个或多个不对称标记(如字母“L”)，以标识微透镜的前表面和后表面。

本发明和展示所使用的方法和材料的实施例可以通过参考以下示例性方案来进一步理解。角膜组织可以从猪供体中采集。微透镜可以取自供体基质内的区域，以在微透镜的前表面和较低密度的后表面处保持高密度的I型胶原蛋白原纤维或鲍曼氏膜。可替代地，角膜组织可以取自自然致密化表面下方的基质区域。

如图1A所示，供体角膜的目标区域可以被切割成盘形微透镜10A，所述盘形微透镜具有前表面12、后表面14和组织的胶原蛋白原纤维层16。在此阶段，微透镜通常具有约0.5毫米到10毫米的直径和小于250微米的厚度。

图1B示出了脱细胞后的微透镜，例如通过化学处理、酶处理或物理技术以产生95％到99.99％不含细胞材料的微透镜。如果期望，可以进一步处理脱细胞的成形的微透镜以降解免疫原性表位。微透镜可以进一步洗涤和灭菌，并且如果期望，可以将交联剂施加到微透镜的前表面和/或后表面。脱细胞的微透镜(通常由于应用洗涤剂、表面活性剂和/或洗涤溶液而溶胀)表现出原纤维层16的更大分离。在一些实施例中，微透镜的顶部前表面也可以用凹口标记以帮助微透镜在患者基质床中定向。

在图1C中，然后使脱细胞的(并且可能溶胀)微透镜经受压缩，以从微透镜主体中驱出过量流体并增加胶原蛋白的密度。胶原蛋白原纤维层被压缩在一起，然后至少部分交联以抑制随后的溶胀。

在图2中，示出了具有前表面区域22的微透镜20，其中胶原蛋白原纤维层已被压缩/压紧和交联。微透镜20的本体区域24也可以被交联以抑制溶胀，但与前表面区域22的程度不同。

在图3中，示出了微透镜30，其中一个表面(例如，后表面14)已经被形成具有图案32以促进术后整合。图案32可以通过选择性应用试剂、选择性辐射或这些技术的组合来形成。(应该清楚的是，所述图案可以应用于前表面12、后表面14或两个表面。)

图4A展示了根据本公开的呈扁平形状的微透镜40A，所述扁平形状通常是制造和/或运输期间的典型形状。

图4B展示了处于用于角膜内植入的示例性最终弯曲状态的微透镜40B。微透镜可以采用各种形状来矫正不同的屈光不正或眼部病状(下文进一步讨论的)。尽管微透镜通常被展示为球形或类球形形状，但应该清楚其同样可以是椭圆形或任何期望的形状(例如，部分环形)。此类形状可以用于矫正患者视力中的散光或高阶像差。此类非球面形状也可以用于匹配患者的角膜或角膜缘的形状。

图5A展示了被设计成用于角膜内植入以矫正远视病状的微透镜50A。图5B展示了被设计成用于角膜内植入以矫正近视病状的微透镜50B。图5C展示了被设计成用于角膜内植入以矫正老花眼病状的微透镜50C。图5D展示了被设计成用于角膜内植入以矫正称为圆锥角膜的病状的微透镜50D，在所述病状中，角膜的天然胶原结构由于损伤、遗传或其它眼部病状，例如角膜内的酶或信号传导活性的不平衡而被削弱。微透镜50A、50B、50C和50D通常被设计成用于角膜内的基质内(天然基质层之间)植入。通过将微透镜放置在基质组织2内，上皮区域4和内皮区域6被保留。

图6A展示了微透镜的另一个实施例，其中微透镜60A被制造为具有强交联的局部斑点61以提供另外的机械强度的区域，例如，用于在穿透性角膜移植术(PK)或深前板层角膜移植术(DALK)期间连接外科缝线，如下文更详细讨论的。

图6B展示了微透镜的又另一个实施例。在此实施例中，微透镜60B包含具有中等交联的中心光学活性区65(例如，具有约3毫米到6.5毫米的主要直径尺寸)和具有强交联的外部或周边区63，以再次提供另外的机械强度的区域，例如，用于连接外科缝线或支持视区外的圆锥角膜弱化的基质。应当注意，区63和65不必是同心的，并且在例如治疗圆锥角膜的情况下，可能期望使光学活性区域偏离微透镜的中心。

图7A展示了根据本公开的微透镜70A用于不同类型的角膜内植入，即深前板层角膜移植术(DALK)。在此手术中，首先去除眼的前片段，并将微透镜70放置到眼中以替换天然鲍曼氏膜3和基质2的一部分。微透镜70A最初可以通过缝线7固定到位。任选地，微透镜70A可以由具有完整鲍曼氏膜的天然供体组织形成，所述完整鲍曼氏膜在微透镜形成的脱细胞和压缩步骤中被保留。可替代地，可以选择性地处理微透镜的前表面，例如，通过浅辐射交联以形成鲍曼氏膜状结构。在任一情况下，在角膜内植入后，患者的外周上皮可以在植入的微透镜的前表面上生长。

图7B展示了微透镜70B的使用，所述微透镜类似于图7A中示出的DALK微透镜，但通常更薄(例如，小于200微米)并且被配置成放置在患者的完整鲍曼氏膜3的顶部上，但在上皮4的下方。在此手术中，有时称为“表层角膜植片术”，微透镜70B可以再次通过缝线7固定到位。

图7C展示了根据本公开的微透镜70C的又另一个实施例，在此情况下，所述微透镜被设计成用于穿透性角膜移植术(PK)手术。微透镜70C类似于图7A中示出的DALK微透镜，但被配置成完全替换中央角膜组织的全部深度，即，角膜后部处的内皮6、基质2和鲍曼氏膜3。微透镜70C可以再次通过缝线7固定到位。在微透镜70C的角膜内植入后，患者的外周上皮可以在植入的微透镜的前表面上生长。

图8A、8B和8C展示了厚微透镜周边的两种替代性设计，例如，如在DALK和PK手术中有用的那些设计。在图8A中，示出了具有简单的，例如圆柱形或圆锥形外围边缘的微透镜80A。在图8B中，示出了在其外围具有锯齿形或阶梯形边缘的微透镜80B。成形的边缘可以被设计为与天然角膜中形成的互补结构相匹配，以进一步帮助微透镜80B与剩余的天然角膜组织接合。也可以采用阶梯形状的变化(例如，反向锯齿形)。如图8C所示，可以采用更先进的外围边缘形状以允许机械锁入或锁定到天然角膜中。在一些情况下，锁定特征可以减少或消除对沿锁入边缘的外科缝线的需要。此类微透镜的外围可以比中心部分更强地被交联。

在一些情况下，这些厚微透镜的厚度可以从中心到边缘变化。例如，微透镜的厚度可以从中心处的约400微米变化到外围边缘处的550微米。这与在大多数角膜中发现的天然厚度变化一致，其中典型的完整角膜可以表现出约500微米的中心角膜厚度，而角膜的外围片段可以表现出约550微米到约650微米的厚度。

图9示意性地展示了用于压缩根据本发明的胶原蛋白支架的压力机90。压力机90可以包含框架92和可移动平台94。框架保持顶部按压元件96并且平台保持底部按压元件98。这些元件中的至少一个是非平面的并且成形为符合支架的期望的最终形状。元件96和98可以通过施加动力(由蜗杆91示意性地展示)而被压缩。在某些实施例中，按压元件96、98中的至少一个可以是透明的，使得在其间保持压缩的支架可以在模制的同时被例如UV辐射源93辐照。

图10A和10B展示了根据本发明的两部分可密封缩放压缩和储存容器或模具101。容器/模具101可以包括模具底座102和模具顶部104，所述模具底座和所述模具顶部在其之间限定室105。模具101的目的是压缩支架100A，例如，脱细胞的基质胶原蛋白(细胞外基质)支架，并且同时从支架中去除流体。图10A展示了处于其预压缩状态的模具101。密封件106，例如，O形环或平垫圈密封件，最初将模具顶部104和模具底部102分开。在一些情况下，还可能期望用流体107填充没有被支架100A占据的室105的其余部分以避免压缩期间气体滞留在支架中。密封件106适用于容纳从支架驱动的流体以及最初围绕室101中的支架的任何流体。在图5A中，示出了在压缩之前，但在密封件106与周围环境隔离的第一时刻的模具。

模具的顶部部分104可以是至少部分透明或半透明的，以允许光化辐射穿过支架以使支架交联。可替代地或另外，模具底部102可以对光化辐射是透明的。模具的透明部分可以由塑料、玻璃、陶瓷或金属或此类材料的任何组合制成，只要其足够透明或半透明以允许辐射透射即可。

图10B展示了支架100B压缩之后的模具101。密封件(例如，O形环)106可以在凹槽103中移动，使得凹槽容纳排出的流体。(也可以采用各种其它引流机制。)在此情况下，模具101可以用于交联和灭菌。如果选择合适的辐射波长和积分通量，此类灭菌可以与交联同时发生。(在许多情况下，使病毒失活所需的辐射剂量将远低于交联所需的辐射剂量。)压缩的、灭菌的模具可以进一步用于运输或长期储存。为了使光化交联辐射(例如，UV辐射)也能有效地用于灭菌用途，辐射应在此过程期间到达微透镜的所有表面。因此，可能期望采用密封件(例如，对所选光化辐射具有透射性的O形环或平垫圈)。例如，如果在模制过程中使用UV光来对微透镜进行交联和灭菌，则密封件可以由UV透射性或半透明材料，如含氟聚合物，例如聚四氟乙烯(PTFE)、氟乙烯聚丙烯(FEP)、乙烯四氟乙烯(ETFE)或全氟烷氧基(PFA)组合物制成。

压缩前支架或微透镜的形状和模具的匹配形状通常将确保微透镜的密度在压缩后保持均匀。例如，压缩可以将竖直尺寸减少一半，并将密度均匀地增加两倍。

图10C到10F展示了用于压缩/压紧的替代过程和设备，其中首先处理微透镜以去除水，然后通过受控再水合来成形。切除的组织部分可以通过任何上文描述的方法初始成形和脱细胞。然后将所得支架至少部分干燥。干燥可以通过化学过程(如乙醇流体交换)或物理过程(如干燥、真空冻干或冷冻干燥)，例如通过在干燥设备中暴露于升华的固体CO₂来实现。干燥可以是部分的，只要微透镜的厚度被充分减小使得其可以装配到如所展示的模具201等模具中即可。

图10C展示了模具201的分解图，所述模具可以包括被设计为相互匹配并在其间限定室216的底部部分202和顶部部分204。如果模具的底部部分和顶部部分对交联辐射不透明，则辐射透明窗210也可以作为模具201的一部分包含在内并形成室216的一部分。室216大于将要放置在其中的干燥的微透镜。在再水合之后，室216的形状限定微透镜或支架的期望的形状。室可以赋予微透镜弯曲的形状(例如，凹的、凸的、平凹的、平凸的、散光的或其它复杂的配置)。通过室216的适当设计，微透镜可以成形为用于近视、远视或老花眼的屈光治疗，具有或不具有散光校正。可以设计定制的室形状来治疗更复杂的医疗病状，如例如，圆锥角膜或LASIK后扩张。可替代地，如果期望的结果是平的或板状的微透镜，则室的厚度可以是基本均匀的。

如图10C到10F所示，顶部部分和底部部分可以例如通过螺钉206固定在一起，所述螺钉穿过顶部部分204中的孔208并被底部部分202中的螺纹螺钉插座212接收。应该清楚的是，可以使用各种其它机构将底部部分202和顶部部分204(以及任选的窗口210)连接在一起。例如，模具可以由基部部分和带螺纹的顶部部分或铰链式顶部部分形成。将模具的一部分指定为“底部”部分而将另一部分指定为“顶部”部分仅仅是为了描述的简单性，并不意味着任何所需的朝向。

图10D展示了处于其闭合配置的模具201。图10E是闭合的模具201的俯视图，并且还示出了窗口210，光化辐射可以通过所述窗口以诱导微透镜的交联。

如图10F的剖面图所示，可以将干燥的微透镜200装载到模具201的室216中。然后闭合模具201以在溶胀期间限制微透镜的形状。当被限制在模具中时，微透镜通过流体注入通道212被流体(例如，被水、酒精、水和酒精的混合物或重酒精或其它流体)淹没，使得微透镜200可以溶胀并成形为静态模具201。模具还可以具有一个或多个出口通道214以在室被填充并且微透镜溶胀以呈现室形状时从室中去除过量流体或排出气体。

微透镜的再水合可以缓慢进行(例如，若干分钟甚至几天)，并且可以通过模具的间歇或持续物理摇动或通过应用声能(例如，通过超声)来辅助，以允许微透镜呈现其期望的形状，同时全局最小化内部张力。

再水合后，微透镜可通过上文描述的任何技术交联。在所展示的实施例中，模具具有一个用于交联步骤的辐射透射窗口(例如，如果使用UV辐射，则由蓝宝石或其它合适的材料形成)。可替代地，模具两侧的窗口可以用于提供来自任一或两个方向的辐射通道。

图11展示了根据本发明的用于拉伸支架161的另外的设备110，所述支架可以是天然脱细胞的基质切除物或已经脱细胞并经过初始压缩处理的支架。在此实施例中，支架161已经通过缩放机构167，例如通过将支架161的外围边缘压接在两个平坦凸缘之间而附接到室163的开放口。(可以使用各种其它密封机构来代替或补充压接以在支架和室口之间提供流体密封连接。)然后通过受控压力导管165将流体166引入室163以填充室的内部并对支架161施加压力。例如，水平和/或切向拉伸可以通过在室中保持足够的流体静压，例如约30mbar到约500mbar，优选地约50mbar到约200mbar(或约22.5托到约375托，优选地约37.5托到约150托)的压力来获得。

即使对支架施加机械应力的流体是纯水或平衡盐溶液(BSS)，此流体压力的应用也会导致支架去溶胀(释放自由水)。流体可以以任何方向流出支架(例如，迁移到加压流体室中或通过从支架外表面渗出或两者)。高渗或低渗溶液也可以用于室163中以增强或限制这种效果。

通过将ECM-支架暴露于此类型的拉伸，可以使胶原蛋白原纤维对准以建立弯曲的形状。当获得期望的曲率时，可以通过交联，例如通过光化辐射168保留(或固定)形状，如图所示。

在图12中，示出了又另一个替代设备120，所述设备类似于图6的设备，但增加了用于同时拉伸和压缩支架以及便于暴露于交联辐射的压缩施加板元件171。通过在室中保持约30mbar到约500mbar、优选地约50mbar到约200mbar的足够的静水压力，再次提供水平和/或切向拉伸。顶板171可以同时施加竖直/径向压缩。优选地，顶板171是至少部分透明的，例如，透明的或半透明的，以允许光化辐射穿过其到达支架以便使支架交联。

尽管顶板171被展示为平板，但此压缩元件的形貌可以采用任何期望的形状和/或曲率以确保胶原蛋白原纤维的布置被适当地固定以构建期望的形状的微透镜，其可以再次通过辐射诱导的交联来保留或固定。

图13展示了用于测量根据本公开生产的微透镜的透明度的设备130。设备130包含光源132、比色皿134(其中可以放置微透镜135)、透镜136和检测器138。光源，例如具有波导/光纤和束准直仪(未示出)的发光二极管(LED)优选地产生准直光线束133。束在其束宽度D(例如，约5mm到7mm)上应该空间相干，具有平坦(非高斯(non-Gaussian))强度分布。例如，光源132可以产生中心波长为约500纳米，并且带宽为约5纳米到10纳米的绿光。

来自源132的光被引导到比色皿134，其中微透镜135悬浮在折射率匹配流体137(例如，硅酮油或其它具有约1.376的折射率n的流体，其与水不混溶，并且化学惰性)中。(n＝1.376的值表示天然角膜组织的标称或平均折射率。)在一些情况下，具有不同折射率的微透镜可能是有利的。在此类情况下，将选择比色皿中的流体以匹配进行测试的微透镜的特定n值。穿过比色皿134(和微透镜135)的光然后被引导到透镜136，所述透镜是高质量透镜，在所选束波长处没有球面像差。透镜136具有焦距f，并且用于将聚焦光引导到位于透镜136的焦平面中的检测器138上。如果微透镜的透明度是完美的(并且假设来自源132的光通过其到达检测器138的光学元件具有理想的光学透明度)，则在检测器(位于焦平面处)之间入射的束的大小将是均匀强度的衍射极限点。实际上，微透镜将不会完美透明，并且由于支架中光的前向散射，检测器处的束强度图像会表现出一定程度的模糊。(应选择透镜的焦距和束直径以施加期望的衍射极限角分辨率。)

因此，可以通过测量检测的束的强度分布来测量微透镜的透明度。用于测量强度或亮度分布的合适的光电检测器可以包含例如照相板、CCD阵列或扫描针孔检测器。

图14是通过测量微透镜的散射角(本文称为“θ”或“西塔”)来量化透明度的此类方法的图示。图14展示了在透镜的焦平面中测量的亮度分布曲线。此高斯样分布表示散射的波前的所有贡献的总和。微透镜中的散射越多，检测到的束的宽度就越大。散射(光学清晰度的退化)的一种度量是全宽、半垂直最大值(FWHV)，如图14中所示。(应当理解，图14的高斯样曲线是一种理想化的曲线，真实的亮度曲线可能会因噪声或其它杂散信号而失真。)可以使用多次测量和平均(或其它已知的降噪信号处理技术)来获得微透镜散射的最佳数据表示。FWHV值除以焦距f，提供了束的角扩展的测量值(以弧度为单位)：

θ＝FWHV/f[rad]

θ仅取决于散射量，也可以使用转换公式以弧分表示：1弧分＝291微弧度。如果角度θ小于4弧分，优选地，小于3弧分或2弧分，更优选地在某些情况下小于1弧分，则通过本文公开的方法制造的微透镜表现出令人满意的透明度(例如，用于角膜内植入)。

如前所述，交联也可以有利地用于改变微透镜和支架的“刚度”。通过本教导可以获得刚度增加的微透镜和支架。所述交联的胶原蛋白的所述刚度可以例如通过称为模量的参数μ来量化。取决于年龄的天然人角膜胶原蛋白的模量μ的标称标准值为约4×10⁴帕斯卡(Pa)到约1.2×10⁵Pa。此外，对于猪眼(其可以是可植入微透镜胶原蛋白和支架胶原蛋白的重要来源)，角膜胶原蛋白的平均模量μ可以低至约2×10⁴帕斯卡(Pa)。

作为根据本教导的压紧和交联的结果，可以获得的胶原微透镜和支架表现出大于2×10⁴Pa、或大于8×10⁴Pa、或大于1.6×10⁵Pa、或大于2×10⁵Pa、或大于3×10⁵Pa、或大于5×10⁵Pa、或大于8×10⁵Pa、或大于1×10⁶Pa、或大于3×10⁶Pa、或大于5×10⁶Pa、或大于1×10⁷Pa的模量刚度μ。

例如，根据本教导的微透镜(包含支架)可以表现出范围为1×10⁴Pa到1×10⁷Pa、或2×10⁴Pa到8×10⁶Pa、或1×10⁵Pa到5×10⁶Pa、或3×10⁵Pa到5×10⁶Pa、或1×10⁶Pa到2.6×10⁶Pa的模量值μ。

用于测量交联的胶原蛋白的增加的刚度(更高的模量μ)的各种技术对于本领域技术人员或普通技术人员将是显而易见的。例如，图15A到15B和16A到16B的仪器是说明性的。

在图15A到15B中，示出了用于测量平交联的微透镜300的刚度的仪器301，所述仪器包括具有带圆形边缘306的内孔304的基座302。待测试的微透镜300被放置在基座上并跨越边缘306。具有限定的重量和几何形状的柱塞320设置在初始距离D₀处，刚好与微透镜300接触。微透镜300将通常具有约6毫米到至9毫米的直径和约0.1毫米(100微米)的厚度。直径圆形边缘(孔尺寸)306可以是约5毫米并且边缘本身的曲率半径可以是例如约0.2毫米(200微米)。柱塞320的直径可以是例如约4毫米。在一些方面，例如当测量弱化微透镜的刚度时，通过非限制性实例，圆形边缘(孔尺寸)306的直径可以是约2毫米，并且柱塞320的直径可以是约1毫米。

当最初放置与微透镜接触时，柱塞施加的力为零。优选地，基座边缘和柱塞由具有低摩擦系数的材料，如聚四氟乙烯(PTFE)或聚醚醚酮(PEEK)形成。柱塞320可以将限定的力施加到微透镜300以向下拉伸微透镜300并且可以测量柱塞行进的距离(D₁)。从此距离D1，可以导出模量μ。可替代地，柱塞300可以移动限定的距离D₁并且测量柱塞所经受的反作用力以导出模量μ。

在图16A到16B中，示出了用于测量具有非平面形状(例如，具有弯曲的前表面或弯曲的后表面(或两者)的微透镜)的交联的微透镜300A的刚度的类似仪器310。仪器310再次包括具有内孔304的基座302，所述内孔具有相似尺寸的圆形边缘306。待测试的微透镜300A类似地被放置在基座上方并跨越边缘306。柱塞320再次设置在与微透镜300A接触的初始距离D₀处。柱塞320最初施加的力再次为零。以类似于上面结合图15A到15B所描述的方式，将限定的力施加到柱塞320或柱塞300移动限定的距离D₁以向下拉伸微透镜300A。从柱塞行进的距离(D₁)或柱塞所经受的反作用力的测量值，同样可以导出微透镜300A的模量μ。

本文所引用的所有专利文献或出版物都以全文引用的方式并入。虽然结合各个实施例对申请人的教导进行了描述，但是申请人的教导不旨在受限于此类实施例。相反，申请人的教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。结合一个实施例示出的任何元件或特征可以与任何其它实施例中示出的任何元件或特征互换使用、与其结合使用或者除了任何其它实施例中示出的任何元件或特征之外被使用，并且元件和特征的所有此类排列应理解被本公开所涵盖。因此，将理解本发明不限于本文所公开的实施例，而是应从以下权利要求中理解，所述权利要求应在法律允许的范围内被广泛解释。

Claims (15)

1.一种由供体角膜基质形成微透镜的方法，所述微透镜适于角膜内植入；

并且所述方法的特征进一步在于：

从所述供体角膜基质中去除水，以及

在受限空间中使所述供体角膜基质再水合以获得微透镜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在所述受限空间中使所述基质的至少一部分交联以抑制随后的溶胀。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述在受限空间中使所述供体角膜基质再水合的步骤赋予所述微透镜的至少一部分增加的胶原蛋白密度或增加的刚度。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微透镜的所述部分表现出增加的胶原蛋白密度，所述胶原蛋白密度比所述供体角膜基质的原始胶原蛋白浓度大至少15％、或大至少20％、或大至少30％、或大至少45％、或大至少60％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微透镜的所述部分表现出大于1.2×10⁵Pa、或大于1.4×10⁵Pa、或大于1.6×10⁵Pa、或大于1.8×10⁵Pa、或大于2×10⁵Pa、或大于3×10⁵Pa、或大于5×10⁵Pa、或大于8×10⁵Pa、或大于1×10⁶Pa、或大于2×10⁵Pa、或大于2.6×10⁶Pa、或大于3×10⁶Pa、或大于4×10⁶Pa的模量刚度μ。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括通过向支架施加压力、加速度(例如，离心力)、真空或将所述基质冷冻干燥来从所述供体角膜基质中去除流体。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括用化学脱细胞剂处理所述基质，并且任选地，其中所述脱细胞步骤在去除水之前或之后发生或在交联之前或之后发生，并且进一步任选地，其中脱细胞的微透镜表现出如通过残留DNA或RNA含量所测量的细胞材料的残留量小于原始DNA或RNA含量的1％重量或小于0.1％重量或小于0.01％重量。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联步骤进一步包括将所述基质的至少一部分暴露于交联促进剂或光化辐射，如紫外辐射、x射线、γ辐射或电子束，并且任选地，其中所述交联步骤进一步包括选择性地将所述微透镜的表面部分暴露于辐射，使得所述表面部分表现出比所述支架的本体区域更大的交联和更高的胶原蛋白密度。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联步骤进一步包括：通过直接暴露或通过以掠入射角或通过耦接到所述支架的表面的消散波导暴露将压缩的支架的至少一部分暴露于紫外辐射；以及任选地，施加足够的辐射以使任何微生物剂灭活和/或对所述支架进行灭菌。

10.一种胶原微透镜，其包括：

源自角膜供体组织的微透镜主体，所述微透镜主体具有为所述微透镜提供期望的形状的前表面和后表面；

所述微透镜的特征进一步在于：

所述微透镜已由所述角膜供体组织形成，所述角膜供体组织已被耗尽流体并以受控方式再水合，使得至少一部分表现出比所述供体角膜基质的原始胶原蛋白浓度高至少15％、或高至少20％、或高至少30％、或高至少45％、或高至少60％的胶原蛋白浓度，

所述微透镜主体进一步包括胶原蛋白，所述胶原蛋白至少部分地交联，使得所述微透镜主体表现出大于2×10⁴Pa、或大于8×10⁴Pa、或大于1.6×10⁵Pa、或大于2×10⁵Pa、或大于3×10⁵Pa、或大于5×10⁵Pa、或大于8×10⁵Pa、或大于1×10⁶Pa、或大于2×10⁶Pa、或大于3×10⁶Pa、或大于4×10⁶Pa、或大于5×10⁶Pa、或大于1×10⁷Pa的模量刚度μ。

11.根据权利要求10所述的微透镜，其特征在于，使所述微透镜脱细胞，使得如通过残留DNA或RNA含量所测量的所述微透镜中剩余的细胞材料的量小于原始DNA或RNA含量的1％重量或小于0.1％重量或小于0.01％重量。

12.根据权利要求10或11所述的微透镜，其特征在于，所述微透镜通过具有盘状平面或非平面形状和约0.5毫米到约10毫米的直径以及小于约600微米、小于约400微米、或小于约200微米、或小于约100微米、或小于50微米的最大厚度而适于角膜内植入。

13.根据权利要求10到12中任一项所述的微透镜，其特征在于，微透镜具有足够的光学清晰度以用作角膜内植入物，并且任选地，其中所述微透镜表现出小于3弧分、或小于2弧分、或小于1弧分的散射角θ。

14.根据权利要求10到13中任一项所述的微透镜，其特征在于，所述微透镜已通过如UV辐射或电子束等辐射灭菌。

15.根据权利要求10到14中任一项所述的微透镜，其特征在于，所述微透镜进一步包括围绕所述微透镜的用于储存和/或运输的容器。

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