KR20230005807A - 콜라겐 지지체의 안정화 - Google Patents

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Abstract

형상-안정화된 콜라겐 지지체 및 이러한 지지체를 얻는 방법이 개시된다. 기질은 예를 들어 인간 또는 돼지의 각막 기질로부터 채취될 수 있고 절제 중에 또는 절제 후 별도의 단계에서 성형될 수 있다. 지지체에서 수분의 일부 또는 전부를 제거하고 지지체가 원하는 압밀된 형상을 갖도록 조절된 방식으로(예를 들어, 몰드 또는 기타 제한된 공간에서) 지지체를 재수화한 다음 지지체의 적어도 일부를 가교처리하여 지지체를 기계적으로 강화하고 후속 팽윤을 억제함으로써 지지체를 압밀할 수 있다. 예를 들어 자외선(UV) 방사선을 비롯한 다양한 에너지원을 사용하여 콜라겐의 가교결합을 유발할 수 있다. 지지체는 또한 선택적으로 조밀화되거나 패턴화될 수 있다. 본 발명은 부가적 안과 수술에서 각막내 이식을 위한 강화된 강성 및 충분한 광학적 선명도를 갖는 안정한 렌티큘인 지지체를 형성하는 데 특히 유용하다.

Description

콜라겐 지지체의 안정화
비정상 굴절 상태, 예를 들어 굴절 이상으로 인한 시력 장애는 모든 연령의 환자에게 심각한 문제가 될 수 있으며 항상 그런 것은 아니지만 종종 절제 레이저 시술로 치료할 수 있다. 최근에, 피판(flap)을 절단하고 다시 접어 각막의 기질내 영역을 노출시킨 후 렌티큘(lenticule)을 환자의 각막에 이식하는 것을 포함하는 부가 기술이 개발되었다. 렌티큘의 형상은 환자 각막의 곡률을 변경함으로써 환자 각막의 광학 도수를 수정한다. 그런 다음 피판을 렌티큘 위에 돌려놓을 수 있다. 원추각막과 같은 다른 상황에서는, 이식된 렌티큘이 비정상적인 기질을 기계적으로 안정화하거나 정상화하고 질병 진행을 늦출 수 있다. 원추각막의 경우 피판보다는 기질 주머니가 더 자주 형성된다.
그러나, 몇 가지 문제 때문에 (렌티큘라(lenticular)) 부가 기술의 폭넓은 수용이 제한된다. 먼저, 렌티큘을 형성하기 위한 공여자 인간 각막의 가용성이 상당히 제한적이다. 또한, 렌티큘을 비인간 공급원에서 얻은 경우, 면역 반응을 최소화하기 위해 렌티큘을 탈세포화해야 한다. 또한 렌티큘의 특성(콜라겐의 구조화된 층)으로 인해 깨지기 쉽고 특별한 취급이 필요하다. 일반적으로, 탈세포화는 구조를 더욱 약화시키고/시키거나 삼투 특성을 변화시켜 탈세포화된 렌티큘이 수술 후 팽윤되기 쉽게 되므로, 수술 당시의 적절한 굴절 교정이 그대로 유지되지 않을 수 있다. 따라서, 이식 가능한 렌티큘 및 기타 콜라겐 기반 지지체를 안정화시키는 더 나은 방법에 대한 필요성이 존재한다.
콜라겐은 인체에 널리 존재한다. 예를 들어, 콜라겐은 장, 정맥, 관절, 피부, 내막, 심실 판막 및 각막에 존재한다.
그러나, 각막의 기질 콜라겐은 여러 면에서 독특하다. 수분을 제외하면 콜라겐이 각막 기질의 주요 구성요소를 구성한다. 기질의 다른 구성요소로는 글리코아미노글리칸(GAG)과 프로테오글리칸이 있다. 살아있는 세포는 각막 기질의 약 1 내지 4%만 구성한다. 인간 기질은 각각 평행한 콜라겐 원섬유를 포함하는 약 100 내지 150개의 층판으로 구성된다. 투명하도록 하기 위해, 콜라겐 원섬유의 층은 층 또는 층판 사이의 간격이 거의 이상적인 분포인 평면내 정렬을 나타낸다. 다른 어떤 기관도 이런 방식으로 배열된 콜라겐 원섬유를 포함하지 않는다.
기질 콜라겐은 평면내 방향으로는 높은 인장강도를 나타내지만 평면에 수직인 방향으로는 현저히 약하다. 탈세포화된 기질은 그 이상의 약점을 나타낸다. 이러한 탈세포화된 기질 콜라겐을 지지체로 사용하려면, 그 기계적 강도를 증강시키는 더 나은 방법이 필요하다.
콜라겐 지지체를 안정화시키는 방법들이 개시되며, 이에 의해 수분 추출 및/또는 압축, (또는 건조 및 조절된 재수화), 그리고 가교처리를 사용하여 지지체를 성형하고, 기계적으로 강화하고, 수성 환경에서 팽윤 경향을 억제할 수 있다. 이들 방법은 부가 굴절 수술의 일부로서 기질내 또는 각막내 이식을 위한 렌티큘로서 콜라겐 지지체를 제조하는 데 특히 유용할 수 있다.
콜라겐성 조직으로부터 형성된 지지체는 각막에 기계적 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 지지체는 일반적으로 탈세포화 과정에 의해 기계적으로 약해지기 때문에, 기질 내로 또는 기질 위에 배치하기 전에 강화하고 배향해야 할 필요가 있다. 본 발명의 일 양태에서, 공여자 콜라겐성 조직 공급원(예를 들어, 공여자 각막 기질)의 중앙 영역으로부터 조직의 일부를 절제하는 단계; 조직 부분을 성형하여 원하는 제1 형상의 지지체를 제공하는 단계; 지지체를 탈세포화하는 단계; 지지체를 (예를 들어, 지지체의 층판 구조에 대체로 수직인 방향으로) 압밀하여 지지체에 존재하는 과잉 유체를 제거하고 콜라겐 밀도를 향상시키는 단계; 및 지지체의 적어도 일부를 가교처리하여 기계적으로 강화하고 지지체가 수성 환경에 노출될 때 후속 팽윤을 억제하는 단계를 포함하는 공여자 콜라겐성 조직으로부터 지지체를 형성하고 강화하는 방법이 개시된다.
대안적으로, 본 발명의 방법은 공여자 콜라겐성 조직 공급원(예를 들어, 공여자 각막 기질)의 중앙 영역으로부터 조직의 일부를 절제하는 단계; 선택적으로 조직 부분을 성형하여 원하는 제1 형상의 지지체를 제공하는 단계; 지지체를 탈세포화하는 단계; 지지체에서 수분의 일부 또는 전부를 제거하고, 지지체가 원하는 압밀된 형상을 갖도록 조절된 방식으로(예를 들어, 몰드(mold) 또는 기타 제한된 공간에서) 지지체를 재수화함으로써 지지체를 압밀하는 단계; 그런 다음, 다시, 지지체의 적어도 일부를 가교처리하여 기계적으로 강화하고 지지체가 수성 환경에 노출될 때 후속 팽창을 억제하는 단계에 의해 실시될 수 있다.
중요하게는, 본 발명의 방법은 콜라겐 지지체의 기계적 강도 및 화학적 안정성을 향상시킬 수 있다. 지지체가 각막내 이식 가능한 렌티큘로 사용하도록 의도된 경우 지지체의 광학적 선명도(예를 들어, 투명도)를 복원 및/또는 보존하기 위해서도 가교처리를 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 절제 및 초기 성형 단계가 동시에 수행될 수 있다. 지지체를 탈세포화하는 단계는 세제 또는 계면활성제를 사용하여 세포를 용해하고 렌티큘로부터 세포 파편을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있고; 선택적으로 렌티큘로부터 적어도 하나의 면역원성 항원결정인자를 효소적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 지지체를 탈세포화하는 데 유용한 한 가지 용액은 물, 에틸알코올 및 글리세롤을 포함할 수 있다. 탈세포화 용액은, 특히 조절된 재수화 단계가 사용되는 경우, 지지체를 압밀하는 데 사용할 수도 있다. 대안적으로, 탈세포화 후에 건조가 뒤따를 수 있다. 지지체의 배향 역시 조작할 수 있다. 본 명세서에 인용된 방법 단계는 가능한 경우 언제든 임의의 순서로 수행될 수 있다.
특정 작동 이론에 얽매이지 않고, 콜라겐 지지체의 기계적 강화는 가교처리의 결과일 뿐만 아니라 콜라겐 원섬유를 더 조밀한 다발로 압밀(또는 제한)한 결과이기도 하다. 조밀한 원섬유 다발의 가교처리는 재료 강도가 가교처리 단독으로 달성할 수 있는 개선 이상이 되는 결과를 가져올 수 있다.
본 발명의 방법에서, 가교처리 단계는 압축된 지지체의 적어도 일부를 가교제 또는 에너지 매개제에 노출시키거나 압축된(또는 제한된) 지지체의 적어도 일부를 방사선(radiation)에 노출시켜 에너지 매개제의 도움을 받거나 받지 않고 콜라겐 원섬유 사이의 펩타이드 결합 형성에 의해 가교결합을 유발하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 화학적 가교처리 및 광 가교처리의 조합이 또한 개시되어 있으며, 이에 의해 화학적 작용제는 상이한 화학적 결합을 유발하고 콜라겐 원섬유 사이에 물리적으로 기계적 가교결합을 형성할 수 있다.
가교처리 단계는 압축된(또는 다른 방법으로 압밀된) 지지체의 적어도 일부를 직접 노출에 의해 방사선에 노출시키거나, 스치는 각도로 또는 지지체의 표면에 결합된 소멸 도파관을 통해 이러한 방사선에 노출시킴으로써 수행할 수 있다. 가교처리는 압축된 지지체의 표면 부분이 지지체의 벌크 영역보다 더 큰 가교결합 및 더 높은 콜라겐 밀도를 나타내도록 표면 부분을 방사선에 노출시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 압축/압밀 및 가교처리 단계는 지지체의 적어도 일부가 초기 탈세포화된 지지체 분절보다 더 큰 콜라겐 조성 또는 밀도를 갖는 결과를 가져온다. 예를 들어, 압축되고 가교처리된 지지체의 적어도 일부는 20% 이상의 콜라겐, 바람직하게는 35% 초과의 콜라겐의 조성을 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 지지체가 렌티큘 본체, 배향된 전방 표면 및 후방 표면을 갖는 이식 가능한 각막내 렌티큘로 사용하기 위해 구성되도록 실시될 수 있고, 방법은 렌티큘이 기질층에 부착되는 것을 촉진하기 위해 가교제에 의해 또는 패턴화 방사선의 선택적 적용에 의해 렌티큘의 후방 표면의 적어도 일부를 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 방법은 공여자 기질로부터 렌티큘을 형성하는 단계, 렌티큘 추출에 의해 공여자 기질의 중앙 영역으로부터 조직의 일부를 제거하는 단계, 제거된 조직 부분을 렌티큘 본체, 전방 표면 및 후방 표면을 갖는 원하는 제1 형상의 렌티큘로 성형하고, 렌티큘로부터 세포 물질을 제거하는 단계; 렌티큘에 존재하는 과잉 유체(예를 들어, 기질에 원래 존재하는 수분 및 탈세포화 중에 렌티큘에 도입되었을 수 있는 기타 모든 유체)를 제거하는 단계; 및 렌티큘의 적어도 일부를 가교처리하여 최종 원하는 형상을 형성하고 렌티큘이 수성 생체내 환경에 노출될 때 후속 팽윤을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. 렌티큘 형성은 각막절삭기 또는 펨토초 레이저 또는 엑시머 레이저 또는 워터 제트에 의해 수행되는 렌티큘 절제 또는 추출에 의해 진행될 수 있다.
본 명세서에 개시되고 청구된 렌티큘의 제조방법은 수술 또는 요법에 의한 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법이 아니다. 대신, 본 명세서에 개시된 방법은 이미 인간 또는 동물 공급원으로부터 절제된 공여자 각막 기질 조직에 대해 수행된다. 유사하게, 개시된 방법에 의해 형성된 렌티큘이 각막내 이식물로 사용될 수 있지만, 본 명세서에 청구된 제조방법을 실시하기 위해 실제 이식이 필요하지는 않다.
렌티큘의 가교처리는 압축된 지지체의 적어도 일부를 가교제 또는 에너지 매개제에 노출시키거나 압축된 지지체의 적어도 일부를 방사선에 노출시켜 에너지 매개제의 도움을 받거나 받지 않고 콜라겐 원섬유 사이의 펩타이드 결합 형성에 의해 가교결합을 유발함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 렌티큘의 가교처리는 직접 노출에 의해, 또는 스치는 각도로 또는 지지체의 표면에 결합된 소멸 도파관을 통한 노출에 의해 압축된 지지체의 적어도 일부를 방사선에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 응용 분야에서는 선호되는 에너지원은 자외선이다.
콜라겐 가교처리의 화학적 방법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 화학 작용제(예를 들어, 제니핀) 또는 광화학 작용제의 사용이 포함될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2017/0119928호는 심장막 조직을 탈세포화하여 글루타르알데하이드 함유 용액과 가교결합될 수 있고 이식을 위해 원하는 구조로 성형될 수 있는 콜라겐성 기질 물질을 얻음으로써 심장 판막 보철물을 형성하는 방법을 개시한다.
방사선 가교처리는 화학적 가교처리보다 유리할 수 있는데, 그 이유는 생성된 렌티큘이 종종 더 투명하여 수여자 각막에 이식한 후 시력이 더 좋아지게 되기 때문이다.
압밀된 지지체의 방사선 가교처리는 압밀되지 않은(유체 함유) 지지체에 필요한 것보다 훨씬 더 적은 에너지로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 압밀 후 렌티큘의 경우, 가교처리는 약 15 줄(Joule)/㎠ 미만 또는 일부 경우에는 약 2500 줄/㎠ 미만의 플루언스(fluence)를 갖는 자외선에 의해 달성될 수 있다. 보다 일반적으로, 원하는 플루언스는 약 15 줄/㎠ 내지 약 600 줄/㎠의 범위에 있다. 콜라겐성 지지체의 가교처리에 유용한 하나의 특정 파장 범위는 일반적으로 "UV-C" 파장 대역의 일부, 예를 들어 약 185㎚ 내지 약 280㎚에 해당한다. 지지체의 적어도 부분적인 가교처리 및/또는 멸균을 유발하기 위해 다른 UV 파장 대역(약 280㎚ 내지 약 315㎚(또는 320㎚) 범위의 UV-B 대역 또는 약 315㎚(또는 320㎚) 내지 약 400㎚의 UV-A 대역)이, 그리고 일부 경우에는 엑스선, 감마선 또는 전자빔이, 또한 사용될 수 있다.
탈세포화된 콜라겐 지지체는 어느 정도의 "형상 기억" 또는 "압축 히스테리시스"를 나타내기 때문에, 이를 분리하여 압축한 다음 압축 몰드에 의해 더 이상 구속되지 않는 동안 가교처리하는 것이 가능하다. 이 분리(순차적으로)는 대안적인 제조공정이다. 그러나 대부분의 경우 바람직한 방법은 지지체가 몰드에서 압축/압밀된 상태로 유지되는 동안 가교결합을 유발하는 것이다. 어느 경우든 압밀된 콜라겐 다발의 가교처리는 분산된 콜라겐 원섬유 배열의 가교처리보다 더 큰 강도를 가져온다.
본 발명의 방법의 다른 일 양태에서, 가교처리 단계는 압축된 지지체의 표면 부분을 방사선에 노출시켜 표면 부분이 지지체의 벌크 영역보다 더 큰 가교결합 및 더 높은 콜라겐 밀도를 나타내도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 가교처리 단계는 어떤 미생물 작용제든 비활성화하고 렌티큘을 멸균하기에 충분한 방사선을 적용하는 것을 또한 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 지지체를 탈세포화하는 단계는 세제 또는 계면활성제를 사용하여 렌티큘로부터 세포 파편을 제거하는 단계를 포함할 수 있고; 선택적으로 렌티큘로부터 적어도 하나의 면역원성 항원결정인자를 효소적으로 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
추가로, 압축 및 가교처리 단계는 지지체의 적어도 일부가 초기 콜라겐성 조직 분절보다 더 큰 콜라겐 밀도를 갖는 결과를 가져올 수 있다. 가교처리 단계는 전방 표면 영역이 렌티큘 본체의 벌크 영역보다 더 큰 정도의 가교처리 또는 더 큰 콜라겐 밀도를 나타내도록 전방 표면에 선택적으로 방사선을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 가교처리는 또한 본 교시에 의해 형성된 렌티큘 및 지지체의 "강성도"를 유리하게 변형시킬 수 있다. 포유동물의 각막 조직에서 대부분의 콜라겐 원섬유는 "수평 방향으로"(또는 대안적으로 표현하면, 각막 표면에 접선 방향으로) 정렬된다. 원섬유는 1차, 2차 및/또는 3차 코일에 감긴 매우 긴 콜라겐 분자로 만들어진다.
본 교시에 따르면, 몇 가지 구별되는 유형의 가교결합이 유발될 수 있다. 예를 들어, 가교결합은 콜라겐의 3차 코일 내에서 일종의 콜라겐-콜라겐 가교결합으로서 유발될 수 있다. 이 가교결합은 개별 코일이 서로 더 강하게 접착되도록 함으로써 길이방향 탄성 콜라겐 원섬유를 감소(예를 들어, 경직)시킬 수 있다. 이 가교결합의 속도는 지지체 압축에 덜 민감한데, 이는 코일이 "수평 방향으로" 배향되고 압축은 개별 원섬유의 압밀함에 크게 영향을 미치지 않기 때문이다. 이러한 종류의 가교결합의 양은 일반적으로 누적 방사선량에 비례하며 압축/압밀 상태는 그 중요성이 제한적이다. 이 제1 유형의 가교결합은, 안내액의 안압(IOP)에 의한 기질 늘이기의 경우와 같이, 표면에 "평행/접선" 방향으로 늘이는 것에 대해 각막 조직이 더욱 복원력이 있도록 만든다.
제2 유형의 가교결합은 (인접하긴 하지만) 상이한 콜라겐 가닥 또는 원섬유에 속하는 콜라겐 사이에서 발생할 수 있다. 이 가교결합은 일반적으로 직접적인 콜라겐-콜라겐 결합을 포함하지 않으며, 오히려 연결은 GAG 또는 프로테오글리칸과 같은 다른 분자에 의해 매개(가교)된다. 제1 유형과 대조적으로, 이 제2 유형의 가교결합은 지지체의 압축/압밀에 매우 민감하며 지지체의 기계적 특성/거동에 세 가지 독특한 변화를 유발할 수 있다.
2차 가교결합(원섬유 사이의 가교 분자에 의해 매개됨)은 내팽윤성을 증가시킨다. 이 내성은 렌티큘 또는 지지체의 "수직"(반경) 방향 경직의 직접적인 표현이다. 수직 방향 가교는 인접한 원섬유 사이의 거리 변화에 내성이 있다. 2차 가교결합은 또한 인간 기질에 이식될 때 지지체의 삼투압 붕괴에 대한 내성을 유발한다. 이러한 내성은 GAG 및 프로테오글리칸의 압밀 및 이에 따른 더 높은 (단위 부피당) 농도로 인해 발생하며, 이는 수여자의 천연 기질보다 더 높은(또는 적어도 동일한) 삼투압을 가한다. 또한, 2차 가교결합은 콜라겐 원섬유의 층들 사이의 미끄러짐을 억제한다. 이러한 억제는 천연 인간 기질에 비해 굽힘 힘에 대항하여 지지체를 경직시킨다.
공여자 조직의 탈세포화는 그 자체로 조직의 GAG 및 프로테오글리칸을 부분적으로 제거(분해)하여, 탈세포화된 조직이 천연 인간 기질보다 더 낮은 삼투압(약 50 내지 60 mmHg)을 나타내고 이식시 지지체의 붕괴를 초래할 수 있다. 반면에 압축(또는 압밀)은 (탈세포화 전의) 공여자 렌티큘의 원래 두께보다 낮은 두께에도 불구하고 지지체의 최대 삼투압을 회복할 수 있다. 소수성 물질인 콜라겐은 삼투 특성에 거의 기여하지 않는다. 그러나, (더 작은 공간에서) GAG 및 프로테오글리칸의 증가된 농도는 삼투압에 대한 이들의 기여도를 높인다. 다시 말해, 압축/압밀은 GAG 및 프로테오글리칸의 탈세포화 손실을 보상하고 이들의 농도를 회복하지만 이는 더 작은 부피에서만 그러하다.
따라서, 가교결합에 의해, 삼투 상호작용이 작용할 때 이식 후 생체내 렌티큘의 붕괴를 방지하는 동시에 형성 중의 팽윤을 방지하기 위해 압밀된 렌티큘의 향상된 삼투 특성을 고정화할 수 있게 된다. 다시 말해서, 본 교시에 따른 가교결합은 이식 전 및 이식 후 양방향으로 렌티큘을 삼투적으로 안정화시킨다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 증가된 강성의 렌티큘 및 지지체는 본 교시에 의해 얻을 수 있다. 가교처리된 콜라겐의 강성은 예를 들어 모듈러스라고 지칭하는 매개변수(μ)에 의해 정량화될 수 있다. 천연 인간 각막 콜라겐의 모듈러스(μ)에 대한 공칭 표준 값은 사람에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 젊은 사람 눈의 경우 각막 콜라겐의 평균 모듈러스(μ)는 약 5×104 파스칼(Pa)일 수 있다. 나이든 개인의 경우 모듈러스(μ)는 1.2×105 Pa 정도로 높을 수 있다. 또한 돼지 눈(이는 이식 가능한 렌티큘러 및 지지체 콜라겐의 중요한 공급원이 될 수 있음)의 경우 각막 콜라겐의 평균 모듈러스(μ)는 약 2×104 파스칼(Pa) 정도로 낮을 수 있다.
본 교시에 따른 압밀 및 가교처리의 결과로서, 2×104 Pa 초과, 또는 8×104 Pa 초과, 또는 1.6×105 Pa 초과, 또는 2×105 Pa 초과, 또는 3×105 Pa 초과, 또는 5×105 Pa 초과, 또는 8×105 Pa 초과, 또는 1×106 Pa 초과, 또는 3×106 Pa 초과, 또는 5×106 Pa 초과 또는 1×107 Pa 초과의 모듈러스 강성(μ)을 나타내는 콜라겐성 렌티큘 및 지지체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 렌티큘(지지체 포함)은 1×104 Pa 내지 1×107 Pa, 또는 2×104 Pa 내지 8×106 Pa, 또는 1×105 Pa 내지 5×106 Pa, 또는 3×105 Pa 내지 5×106 Pa, 또는 1×106 Pa 내지 2.6×106 Pa 범위의 모듈러스 값(μ)을 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, 렌티큘에 원하는 형상 및 배향을 제공하도록 형성된 전방 표면 및 후방 표면을 갖는 공여자 조직으로부터 유래된 렌티큘러 본체를 갖는 탈세포화된 콜라겐 렌티큘이 개시된다. 예를 들어, 렌티큘은 렌티큘의 전방 및 후방 표면과 자주 일치하지만 항상 그런 것은 아닌 볼록한 면 및 오목한 면을 가질 수 있다. 렌티큘러 본체는 15% 또는 25% 콜라겐을 초과하는 조성을 달성하기 위해 탈세포화 및 압축/압밀된 콜라겐 층을 포함할 수 있으며 추가적으로 축방향 팽윤을 억제하기 위해 적어도 부분적으로 가교처리될 수 있다. 벌크 가교처리된 렌티큘의 경우, 조성은 30% 콜라겐을 초과할 수 있다. 더욱이, 국부적으로 조밀화된 층이 바람직하다면(예를 들어, 보우만막(Bowman's Membrane)과 같은 각막 구조를 근사하기 위해) 국부적 콜라겐 농도는 훨씬 더 높을 수 있다(예를 들어, 35% 콜라겐 초과 또는 40% 콜라겐 초과 또는 심지어 60% 콜라겐 초과).
특정 실시예에서 렌티큘은 방사선의 적용에 의해 가교처리된 콜라겐 층을 특징으로 할 수 있고, 렌티큘은 또한 콜라겐 원섬유 사이의 유발된 펩타이드 결합을 추가 특징으로 할 수 있다. 렌티큘의 90% 내지 100%, 또는 바람직하게는 95% 내지 99.99%는 세포 물질이 없고 탈세포화, 압축 및 가교처리 후에 렌티큘이 환자의 눈에 이식되어 각막의 굴절력을 변경하거나 기질의 손상되거나 병든 부위를 교체하거나 강화할 수 있도록 원하는 형상으로 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 렌티큘은 일반적으로 만곡된 원반형 형상이고, 직경이 약 0.5㎜ 내지 약 10㎜이다. 이들은 또한 일반적으로 최대 두께의 범위가 약 600 내지 약 50 마이크로미터, 보다 바람직하게는 약 400 내지 약 100 마이크로미터일 수 있다. 렌티큘은 일반적으로 두께가 균일하지 않으며 최소 두께는 약 50 마이크로미터 미만, 보다 바람직하게는 약 30 마이크로미터 미만 또는 약 15 마이크로미터 미만일 수 있다.
렌티큘은 면역원성 항원결정인자의 분해로 인해 낮은 면역반응성을 나타내야 한다. 특정 실시예에서, 렌티큘의 적어도 하나의 표면은 환자의 기질층에 기질 내로 이식될 때 기질층에 대한 렌티큘의 부착을 촉진하기 위한 가변 가교처리 패턴을 추가로 포함한다. 렌티큘은 또한 렌티큘 본체의 벌크 영역보다 콜라겐 밀도가 더 큰 전방 표면 영역을 갖는 전방 표면을 가질 수 있다. 예를 들어, 전방 표면 영역의 콜라겐 밀도는 적어도 약 35% 또는 40% 또는 60% 콜라겐일 수 있다.
따라서, 본 발명은 콜라겐 렌티큘 및 지지체의 형상을 안정화시키는 방법을 개시한다. 콜라겐성 조직은 인간 또는 동물 기원의 임의의 콜라겐성 공급원에서 채취할 수 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 조직은 인간 또는 돼지 기질에서 채취될 수 있다. 공급원 조직은 절제 중 또는 절제 후 별도의 단계에서 성형될 수 있다. 조직은 다양한 기술에 의해 성형, 탈세포화 및 안정화될 수 있으며, 그 중 몇 가지에 대해서는 보다 상세히 후술한다. 성형 및 탈세포화 후, 절제된 콜라겐성 조직 분절은 유체 함량을 줄이기 위해 압축/압밀되고 콜라겐 사슬 또는 원섬유의 가교결합을 유발하기 위해 방사선에 조사된다. 가교결합은 화학적 중간체, 예를 들어 가교제의 존재 또는 부재 하에 유발될 수 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 가교결합은 충분히 강력한 방사선에 노출되어 콜라겐 원섬유 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써 달성된다. 이 강력한 방사선은 바람직한데, 이는 콜라겐 사슬 사이에 펩타이드 결합을 생성하는 것은 일반적으로 흡열 반응이기 때문이다. 펩타이드 결합 가교결합을 유발하기 위한 다양한 에너지원이 사용될 수 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 에너지는 자외선(UV) 방사선에 의해 전달된다.
본 발명은 일반적으로 층상 콜라겐성 조직, 특히 각막 기질로부터 채취된 콜라겐 지지체의 공간적 안정화에 특히 적용 가능하다. 공급원 조직의 층상 콜라겐 배열은 광학적 투명도를 위해 자연적으로 진화했을 수 있지만 기계적 약점 및/또는 수성 환경에 노출될 때 팽윤되는 삼투 경향을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 팽윤을 억제하고/하거나 최종 지지체에 더 큰 축방향 기계적 강도를 제공하는 것이다. 본 발명은 층을 이루지 않은(또는 무질서한) 절제된 콜라겐성 조직 분절에도 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 지지체가 각막 이식용 렌티큘인 경우, 지지체의 적어도 하나의 표면, 예를 들어 전방 표면 상의 콜라겐 밀도 또는 평활도를 변경하기 위한 방법이 개시된다. 이러한 표면 변경은, 예를 들어 이식물에 접근하기 위해 위에 놓여있는 피판을 다시 열어야 하는 경우, 이식 후에 지지체를 조작하기 쉽게 할 수 있다. 표면 변경은 방사선 조사 및/또는 화학 약품의 적용에 의해 달성될 수 있다.
동종 이식 및/또는 이종 이식 공급원으로부터의 탈세포화되고 성형된 각막 조직 렌티큘 및 이러한 렌티큘을 얻는 방법이 개시된다. 렌티큘은 각막이식 시술에서 기질내 또는 각막내 렌티큘러 이식물로 특히 유용하며, 이때 힌지가 있는 피판이 환자의 각막에 형성되고 힌지를 따라 뒤로 접혀 각막의 기질층을 노출시킨다. 그런 다음 성형된 렌티큘을 기질층에 적용하고 피판을 원래 위치로 되돌려 각막에 새로운 곡률을 부여하여 원하는 굴절률 교정을 얻는다. 새로운 굴절력의 미세 조정은 이식과 동시에 또는 추후 퇴화 내지 색조 변화가 있는 경우에 레이저 절제를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 이식된 렌티큘에 대한 환자 측의 잠재적인 면역원성 반응을 감소시키기 위해 탈세포화된 각막 렌티큘 및 각막 조직을 탈세포화하는 방법이 개시된다. 전형적인 각막의 약 1 내지 4%만이 세포로 구성되어 있다. 나머지 96 내지 99%는 대개 세포외 기질(ECM)로서 주로 콜라겐, 글리코아미노글리칸(GAG), 프로테오글리칸, 및 수분이다. 바람직한 일 실시예에서, 렌티큘의 세포 성분은 예를 들어 나트륨 테트라데실 설페이트(STS)와 같은 계면활성제로 처리하여서 또는 효소 가용화에 의해 제거된다. 원하는 경우, 특히 공급원이 비인간 (이종) 공여자인 경우, 렌티큘의 면역원성을 추가로 감소시키기 위해 추가 조치를 취할 수 있다. 예를 들어, 이종 조직에 존재할 수 있는 두 개의 비인간 항원결정인자는 neu5GC와 알파 갈(Alpha-Gal)이다. 이들 바람직하지 않은 항원결정인자는 기질 세포 내부 또는 표면에만 존재할 수 있는 것은 아니다. 항원결정인자의 일부는 ECM 콜라겐 원섬유를 감싸는, 점액다당류라고도 하는 GAG의 내부에 내재될 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 항원결정인자는 키나제 처리 및 추가 세척에 의해 적어도 부분적으로는 선택적으로 제거될 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 렌티큘은 일반적으로 95% 내지 100%의 세포 물질이 제거된다. 바람직하게는, 렌티큘의 95% 내지 99.99%는 무세포이다. 95%와 100% 사이의 모든 가능한 하위 범위를 언급하지 않더라도, 이러한 모든 하위 범위가 고려되고 본 발명의 일부로 간주된다는 점은 명백할 것이다. 예를 들어, 렌티큘의 95% 내지 97%, 97% 내지 99% 또는 98% 내지 99.9%는 세포 물질이 없을 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 본 발명에 따른 원반 형상 렌티큘은 공여자 각막으로부터 원반 형상 조직 분절을 절단함으로써 얻는다. 조직 분절은 슬라이싱 시술 중에 원하는 형상이 얻어지도록 하는 방식으로 슬라이싱되고/되거나 추가 성형 또는 절단될 수 있다. 절단은 기계적으로, 예를 들어 미세각막절삭기 등에 의해 수행될 수 있고, 레이저 가공에 의해, 예를 들어 펨토초 레이저에 의한 광절단에 의해 또는 엑시머 레이저에 의해 또는 워터 제트에 의해 수행될 수 있다. 비대칭의 가능성을 줄이기 위해, 조직 분절은 바람직하게는 예를 들어 공여자 각막의 광학적 또는 기하학적 축이 렌티큘의 중심에 보존된 상태로 공여자 각막의 중앙 부분으로부터 채취된다. 조직 분절의 형상은 환자의 굴절 이상을 교정하는 데 필요한 굴절력 변화에 의해 결정된다. 예를 들어, 원시(원시안) 및/또는 노안 교정의 경우, 일반적으로 각막의 곡률을 높이는 것이 목표이며 원하는 렌티큘 형상은 적어도 한 면에서 약간 볼록한 것이다. 전형적으로, 렌티큘의 최대 두께는 400 마이크로미터 미만, 또는 많은 경우에 200 마이크로미터 미만, 또는 100 마이크로미터 미만, 또는 50 마이크로미터 미만일 것이다. 거의 모든 응용분야에서 최대 두께는 600 마이크로미터 미만이다. 일부 상황에서, 상기 원반-렌티큘이 빛을 망막의 다른 부분으로 재지향시키는 프리즘으로서 형성되면 황반변성을 앓고 있는 환자의 시각 개선이 달성될 수 있다.
원추각막의 치료는 시각적 수차의 감소뿐만 아니라 병든 기질의 기계적 강화만을 포함할 수 있다. 원반 둘레에 전이 경사 구역(쐐기형)이 있는 두께가 50 내지 300 마이크로미터인 동일 평면 원반이 이러한 목적에 적합할 수 있다. 대안적으로, 원추각막 치료용 렌티큘은 공여자의 각막에서 물려받은 자연적인 곡률을 이용할 수 있거나 또는 곡선형 몰드를 사용하여 압축/압밀 및/또는 가교처리 중에 추가 곡률을 도입할 수 있다. 일부 경우에는, 렌티큘을 "거꾸로", 예를 들어 렌티큘의 곡률이 수여자 각막의 반대가 되도록 이식하는 것이 원추각막을 치료하는 데 유리할 수 있다.
일부 경우에는 만곡된 몰드가 바람직할 수 있지만, 압축/압밀 및 가교처리 단계는 편평한 몰드로도 실행될 수 있다. (평면 성형은 저장 및 운송 또는 제조 효율에 유리할 수 있다.) 본 발명의 다른 일 양태에서, 기밀 밀봉 가능한 몰드를 압축/압밀 및 저장 양쪽 모두에 사용할 수 있다.
지지체의 한 표면에 가해지는 압력은 그 곡률을 변경하고/하거나 콜라겐 원섬유를 재정렬(또는 그 정렬을 유지)하는 데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 지지체는 챔버의 개구부에 고정될 수 있으며, 그런 다음 챔버에 가압 유체가 채워져 지지체의 한쪽 면에 압력을 가하여, 지지체에 수평/접선 방향 힘을 전달한다. 유체 압력은 지지체를 (풍선처럼) 팽창하게 할 것이다. 선택적으로 압축 판을 반대쪽 표면에 적용할 수 있다. 예를 들어, 만곡된 (오목 비슷한) 압축 판을 사용하여 지지체를 늘이거나 재성형할 수 있는 범위를 제한할 수 있다. 원하는 곡률이 얻어지면 가교처리를 사용하여 원하는 형상을 유지하고/하거나 그렇게 조작된 지지체가 기질내 또는 각막내 이식시 팽윤되는 경향을 억제할 수 있다.
일부 실시예에서, 상부 기질 표면, 즉 소위 "보우만막"을 보존하여 렌티큘의 전방 표면이 다른 (후방) 표면과 상이한 질감을 나타내도록 하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 각막의 이 자연적인 전방 분절이 기질 조직의 최외측 층의 자연적인 응축으로 인해 더 조밀하고 매끄럽기 때문이다. 대안적으로, 절제된 분절을 기질의 중앙 영역으로부터 채취할 수 있고, 전방 표면은 더 상세히 후술하는 바와 같은 선택적 가교처리에 의해 성형 및 절제 후에 조밀화할 수 있다. 후방 표면(전방 표면 또는 보우만막의 반대쪽)은 낮은 기질 조직 밀도와 조직의 기계적 또는 레이저 절단에 의해 형성된다는 사실로 인해 더 거칠게 된다. 이러한 거칠기의 차이는 렌티큘이 기질내 또는 각막내 이식에 사용될 때 특히 유리할 수 있는데, 이는 렌티큘이 기질층에 강하게 부착되는 것이 매우 바람직할 수 있기 때문이다. 시술 후 최적에 못 미치는 굴절 결과가 관찰되는 경우, 레이저 절제 등에 의한 추가 각막 성형(렌티큘의 재조형)을 허용하기 위해 피판을 다시 접어야 할 수 있다. 렌티큘이 기질층에서의 원래 위치에서 움직이게 되면 이 각막 성형의 효과가 손상될 수 있다. 더욱이, 렌티큘의 전방 표면의 매끄러움은 또한 피판을 다시 열 때 렌티큘이 빠져나올 가능성을 낮춘다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, 후방 표면을 절제, 성형 및 탈세포화 후에 처리하여 표면이 기질층에 더 부착되도록 할 수 있다. 예를 들어, 멸균 및 포장 전에 가교제를 적용할 수 있다. 대안적으로, 시술 중 이식 전에 임상의가 접착력 강화제를 적용할 수 있다. 전방 표면을 처리하여 피판에 덜 부착되도록 할 수 있다.
도 1a는 절제된 기질 조직 분절의 개략 단면도이고;
도 1b는 탈세포화 후 절제된 기질 조직 분절의 개략 단면도로서, 조직의 팽윤 및 그에 따른 콜라겐 원섬유의 분리를 보여주고;
도 1c는 본 발명에 따른 탈세포화, 압축/압밀 및 가교처리 후 절제된 기질 조직 분절의 개략 단면도이고;
도 2는 전방 표면 영역의 탈세포화, 압축/압밀 및 선택적 가교처리 후 절제된 기질 조직 분절의 개략 단면도이고;
도 3은 후방 표면 영역의 탈세포화, 압축/압밀 및 선택적 패턴화 후 절제된 기질 조직 분절의 개략 단면도이고;
도 4a는 제조 및/또는 운송 중의 전형적인 형상인 평평한 형상의 본 개시에 따른 렌티큘을 도시하고;
도 4b는 각막내 이식을 위해 준비된 최종 만곡 상태의 렌티큘을 도시하고;
도 5a는 원시 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘을 도시하고;
도 5b는 근시 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘을 도시하고;
도 5c는 노안 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘을 도시하고;
도 5d는 원추각막으로 알려진 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘을 도시하고;
도 6a는 강한 가교결합의 국부적 지점들과 함께 제조된 렌티큘의 또 다른 실시예를 도시하고;
도 6b는 중간 정도의 가교결합을 갖는 중앙 광학 활성 구역 및 강한 가교결합을 갖는 외부 또는 주변 구역을 포함하는 렌티큘의 또 다른 실시예를 도시하고;
도 7a는 심부표층각막이식(DALK)을 위한 렌티큘의 사용을 도시하고;
도 7b는 환자의 온전한 보우만막 상부에 배치하도록 구성된 렌티큘의 사용을 도시하고;
도 7c는 전층각막이식(PK) 시술을 위한 렌티큘의 또 다른 실시예를 도시하고;
도 8a 및 도 8b는 두꺼운 렌티큘의 주변부에 대한 두 개의 대안적인 설계를 도시하고;
도 8a는 단순한, 예를 들어 원통형 또는 원추형 주변부 가장자리를 갖는 렌티큘을 도시하고;
도 8b는 주변부에 지그재그 또는 계단형 가장자리를 갖는 렌티큘을 도시하고;
도 8c는 주변부에 "락앤키(lock and key)" 가장자리를 갖는 렌티큘을 도시하고;
도 9는 본 발명에 따른 콜라겐 지지체를 압축하고 가교처리하는 데 사용하기 위한 프레스 장치의 개략 사시도이고
도 10a 및 도 10b는 본 발명에 따른 두 부분으로 구성되고 기밀 밀봉 가능한 압축 및 저장 몰드를 도시하고;
도 10a는 지지체의 압축 전의 몰드를 도시하고;
도 10b는 압축 후의 몰드를 도시하고;
도 10c는 지지체의 압축/압밀을 위한 대안적인 몰드의 분해도를 도시하고;
도 10d는 도 10c의 몰드를 조립된 형태로 도시하고;
도 10e는 도 10d의 몰드의 평면도이고;
도 10f는 도 10c 내지 도 10e의 몰드의 단면도이고;
도 11은 지지체를 늘이기 위한 본 발명에 따른 추가 장치를 도시하고;
도 12는 도 11의 장치와 유사하지만 지지체를 늘이는 동시에 압축하는 한편 가교처리 방사선에 대한 노출을 용이하게 하기 위한 압축 인가 판 요소가 추가된 또 다른 대안적인 장치를 도시하고;
도 13은 본 개시에 따라 생산된 렌티큘의 투명도를 측정하기 위한 장치를 도시하고;
도 14는 광학적 선명도를 정량화하기 위해 도 13의 장치 등에 의해 얻을 수 있는 밝기 분포 곡선의 그래프이고;
도 15a는 초기 응력비인가 상태에 있는 본 개시에 따른 압축/압밀되고 가교처리된 평면 렌티큘의 강성(모듈러스, μ)을 측정하기 위한 기구의 개략 단면도이고;
도 15b는 시험 힘 인가시의 도 15a의 기구의 개략 단면도이고;
도 16a는 초기 응력비인가 상태에 있는 본 개시에 따른 압축/압밀되고 가교처리된 비평면 렌티큘의 강성(모듈러스, μ)을 측정하기 위한 기구의 개략 단면도이고
도 16b는 시험 힘 인가시의 도 16a의 기구의 개략 단면도이다.
설명된 특정 공정, 조성 또는 방법론은 변화가 가능하기 때문에 본 발명은 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 버전 또는 실시예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 해당 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"절단"이라는 용어는 예를 들어 기계적 칼날, 자외선(UV) 레이저, 펨토초 레이저, 또는 워터 제트의 작용에 의한 생물학적 재료의 절개, 절제 또는 제거의 공지된 방법 모두를 포함한다.
"압축", "압축된" 및 "압축하는"이라는 용어는 압력의 인가에 의한 압밀 또는 진공이나 원심력-구동 수분 추출과 같은 다른 기술에 의한 압밀을 포함한다. "압축"이라는 용어는 지지체 또는 렌티큘이 원하는 밀도를 갖도록 하는 제한된 공간에서의 탈수 및 조절된 재수화를 설명하는 데 전반적으로 사용된다. "제한된" 및 "재구성된"이라는 용어는 원하는 형상과 밀도의 렌티큘 또는 지지체를 달성하기 위해 구속 챔버에서 조직 부분을 탈수(또는 건조)시키고 조절된 재수화(또는 팽윤)를 하는 과정을 설명하는 데에도 사용된다.
"방사선"이라는 용어는 적외선, 가시광선 및 자외선(예를 들어, 약 400㎚에서 약 193㎚ 또는 그 이하까지), 엑스선, 감마선 및 전자빔을 포함한다.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 조직, 세포, 세포 추출물, 균질화된 조직 추출물, 또는 하나 이상의 세포 생성물의 혼합물을 지칭한다. 생물학적 샘플은 생리학적으로 허용되는 적절한 담체에 사용되거나 제공될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 통상의 기술자에게 알려진 그 등가물 등에 대한 언급이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약"이라는 용어는 그것이 사용되는 숫자의 수치의 위아래 10%를 의미한다. 따라서 약 100㎛는 90 내지 110㎛ 범위를 의미한다. 본 개시 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은 각각의 모든 수치 하한을 마치 본 명세서에 명시적으로 기재한 것처럼 대안으로서 포함하는 것으로 간주됨을 이해해야 한다. 본 개시 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은 각각의 모든 수치 상한을 마치 본 명세서에 명시적으로 기재한 것처럼 대안으로서 포함하는 것으로 간주된다. 본 개시 전반에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 이러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 각각의 모든 더 좁은 수치 범위를 마치 본 명세서에 모두 명시적으로 기재한 것처럼 포함하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 "동물", "환자" 또는 "피험자"이라는 용어는 인간 및 야생 동물, 가축 및 농장 동물과 같은 비인간 척추동물을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. "동물", "환자" 또는 "피험자"라는 용어는 또한 각막 렌티큘 이식의 수여자를 지칭한다. "이종 이식편"이라는 용어는 돼지, 소, 유인원, 원숭이, 개코원숭이, 기타 영장류 및 기타 모든 비인간 동물을 비롯한 동물로부터 공여를 위해 수집한 조직을 의미하며, "동종 이식편"은 수여자와 같은 종인 공여자로부터 채취한 조직을 의미한다.
일반적으로 말해서, "조직"이라는 용어는 특정 기능의 수행에서 결합된 유사하게 특수화된 세포의 임의의 집합체를 지칭한다. 각막 기질은 대부분 무세포(약 1 내지 5%의 세포)이지만 "조직"의 한 예이다.
"건조시키는", "건조된" 등의 용어는 조직 부분에서 수분의 일부 또는 전부를 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "건조"는 조직에 존재하는 수분의 50% 내지 100%, 바람직하게는 일부 경우에는 수분의 60% 내지 95%를 제거할 수 있다. 일반적으로, 원하는 압밀 정도를 달성하기 위해, "건조"는 조직 부분에 있는 수분의 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상을 제거함으로써 실시될 수 있다. 건조는 에탄올 유체 교환과 같은 화학적 공정 또는 진공 건조 또는 (예를 들어, 드라이아이스를 포함하는 챔버 또는 기타 동결 건조 장치에서의) 동결 건조와 같은 물리적 수단을 통해 달성할 수 있다.
"렌티큘(lenticule)"이라는 용어는 수여자의 각막 내로 또는 각막 상에 이식될 준비가 된 탈세포화되고 가공된 공여자 각막 조직을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, "렌티큘"과 "지지체"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 사용될 때, 각 용어는 다른 용어를 포함하도록 의도된다. "콜라겐 농도" 및 "콜라겐 백분율"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 렌티큘 또는 지지체에 존재하는 콜라겐의 양을 지칭한다. 이 농도 또는 백분율은 (물과 완전히 평형 상태인) 건조 전 렌티큘의 중량에 대비한 완전히 건조된 렌티큘, 예를 들어 진공 건조된 렌티큘의 중량 분율로서 측정될 수 있다. 일부 경우에는, 에탄올을 사용하여 건조를 개선할 수 있다.
렌티큘 이식과 관련하여 "각막내"라는 용어는 렌티큘이 각막 내에 또는 각막 상에 배치되는 임의의 시술을 지칭한다. 각막내 이식의 한 유형은 "기질내" 이식으로, 이는 전방 보우만막 또는 상피의 절제 없이, 예를 들어 전방 조직 피판의 접힌 후면에 의해 또는 측면 접근을 통한 직접 삽입에 의해 렌티큘을 눈의 기질 내에 배치하는 시술이다. 렌티큘의 각막내 사용의 다른 유형에는 보다 상세히 후술하는 바와 같이 렌티큘이 눈의 전안부를 완전히 대체하는 심부표층각막이식술(DALK) 및 전층각막이식술(PK)이 포함된다. 적용 가능한 또 다른 "각막내" 시술은 소위 "상층각막성형술"이며, 이 역시 보다 상세히 후술한다.
"축방향"라는 용어는 렌티큘 또는 지지체의 배향에 대한 방향을 지칭한다. 전형적으로, 성형된 렌티큘은 회전 타원체 또는 타원체 원반형 형상으로 만곡될 것이고 축방향 또는 "축"은 대체로 원반의 중심에 수직일 것이다. 달리 명시되지 않는 한, "축방향"은 또한 조직 분절이 절제되는 눈 또는 렌티큘이 이식되도록 설계된 수여자의 눈의 시각적 또는 광학적 축과 대체로 거의 평행하거나 동축이다. (자연적인 눈에서 광학적 축은 일반적으로 거의 각막 중앙을 통과하지만 각막 중앙을 정확히 통과하는 것은 아니다.)
행성 물리학(구형 기하학)은 기질에서 콜라겐 원섬유의 공간적 배열을 설명하는 편리한 명명법을 제공할 수 있다. 콜라겐 원섬유의 대부분은 고위도에서 중위도 궤도에 있으며 단지 일부만이 극궤도에 존재한다. 이러한 이유로 기질은 일반적으로 중앙(중간) 영역/위치에서 가장 얇다. 압축의 축방향은 극관 압축 또는 반경방향 압축이라고 할 수 있다. 공여자 기질의 중앙 영역은 원섬유 정렬에서 강한 회전 대칭을 나타낸다. 이식물이 압축뿐만 아니라 인장응력 하에서도 작용하도록 지정된 경우, 중앙 기질 위치로부터 추출한 렌티큘은 이식물에 회전 대칭인 인장 특성을 부여하는 것이 바람직하다.
본 개시는 또한 동종 이식편 및/또는 이종 이식편 공급원으로부터의 탈세포화된 각막 렌티큘 및 공여자 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법에 관한 것이다. 개시된 탈세포화된 각막 렌티큘은 근시, 원시, 노안 및 난시와 같은 비정상적인 굴절 상태뿐만 아니라 기타 안과적 병리를 교정하는 데도 사용될 수 있다.
각막은 전방에서 후방까지 각막 상피, 얇지만 조밀한 상부 기질 층(일반적으로 인간의 눈에서는 보우만막으로 지칭됨), 각막 기질, 데스메막 및 각막 내피의 5개 층으로 구성되는 것으로 일반적으로 간주될 수 있다. 각막 상피는 빠르게 성장하고 쉽게 재생되는 비각화 중층편평상피세포의 약 6개 층으로 구성된다. 전방 기질층(예를 들어, 보우만막)은 무작위로 조직되고 촘촘하게 짜여진 콜라겐 유형 I 원섬유로 대부분 구성된 단단한 층이다. 각막 기질은 평행한 층으로 배열된 콜라겐 유형 I 섬유로 구성된 두껍고 투명한 층이다. 데스메막은 각막 내피의 기저막 역할을 하는 얇은 무세포층으로 덜 단단한 콜라겐 유형IV 원섬유로 구성된다. 마지막으로, 각막 내피는 미토콘드리아가 풍부한 세포의 단순 편평 단층 또는 낮은 입방체 단층으로 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "보우만막"이라는 용어는 인간 각막 또는 공여자 동물 각막으로부터의 임의의 각막의 전방 기질 영역을 설명하는 데 사용된다. 인간 각막의 조밀화된 층이 더 뚜렷할 수 있지만(따라서 인간 각막의 보우만막으로 알려짐), 모든 각막은 동물 종 및 연령에 따라 어느 정도 더 높은 전방 조밀화와 (기질층 조직 대비) 어느 정도의 매끄러움을 나타낸다. 따라서, "보우만막"은 이 전방 분절을 설명하기 위해 본 출원 전체에 걸쳐 사용되는 용어이다.
이와 같이, 공여자 각막의 채취 및 가공 그리고 렌티큘의 생성은 시력의 굴절 이상 교정에 중요한 요소이다. 렌티큘은 각막이식 시술에서 렌티큘러 이식물로 특히 유용하며, 이때 힌지가 있는 피판이 환자의 각막에 형성되고 힌지를 따라 뒤로 접혀 각막의 기질층을 노출시킨다. 그런 다음 성형된 렌티큘을 기질층에 적용하고 피판을 원래 위치로 되돌려 각막에 새로운 곡률을 생성하고 원하는 굴절률 교정을 얻는다. 새로운 굴절력의 미세 조정은 이식과 동시에 또는 추후 퇴화 내지 색조 변화가 있는 경우에 레이저 절제를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 탈세포화된 각막 렌티큘은, 공여자 기질로부터의 상부 층의 적어도 일부를 포함하는 전방 표면 및 렌티큘에 원하는 형상을 제공하도록 형성된 후방 표면을 갖는 공여자 기질로부터 유래된 렌티큘라 본체를 포함할 수 있고, 이때 공여자 기질은 탈세포화된다. 다른 실시예에서, 렌티큘은 보우만막 및 공여자 기질의 임의의 상부 부분의 보존과 관계없이 성형된다. 예를 들어, 렌티큘은 기질 조직 분절의 기질내 절제에 의해, 예를 들어 펨토초 레이저 펄스에 의한 절제에 의해 형성될 수 있다.
특정 실시예에서, 공여자 기질은 채취되고 탈세포화되어 환자 측에서 임의의 잠재적인 면역원성 반응이 감소된 렌티큘을 생성한다. 전형적인 각막의 약 1 내지 4%만이 세포로 구성되어 있다. 나머지 96 내지 99%는 대개 세포외 기질(ECM)로서, 주로 콜라겐, 수분, 글리코아미노글리칸 및 프로테오글리칸이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 탈세포화된 렌티큘은 일반적으로 95% 내지 100%의 세포 물질이 제거되어 있다. 바람직하게는, 렌티큘의 95% 내지 99.99%는 무세포이다. 95%와 100% 사이의 모든 가능한 하위 범위를 언급하지 않더라도, 이러한 모든 하위 범위가 고려되고 본 발명의 일부로 간주된다는 점은 명백할 것이다. 예를 들어, 렌티큘의 95% 내지 97%, 97% 내지 99% 또는 98% 내지 99.9%는 세포 물질이 없을 수 있다. 렌티큘에 남아 있는 세포 물질의 양은 예를 들어 잔류 DNA 또는 RNA 함량으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, DNA 또는 RNA 함량은 원래의 DNA 또는 RNA 함량의 1 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만, 또는 0.01 중량% 미만이다.
탈세포화, 즉 공여자 기질로부터 세포 물질의 제거는 다양한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 각막의 세포 물질은 화학적 처리에 의해 제거된다. 각막에서 세포를 용해하고 제거하는 데 사용되는 화학 물질에는 나트륨 테트라데실 설페이트(STS)와 같은 계면활성제, 산, 알칼리성 처리제, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)와 같은 이온성 세제, Triton X-100과 같은 비이온성 세제, 및 쯔비터이온성 세제가 포함된다. 일부 실시예에서, 각막의 세포 물질은 효소 처리를 사용하여 제거된다. 리파제, 써모리신, 갈락토시다제, 뉴클레아제, 트립신, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제가 각막에서 세포 물질을 제거하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 각막의 세포 물질은 물리적 기술을 사용하여 제거된다. 이러한 물리적 기술에는 온도, 힘, 압력 및 전기적 파괴를 사용하여 조직의 기질에서 세포를 용해, 사멸 및 제거하는 데 사용되는 방법이 포함된다. 온도 방법은 급속 동결-해동 메커니즘에서 종종 사용된다. 온도 방법은 ECM 지지체의 물리적 구조를 보존한다. 압력 탈세포화는 지지체를 손상시킬 수 있는 모니터링되지 않은 얼음 결정 형성을 피하기 위해 고온에서 정수압의 조절된 사용을 포함한다. 원형질막의 전기적 파괴는 각막의 세포 물질을 용해시키는 또 다른 방안이다.
본 명세서에 기재된 실시예에서, 렌티큘은 면역원성 항원결정인자의 분해로 인해 훨씬 더 낮은 면역반응성을 나타낼 수 있다. 이는 이종 공여를 사용할 때 중요한 단계가 될 수 있다. 예를 들어, 이종 조직에 존재할 수 있는 두 개의 비인간 항원결정인자는 N-글리콜릴뉴라민산(Neu5GC) 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파 갈)이다. 이러한 바람직하지 않은 항원결정인자는 기질 세포의 내부 또는 표면에만 존재할 수 있는 것은 아니며, 항원결정인자의 작은 일부는 ECM 콜라겐 원섬유를 감싸는, 점액다당류라고도 하는 글리코아미노글리칸(GAG)에 내재될 수 있다. 특정 실시예에서, 항원결정인자는 갈락토시다제 처리와 같은 효소 처리 및 추가 세척에 의해 선택적으로 제거될 수 있다. 대안적으로, 각막 조직은 면역원성 항원결정인자가 결여되어 있는 넉아웃(knockout) 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 돼지)로부터 채취될 수 있으며, 따라서 항원결정인자 분해 단계를 필요로 하지 않고 비면역원성 렌티큘을 생성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시예에서, 탈세포화된 렌티큘은 포장 및 밀봉과 연관되어 추가로 멸균될 수 있다. 멸균은 습윤제, 방사선 또는 전자빔을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 탈세포화된 렌티큘의 멸균이 UV 방사선을 사용하여 수행되는데, 이는 콜라겐 지지체에 대한 손상이 발생할 가능성이 낮기 때문이다. UV 방사선의 사용은 렌티큘의 광학적 투명도를 향상시키는 데 유리할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 렌티큘의 형상 및 배향은 최적의 결과를 위해 설계된다. 일부 실시예에서, 렌티큘의 직경은 약 0.5 밀리미터(㎜) 내지 약 10㎜, 또는 약 3㎜ 내지 약 9㎜, 또는 약 4㎜ 내지 약 8㎜, 또는 약 5㎜ 내지 약 7㎜이다. 다시 말하지만, 0.5㎜와 10㎜ 사이의 모든 가능한 하위 범위를 언급하지 않더라도 이러한 모든 하위 범위가 고려되고 본 발명의 일부로 간주된다는 점은 명백할 것이다.
공여자 각막 기질은 원하는 형상을 얻기 위해 슬라이싱되고/되거나 추가 성형될 수 있다. 절단은 기계적으로, 예를 들어 미세각막절삭기 등에 의해 수행될 수 있고, 레이저 가공에 의해, 예를 들어 엑시머 레이저를 사용한 광절제 또는 펨토초 레이저를 사용한 광절단에 의해 수행될 수 있다. 비대칭의 가능성을 줄이기 위해, 각막 조직 분절은 바람직하게는 예를 들어 공여자 각막의 광학적 또는 기하학적 축이 렌티큘의 중심에 보존된 상태로 공여자 각막의 중앙 부분으로부터 채취된다. 각막 조직 분절의 형상은 환자의 굴절 이상을 교정하는 데 필요한 굴절력 변화에 의해 결정된다. 예를 들어, 원시(원시안) 및/또는 노안의 교정의 경우, 일반적으로 각막의 곡률을 높이는 것이 목표이며 원하는 렌티큘 형상은 적어도 한 면에서 약간 볼록한 것이다. 일부 실시예에서, 렌티큘의 최대 두께는 600 마이크로미터 미만, 400 마이크로미터 미만, 200 마이크로미터 미만, 100 마이크로미터 미만, 또는 50 마이크로미터 미만이다. 직경이 더 작고 렌티큘이 더 얇을수록 환자의 기질층에 더 빨리 통합될 것이다.
기질 콜라겐 원섬유는 긴 폴리머(폴리펩타이드) 스트링이다. 그들은 삼중 윈디드(winded) 단백질이다. 단일 콜라겐 원섬유의 길이는 거의 거시적이므로 각 원섬유는 개별적으로 빛의 강한 산란체가 될 수 있다. 기질이 축방향으로 투명하다는 사실은 강력히 산란시키는 이러한 모든 기여의 음의 합계의 결과이다. 즉, 콜라겐 원섬유는 개별 산란에도 불구하고 총체적으로 거의 0에 가까운 집합적 산란에 집합적으로 기여한다. 이 집합적 투명도는 원섬유가 한 평면에서 평행하게 배열되면 달성된다. 각막 기질에서 배열 평면은 광학적 축에 수직이다. 이 독특한 구성은 각막에는 존재하지만 다른 기관에서는 관찰되지 않는다. 장이나 심근막, 심실 판막 같은 다른 기관에서는 원섬유가 조심스럽게 정렬되지 않아 빛이 산란된다. 눈의 윤부 콜라겐에 대해서도 마찬가지이다.
투명도에 더하여, 자연 선택은 각막의 구조 역시 강도에 대해 최적화했다. 콜라겐 원섬유의 길이와 정렬은 기질의 평면 내(접선 방향) 인장(당김) 강도에 상당히 기여한다. 자연적인 눈의 모양은 기질에 접선 방향 인장(당김) 응력을 가하는 정수압 안내압에 의해 유지된다. 콜라겐 원섬유의 평면 내 배향은 각막 투명도에 도움이 되고 상당한 기계적 인장(당김) 강도를 제공한다. 그러나 이 강도는 주로 평면 내에서 힘을 가하는 경우로 제한된다. 광학적 축방향으로 각막 기질의 강도는 훨씬 더 약하다. 이 축방향 강도 결핍의 한 가지 징후는 물, 예를 들어 완충된 식염수(BSS)에 침지되었을 때 지지체의 팽윤이다. 팽윤은 광학적 축의 방향으로 거의 전적으로 단방향이다. 평면 내 방향의 팽윤은 무시할 수 있다.
지지체의 이러한 약점은 우려의 원인이 되는데, 왜냐하면 광학 활성 렌티큘의 형상 충실도가 성공적인 부가 굴절 수술에 중요하기 때문이다. 축방향으로 지지체의 팽윤은 굴절 이상을 유발할 수 있다.
팽윤의 양은 종종 침지 유체의 함수이다. 계면활성제 및/또는 세제를 물에 첨가할 때 가장 높은 정도의 팽윤, 즉 공칭 두께의 약 250 내지 400%가 관찰된다. BSS는 일반적으로 공칭 두께의 약 150 내지 250%만큼 팽윤을 유발한다. 알코올(가벼운 것과 무거운 것 모두)에서의 팽윤은 일반적으로 덜하다. (공칭 두께는 탈세포화 단계 전, 예를 들어 조직 표본이 매우 신선할 때, 예를 들어 절제 후 약 60초 미만(또는 표본이 상피 및/또는 내피 세포를 보유하는 경우 더 긴 시간)일 때, 원래의 절제된 기질 분절(층판)의 축방향 두께로 정의할 수 있다.)
두꺼운 렌티큘의 경우, 팽윤으로 인해 렌티큘이 너무 두꺼워져 피판을 기질층에 다시 놓는 것이 어려워질 수 있다. 피판은 또한 추가된 물질을 덮기에는 너무 짧을 수 있으며(상피 과소성장의 위험을 높임), 피판을 기질층에 기계적 늘이기 및/또는 봉합하는 추가 절차가 필요할 수 있다.
콜라겐-지지체의 단방향 기계적 약점은, 삼투 특성 및/또는 (탈세포화 전 기질과 비교하여) 지지체의 물 친화성의 변화와 함께, 지지체의 두께 방향(즉, 축방향)으로 상당한 단방향 팽윤을 유발할 수 있다.
자유수가 콜라겐성 조직 내부에 존재한다. 손상되지 않은 자연 각막에서 기질의 수분 함량은 각막의 전체 구조, 예를 들어 각막 경계를 제공하는 상피막 및 내피막에 의해 조절된다. 그러나, 부가굴절 수술시 외인성 기질 조직을 이식하는 경우, 이 균형이 흐트러지는 경우가 많고, 이식된 렌티큘의 수분 함량이 증가하여 공칭 두께를 초과하는 수술 후 부종을 초래하는 경향이 있다.
본 발명에 따르면, 평평한(원통형) 콜라겐성 조직 표본이 지속적인 압력을 가하는 두 개의 판 사이에 배치되면, 유체 함량이 감소될 수 있다(또는 동등하게 콜라겐 농도가 증가될 수 있다). 탈세포화를 거친 성형된 렌티큘의 경우도 마찬가지이다. 프레스는 과잉 자유 유체가 조직에서 옆으로 빠져나갈 수 있도록 배액을 제공해야 한다. 성형된 렌티큘의 경우, 프레스의 판 중 적어도 하나는 렌티큘의 두께의 반경방향 변동을 수용하도록 만곡되어야 한다. 바람직하게는 압력은 원하는 시간 동안 부드럽게 가해진다. 원하는 압축 정도에 따라, 압력은 수 초 내지 수 시간 범위, 예를 들어 30초 내지 1시간 범위, 또는 일부 경우 5분 내지 30분 범위의 소정 지속시간 동안 콜라겐 지지체에 가해질 수 있다.
프레스의 판이 이동한 거리는 대략적인 콜라겐 농도의 계산을 가능하게 한다. 예를 들어, 평평한 절제 조직 분절의 공칭 두께가 100 마이크로미터이고 탈세포화 과정 후에 팽윤되어 200 마이크로미터가 된다면, 조성물의 콜라겐 함량은 약 15%일 수 있다. 그런 다음 100 마이크로미터 두께로 재압축한다면, 공칭 콜라겐 농도는 약 30% 수준으로 복원될 것이다. 지지체를 50 마이크로미터 두께로 더 압축하면 콜라겐 농도는 약 60%가 된다. 지지체를 40 마이크로미터의 두께로 더 압축하면 콜라겐 농도는 약 75%가 된다. (콜라겐 함량 백분율은 물과 완전히 평형 상태일 때의 건조 전 중량에 대한 진공 건조된 렌티큘의 중량 분율로 측정할 수 있다.) 이 값은 장기간 압력을 가한 후에만 달성되며 합리적으로 달성할 수 있는 콜라겐 농도의 상한값에 가깝다. 이 시점에서 남아 있는 수분은 예를 들어 반 데르 발스 힘에 의해 단백질에 단단히 결합되며, 추가 압력은 콜라겐 원섬유의 무결성을 손상시킬 수 있다.
콜라겐성 조직을 압축하는 과정은 지지체가 프레스에서 제거되고 다시 유체에 침지되는 경우 대체로 가역적이다. 지지체는 압축 전 두께에 근접하도록 다시 팽윤한다. 그러나, 본 발명의 다른 일 양태에서, 콜라겐 지지체의 강화에 의해, 특히 가압 공정 중에 콜라겐 지지체의 가교처리를 통해 축 변형 방향으로의 재팽윤을 방지하는 방법이 개시된다. 지지체의 압축 및/또는 과잉 유체의 제거는 지지체를 가속, 예를 들어 원심분리기에 노출시켜서도 달성할 수 있다. 예를 들어, 10 G에서 최대 100 G(981 m/s2) 내지 그 이상 범위의 가속을 사용할 수 있다. 과잉 유체의 제거는 또한 지지체를 진공 또는 감압에 노출시켜 달성하거나 도움을 받을 수 있다.
특정 실시예에서, 가교결합은 화학 작용제에 의해 달성될 수 있다. 외부 화학 분자가 충분한 농도, 지속 시간 및 온도에서 (대부분 수용액 또는 기타 유체에) 추가될 수 있다. 분자는 일단부에서 하나의 콜라겐 원섬유와 결합하고 타단부에서 다른 콜라겐 원섬유와 결합하도록 구성될 수 있다. 결합의 유형은 제제에 특이적일 수 있고 또는 펩타이드 유형 결합일 필요는 없다. 화학 분자는 강한 부착물로서 화학 결합(공유 결합)을 갖는 물리적 가교결합을 생성한다. 그러한 가교결합의 충분히 조밀한 집합체는 콜라겐 지지체에 축방향으로 새로운 강도 및/또는 강성을 부여한다. 콜라겐 분자는 서로 접촉할 필요는 없지만 대략 제제의 분자 크기만큼 떨어져 있어야 한다. 이 완화된 작동 요건은 가교 공정을 쉽게 만든다. 화학적 가교제의 예로는 글루타르 알데하이드, 제니핀 및 단순당이다.
콜라겐 원섬유는 그 자체로 강한 광 산란체이지만, 그들의 방향 및 통계적 배열은 집합적으로 산란을 제거한다. 가교제 및 에너지 매개 분자의 잠재적인 단점은 굴절 교정 시술에서 이식 가능한 렌티큘로 사용될 때 광 산란체로 작용할 수 있고 지지체의 광학적 투명도에 악영향을 미칠 수 있는 콜라겐 지지체에 외인성 물질을 도입한다는 점이다.
다른 실시예에서, 콜라겐 원섬유는 원섬유 바로 사이에 확립된 안정한 화학 결합에 의해 또한 강화될 수 있다. 이것은 원섬유가 서로 접촉할 때 발생하지만 자발적인 것은 아니다. 소위 펩타이드 결합은 흡열적이며 원섬유가 접촉하는 위치에 외부 에너지가 국부적으로 적시에 전달되는 것을 요건으로 한다. 일부 실시예에서, 광 양자로부터 에너지를 받는 특수 매개-분자가 사용될 수 있다. 그런 다음 매개 분자는 연결 구조에 참여하지 않고 결합 에너지를 제공하거나 가교처리 공정의 촉매가 될 수 있다. 따라서 빛은 안정적인 결합을 구축하기 위한 간접적인 에너지원이다. 매개 분자의 한 예로는 예를 들어 발광 다이오드(LED) 등으로부터의 빛에 노출될 때의 리보플라빈이 있다.
또 다른 변형 방법에서, 지지체의 콜라겐 원섬유는 원섬유가 서로 접촉하는 곳에서 국부적으로 흡수된 방사선에 의해 서로 직접 결합될 수 있다. 외인성 매개 분자가 에너지 양자를 포착할 필요는 없다(콜라겐성 조직에 존재하는 글리코아미노글리칸(GAG)과 같은 내인성 분자가 유사한 기능을 제공할 수 있음). 양자는 터치 이벤트의 접촉부에서 직접적으로 적시에 흡수된다. 이 방법은 다양한 형태의 직접 조사, 예를 들어 가시광선, 청색 또는 UV 방사선, 감마선 또는 전자빔을 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 에너지원은 제곱센티미터당 100줄 이상, 또는 제곱센티미터당 200줄 이상, 또는 제곱센티미터당 300줄 이상의 에너지 밀도를 갖는 UV 광이다. 예를 들어, 화학 방사선에 대한 바람직한 에너지 밀도는 제곱센티미터당 약 100 내지 약 5000, 또는 약 200 내지 약 1000, 또는 약 300 내지 약 600 줄의 범위일 수 있다.
콜라겐 지지체의 밀도(압축/압밀)는 가교처리 속도에서 역할을 할 수 있다. 콜라겐 농도가 더 높으면(즉, 콜라겐 지지체가 더 압축되거나 다른 방법으로 압밀되면), 가교처리 공정이 더 빨리 진행될 수 있다.
(리보플라빈과 같은 매개제가 없는) 순수 방사선-유도 가교처리에 대해서만 필요한 임계(역치) 투여량은 탈세포화 과정의 함수일 수 있다. 탈세포화되지 않은 기질에 대한 역치 투여량은 탈세포화된 콜라겐 지지체에 대한 임계 투여량보다 3 내지 300배 정도 더 많을 수 있다. (이 비율 또한 가해진 방사선의 파장의 함수일 수 있다.) 본 발명의 다른 일 양태에서, 탈세포화가 기질에 존재하는 (GAG와 같은) 세포외 물질을 더 많이 제거하면 콜라겐 가교처리에 대한 역치가 떨어지는 것으로 밝혀졌다. 역치의 차이는 적용된 탈세포화 프로토콜 및 방사선의 파장에 따라 10배 정도 달라질 수 있다. 이 가교처리 역치 낮추는 것은 탈세포화 프로토콜의 강도와 상관관계가 있는 것으로 보인다.
가교처리는 압축/압밀과 동시에 또는 전용 UV 방사선 공급원을 통해 후속 단계에서(또는 대안적으로 환경 UV 방사선, 예를 들어, 태양광에 의해) 실행될 수 있다.
가교처리를 유도하기 위해 빛 에너지가 사용되는 경우, 빛의 흡수는 비어의 법칙(Beer's Law)에 의해 지배될 수 있다. 즉, 빛이 닿는 재료의 표면 층에 더 많은 빛이 흡수되고 재료의 더 깊은 층에는 더 적은 양의 빛이 흡수된다. 가교처리를 유도하는 데 사용할 수 있는 빛의 양은 기본적으로 기하급수적으로 감소한다. 지지체에 있는 광 산란 분자의 양에 차이가 있는 경우, 이는 에너지 분포에도 영향을 미칠 수 있는데, 왜냐하면 산란제는 조사된 물질의 하부 영역으로 통과할 수 있는 빛의 양을 감소시키기 때문이다. 본 발명에서 이러한 효과는 등급화된 가교처리 정도를 생성하고/하거나 화학 방사선에 노출되는 지지체의 표면 영역에 상이한 특성을 부여하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 광 에너지 단독의, 또는 (예를 들어, 표면 코팅으로서) 광 산란제의 도입과 함께인 경우의 자연 흡수 프로파일은 콜라겐 지지체의 선택적 표면 가교처리 및/또는 표면 아래의 더 낮은 정도의 가교처리의 옵션을 제공한다. 렌티큘 표면의 선택적 가교처리는 표면에 다른 접착성, 투과성 또는 평활도를 부여하거나 이식 후 수여자의 세포에 의한 더 많거나 더 적은 침투를 촉진하는 데 유리할 수 있다. 예를 들어, 지지체가 약 60% 콜라겐 밀도로 압축되고 표면에서 약 5 내지 10 마이크로미터의 깊이까지 선택적으로 가교처리되면, 표면은 고밀도를 유지하는 반면 지지체의 나머지 부분은 탈세포화 과정 후의 확장된 상태에서 변경되지 않은 상태로 유지된다. 이러한 조밀화된 표면은 유사 보우만막을 제공할 수 있다.
더욱이, 선택적으로 표면의 일부를 광 산란제로 처리하거나 패턴화된 마스크를 통해 지지체를 노출시킴으로써 표면 가교처리를 사용하여 전방 표면, 후방 표면 또는 둘 모두에 패턴화된 효과를 부여할 수 있다. 표면 패턴화는 표면 부분들의 마찰 또는 접착성을 선택적으로 변경할 수 있다.
지지체의 표면을 선택적으로 가교처리하는 세 가지 방법이 있다. 첫째, 지지체에서 강한 흡수를 갖는 단파장 UV 방사선을 사용함으로써 침투 깊이를 제한할 수 있다. 이러한 접근법에서, 바람직한 파장은 약 230 내지 약 150 나노미터, 보다 바람직하게는 약 215 내지 약 193 나노미터(예를 들어, 193㎚)의 범위일 것이다. 방사선이 부딪치는 각도는 일반적으로 표면에 수직이지만 표면 수직에 대해 0도에서 60도까지 변할 수 있다.
대안적으로, 더 긴 파장의 UV 방사선, 예를 들어 약 400 나노미터까지 확장되고, 60도 초과, 바람직하게는 75도 초과 또는 그 이상, 예를 들어 약 80도 내지 약 89.9도 범위의 스침 입사각(grazing incidence angle)으로 지지체에 진입하는 UV 방사선이 사용될 수 있다. 이 방법의 한 가지 장점은 상업적 사용으로 인해 약 280나노미터 또는 그 이상의 파장의 안정적이고 강력한 UV 방사선 공급원을 손쉽게 사용할 수 있다는 것이다. 레이저 광의 공간적 응집성으로 인해 우수한 입사각 선명도가 가능해지기 때문에 광원으로 레이저 방사선을 사용하는 것도 선호될 수 있다.
또 다른 대안에서, 소멸파 슬래브 도파관이 사용될 수 있다. 이것은 (입사광의 파장에 대해) 매우 얕은 가교처리 깊이를 허용한다. 예를 들어, 380 나노미터 UV 방사선을 사용할 경우 가교처리는 1 마이크로미터 이하의 표면층으로 제한될 수 있다.
중요하게는, 렌티큘의 전방 표면을 조밀화(또는 선택적으로 더 강력하게 가교처리)함으로써, 후방 표면과 다른 질감을 나타낼 것인데, 이는 보우만막이 촘촘하게 짜여진 콜라겐 유형 I 원섬유로 인해 더 조밀하고 매끄러워지기 때문이다. (전방 표면 반대쪽의) 후방 표면은 렌티큘의 이 부분의 덜 조밀한 구성(및 조직의 기계적 또는 레이저 절단에 의해 형성된다는 사실)으로 인해 더 거칠 것이다. 이러한 거칠기의 차이는 렌티큘이 기질내 또는 각막내 이식에 사용될 때 특히 유리할 수 있는데, 왜냐하면 렌티큘이 기질층에 강하게 부착되는 것이 매우 바람직하기 때문이다. 시술 후 최적에 못 미치는 굴절 결과가 관찰되는 경우, 레이저 절제 등에 의한 추가 각막 성형(렌티큘의 재조형)을 허용하기 위해 피판을 다시 접어야 할 필요가 있을 수 있다. 렌티큘이 기질층에서의 원래 위치에서 움직이게 되면 이 각막 성형의 효과가 손상될 수 있다. 더욱이, 렌티큘의 전방 표면의 매끄러움은 또한 피판을 다시 열 때 렌티큘이 빠져나올 가능성을 낮춘다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, 후방 표면을 절제, 성형 및 탈세포화 후에 처리하여 표면이 기질층에 더 부착되도록 할 수 있다. 예를 들어, 멸균 및 포장 전에 가교제 또는 접착 강화제를 적용할 수 있다. 대안적으로, 시술 중 이식 전에 임상의가 가교제 또는 접착 강화제를 적용할 수 있다.
일부 실시예에서, 채취, 성형 및 탈세포화된 렌티큘은 임상의가 피판의 재개방 및 레이저 재조형 조정 중에 렌티큘의 적절한 배향을 유지할 수 있는 방식으로 표시될 것이다. 표시는 다양한 방식으로 수행할 수 있지만 모든 경우에 일단 렌티큘이 기질층에서 제 위치에 있으면 환자에게는 보이지 않는다. 일부 실시예에서, 표시는 렌티큘의 상부 전방 부분 또는 하부 전방 부분의 미세한 노치일 수 있다. 일부 실시예에서, 표시는 렌티큘의 상부 전방 또는 하부 전방에 배치된 염료로 만들어진 선 또는 점일 수 있다.
또한 본원에는 공여자 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시예에서, 공여자 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법은 공여자 각막의 중앙 영역으로부터 기질의 일부를 제거하고 원하는 형상의 렌티큘 본체를 제공하도록 상기 공여자 기질의 후방 표면을 성형하는 것을 포함한다. 비대칭의 가능성을 줄이기 위해, 조직 분절은 바람직하게는 예를 들어 공여자 각막의 광학적 또는 기하학적 축이 렌티큘의 중심에 보존된 상태로 공여자 각막의 중앙 부분으로부터 채취한다. 조직 분절의 형상은 환자의 굴절 이상을 교정하는 데 필요한 굴절력 변화에 의해 결정된다. 예를 들어, 원시(원시안) 및/또는 노안 교정의 경우, 일반적으로 각막의 곡률을 높이는 것이 목표이며 원하는 렌티큘 형상은 적어도 한 면에서 약간 볼록한 것이다. 렌티큘은 또한 렌티큘의 전방 및 후방 표면을 식별하기 위해 렌티큘의 둘레에 (문자 "L"과 같은) 하나 이상의 비대칭 마커를 포함할 수 있다.
본 발명의 지지체는 천연 기질 조직보다 더 높은 굴절률을 갖도록 설계될 수 있다는 점에서 굴절성(예를 들어, 부가적) 렌티큘로서 이점을 추가로 제공할 수 있다. 현재, 이식된 렌티큘을 사용하여 각막의 곡률을 변경하는 것은, 상피 불안정 또는 수용할 수 없는 상피 침식이 발생하기 전에, 일반적으로 (정점 부근에서 측정 가능한 바와 같은) 약 50D 미만의 총 굴절력(예를 들어, 천연 각막 및 부가 렌티큘의 굴절력 값의 합)으로 제한된다. 굴절률이 더 높은 이식 가능한 지지체는 더 높은 원시 교정 가능성을 제공한다. 기질 조직의 표준 굴절률은 일반적으로 약 1.376이다. 본 발명의 압축/압밀 기술은 굴절률이 1.377 이상, 1.378 이상, 1.379 이상, 1.38 이상 또는 그 이상인 지지체를 제공할 수 있다. 렌티큘의 굴절률의 기울기는 조절된 가교처리를 통해 달성할 수도 있다. (이러한 기울기는 고차 굴절 이상의 교정에도 사용할 수 있으며, 그 조건은 인간 눈의 고차 제르니케(Zernike) 다항식으로 설명할 수 있다.)
본 명세서에 기재된 실시예에서, 방법은 최적의 결과를 위해 설계된 형상 및 밀도를 갖는 렌티큘을 생성한다. 렌티큘은 먼저 보우만막을 전방 표면으로 보존하는 방식으로 공여자 기질에서 원반 형상의 조직 분절을 절단하여 얻는다. 일부 실시예에서, 렌티큘의 직경은 약 0.5㎜ 내지 약 10㎜, 약 3㎜ 내지 약 9㎜, 약 4㎜ 내지 약 8㎜ 및 약 5㎜ 내지 약 7㎜이다. 조직 분절은 슬라이싱 시술 중에 원하는 형상이 얻어지도록 하는 방식으로 슬라이싱되고/되거나 추가 성형 또는 절단될 수 있다. 절단은 기계적으로, 예를 들어 미세각막절삭기 등에 의해 수행될 수 있고, 레이저 가공에 의해, 예를 들어 펨토초 레이저에 의한 광절단에 의해 수행될 수 있다. 절단은 예를 들어, 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 "Surgical Apparatus and Blade Elements for slicing Lamellar Segments From Biological Tissue"라는 명칭의 국제 특허 출원 PCT/IB2016/054793에 개시된 것과 같은 기구로 수행할 수 있다.
렌티큘은 또한 펨토초 레이저 절제, 엑시머 레이저 절제, 또는 워터 제트로 절단에 의해 얻을 수 있다. 전안부의 보존이 필요하지 않은 경우, 렌티큘은 또한 예를 들어 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는 "Method For Corneal Laser Surgery"이라는 명칭의 미국 특허 제6,110,166호에 개시된 최소 절개 렌티큘 추출(SMILE) 기술에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시예에서, 렌티큘의 최대 두께는 600 마이크로미터 미만, 400 마이크로미터 미만, 200 마이크로미터 미만, 또는 100 마이크로미터 미만, 또는 50 마이크로미터 미만이다. 직경이 더 작고 렌티큘이 더 얇을수록 환자의 기질층에 더 빨리 통합될 것이다.
특정 실시예에서, 공여자 기질은 탈세포화되어 세포 기원의 면역원에 대한 환자 측의 유해 반응 가능성이 감소된 렌티큘을 생성된다. 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 탈세포화된 렌티큘의 90% 내지 100%, 또는 바람직하게는 95% 내지 99.99%, 또는 98% 내지 99.9%는 세포 및/또는 세포 잔류물이 없다. 전형적인 각막의 약 2%만이 세포로 구성되어 있다. 나머지 98%는 대개 세포외 기질(BCM)로서, 주로 콜라겐, 수분, GAG 및 프로테오글리칸이다. 탈세포화 과정 후 세포 잔류물의 양을 특성화하기 위해 선호되고 가장 많이 실행되는 방법은 DNA 잔류물 또는 대안적으로 RNA 잔류물의 검출을 기반으로 한다. 이러한 방법은 매우 민감하고 특이도가 높다. 이러한 측정은 일반적으로 탈세포화 단계 전에 렌티큘에 존재하는 DNA/RNA의 양으로 정규화된다. 90%와 99.99% 사이의 모든 가능한 하위 범위를 언급하지 않더라도, 이러한 모든 하위 범위가 고려되고 본 발명의 일부로 간주된다는 점은 명백할 것이다. 예를 들어, 생성된 렌티큘의 90%, 95%, 99% 내지 99.7%, 99.7% 내지 99.9%, 또는 그 이상은 천연 세포 물질이 없을 수 있다(DNA/RNA 잔류 함량으로 측정). 다시 말해서, 잔류 DNA 또는 RNA 함량으로 측정한 렌티큘에 남아 있는 세포 물질의 양은 원래 DNA 또는 RNA 함량의 1 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만, 또는 0.01 중량% 미만일 수 있다. (렌티큘 추출 자체로 인해 상당한 양의 탈세포화가 발생할 수 있다. 총 각막 세포 함량의 95% 정도가 상피 및 내피에 존재하며, 이는 기계적으로 폐기되어 향후 탈세포화를 위해 각막 기질만 남기게 될 수 있다.)
공여자 기질로부터 세포 물질의 제거(탈세포화)는 다양한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 각막의 세포 물질은 화학적 처리에 의해 제거된다. 각막에서 세포를 용해하고 제거하는 데 사용되는 화학 물질에는 산, 염기, 계면활성제(예를 들어, 나트륨 테트라데실 설페이트(STS)), 이온성 세제(예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)), 비이온성 세제(예를 들어, Triton X-100), 및 쯔비터이온성 세제가 포함된다.
대안적으로 또는 추가로, 각막의 세포 물질은 효소 처리를 사용하여 제거될 수 있다. 리파아제, 써모리신, 갈레토시클라아제, 뉴클레아제, 트립신, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 사용하여 각막에서 세포 물질을 제거할 수 있다. 일부 실시예에서, 각막의 세포 물질은 물리적 기술을 사용하여 제거된다. 이러한 물리적 기술에는 온도, 압력 및/또는 전기적 파괴를 사용하여 조직의 기질에서 세포를 용해, 사멸 및 제거하는 데 사용되는 방법이 포함된다. 온도 기반 탈세포화 방법에는 급속 동결-해동 프로토콜이 포함될 수 있다. 이러한 온도 기반 방법은 ECM 지지체의 물리적 구조를 보존한다. 압력 탈세포화는 지지체를 손상시킬 수 있는 모니터링되지 않은 얼음 결정 형성을 피하기 위해 고온에서 정수압의 조절된 사용을 포함한다. 원형질막의 전기적 파괴는 각막의 세포 물질을 용해시키는 또 다른 방안이다.
일부 실시예에서, 렌티큘은 면역원성 항원결정인자의 분해로 인해 훨씬 더 낮은 면역반응성을 나타내도록 추가로 처리될 수 있다. 이는 이종 공여를 사용할 때 중요한 단계이다. 예를 들어, 이종 이식 조직에 존재할 수 있는 두 개의 비인간 항원결정인자는 N-글리콜릴뉴라민산(Neu5GC) 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파 갈)이다. 이러한 바람직하지 않은 항원결정인자는 기질 세포의 내부 또는 표면에만 존재할 수 있는 것은 아니며, 항원결정인자의 작은 일부는 ECM 콜라겐 원섬유를 감싸는, 점액다당류라고도 하는 글리코아미노글리칸(GAG)에 내재될 수 있다. 특정 실시예에서, 이러한 항원결정인자는 (면역원을 중화하기 위해) 키나제 또는 갈락토시다제 처리와 같은 효소 처리, 및 추가 세척에 의해 제거되거나 형태적으로 변경될 수 있다. 대안적으로, 각막 조직은 항원결정인자가 결여되어 있는 넉아웃 형질전환 돼지로부터 채취될 수 있으며, 따라서 분해 단계를 필요로 하지 않고 비면역원성 렌티큘을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 항원결정인자 중화 전에 렌티큘에서 상피 및/또는 내피 세포층 또는 잔류물을 제거하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어 외과용 메스로 긁거나, 예를 들어 적절한 거칠기의 연마재로 문지름으로써 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시예에서, 탈세포화된 렌티큘을 생성하는 방법은 포장 및 밀봉과 연관될 수 있는 멸균 단계를 추가로 포함할 수 있다. 멸균은 습윤제, 감마선 또는 전자빔을 사용하여 수행할 수 있다. 일 실시예에서, 탈세포화된 렌티큘의 멸균이 전자빔을 사용하여 수행되는데, 이는 콜라겐 지지체에 대한 손상이 발생할 가능성이 낮기 때문이다. 대안적으로, 가교처리를 유도하기 위해 사용된 방사선은 또한 렌티큘의 멸균을 위한 충분한 에너지를 제공할 수 있다.
일부 실시예에서, 채취, 성형 및 탈세포화된 렌티큘의 준비는 임상의가 피판의 재개방 및 레이저 조정 중에 렌티큘의 적절한 배향을 유지할 수 있는 방식으로 렌티큘에 표시를 하는 단계를 포함할 것이다. 표시는 다양한 방식으로 수행할 수 있지만 모든 경우에 일단 렌티큘이 제 위치에 있으면 환자에게는 보이지 않는다. 일부 실시예에서, 표시는 렌티큘의 상부 전방 부분 또는 하부 전방 부분의 미세한 노치일 수 있다. 일부 실시예에서, 표시는 렌티큘의 상부 전방 또는 하부 전방에 배치된 염료로 만들어진 선 또는 점일 수 있다.
본 발명과 사용된 방법 및 재료를 예시하는 실시예는 아래의 예시적인 프로토콜을 참조하여 추가로 이해될 수 있다. 각막 조직은 돼지 공여자로부터 채취할 수 있다. 렌티큘은 렌티큘의 전방 표면 및 덜 조밀한 후방 표면에서 고밀도 콜라겐 유형 I 원섬유 또는 보우만막을 유지하기 위해 공여자 기질 내의 영역에서 채취될 수 있다. 대안적으로, 각막 조직은 자연적으로 조밀화된 표면 아래의 기질 영역에서 채취될 수 있다.
도 1a에 도시된 바와 같이, 공여자 각막의 표적 영역은 전방 표면(12), 후방 표면(14) 및 콜라겐 원섬유(16)의 조직화된 층을 갖는 원반 형상 렌티큘(10A)로 절단될 수 있다. 이 단계에서, 렌티큘은 일반적으로 직경이 약 0.5 내지 10 밀리미터이고 두께는 250 마이크로미터 미만이다.
도 1b는 95 내지 99.99%는 세포 물질이 없는 렌티큘을 생성하기 위해 예를 들어 화학 처리, 효소 처리 또는 물리적 기술에 의한 탈세포화 후의 렌티큘을 도시한다. 원하는 경우, 탈세포화되고 성형된 렌티큘을 추가로 처리하여 면역원성 항원결정인자를 분해할 수 있다. 렌티큘은 추가로 세척 및 멸균될 수 있으며, 원하는 경우 가교제가 렌티큘의 전방 표면 및/또는 후방 표면에 적용될 수 있다. 탈세포화된 렌티큘(일반적으로 세제, 계면활성제 및/또는 세척 용액의 적용으로 인해 팽윤됨)은 원섬유 층(16)의 더 큰 분리를 나타낸다. 일부 실시예에서, 렌티큘의 상부 전방 표면은 환자의 기질층에서 렌티큘라 배향에 도움을 주는 노치로 표시될 수도 있다.
도 1c에서, 탈세포화된(및 잠재적으로 팽윤된) 렌티큘은 다음으로 렌티큘 본체로부터 과잉 유체를 몰아내고 콜라겐 밀도를 증가시키기 위해 압축을 받는다. 콜라겐 원섬유 층은 함께 압축된 다음 적어도 부분적으로 가교처리되어 후속 팽창을 억제한다.
도 2에서, 콜라겐 원섬유 층이 압축/압밀되고 가교처리된 전방 표면 영역(22)을 갖는 렌티큘(20)이 도시되어 있다. 렌티큘(20)의 벌크 영역(24) 역시 팽윤을 억제하기 위해 가교처리될 수 있지만 전방 표면 영역(22)과 동일한 정도로는 아니다.
도 3에서, 하나의 표면(예를 들어, 후방 표면(14))에 수술 후 통합을 촉진하기 위해 패턴(32)이 형성된 렌티큘(30)이 도시되어 있다. 패턴(32)은 제제의 선택적 적용, 선택적 조사 또는 이들 기술의 조합에 의해 형성될 수 있다. (패턴이 전방 표면(12), 후방 표면(14) 또는 양 표면 모두에 적용될 수 있음은 명백할 것이다.)
도 4a는 흔히 제조 및/또는 운송 중의 전형적인 형상인 평평한 형상의 본 개시에 따른 렌티큘(40A)을 도시한다.
도 4b는 각막내 이식을 위한 예시적인 최종 만곡 상태의 렌티큘(40B)을 도시한다. 렌티큘은 다양한 굴절 이상 또는 안구 상태의 교정을 위해 다양한 형상을 취할 수 있다(아래에서 더 논의됨). 렌티큘은 일반적으로 형상이 구형 또는 회전 타원체로 도시되어 있지만, 마찬가지로 타원체 또는 임의의 원하는 형상(예를 들어, 부분적으로 환상체)일 수 있음은 명백할 것이다. 이러한 형상은 환자의 시력에서 난시 또는 고차 수차를 교정하는 데 유용할 수 있다. 이러한 비구면 형상은 또한 환자의 각막 또는 윤부의 형상을 매칭하는 데 유용할 수 있다.
도 5a는 원시 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘(50A)을 도시한다. 도 5b는 근시 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘(50B)을 도시한다. 도 5c는 노안 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘(50C)을 도시한다. 도 5d는 손상, 유전 또는 다른 눈 상태, 예를 들어, 각막 내 효소 또는 신호 활성의 불균형으로 인해 각막의 천연 콜라겐 구조가 약화되는 원추각막으로 알려진 상태를 교정하기 위한 각막내 이식을 위해 설계된 렌티큘(50D)을 도시한다. 렌티큘(50A, 50B, 50C 및 50D)은 일반적으로 각막 내의 기질내(자연 기질의 층 사이) 이식을 위해 설계되었다. 렌티큘을 기질 조직(2) 내에 배치함으로써, 상피 영역(4) 및 내피 영역(6)이 보존된다.
도 6a는 후술하는 바와 같이, 예를 들어 전층각막이식술(PK) 또는 심부표층각막이식술(DALK) 동안 수술 봉합부의 부착을 위해 렌티큘(60A)이 추가적인 기계적 강도의 영역을 제공하는 강한 가교결합의 국부적 지점들(61)과 함께 제조된 렌티큘의 다른 실시예를 도시한다.
도 6b는 렌티큘의 또 다른 실시예를 도시한다. 이 실시예에서, 렌티큘(60B)은 중간 정도의 가교결합을 갖는 중앙 광학 활성 구역(65)(예를 들어, 주요 직경 치수가 약 3 내지 6.5 밀리미터임) 및 강한 가교결합을 갖는 외부 또는 주변 구역(63)을 포함하여, 다시, 예를 들어 수술 봉합부를 부착하거나 시각 구역 외부의 원추각막형으로 약화된 기질을 지지하기 위한 추가적인 기계적 강도의 영역을 제공한다. 구역(63, 65)은 동심일 필요는 없으며, 예를 들어 원추각막의 치료의 경우에는 광학적 활성 구역을 렌티큘의 중심으로부터 오프셋시키는 것이 바람직할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
도 7a는 상이한 유형의 각막내 이식, 즉 심부표층각막이식(DALK)을 위한 본 개시에 따른 렌티큘(70A)의 사용을 도시한다. 이 시술에서, 눈의 전안부가 먼저 제거되고 렌티큘(70)이 눈에 배치되어 천연 보우만막(3)과 기질(2)의 일부를 대체한다. 렌티큘(70A)은 초기에 봉합부(7)에 의해 제 위치에 고정될 수 있다. 선택적으로, 렌티큘(70A)은 렌티큘 형성의 탈세포화 및 압축 단계를 통해 보존되는 온전한 보우만막이 있는 천연 공여자 조직으로부터 형성될 수 있다. 대안적으로, 렌티큘의 전방 표면은, 예를 들어 보우만막-유사 구조를 형성하기 위한 얕은 방사선 가교처리에 의해, 선택적으로 처리될 수 있다. 어느 경우든, 각막내 이식 후, 환자의 말초 상피는 이식된 렌티큘의 전방 표면 위로 성장할 수 있다.
도 7b는 도 7a에 도시된 DALK 렌티큘과 유사하지만 일반적으로 더 얇고(예를 들어, 200 마이크로미터 미만) 환자의 온전한 보우만막(3) 위에 그러나 상피(4) 아래에 배치하도록 구성된 렌티큘(70B)의 사용을 도시한다. 때때로 "상층각막성형술"이라고도 하는 이 시술에서 렌티큘(70B)은 역시 봉합부(7)에 의해 제 위치에 고정될 수 있다.
도 7c는 본 개시에 따른 렌티큘(70C)의 또 다른 실시예를 도시하며, 이 경우에는 전층각막이식술(PK) 시술을 위해 설계된 것이다. 렌티큘(70C)은 도 7a에 도시된 DALK 렌티큘과 유사하지만 중심 각막 조직의 전체 깊이, 즉 각막 후방의 내피(6), 기질(2) 및 보우만막(3)을 완전히 대체하도록 구성되어 있다. 렌티큘(70C)은 역시 봉합부(7)에 의해 제 위치에 고정될 수 있다. 렌티큘(70C)의 각막내 이식 후, 환자의 말초 상피는 이식된 렌티큘의 전방 표면 위로 성장할 수 있다.
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 예를 들어 DALK 및 PK 시술에 유용한 것과 같은 두꺼운 렌티큘의 주변부에 대한 두 개의 대안적인 설계를 도시한다. 도 8a에서, 렌티큘(80A)은 단순한, 예를 들어 원통형 또는 원추형 주변부 가장자리를 갖는 것으로 도시된다. 도 8b에서, 렌티큘(80B)은 그 주변부에 지그재그 또는 계단형 가장자리를 갖는 것으로 도시된다. 성형된 가장자리는 천연 각막에 형성된 상보적 구조와 짝을 이루도록 설계되어 남아 있는 본래의 각막 조직에 대한 렌티큘(80B)의 결합을 추가로 보조할 수 있다. 계단 형상의 변형(예를 들어, 역 지그재그)도 사용할 수 있다. 도 8c에 도시된 바와 같이, 주변부 가장자리의 훨씬 더 발전된 형상을 사용하여 본래의 각막 내로의 기계적 걸림 또는 잠금을 허용할 수 있다. 잠금 기능은 일부 경우에는 걸림 가장자리를 따라가는 수술 봉합부에 대한 필요성을 줄이거나 없앨 수 있다. 이러한 렌티큘의 주변부는 중앙 부분보다 더 강하게 가교처리될 수 있다.
일부 경우에, 이러한 두꺼운 렌티큘의 두께는 중심에서 가장자리까지 변할 수 있다. 예를 들어, 렌티큘의 두께는 중심에서 약 400 마이크로미터에서 주변 가장자리에서 550 마이크로미터까지 변할 수 있다. 이는 전형적인 온전한 각막이 약 500 마이크로미터의 중심 각막 두께를 나타낼 수 있는 한편 각막의 주변 분절은 550 내지 약 650 마이크로미터 정도의 두께를 나타낼 수 있다고 하는, 대부분의 각막에서 발견되는 자연적인 두께 변화와 일치한다.
도 9는 본 발명에 따른 콜라겐 지지체를 압축하는 데 사용하기 위한 프레스(90)를 개략적으로 도시한다. 프레스(90)는 프레임(92) 및 이동식 스테이지(94)를 포함할 수 있다. 프레임은 상부 프레스 요소(96)를 유지하고 스테이지는 하부 프레스 요소(98)를 유지한다. 이들 요소 중 적어도 하나는 비평면이며 원하는 최종 지지체 형상과 일치하도록 성형된다. 요소(96, 98)는 원동력(웜 스크류(91)로 개략적으로 도시됨)의 인가에 의해 압축될 수 있다. 특정 실시예에서 프레스 요소(96, 98) 중 적어도 하나는 투명하여 그 사이에 압축 상태로 유지된 지지체가 성형되고 있는 동시에 예를 들어 UV 방사선 공급원(93)에 의해 조사될 수 있다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명에 따른 두 부분으로 구성되고 기밀 밀봉 가능한 압축 및 저장 용기 또는 몰드(101)를 도시한다. 용기/몰드(101)는 사이에 챔버(105)를 한정하는 몰드 베이스(102) 및 몰드 상부(104)를 포함할 수 있다. 몰드(101)의 목적은 지지체(100A), 예를 들어 탈세포화된 기질 콜라겐(세포외 기질) 지지체를 압축하는 동시에 지지체에서 유체를 제거하는 것이다. 도 10a는 압축되기 전 상태의 몰드(101)를 도시한다. 시일(106), 예를 들어 O-링 또는 평평한 개스킷 시일은 초기에 몰드 상부(104)와 몰드 하부(102)를 분리한다. 일부 경우에는, 압축 중에 지지체에 가스가 끼는 것을 방지하기 위해 지지체(100A)가 차지하지 않은 챔버(105)의 나머지 부분을 유체(107)로 채우는 것이 또한 바람직할 수 있다. 시일(106)은 지지체로부터 몰아내어진 유체뿐 아니라 초기에 챔버(101)에서 지지체를 둘러싸고 있는 어떠한 유체든 수용하도록 구성된다. 도 5a에는, 압축 이전이지만 시일(106)이 주변 환경으로부터 격리를 생성하는 첫 번째 순간에 있는 몰드가 도시되어 있다.
몰드의 상부 부분(104)은 지지체를 가교처리하기 위해 화학 방사선이 지지체를 통과할 수 있도록 적어도 부분적으로 투명하거나 반투명할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 몰드 하부(102)가 화학 방사선에 대해 투명할 수 있다. 몰드의 투명한 부분은 방사선 투과를 허용할 만큼 충분히 투명하거나 반투명한 한 플라스틱, 유리, 세라믹 또는 금속 또는 이러한 재료의 임의의 조합으로 만들 수 있다.
도 10b는 지지체(100B)의 압축 후의 몰드(101)를 도시한다. 시일, 예를 들어 O-링(106)은 홈(103) 내에서 이동하여 홈이 배출된 유체를 수용하도록 할 수 있다. (다양한 다른 배액 메커니즘 역시 사용할 수 있다.) 이 상태에서, 몰드(101)는 가교처리 및 멸균에 사용될 수 있다. 적절한 파장과 플루언스의 방사선이 선택되면 이러한 멸균은 가교처리와 동시에 일어날 수 있다. (많은 경우에, 바이러스의 무기력화에 필요한 방사선량은 가교처리에 필요한 것보다 훨씬 적다.) 압축되고 멸균된 몰드는 추가적으로 배송 또는 장기 보관에 사용할 수 있다. 화학 가교처리 방사선, 예를 들어 UV 방사선이 멸균 목적에도 효과적이기 위해서는, 방사선은 이 과정에서 렌티큘의 모든 표면에 도달해야 한다. 따라서 시일(예를 들어, 선택한 화학 방사선을 투과시키는 0-링 또는 평평한 개스킷)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, UV 광이 성형 중에 렌티큘을 가교처리 및 멸균하는 양쪽 모두에 사용되는 경우, 시일은 UV 투과성 또는 반투과성 재료, 예를 들어 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 불소화에틸렌프로필렌(FEP), 에틸렌테트라플루오로에틸렌(ETFE) 또는 퍼플루오로알콕시(PFA) 조성물과 같은 불소 중합체로 만들어질 수 있다.
압축 전의 지지체 또는 렌티큘의 형상과 몰드의 매칭되는 형상은 일반적으로 압축 후 렌티큘의 밀도가 균질하게 유지되도록 보장한다. 예를 들어, 압축은 수직 치수를 절반으로 줄이고 밀도를 균일하게 두 배만큼 증가시킬 수 있다.
도 10c 내지 도 10f는 렌티큘이 먼저 수분을 제거하도록 처리된 다음 조절된 재수화에 의해 성형되는 압축/압밀을 위한 대안적인 공정 및 장치를 도시한다. 절제된 조직 부분은 전술한 방법 중 어느 것에 의해서도 초기에 성형 및 탈세포화될 수 있다. 생성된 지지체는 그 다음 적어도 부분적으로 건조된다. 건조는 에탄올 유체 교환과 같은 화학적 공정, 또는 건조, 진공 동결건조 또는 동결건조(예를 들어, 건조 장치에서 승화 고체 CO2에 노출시켜서)와 같은 물리적 공정을 통해 달성할 수 있다. 렌티큘의 두께가 도시된 몰드(201)와 같은 몰드에 맞을 수 있도록 충분히 감소되는 한 건조는 부분적일 수 있다.
도 10c는 서로 짝을 이루고 그 사이에 챔버(216)를 형성하도록 설계된 베이스 부분(202) 및 상부 부분(204)을 포함할 수 있는 몰드(201)의 분해도를 도시한다. 몰드의 베이스 및 상부 부분이 가교처리 방사선에 대해 투명하지 않은 경우, 방사선 투과성 창(210)이 몰드(201)의 일부로서 포함되고 챔버(216)의 일부를 형성할 수 있다. 챔버(216)는 그 내부에 배치될 건조된 렌티큘보다 크다. 챔버(216)의 형상은 재수화 후 렌티큘 또는 지지체의 원하는 형상을 한정한다. 챔버는 렌티큘에 만곡된 형상(예를 들어, 오목, 볼록, 평면 오목, 평면 볼록, 난시 또는 기타 복잡한 구성)을 부여할 수 있다. 챔버(216)의 적절한 설계에 의해, 렌티큘은 난시 교정이 있거나 없이 근시, 원시, 또는 노안의 굴절 치료를 위해 성형될 수 있다. 예를 들어 원추각막 또는 라식(LASIK) 후 확장증과 같은 보다 복잡한 의학적 상태를 치료하기 위해 맞춤형 챔버 형상을 고안할 수 있다. 대안적으로, 챔버는 원하는 결과가 평평한 또는 판형 렌티큘인 경우 두께가 실질적으로 균일할 수 있다.
도 10c 내지 도 10f에 도시된 바와 같이, 상부 및 베이스 부분은 예를 들어 상부 부분(204)의 구멍(208)을 통과하고 베이스 부분(202)의 나사산 나사 리셉터클(212)에 의해 수용되는 나사(206)에 의해 함께 고정될 수 있다. 다양한 다른 메커니즘을 사용하여 베이스 부분(202)과 상부 부분(204)(및 선택사항인 창(210))을 함께 결합할 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 몰드는 베이스 부분과 나사산이 있는 상부 부분 또는 힌지가 있는 상부 부분에 의해 형성될 수 있다. 몰드의 한 부분을 "베이스" 부분으로 지정하고 다른 부분을 "상부" 부분으로 지정하는 것은 단지 설명을 단순화하기 위한 것이며 요구되는 배향을 의미하지는 않는다.
도 10d는 닫힌 구성의 몰드(201)를 도시한다. 도 10e는 닫힌 몰드(201)의 평면도로서 화학 방사선이 렌티큘의 가교결합을 유도하기 위해 통과할 수 있는 창(210)을 또한 도시한다.
도 10f의 단면도에 도시된 바와 같이, 건조된 렌티큘(200)은 몰드(201)의 챔버(216) 내로 로딩될 수 있다. 그 다음 몰드(201)는 닫혀서 팽윤되는 동안 렌티큘의 형상을 제한한다. 몰드에 구속되어 있는 동안, 렌티큘은 유체 주입 채널(212)을 통해 유체(예를 들어, 물, 알코올, 물과 알코올의 혼합물 또는 중알코올, 또는 기타 유체)에 잠겨서 렌티큘(200)이 팽윤되여 정적 몰드(201)의 형상을 취할 수 있도록 한다. 몰드는 또한 챔버가 채워지고 렌티큘이 챔버의 형상을 취하도록 팽윤할 때 챔버로부터의 과잉 유체 또는 배출가스를 제거하기 위해 하나 이상의 출구 채널(214)을 가질 수 있다.
렌티큘의 재수화는 천천히(예를 들어, 몇 분 또는 심지어 며칠에 걸쳐) 일어날 수 있고, 렌티큘이 원하는 형상을 취하는 동시에 내부 장력을 전체적으로 최소화할 수 있도록 하기 위해, 몰드의 간헐적이거나 일정한 물리적 흔들림에 의해, 또는 음향 에너지의 인가에 의해(예를 들어, 초음파에 의해) 도움을 받을 수 있다.
재수화시에, 렌티큘은 전술한 기술 중 어느 것에 의해서도 가교처리될 수 있다. 도시된 실시예에서, 몰드는 가교처리 단계를 위한 하나의 방사선 투과 창(예를 들어, UV 방사선이 사용되는 경우 사파이어 또는 기타 적절한 재료로 형성됨)을 갖는다. 대안적으로, 몰드의 양쪽에 있는 창을 사용하여 일방향 또는 양방향 방사선 접근을 제공할 수 있다.
도 11은 탈세포화된 천연 기질 절제 또는 탈세포화되고 초기 압축 처리를 거친 지지체일 수 있는 지지체(161)를 늘이기 위한 본 발명에 따른 추가 장치(110)를 도시한다. 이 실시예에서, 지지체(161)는 밀봉 메커니즘(167)에 의해, 예를 들어 지지체(161)의 주변 가장자리를 두 개의 평평한 플랜지 사이에 크림핑(crimping)함으로써 챔버(163)의 개방된 입구에 부착되었다. (지지체와 챔버 입구 사이에 유밀 연결을 제공하기 위해 크림핑 대신에 또는 크림핑에 추가하여 다양한 다른 밀봉 메커니즘이 사용될 수 있다.) 그런 다음 유체(166)가 조절된 압력 도관(165)을 통해 챔버(163)에 도입되어 챔버 내부를 채우고 지지체(161)에 압력을 가한다. 예를 들어, 수평 및/또는 접선 방향 늘이기는 챔버에서 충분한 정수압, 예를 들어 약 30 내지 약 500 mbar, 바람직하게는 약 50 내지 약 200 mbar(또는 약 22.5 내지 약 375 Torr, 바람직하게는 약 37.5 내지 약 150 Torr)의 압력을 유지함으로써 얻을 수 있다.
지지체에 기계적 응력을 가하는 유체가 순수한 물 또는 균형 염 용액(BSS)인 경우에도 이 유체 압력의 적용은 또한 지지체가 팽윤되지 않게 할 수 있다(자유수 방출). 유체는 임의의 방향으로 지지체에서 유출될 수 있다(예를 들어, 가압된 유체 챔버로의 이동 또는 지지체의 외부 표면에서 삼출에 의해 또는 둘 다). 이 효과를 강화하거나 제한하기 위해 고장성 또는 저장성 용액이 챔버(163)에 사용될 수도 있다.
ECM-지지체를 이러한 유형의 늘이기에 노출시킴으로써, 콜라겐 원섬유가 정렬되어 만곡된 형상을 구축할 수 있다. 원하는 곡률이 얻어지면 도시된 바와 같이 가교처리, 예를 들어 화학 방사선(168)에 의한 가교처리를 통해 형상이 보존(또는 고정)될 수 있다.
도 12에는 도 6의 장치와 유사하지만 지지체를 늘이는 동시에 압축하는 한편, 가교처리 방사선에 대한 노출을 용이하게 하기 위해 압축 인가 판 요소(171)가 추가된 또 다른 대안적인 장치(120)가 도시되어 있다. 약 30 내지 약 500 mbar, 바람직하게는 약 50 내지 약 200 mbar의 충분한 정수압을 챔버에서 유지함으로써 수평 및/또는 접선 방향 늘이기가 다시 제공된다. 수직/반경 방향 압축은 상부 판(171)에 의해 동시에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 상부 판(171)은 적어도 부분적으로 투명, 예를 들어 투명하거나 반투명하여, 지지체를 가교처리하기 위해 화학 방사선이 통과하여 지지체로 갈 수 있도록 한다.
상부 판(171)이 평판으로 도시되어 있지만, 이 압축 요소의 형상적 특징은 콜라겐 원섬유의 배열이 원하는 형상의 렌티큘을 구축하도록 적절히 고정되고 이는 다시 방사선 유도 가교결합에 의해 보존되거나 고정될 수 있도록 보장하기 위해 임의의 원하는 형상 및/또는 곡률을 취할 수 있다.
도 13은 본 개시에 따라 생성된 렌티큘의 투명도를 측정하기 위한 장치(130)를 도시한다. 장치(130)는 광원(132), 큐벳(cuvette)(134)(내부에 렌티큘(135)이 배치될 수 있음), 렌즈(136) 및 검출기(138)를 포함한다. 광원, 예를 들어 도파관/섬유 및 빔 시준기(도시되지 않음)가 있는 발광 다이오드(LED)는 바람직하게는 시준된 광선(133)의 빔을 생성한다. 빔은 빔 폭(D)(예를 들어, 약 5 내지 7㎜)에 걸쳐 평평한(비-가우시안) 강도 프로파일로 공간적으로 응집되어야 한다. 예를 들어, 광원(132)은 중심 파장이 약 500 나노미터이고 대역폭이 약 5 내지 10 나노미터인 녹색 광을 생성할 수 있다.
광원(132)의 빛은 렌티큘(135)이 굴절률 일치 유체(137)(예를 들어, 물과 섞이지 않고 화학적으로 불활성인, 굴절률(n)이 약 1.376인 실리콘 오일 또는 기타 유체)에 현탁되어 있는 큐벳(134)으로 보내진다. (n=1.376의 값은 천연 각막 조직에 대한 공칭 또는 평균 굴절률을 나타낸다.) 어떤 경우에는 상이한 굴절률의 렌티큘을 갖는 것이 유리할 수 있다. 이러한 경우 큐벳의 유체는 테스트 중인 렌티큘의 특정 n 값과 일치하도록 선택될 것이다. 큐벳(134)(및 렌티큘(135))을 통과하는 빛은 이어서 선택한 빔 파장에서 구면 수차가 없는 고품질 렌즈인 렌즈(136)로 보내진다. 렌즈(136)는 초점거리(f)를 가지며, 집속된 빛을 렌즈(136)의 초점면에 위치한 검출기(138)로 지향시키는 역할을 한다. 렌티큘의 투명도가 완벽하다면(그리고 광원(132)으로부터의 빛이 통과하여 검출기(138)로 가는 광학 요소에 대한 이상적인 광학적 투명도를 가정하면), 검출기(초점면에 위치) 사이에 부딪치는 빔의 크기는 균일한 강도의 회절 한계 지점이 될 것이다. 실제로는, 렌티큘은 완벽하게 투명하지 않을 것이고 검출기에서 빔 강도 이미지는 지지체에서 빛의 전방 산란으로 인해 어느 정도 흐릿함을 나타낼 것이다. (빔 직경과 함께 렌즈의 초점거리는 원하는 회절 제한 각도 분해능을 부과하도록 선택해야 한다.)
따라서, 렌티큘의 투명도는 검출된 빔의 강도 프로파일을 측정함으로써 측정할 수 있다. 강도 또는 밝기 프로파일을 측정하기 위한 적절한 광 검출기에는 예를 들어 사진판, CCD 어레이 또는 주사 핀홀 검출기가 포함될 수 있다.
도 14는 렌티큘의 산란각(본 명세서에서 "θ" 또는 "세타"로 지칭함)을 측정함으로써 투명도를 정량화하는 그러한 방법의 예시이다. 도 14는 렌즈의 초점면에서 측정한 밝기 분포 곡선을 도시한다. 이 가우시안 유사 분포는 분산된 파면의 모든 기여도의 합을 나타낸다. 렌티큘의 산란이 많을수록 검출된 빔의 폭이 커진다. 산란(광학적 선명도의 저하)의 한 척도는 도 14에 도시된 바와 같은 전폭, 수직반치전폭(FWHV)이다. (도 14의 가우시안 유사 곡선은 이상화된 것이며 실제 밝기 곡선은 노이즈 또는 기타 가짜 신호에 의해 왜곡될 수 있음을 이해해야 한다.) 다중 측정 및 평균화(또는 기타 알려진 노이즈 감소 신호 처리 기술)를 사용하여 렌티큘에 의한 산란의 최상의 데이터 표현을 얻을 수 있다. FWHV 값을 초점거리(f)로 나누면 빔의 각도 확산(라디안) 측정값이 제공된다.
θ = FWHV/f[rad]
세타는 산란의 양에만 의존하고 변환 공식인 '1 분 = 291 마이크로라디안'을 사용하여 분각으로 표현할 수도 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 렌티큘은 각도 θ가 4 분 미만, 바람직하게는 3 또는 2 분 미만, 일부 경우에 더욱 바람직하게는 1 분 미만인 경우 (예를 들어, 각막내 이식을 위한) 만족스러운 투명도를 나타낸다.
이전에 언급된 바와 같이, 가교처리는 렌티큘 및 지지체의 "강성"을 수정하는 데 또한 유리하게 사용될 수 있다. 강성이 증가된 렌티큘 및 지지체가 본 교시에 의해 얻어질 수 있다. 가교처리된 콜라겐의 강성은 예를 들어 모듈러스라고 부르는 매개변수(μ)에 의해 정량화될 수 있다. 천연 인간 각막 콜라겐의 모듈러스(μ)에 대한 공칭 표준 값은 연령에 따라 약 4×104 파스칼(Pa) 내지 약 1.2×105 Pa이다. 더욱이, 돼지 눈(이식 가능한 렌티큘러 및 지지체 콜라겐의 중요한 공급원이 될 수 있음)의 경우 각막 콜라겐의 평균 모듈러스(μ)는 약 2×104 파스칼(Pa)만큼 낮을 수 있다.
본 교시에 따른 압축 및 가교처리의 결과로서, 2×104 Pa 초과, 또는 8×104 Pa 초과, 또는 1.6×105 Pa, 또는 2×105 Pa 초과, 또는 3×105 Pa 초과, 또는 5×105 Pa 초과, 또는 8×105 Pa 초과, 또는 1×106 Pa 초과, 또는 3×106 Pa 초과, 또는 5×106 Pa 초과, 또는 1×107 Pa 초과의 모듈러스 강성(μ)을 나타내는 콜라겐성 렌티큘 및 지지체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 본 교시에 따른 렌티큘(지지체 포함)은 1×104 Pa 내지 1×107 Pa, 또는 2×104 Pa 내지 8×106 Pa, 또는 1×105 Pa 내지 5×106 Pa, 또는 3×105 Pa 내지 5×106 Pa, 또는 1×106 Pa 내지 2.6×106 Pa 범위의 모듈러스 값(μ)을 나타낼 수 있다.
가교처리된 콜라겐의 증가된 강성(더 높은 모듈러스, μ)을 측정하기 위한 다양한 기술은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 도 15a 및 도15b 그리고 도 16a 및 도 16b의 기구는 예시적이다.
도 15a 및 도15b에는, 원형 테두리(306)가 있는 내부 구멍(304)을 갖는 받침대(302)를 포함하는, 평평한 가교처리된 렌티큘(300)의 강성을 측정하기 위한 기구(301)가 도시되어 있다. 테스트할 렌티큘(300)은 받침대에 배치되고 테두리(306)에 걸쳐 있다. 소정의 중량 및 기하학적 구조의 플런저(320)가 렌티큘(300)과 간신히 접촉하는 초기 거리(D0)로 설정된다. 렌티큘(300)의 직경은 일반적으로 약 6 내지 약 9 밀리미터이고 두께는 약 0.1 밀리미터(100 마이크로미터)일 것이다. 원형 테두리(306)의 직경(구멍 크기)은 약 5밀리미터일 수 있고 테두리 자체의 곡률 반경은 예를 들어 약 0.2 밀리미터(200 마이크로미터)일 수 있다. 플런저(320)의 직경은 예를 들어 약 4 밀리미터일 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어 약화된 렌티큘의 강성을 측정할 때, 비제한적인 예로서 원형 테두리(306)의 직경(구멍 크기)은 약 2 밀리미터일 수 있고, 플런저(320)의 직경은 약 1 밀리미터일 수 있다.
처음에 렌티큘과 접촉하도록 배치될 때, 플런저에 의해 가해지는 힘은 0이다. 바람직하게는, 받침대 테두리와 플런저는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 폴리에테르에테르케톤(PEEK)과 같이 마찰계수가 낮은 재료로 형성된다. 렌티큘(300)을 아래쪽으로 늘이기 위해 플런저(320)에 의해 렌티큘(300)에 소정의 힘이 가해질 수 있고 플런저가 이동한 거리(D1)가 측정될 수 있다. 이 거리(D1)로부터 모듈러스(μ)를 도출할 수 있다. 대안적으로, 플런저(300)를 소정의 거리(D1)만큼 이동시키고 플런저가 겪는 반력을 측정하여 모듈러스(μ)를 도출할 수 있다.
도 16a 및 도 16b에는, 비평면 형상을 갖는 가교처리된 렌티큘(300A)(예를 들어, 만곡된 전방 표면 또는 만곡된 후방 표면(또는 둘 다)을 갖는 렌티큘)의 강성을 측정하기 위한 유사한 기구(310)가 도시되어 있다. 기구(310)는 유사한 치수의 원형 테두리(306)가 있는 내부 구멍(304)을 갖는 받침대(302)를 역시 포함한다. 테스트할 렌티큘(300A)은 유사하게 받침대 위에 배치되고 테두리(306)에 걸쳐 있다. 플런저(320)는 렌티큘(300A)과 간신히 접촉하는 초기 거리(D0)로 역시 설정된다. 플런저(320)에 의해 초기에 가해진 힘 역시 0이다. 도 15a 내지 도 15b와 관련하여 전술한 것과 유사한 방식으로, 소정의 힘을 플런저(320)에 가하거나 렌티큘(300A)을 아래쪽으로 늘이기 위해 플런저(300)를 소정의 거리(D1)만큼 이동시킨다. 플런저가 이동한 거리(D1) 또는 플런저가 겪은 반력의 측정치로부터 렌티큘(300A)의 모듈러스(μ)를 마찬가지로 도출할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 문헌 또는 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다. 출원인의 교시가 다양한 실시예와 관련하여 설명되지만, 출원인의 교시가 이러한 실시예로 제한되는 것으로 의도된 것은 아니다. 반대로, 출원인의 교시는 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이 다양한 대안, 수정 및 등가물을 포함한다. 하나의 실시예와 관련하여 도시된 임의의 요소 또는 특징은 임의의 다른 실시예에 도시된 임의의 요소 또는 특징과 상호교환 가능하게, 조합하여, 또는 이에 추가하여 사용될 수 있으며 요소 및 특징의 이러한 모든 치환은 본 개시에 의해 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 실시예로 한정되어서는 안 되며, 법률에 의해 허용되는 한 넓게 해석되어야 하는 아래의 청구범위로부터 이해되어야 함을 이해해야 한다.

Claims (15)

  1. 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법으로서,
    상기 렌티큘은 각막내 이식에 적합하며;
    상기 공여자 각막 기질로부터 수분을 제거하는 단계, 및
    제한된 공간에서 상기 공여자 각막 기질을 재수화하여 렌티큘을 얻는 단계
    를 추가로 특징으로 하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 후속 팽윤을 억제하기 위해 상기 제한된 공간에 있는 동안 상기 기질의 적어도 일부를 가교결합시키는 단계를 추가로 포함하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제한된 공간에서 상기 공여자 각막 기질을 재수화하는 것은 상기 렌티큘의 적어도 일 부분에서 증가된 콜라겐 밀도 또는 증가된 강성을 부여하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 렌티큘의 상기 부분이 상기 공여자 각막 기질의 원래 콜라겐 농도보다 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 45% 이상, 또는 60% 이상 더 큰 증가된 콜라겐 밀도를 나타내는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 렌티큘의 상기 부분이 1.2×105 Pa 초과, 또는 1.4×105 Pa 초과, 또는 1.6×105 Pa 초과, 또는 1.8×105 Pa 초과, 또는 2×105 Pa 초과, 또는 3×105 Pa 초과, 또는 5×105 Pa 초과, 또는 8×105 Pa 초과, 또는 1×106 Pa 초과, 또는 2×105 Pa 초과 또는 2.6×106 Pa 초과, 또는 3×106 Pa 초과, 또는 4×106 Pa 초과의 모듈러스 강성(μ)을 나타내는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 압력, 가속도(예를 들어, 원심력), 진공을 상기 지지체에 가하거나, 또는 상기 기질을 동결 건조함으로써 상기 공여자 각막 기질로부터 유체를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 기질을 화학적 탈세포화제로 처리하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로, 상기 탈세포화 단계는 수분 제거 전 또는 후에, 또는 가교결합 전 또는 후에 일어나고, 추가적 선택적으로, 상기 탈세포화된 렌티큘은 잔류 DNA 또는 RNA 함량으로 측정할 때 세포 물질의 잔류량이 원래 DNA 또는 RNA 함량의 1 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만, 또는 0.01 중량% 미만임을 나타내는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 가교결합시키는 단계는 가교 촉진제, 또는 자외선, 엑스선, 감마선 또는 전자빔과 같은 화학 방사선에 상기 기질의 적어도 일부를 노출시키는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로, 상기 가교결합시키는 단계는 상기 렌티큘의 표면 부분이 상기 지지체의 벌크 영역보다 더 큰 가교결합 및 더 높은 콜라겐 밀도를 나타내도록 상기 표면 부분을 방사선에 선택적으로 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가교결합시키는 단계는 직접 노출에 의해, 또는 스침 입사각(grazing incidence angle)에서의 노출에 의해 또는 상기 지지체의 표면에 결합된 소멸 도파관을 통해 상기 압축된 지지체의 적어도 일부를 자외선에 노출시키는 단계, 및 선택적으로, 어떤 미생물 작용제도 비활성화하고/하거나 상기 지지체를 멸균하기에 충분한 방사선을 가하는 단계를 추가로 포함하는, 공여자 각막 기질로부터 렌티큘을 형성하는 방법.
  10. 콜라겐성 렌티큘로서,
    상기 렌티큘에 원하는 형상을 제공하는 전방 표면 및 후방 표면을 갖는 각막 공여자 조직으로부터 유래된 렌티큘러 본체를 포함하고;
    상기 렌티큘은 유체가 고갈된 상기 각막 공여자 조직으로부터 형성되고, 적어도 일부는 공여자 각막 기질의 원래 콜라겐 농도보다 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 45% 이상, 또는 60% 이상 더 큰 콜라겐 농도를 나타내도록 조절된 방식으로 재수화되고,
    상기 렌티큘러 본체는 상기 렌티큘 본체가 2×104 Pa 초과, 또는 8×104 Pa 초과 또는 1.6×105 Pa 초과 또는 2×105 Pa 초과 또는 3×105 Pa 초과, 또는 5×105 Pa 초과, 또는 8×105 Pa 초과, 또는 1×106 Pa 초과, 또는 2×106 Pa 초과, 또는 3×106 Pa 초과, 또는 4×106 Pa 초과, 또는 5×106 Pa 초과, 또는 1×107 Pa 초과의 모듈러스 강성(μ)을 나타내도록 적어도 부분적으로 가교결합된 콜라겐을 추가로 포함하는 것을 추가로 특징으로 하는, 콜라겐성 렌티큘.
  11. 제10항에 있어서, 상기 렌티큘은, 잔류 DNA 또는 RNA 함량으로 측정할 때, 상기 렌티큘에 잔류하는 세포 물질의 양이 원래 DNA 또는 RNA 함량의 1 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만, 또는 0.01 중량% 미만이 되도록 탈세포화되는, 콜라겐성 렌티큘.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 렌티큘은 원반형 평면 또는 비평면 형상 및 약 0.5 밀리미터 내지 약 10 밀리미터의 직경, 및 약 600 마이크로미터 미만, 약 400 마이크로미터 미만, 또는 약 200 마이크로미터 미만 또는 약 100 마이크로미터 미만, 또는 50 마이크로미터 미만의 최대 두께를 가짐으로써 각막내 이식에 적합한, 콜라겐성 렌티큘.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티큘은 각막내 이식물로서 사용하기에 충분한 광학적 선명도를 갖고, 선택적으로, 상기 렌티큘은 3분 미만, 또는 2분 미만, 또는 1분 미만의 산란각(θ)을 나타내는, 콜라겐성 렌티큘.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티큘은 UV 방사선 또는 전자빔과 같은 방사선에 의해 멸균된, 콜라겐성 렌티큘.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티큘은 저장 및/또는 배송을 위해 상기 렌티큘을 둘러싸는 용기를 더 포함하는, 콜라겐성 렌티큘.
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