CN115074463A - 一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用 - Google Patents

一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用，所述系统包括：用于高通量快速筛查待测核酸样本的阵列微腔芯片，以及用于快速定量核酸基因拷贝数的微流控液滴芯片或微流控微腔芯片，所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片共用一个快速热循环平台，可在15分钟内完成单次检测。本发明既可以实现对待测样本的高通量快速筛查，还可以实现对确诊病例的病毒载量的快速精准定量，并且具有检测时间短、检测精度高的优点，在进行新冠核酸检测时，能够对疑似阳性患者的核酸样本进行高通量的快速筛查，还能对感染病例的病毒载量完成快速、灵敏度高、准确度高的绝对定量分析，有效评估患者体内的病毒载量，具有深远的临床检测意义。

Description

一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，更具体地涉及一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用。
背景技术
目前，SARS-CoV-2病毒所引起的新冠肺炎(COVID-19，coronavirus disease2019)已经席卷全球。其较强的传染率和较高的死亡率时刻威胁着人们的生命，并且对全球的经济和社会的稳定都造成了不可小觑的影响。但是由于目前仍然缺乏有效的疫苗或者治疗手段，早期的诊断和及时的隔离对遏制新冠传播至关重要。因此，能够进行重点防疫场所的现场快速检测对于确定感染者(无症状或有症状)以及追踪可能的密接接触者都非常重要；此外，病毒载量的分析有助于对新冠患者进行风险评估，从而为个性化治疗、疾病的检测以及药物筛选提供良好的研究基础。遗憾的是，目前还没有多功能化的、检测速度快的诊断工具和方法。虽然基于免疫分析的抗原检测是一种目前相对流行的技术，其操作简便、快速且成本低，但是抗体的产生过程中存在一个延迟性，这会阻碍感染者早期的诊断。所以目前作为新冠检测的金标准仍然是基于PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)的核酸检测方法，其具有良好的检测准确性。
目前大部分的PCR方法仍然是以中心化实验室为依托进行部署，整个检测的周转时间耗时较长(至少3小时)，再到待测者获得检测报告结果时可能已经耗时1～2天。而一些基于等温扩增的新型核酸检测方法确实能够有效的缩短检测时间，但是由于其反应体系复杂，扩增特异性不强且灵敏度低等缺点，目前还是无法取代PCR方法，并且众多基于等温扩增的核酸检测方法无法实现在单一反应体系内同时检测多个核酸靶标。
针对上述缺点，基于微流控芯片的PCR方法逐步兴起，其结合微流控技术，有效降低了反应体系的热容，从而使反应体系可以与外界的热循环装置进行快速的热交换，将传统的检测耗时从数小时量级缩短到分钟量级。但是，一方面大部分快速PCR技术依赖于终点法检测以获取定性分析，或者是利用半定量的荧光定量PCR原理，这些方法无法给出较可靠的具有基因组拷贝数差异的核酸浓度结果，即病毒载量相关的核酸绝对定量分析结果。另一方面，即便是一些商业化的现场核酸诊断设备，也只能在单次开机运行过程中检测单个样本，并且成本高昂。因此，在面对新冠疫情这类大流行疾病时，多功能、快速高效、准确灵敏的核酸检测微流控系统亟需被开发出来，其除了能够快速高通量的筛查疑似病例，还应具备准确定量阳性患者体内病毒载量的功能，从而能够有效的定期监测阳性患者的病程，也有利于指导个性化的治疗方案以及药物筛选评估。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用，从而解决现有技术中核酸扩增反应耗时长、检测精度不高等缺点导致核酸检测效率较低、检测结果信息量有限等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种多功能核酸快速检测微流控系统，所述多功能核酸快速检测微流控系统包括：用于高通量快速筛查待测核酸样本的阵列微腔芯片，以及用于快速定量核酸基因拷贝数的微流控液滴芯片或微流控微腔芯片，所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片共用一个快速热循环平台，所述多功能核酸快速检测微流控系统可在15分钟内完成单次检测。
优选的，所述热循环平台可以是选自硅、玻璃、石英玻璃等材料中的一种或多种材料制成的热循环温度控制平台。
优选的，为了实现反应体系与热循环平台的快速热交换，所述阵列微腔芯片和微流控液滴芯片基底均选自硅、玻璃、石英玻璃、塑料等材料中的任意一种或多种材料制成，且各反应芯片的基底厚度小于1mm。
所述阵列微腔芯片包括至少四个相互独立的毫米尺度的反应腔室，单个反应腔室内可容纳1～10μL的反应体系，各反应腔室的直径为2～5mm，各反应腔室的高度为2～5mm。
所述阵列微腔芯片采用了薄玻璃片基底，实现快速的热交换，从而完成快速核酸扩增反应；通过构造多个毫米量级的通孔，随后键合在薄玻璃片基底上。
所述微流控液滴芯片包括：试剂加载外壳、液滴生成结构层、玻璃盖板以及基底层；其中，所述液滴生成结构层与所述玻璃盖板在所述基底层上并排布置，所述试剂加载外壳包括：分别用于加载液相和油相的液相装载腔室、油相装载腔室；所述液滴生成结构层包括：在下方分别与所述液相装载腔室和油相装载腔室连接的液相进样口、油相进样口，以及用于生成液滴的十字结构喷口；所述玻璃盖板通过双面胶或者紫外固化胶固定于所述基底层之上并在二者之间形成一个微滴存储腔，所述一个微滴存储腔内可容纳10000～50000个微米级样本反应单元。
在所述微流控液滴芯片中，所述液滴生成结构层的厚度为50～200μm，所述液相进样口、所述油相进样口的内径尺寸为30～150μm，所生成液滴的直径为40～150μm；所述微滴存储腔的高度为100～200μm，所述微滴存储腔的面积为2～5cm2。
所述微流控液滴芯片具备将核酸扩增反应体系分割成微米级的独立反应单元的功能。优选的，微流控液滴芯片中的存储腔内可容纳10000～50000个微米级样本反应单元。进一步优选的，存储腔内的样本反应单元为油包水微滴形式，该液滴的直径为40～150μm。
所述微流控液滴芯片的优点包括以下几个方面：其一，采用薄玻璃片基底，从而实现快速的热交换；其二，采用玻璃腔结构，防止传统PDMS材料多孔结构导致的油相吸收而引发的液滴融合，液滴更加稳定；其三，玻璃材质能够耐住PCR热循环变性的高温，硬度上不会随温度产生波动；第四，采用试剂装载外壳更加便于与标准的鲁尔接头的气泵连接进行液滴生成。
所述微流控液滴芯片的存储腔通过固定厚度的双面胶制备或采用紫外固化胶固定，具体构造为三明治结构，在玻璃上盖板三个边缘均粘贴双面胶后与基底薄玻璃片粘贴，与大气相通，但是在生成油包水结构液滴时，四周与大气相通的边缘会由于油相的表面张力，不会从边缘流出，保证了液滴存储过程中的稳定性，该存储腔室高度优选为100～200μm。存储腔上表面选自硅、玻璃、石英玻璃等材料中的任意一种或多种材料制成，整个存储腔室的表面积在2～5cm2。此外，存储腔室内样本不与快速热循环平台直接接触，快速热循环平台将通过所述介质层与存储腔内样本实现热交换。
快速热循环平台的接触平面为硅基材料，其具有良好的导热性，也兼容半导体工艺，从而可以在上面加工出测温电极和加热电极，实现温控；存储腔室或者芯片均是放置于加热平面即可，介质层可以选择导热硅胶或者液态的导热硅油保证反应腔室内的体系通过薄玻璃片基底可以更好的和硅基加热盘接触；因为硅基加热盘和薄玻璃基底都是硬质的，因此需要一个介质层来有效的保证两者的热接触。
优选的，该介质层厚度在50～300μm，并且其选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环氧树脂、玻璃、石英玻璃、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等材料中的任意一种制成或者多种材料复合而成。
优选的，微流控液滴芯片还配备有试剂加载外壳，使用3D打印或雕刻技术、注塑技术等加工技术制备而成，其材料为光敏树脂或任何可用于微流控制备塑料材料。加载外壳的反应液存储腔以及油相存储腔外围均为标准的鲁尔接头尺寸。
根据本发明，微流控液滴芯片可以替换为微流控微腔芯片。这种微流控微腔芯片是另一种数字PCR芯片，有成千上万个百或者数十微米量级腔室，直径在100μm左右，通过微流通道填满这些上万个很小的微腔室，实现反应体系的分区；可以说微流控微腔是另一种形式的分散反应体系的方法。
微流控微腔芯片上的微腔阵列更像是孔板阵列，是毫米量级的微腔室，并且每个腔室内检测的是多个不同的反应体系，使用移液枪加样；而微流控微腔芯片，是将一个反应体系均分为了成千上万个小的反应单元，是另一种常见的数字PCR芯片结构，移液枪加样后通过泵或者负压自吸力让反应体系进入到成千上万个微米级腔室内，微米级的独立反应单元以微腔形式实现分割功能，微腔直径为20～200μm，高度为20～200μm。
所述反应芯片选自包括但不限于二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、丙烯酸甲酯(PMMA)等材料中任意一种或多种材料复合而成。此外，反应芯片由至少两种材料通过等离子键合，超声波焊接，化学键合等方式相接复合。
根据本发明的第二方面，提供一种如上面所述的多功能核酸快速检测微流控系统在核酸的快速定量检测，核酸突变或甲基化的快速检测，以及核酸拷贝数的快速精准定量中的应用。此系统作为普适平台配合反应芯片以及快速核酸反应体系，可以在核酸检测领域中有相当广泛的应用，包括但不限于病毒检测，核酸RNA和DNA等靶标分子的序列检测，核酸突变或者甲基化检测等应用。
根据本发明的一个优选实施方式，该方法包括：(1)提供一种如上面所述的多功能核酸快速检测微流控系统；(2)将核酸检测反应体系通过移液枪加载在阵列微腔芯片内，通过快速热循环平台实现对核酸特异性靶标存在性的快速定性筛查，判断核酸样本是否携带相关靶标，从而快速排查疑似病例，提高检测效率；(3)对于确认含有靶标的核酸样本，通过微流控液滴芯片或微流控微腔芯片将核酸检测反应体系分散为上万个微米级的样本反应单元；(4)通过快速热循环平台对分散的样本反应单元进行核酸扩增，再通过统计腔室内的带有阳性荧光信号的反应单元数目，即可确定初始核酸样本中的核酸拷贝数，实现对核酸靶标的快速而准确的绝对定量。
在一个具体的实施例中，核酸扩增反应依次包括逆转录、预变性和变性、退火及延伸。鉴于核酸扩增反应体系内使用了具有热启动特性的DNA快速聚合酶以及快速热循环平台，优选的，热循环参数可设置为逆转录温度42～50℃，时间30s～5min，循环数为1；预变性95℃，时间30s～1min，循环数为1；两步法PCR程序设置为变性温度95℃，时间2～5s，退火及延伸温度55～65℃，时间4～12s，循环数40～45；或者，三步法PCR程序设置为变性温度95℃，时间2～5s，退火温度55～65℃，时间4～10s，延伸温度72℃，时间2～5s，循环数40～45。
根据本发明的第三方面，还提供一种所述多功能核酸快速检测微流控系统在新冠病毒核酸快速检测中的应用。一方面可以快速高通量的筛查可疑样本，另一方面可以在隔离后对阳性样本的核酸靶标进行快速的绝对定量分析，实现对病毒载量的评估与患者病程的监测。
如背景技术部分所述，现有技术中，为了加快核酸检测过程，通常会选择避开基于PCR原理的核酸扩增方法，而采用基于恒温扩增原理的技术，但是其特异性和灵敏度均不如PCR原理的核酸扩增技术；其次，大部分快速PCR或者集成化的核酸检测系统，没有展示出其实际应用的意义及功能性，比如高通量的核酸筛查能力，而这在新冠检测过程中又是至关重要的，大部分现有产品仅能单次检测单个样本，并且需要耗费1小时左右完成检测。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的关键发明点即在于将阵列微腔芯片和微流控液滴芯片或微流控微腔芯片同时提供在一个检测系统中，根据需求使用不同的芯片可以满足不同的检测需求，一方面可以进行快速高通量的筛查，另一方面针对阳性样本可以进行快速的定量分析。本发明通过数字PCR技术与快速PCR技术的结合实现，这样可以应用于阳性病人体内病毒核酸载量的快速监测，提供个性化治疗方案，并且可以用于药物筛选，具有重大的意义；此外，本发明还采用了快速热循环平台，可以在十几分钟内完成40个热循环，与恒温扩增方法或者抗原抗体检测方法的耗时相当，但是PCR技术却有更好的特异性和灵敏度。
就阵列微腔芯片和微流控液滴芯片结构而言，均采用薄的基底材料实现快速导热，此外该结构设计简单并便于操作加样，对于微流控液滴芯片，采用玻璃腔室对PCR快速热循环过程中的液滴具有抗蒸发、抗融合的优势。
此外，本发明还克服了大众对于传统PCR技术耗时久从而采用恒温扩增等方法的偏见，但是实际上目前依然是基于PCR技术的核酸扩增检测是新冠检测的金标准，本发明通过快速升降温平台配合微流控技术所制备的多种芯片，来满足目前检测的一系列需求，实现了快速筛查多个样本和快速绝对定量病毒核酸载量评估病人病程。
根据本发明的技术方案，可以在15min内实现PCR的40个热循环并完成9个核酸样本的定性筛查；最后，本发明还通过微流控液滴芯片的引入，将数字PCR技术结合到快速PCR中，实现对核酸检测的绝对定量，这相对于荧光定量PCR或者终点法的定性检测PCR有着更加的定量精度，这样既能在快速升降温平台上实现又快又准的病毒核酸载量的评估，相应地也表现出病人体内的病毒量，具有深远的临床检测意义。
综上所述，根据本发明提供的一种多功能核酸快速检测微流控系统以及应用，既可以实现对待测样本的高通量快速筛查，还可以实现对确诊病例的病毒载量的快速精准定量，并且具有检测时间短、检测精度高的优点，特别是在利用本发明的多功能核酸快速检测微流控系统进行新冠核酸检测时，能够对疑似阳性患者的核酸样本进行高通量的快速筛查，并对感染病例的病毒载量完成快速、灵敏度高、准确度高的绝对定量分析，有效评估患者体内的病毒载量，从而促进新冠个性化诊疗方案的实施，具有深远的临床检测意义。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1提供的一种多功能核酸快速检测微流控系统的示意图；
图2是如图1所示多功能核酸快速检测微流控系统的阵列微腔芯片的单独结构示意图；
图3是如图1所示多功能核酸快速检测微流控系统的微流控液滴芯片的单独结构示意图；
图4是根据本发明的实施例2的提供的快速热循环反应参数的温度曲线；
图5是实施例2中，根据本发明提供的阵列微腔芯片对新冠标准品进行快速多靶标(RdRp、N和RNase P基因)的检测结果；
图6是实施例2中，根据本发明提供的阵列微腔芯片对区分阴阳性阈值的鉴定结果图；
图7是实施例2中，根据本发明提供的阵列微腔芯片检测新冠靶标RdRp基因的重复性及稳定性的结果图；
图8是实施例2中，根据本发明提供的阵列微腔芯片检测新冠靶标N基因的重复性及稳定性的结果图；
图9是实施例2中，根据本发明提供的阵列微腔芯片检测质控基因RNase P的重复性及稳定性的结果图；
图10是实施例2中，根据本发明提供的微流控液滴芯片检测新冠靶标RdRp基因的重复性及稳定性的结果图；
图11是实施例2中，根据本发明提供的微流控液滴芯片检测新冠靶标N基因的重复性及稳定性的结果图；
图12是实施例2中，根据本发明提供的微流控液滴芯片检测质控基因RNase P的重复性及稳定性的结果图；
图13是实施例3中，根据本发明提供的多功能核酸快速检测微流控系统对临床样本的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1一种多功能新冠核酸快速检测微流控系统
根据该优选实施例，提供一种多功能新冠核酸快速检测微流控系统，如图1所示，该系统主要包括：阵列微腔芯片100和微流控液滴芯片200。通过使用不同结构的反应芯片不仅能够实现快速高通量的核酸样本筛查，还能同时实现对核酸特异靶标基因拷贝数的快速、灵敏、准确的绝对定量。
如图2所示，是根据该优选实施例提供的一种阵列微腔芯片100，该阵列微腔芯片主要包括微腔阵列结构层1和薄玻璃基底层2，微腔阵列结构层1包括9个相互独立的反应体系装载腔室，其中单个腔室的直径为3mm，实际也可优选为2～5mm，整体的腔室高度与芯片厚度一致，为3mm，实际也可优选为2～5mm。但是应当理解的是，此处仅作为举例而非限制，该阵列微腔芯片100的反应体系装载腔室的数量也可更多或更少。
如图3所示，是根据该优选实施例提供的一种微流控液滴芯片200，其主要由试剂装载外壳3、微流控液滴生成结构层4、基底层5、上层玻璃盖板6以及双面胶7装配而成。
本实施例中，试剂装载外壳3使用透明的光敏树脂材料通过3D打印制作而成，包括：液相装载腔室11，油相装载腔室12，且与气阀或外界气路接口为标准的鲁尔接头结构，装载腔室11、12均优选为倒锥形，可储存液体(液相或油相)的体积为40μL，实际也可优选为20～200μL。
微流控液滴生成结构层4具备将核酸扩增反应体系分割为成千上万的独立反应单元的功能，主要包括液相进样口8、油相进样口9以及十字结构喷口10，当反应体系通过液相进样口8注入后，受到来自油相进样口9的油相剪切生成尺寸为微米量级、大小均一的微滴，微滴直径为90μm，实际也可优选为40～150μm。
上层玻璃盖板6通过双面胶7固定于基底层5之上，从而在上层玻璃盖板6与基底层5之间形成一个微滴存储腔，该微滴存储腔内可容纳10000～50000个微米级样本反应单元。
在油相的剪切作用下，微流控液滴生成结构层4中生成的微滴随后被油相推入至上层玻璃盖板6与基底层5之间形成的微滴存储腔中。具体地，先用油相去填充腔室，一方面引导液滴进入玻璃腔室，另一方面通过表面张力密封住玻璃腔边缘，由于微滴周围均有油相包围，且在靠近存储腔室的边缘，由于表面张力的存在，油相将被限制在上层玻璃盖板6与基底层5之间，从而液滴会在微滴存储腔内保持静止。
上层玻璃盖板6的各边均采用固定厚度的双面胶进行粘贴，从而保证微滴存储腔的高度为100μm，实际也可优选为100～200μm。应当理解的是，单个液滴芯片只有一个微滴存储腔。优选的，单个微流控液滴芯片的微滴存储腔内包含20000～25000个微滴，实际也可优选为10000～50000个。还应当理解的是，微流控液滴芯片的主要功能是将反应体系以分散形式存储在固定的腔室内，除了实施例所示的油包水的微滴形式，实际也可以是微腔形式。
如图2及图3所示，阵列微腔芯片100和微流控液滴芯片200的结构层材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，该结构层和玻璃基底通过等离子体键合的方式键合而成。
但是应当理解的是，这些反应芯片可以由选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环氧树脂、玻璃、石英玻璃中的任意一种材料制成或者多种材料复合制成。还优选的，反应芯片由至少两种材料通过等离子键合、超声波焊接、化学键合等方式中的一种相接复合。
实施例2一种多功能新冠核酸快速检测的方法
为了验证实施例1中提供的多功能核酸快速检测微流控系统的重复性及稳定性，本实施例采用该系统对国家计量院提供的新冠RNA标准品梯度稀释后进行了重复性测试。
由于标准品内仅有RdRp和N双重靶标，为了更好地模拟真实的病例样本检测，将从人唾液核酸提取到的靶标RNase P与初始浓度的标准品进行均匀混合，作为整个核酸检测扩增中的质控靶标，随后再进行梯度稀释。根据国家计量院标准品说明书所提供的初始模板浓度值，稀释后的RdRp和N靶标的浓度分别为10、100、1000、5000、10000copies/μL和20、200、2000、10000、20000copies/μL，而由于未定量RNase P靶标的浓度，因此将稀释梯度作为测试结果的横坐标，稀释梯度参数为10-4、10-3、10-2、2×10-2、10-1，每次检测至少重复三次以上。
如实施例1中所述，该系统同时包括阵列微腔芯片100和微流控液滴芯片200，在同一快速热循环平台上，本实施例采用阵列微腔芯片100进行快速核酸定性分析，采用微流控液滴芯片200进行核酸的快速、灵敏、准确的绝对定量分析，从而有效的定量样本中的核酸拷贝数，进而评估患者体内的病毒载量。
具体地，我们采用优选的热循环参数进行多功能新冠核酸的快速检测，具体的热循环温度及时间参数如图4所示，逆转录温度50℃，时间2min，循环数为1；预变性温度95℃，时间30s，循环数1：三步法PCR包括：变性温度95℃，时间3s，退火温度60℃，时间8s，延伸温度72℃，时间2s，循环数为40。
如图5所示，选取适中的标准品浓度进行测试，发现含有靶标基因的腔室内荧光强度明显强于阴性对照。为了有效的区分腔室内载入样本的阴阳性，对阴性对照进行了至少10次的重复性测试，随后获得一个区分阴阳性荧光强度的阈值如图6所示。具体的阈值计算方法遵从3-sigma原则，即将多次重复的阴性对照的荧光强度值的均值加上3倍标准差作为区分阴阳性荧光强度的阈值。
Figure BDA0003698899650000101
其中T为阈值的荧光强度数值，
Figure BDA0003698899650000102
为多次重复的阴性对照的荧光强度均值，
Figure BDA0003698899650000103
为多次重复结果的标准差。
进一步的，相关阈值确定后即可对多个待测样本的阴阳性进行快速的筛查，为了评估微腔阵列芯片的检测灵敏度和稳定性，使用前述的梯度稀释标准品进行测试，图7-图9为检测结果，图中左侧为各靶标在不同标准品梯度稀释下的荧光结果图，右侧为具体的荧光强度数值，从图中可以看出，三重靶标的检测灵敏度至少能达到10copies/反应，具有良好的检测灵敏度，能够有效区分阴阳性模板。
在本实施例中，采用微流控液滴芯片，使用前述的优选的热循环反应参数进行核酸的快速、灵敏、准确的绝对定量分析，能够有效的定量样本中的核酸拷贝数从而评估患者体内的病毒载量。应当知晓的是，在本实施例中两种芯片上采用了相同的热循环反应参数，均能在15min内实现定性或者定量的扩增反应。为了评估快速定量的准确性和灵敏度，同样使用了前述的梯度稀释标准品进行了测试，图10-图12为检测结果，图中左侧为各稀释梯度下不同浓度对应的荧光照片，可以看到随着浓度的降低和稀释梯度的提升，阳性液滴的数目和在视野中出现的比例逐渐减小。右侧为对应的浓度拟合结果，从图中可以看出，三重靶标的检测结果与标准品浓度具有较好的一致性R2>0.99，且最低可检测5copies/反应浓度的标准品，证明此微流控液滴芯片在新冠快速核酸检测系统中的重复性及稳定性效果良好，且检测灵敏度至少能达到5copies/反应。
具体的，通过荧光显微镜的FAM、VIC以及CY5通道，统计总液滴数nt和具有荧光信号的液滴数np，即可通过泊松分布统计获得初始核酸模板的拷贝数N，并可以根据液滴的体积计算出样本内的待测靶标的浓度c(其中：Vd表示单个液滴体积，Vs表示加入核酸模板的体积，Vr表示整个反应体系的体积)。
Figure BDA0003698899650000111
Figure BDA0003698899650000112
实施例3采用该多功能核酸快速检测微流控系统及方法对临床样本的检测
本实施例中，采用实施例1提供的多功能核酸快速检测微流控系统，以及实施例2提供的多功能核酸快速检测微流控方法对临床样本进行了测试。通过微腔阵列芯片，能够高通量的有效快速判断样本的阴阳性，随后配合微流控液滴芯片，实现对样本内病毒载量的快速、灵敏、准确的绝对定量。
如图13所示，为13个临床样本的检测结果，其中1～10号为10例确诊的新冠病毒患者的核酸样本，11～13号为3例为健康人的咽拭子提取的核酸样本，通过图13可以发现健康人的核酸样本11～13在FAM和VIC通道下的荧光强度值均未超阈值。进一步的，在筛查出临床样本中的阳性病例后，基于此平台可对其进行一个快速、灵敏和准确的绝对定量。
表1为根据泊松分布方程计算的各样本中靶标核酸的拷贝数结果，通过对微流控液滴芯片内的阴阳性液滴进行统计后可以得到相关靶标的核酸拷贝数的绝对定量。定量的结果与传统的RT-qPCR具有良好的一致性，值得注意的是，RT-qPCR仅能通过Ct值的大小来判断靶标浓度，其对靶标的核酸拷贝数的定量误差较大，仅能实现相对定量，但是基于微流控液滴芯片的数字化结果读出，可以实现单拷贝的区分度得到一个准确的数字化的拷贝数，更加准确的表征了阳性病人核酸样本中的靶标浓度，从而可以反馈出病毒载量，有利于指导个性化的治疗方案、监测病程以及药物筛选等研究的开展。
表1确诊病人及健康人核酸样本快速定量检测结果
Figure BDA0003698899650000121
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述多功能核酸快速检测微流控系统包括：用于高通量快速筛查待测核酸样本的阵列微腔芯片，以及用于快速定量核酸基因拷贝数的微流控液滴芯片或微流控微腔芯片，所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片共用一个快速热循环平台，所述多功能核酸快速检测微流控系统可在15分钟内完成单次检测。
2.根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述快速热循环平台由选自硅、玻璃、石英玻璃中的一种或多种制成，所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片的基底由选自硅、玻璃、石英玻璃、塑料中的任意一种或多种制成，且各芯片的基底厚度小于1mm，从而实现所述快速热循环平台与所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片内的检测体系的快速热交换。
3.根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述阵列微腔芯片包括至少四个相互独立的毫米尺度的反应腔室，单个反应腔室内可容纳1～10μL的反应体系，各反应腔室的直径为2～5mm，各反应腔室的高度为2～5mm。
4.根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述微流控液滴芯片包括：试剂加载外壳、液滴生成结构层、玻璃盖板以及基底层；其中，所述液滴生成结构层与所述玻璃盖板在所述基底层上并排布置，所述试剂加载外壳包括：分别用于加载液相和油相的液相装载腔室、油相装载腔室；所述液滴生成结构层包括：在下方分别与所述液相装载腔室和油相装载腔室连接的液相进样口、油相进样口，以及用于生成液滴的十字结构喷口；所述玻璃盖板通过双面胶或者紫外固化胶固定于所述基底层之上并在二者之间形成一个微滴存储腔，所述一个微滴存储腔内可容纳10000～50000个微米级样本反应单元。
5.根据权利要求4所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，在所述微流控液滴芯片中，所述液滴生成结构层的厚度为50～200μm，所述液相进样口、所述油相进样口的内径尺寸为30～150μm，所生成液滴的直径为40～150μm；所述微滴存储腔的高度为100～200μm，所述微滴存储腔的面积为2～5cm2。
6.根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述微流控微腔芯片包括若干微米量级的独立反应腔室，所述微流控微腔芯片以微腔形式实现分割功能，所述独立反应腔室的直径为20～200μm，高度为20～200μm。
7.根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统，其特征在于，所述快速热循环平台与所述阵列微腔芯片、微流控液滴芯片或微流控微腔芯片内的检测体系通过厚度为50～300μm的介质层实现快速热交换，所述介质层的材料选自聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、玻璃、石英玻璃、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种或多种。
8.一种根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统在核酸快速定量检测、核酸突变或甲基化的快速检测、以及核酸拷贝数的快速精准定量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)提供一种根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统；
2)将核酸检测反应体系通过移液枪加载在阵列微腔芯片内，通过快速热循环平台实现对核酸特异性靶标存在性的快速定性筛查，判断核酸样本是否携带相关靶标，从而快速排查疑似病例，提高检测效率；
3)对于确认含有靶标的核酸样本，通过微流控液滴芯片或微流控微腔芯片将核酸检测反应体系分散为上万个微米级的样本反应单元；
4)通过快速热循环平台对分散的样本反应单元进行核酸扩增，再通过统计腔室内的带有阳性荧光信号的反应单元数目，即可确定初始核酸样本中的核酸拷贝数，实现对核酸靶标的快速而准确的绝对定量。
10.一种根据权利要求1所述的多功能核酸快速检测微流控系统在新冠病毒核酸快速检测中的应用。
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