CN115073432A - 甲基化黄烷醇生物碱及其提取、合成、检测和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甲基化黄烷醇生物碱的结构式。本发明公开了上述甲基化黄烷醇生物碱从茶叶中分离纯化及体外合成的方法。本发明公开了上述甲基化黄烷醇生物碱在制备治疗肥胖药物中的应用。本发明公开了一种用于治疗肥胖的药物，采用上述甲基化黄烷醇生物碱和药用辅料制成。本申请人通过高糖诱导的秀丽隐杆线虫降脂实验发现，甲基化黄烷醇生物碱对线虫脂质积累有抑制作用，具有开发减肥药的潜力，而且本发明提供的提取及合成方法简单，成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及化合物技术领域，尤其涉及一种甲基化黄烷醇生物碱及其提取、合成、检测和应用。
背景技术
绿茶作为一种受人欢迎的健康饮品，由茶(Camellia sinensis)通过特别的加工工艺制成。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)，表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)是绿茶中主要的多酚类黄酮，其中EGCG的含量最高且具有很好的生物活性。大量研究表明，儿茶素具有抗肿瘤、预防肥胖、抗氧化、预防神经退行性疾病、抗衰老等功效。然而，尽管具有多种生物活性，但儿茶素的生物利用率却不高，因此多种改善儿茶素稳定性和吸收率的方法被提出。其中，甲基化是一种常见的结构修饰。甲基化儿茶素表儿茶素-3-(3-O-甲基)没食子酸酯(ECG3″Me)和表没食子儿茶素-3-(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3″Me)具有很好的抗炎症功效，且相比于常见儿茶素，其吸收率更高，在血液中更稳定。黄烷醇生物碱是一种儿茶素衍生物，通过在儿茶素A环6位或8位取代N-乙基吡咯烷酮环生成，也被证明了具有多种生物活性，且优于其母核结构。这些儿茶素类衍生物的发现，揭示了茶叶健康功效的机制，为茶叶综合利用奠定了理论基础。且随着各种波谱检测技术的发展，加速了这些功能性化合物的发现与鉴定。
炒青绿茶的加工工艺主要包括，杀青、揉捻和炒干，常见的炒青绿茶包括西湖龙井、碧螺春和出口眉茶等。高温使茶叶内的多酚氧化酶和过氧化物酶等失去活性，阻止多酚类化合物进一步发生酶促氧化反应。使用揉捻机对杀青后的加工叶进行揉捻处理，使茶叶在外力作用下发生形变，茶叶细胞产生破碎并使部分茶叶内含成分附着在加工叶表面，与外部环境产生更多接触，并形成紧结的条索外形。最后通过滚筒炒干机以180℃的温度将茶叶加工叶炒至含水率为4-5％。
杀青作为绿茶加工的关键工艺，使绿茶保留了更多的儿茶素类化合物，炒青工艺提供了长时、高温的加工环境，这些都为进一步在加工过程中产生儿茶素衍生物创造了可能。而这些儿茶素及其衍生物作为茶叶中的活性成分，与炒青绿茶的各种潜在健康功效密不可分。因此，针对炒青绿茶活性成分的分离和鉴定的研究必不可少。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种甲基化黄烷醇生物碱及其提取、合成、检测和应用。
本发明目的之一在于提出：甲基化黄烷醇生物碱，如下列结构式所示：
其中，R1＝-H或-CH3；
R2＝-H或
R3＝-H或
R4＝-H或-CH3；
R5＝-H或-OH；
R6＝-H或-CH3；
R7＝-H或-CH3；
其中，当R2＝-H时，则
当
时，则R3＝-H。
优选地，当R5＝-OH时，则R6和R7中一基团为-H，另一基团为-CH3；当R5＝-H时，则R7＝-H。
优选地，甲基化黄烷醇生物碱的具体结构式如式I-VII之一所示：
本发明目的之二在于提出：上述甲基化黄烷醇生物碱的提取方法，包括以下步骤：
(1)以鄂茶1号炒青绿茶为原料，粉碎，干燥得到绿茶粉末：
(2)依次采用石油醚、乙酸乙酯、甲醇分步浸提得到浸提液；
(3)对步骤(2)所得浸提液进行萃取处理和减压浓缩处理，得到膏状浸提物；
(4)对膏状浸提物进行分离纯化处理，得到所述甲基化黄烷醇生物碱。
优选地，步骤(2)中，向绿茶粉末中加入石油醚，常温浸提，超声浸提，过滤得到滤液，减压蒸馏得到石油醚浸膏；待绿茶粉末上的石油醚完全挥发后，继续加入乙酸乙酯，常温浸提，超声浸提，过滤得到滤液，减压蒸馏得到乙酸乙酯浸膏；待绿茶粉末上的乙酸乙酯完全挥发后，继续加入甲醇，常温浸提，超声浸提，过滤得到滤液，减压蒸馏得到甲醇浸膏；使甲醇浸膏中甲醇挥发，并逐渐加入水，置换为水浸提液。
优选地，步骤(3)中，向水浸提液中加入二氯甲烷进行常温萃取，取上层萃取清液，减压蒸馏浓缩得到膏状浸提物。
优选地，分离纯化处理具体操作如下：将膏状浸提物依次经过MCI gel CHP20P柱层析、Toyopearl HW-40F柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和反向高效液相色谱柱洗脱。
具体地，分离纯化处理具体操作如下：将膏状浸提物经过MCI gel CHP20P柱层析，使用甲醇与水作为流动相，按照甲醇比水的体积比依次为0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、80:20和100:0进行梯度洗脱，收集合并得到C1-C6共6个组分；其中C2组分是由50％甲醇水洗脱得到的，并通过Toyopearl HW-40F柱进行梯度洗脱，Toyopearl HW-40F柱采用与MCIgel CHP20柱相同的流动相及比例进行梯度洗脱，收集得到D1至D12共12个组分；然后将50％甲醇水洗脱得到的D1至D2合并，通过Sephadex LH-20凝胶柱进行梯度洗脱，同之前一样以甲醇水作为流动相，随后收集并合并得到E1至E40共40个组分；将E19至E21组分合并，并采用Waters e2695高效液相色谱系统和半制备色谱柱进行制备分离。其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(5μm，9.4mm×250mm)柱，流速2mL/min，流动相为色谱级乙腈和超纯水，甲基化黄烷醇生物碱I-IV的洗脱条件为：0-20min，20％乙腈水；20-25min，20-25％乙腈水；25-26min，25-95％乙腈水；26-27.5min，95％乙腈水；27.5-29min，95-20％乙腈水；29-33min，20％乙腈水；甲基化黄烷醇生物碱V-VII的洗脱条件为：0-15min，25％乙腈水；15-16min，25-30％乙腈水；16-21min，30％乙腈水；21-22min，30-35％乙腈水；22-26.5min，35％乙腈水；26.5-27.5min，35-95％乙腈水；27.5-29.5min，95％乙腈水；29.5-31.5min，95-25％乙腈水；31.5-35min，25％乙腈水。
本发明目的之三在于提出：上述甲基化黄烷醇生物碱的合成方法，包括以下步骤：
①将表没食子儿茶素没食子酸酯和碳酸氢钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入过量的碘甲烷，常温搅拌反应32-34h，随后加入0℃冰水终止反应；萃取，浓缩，洗脱得到反应中间产物EGCG4"Me；将EGCG4"Me和L型茶氨酸溶于体积分数为18-22％的甲醇水溶液，115-125℃油浴加热，搅拌反应43-53h，分离，洗脱，纯化得到甲基化黄烷醇生物碱；
②采用黄烷醇生物碱etc-pyrrolidinone G和etc-pyrrolidinone H混合物为反应底物，与无水硼砂(Na2B4O7)混合溶于水得到混合物1；常温搅拌10-14h后，加入硫酸二甲酯，调节pH至9.0，得到混合物2；混合物2继续常温反应10-14h，加入硫酸调节pH至6.0；酸性条件下反应2.5-3.5h后得到混合物3，加入水终止反应；萃取，浓缩，分离，洗脱，纯化得到甲基化黄烷醇生物碱。
其中，etc-pyrrolidinone G为(-)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate，而etc-pyrrolidinone H为(-)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate。etc-pyrrolidinone G和etc-pyrrolidinoneH详见于本申请人于2018年09月14日公开的中国专利申请CN 108530430A，其发明名称为酯型儿茶素吡咯烷生物碱及其制备方法和应用，申请号为201810589928.6，申请日为2018年06月08日。
优选地，步骤①中，表没食子儿茶素没食子酸酯和碳酸氢钠的摩尔比为2：3。
优选地，步骤①中，反应中间产物EGCG4"Me和L型茶氨酸的摩尔比的1：2。
优选地，步骤①中，采用Sephadex LH-20凝胶柱进行分离，采用80％乙醇水为流动相进行等度洗脱。
优选地，步骤②中，反应底物与无水硼砂的摩尔比为1：5。
优选地，步骤②中，混合物1的常温产物与硫酸二甲酯的摩尔比为1：4。
优选地，步骤②中，加入10倍体积的水终止反应。
优选地，步骤②中，采用二氯甲烷进行萃取，采用Sephadex LH-20凝胶柱进行分离，采用80％乙醇水为流动相进行等度洗脱。
本发明目的之四在于提出：上述甲基化黄烷醇生物碱的检测方法，采用UPLC-Q-TOF-MS方法，流速0.2mL/min，流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈；
洗脱条件如下：0-5min，5-15％乙腈水；5-12min，15-20％乙腈水；12-17min，20-25％乙腈水；17-18min，25-35％乙腈水；18-20min，35-45％乙腈水；20-21min，45-65％乙腈水；21-22min，65-95％乙腈水；22-24min，95％乙腈水；24-26min，95-5％乙腈水；26-28min，5％乙腈水。
检测到上述甲基化黄烷醇生物碱I去质子化离子分子量为582.1586，保留时间为14.824min；甲基化黄烷醇生物碱II去质子化离子分子量为582.1556，保留时间为15.084min；甲基化黄烷醇生物碱III去质子化离子分子量为582.1558，保留时间为15.574min；甲基化黄烷醇生物碱IV去质子化离子分子量为582.1579，保留时间为16.618min；甲基化黄烷醇生物碱V去质子化离子分子量为566.1610，保留时间为18.578min；甲基化黄烷醇生物碱VI去质子化离子分子量为566.1604，保留时间为20.526min；甲基化黄烷醇生物碱VII去质子化离子分子量为566.1613，保留时间为20.703min。
本发明目的之五在于提出：上述甲基化黄烷醇生物碱在制备治疗肥胖药物中的应用。
优选地，上述甲基化黄烷醇生物碱在制备拮抗高糖所致线虫肥胖药物的应用。
本发明目的之六在于提出：一种用于治疗肥胖的药物，上述甲基化黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
优选地，药物剂型包括口服型、外用型和注射型。
优选地，口服剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂。
优选地，外用剂型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂。
优选地，注射剂型包括注射液、混旋液、冻干粉。
具体制备方法参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明提供的具有生物活性的甲基化黄烷醇生物碱对高糖诱导的秀丽隐杆线虫脂质积累有一定抑制作用，可以用于制备减肥药，对农业和医药领域具有重要的意义，为有效开发利用鄂茶1号炒青绿茶提供了更为广阔的前景。
2、本发明甲基化黄烷醇生物碱的提取/合成方法工艺简单，容易实施，成本较低，产率高，具有非常好的应用前景。
3、本发明甲基化黄烷醇生物碱的检测方法工艺简单，容易实施，准确率高，可用于寻找含有本发明甲基化黄烷醇生物碱的生物资源，增加了本发明甲基化黄烷醇生物碱获取路径，提高其利用度。
附图说明
图1为甲基化黄烷醇生物碱I-V提取分离流程图。
图2为甲基化黄烷醇生物碱III和IV体外合成流程图；(a)代表NaHCO3溶于DMF,CH3I，室温；(b)代表20％甲醇水，120℃。
图3为甲基化黄烷醇生物碱III和IV的合成过程样检测图。
图4为甲基化黄烷醇生物碱V-VII的体外合成流程图；(a)代表Na2B4O7溶于水，室温；(b)代表DMS,NaOH溶于水，pH 9.0，室温；(c)H2SO4，pH 2.0，室温。混合物1-3中R1＝甲基(Me)，R2＝H，R3＝H(V)，或R1＝H，R2＝Me，R3＝H(VI)，或R1＝H，R2＝H，R3＝Me(VII)。
图5-图11依次为甲基化黄烷醇生物碱I-VII紫外光谱UV图。
图12为甲基化黄烷醇生物碱I-VII和EGCG的实测CD谱。
图13-图17依次为甲基化黄烷醇生物碱I-V在鄂茶1号绿茶甲醇提取部位的离子二级离子碎片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明所用提取原料为绿茶，由鄂茶1号鲜叶加工制作而成，属于不发酵的炒青绿茶工艺。炒青绿茶的加工工艺主要包括，杀青、揉捻和炒干，常见的炒青绿茶包括西湖龙井、碧螺春和出口眉茶等。鄂茶1号(Camellia sinensiscv.Echa 1)是由湖北农业科学院果树研究所于1974～1992年以福鼎大白为母本，梅占为父本，采用杂交育种法育成，目前主要在湖北有栽培。利用机器采摘九月份的鄂茶1号鲜叶，制成炒青绿茶。从鄂茶1号炒青绿茶中研究开发出具有生物活性的生物成分，不仅对夏秋季茶树资源的开发利用提供解决方案，还能为天然成分药物的开发应用等领域做出重要贡献。
实施例1甲基化黄烷醇生物碱
甲基化黄烷醇生物碱的结构如式I、II、III、IV、V、VI或式VII所示结构表示：
式I所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱I。
式II所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-6-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱II。
式III所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(4-O-methyl)gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱III。
式IV所示的甲基化黄烷醇生物碱((+)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-gallocatechin-3-O-(4-O-methyl)gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱IV。
式V所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)，命名为甲基化黄烷醇生物碱V。
式VI所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(7-O-methyl)epicatechin-3-O-gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱VI。
式VII所示的甲基化黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(5-O-methyl)epicatechin-3-O-gallate)命名为甲基化黄烷醇生物碱VII。
实施例2提取甲基化黄烷醇生物碱
(1)取3.5kg炒青绿茶(鄂茶1号鲜叶加工制作而成)，对其粉碎处理，得到绿茶粉末；
(2)如图1所示，向绿茶粉末中加入15L石油醚，常温浸提24h，然后在70Hz下超声浸提2h，之后过滤得到滤液；按上述步骤浸提七次，通过减压蒸馏获得400g石油醚浸膏。
待绿茶粉末上的石油醚完全挥发后，继续加入15L乙酸乙酯，常温浸提24h，然后在70Hz下超声浸提2h，之后过滤得到滤液；按上述步骤浸提七次，通过减压蒸馏获得100g乙酸乙酯浸膏。
待绿茶粉末上的乙酸乙酯完全挥发后，继续加入15L甲醇，常温浸提24h，然后在70Hz下超声浸提2h，之后过滤得到滤液；按上述步骤浸提九次，通过减压蒸馏获得500g甲醇浸膏。
将甲醇浸膏置于通风橱内，使甲醇挥发，并逐渐加入水，置换为3L水浸提液。
用3L二氯甲烷对上述浸提液进行常温萃取，震荡摇匀并静置后，下层即为二氯甲烷萃取液，按上述步骤萃取五次，保留上层经二氯甲烷萃取后的母液，通过减压蒸馏浓缩获得300g水浸膏。
(3)如图1所示，将鄂茶1号炒青绿茶水部位浸膏经过MCI gel CHP20P柱层析，使用甲醇与水作为流动相，按照甲醇比水的体积比依次为0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、80:20和100:0进行梯度洗脱，收集合并得到C1-C6共6个组分。
其中C2组分是由50％甲醇水洗脱得到的，并通过Toyopearl HW-40F柱进行梯度洗脱，Toyopearl HW-40F柱采用与MCI gel CHP20柱相同的流动相及比例进行梯度洗脱，收集得到D1至D12共12个组分。
然后将50％甲醇水洗脱得到的D1至D2合并，通过Sephadex LH-20凝胶柱进行梯度洗脱，同之前一样以甲醇水作为流动相，随后收集并合并得到E1至E40共40个组分。将E19至E21组分合并，并采用Waters e2695高效液相色谱系统和半制备色谱柱进行制备分离。其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(5μm，9.4mm×250mm)柱，流速2mL/min，流动相为色谱级乙腈和超纯水。
甲基化黄烷醇生物碱I-IV的洗脱条件为：
| 时间 | 流动相 |
| 0-20min | 20％乙腈水 |
| 20-25min | 20-25％乙腈水 |
| 25-26min | 25-95％乙腈水 |
| 26-27.5min | 95％乙腈水 |
| 27.5-29min | 95-20％乙腈水 |
| 29-33min | 20％乙腈水 |
甲基化黄烷醇生物碱V-VII的洗脱条件为：
得到：
甲基化黄烷醇生物碱I((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)(保留时间为14.824min，质量10mg)；
甲基化黄烷醇生物碱II((–)-6-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)(保留时间为15.084min，质量3mg)；
甲基化黄烷醇生物碱III((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epigallocatechin-3-O-(4-O-methyl)gallate)(保留时间为15.574min，质量4mg)；
甲基化黄烷醇生物碱IV((+)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-gallocatechin-3-O-(4-O-methyl)gallate)(保留时间为16.618min，质量5mg)；
甲基化黄烷醇生物碱V((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate)(保留时间为18.578min，质量5mg)。
实施例3体外合成甲基化黄烷醇生物碱
3.1甲基化黄烷醇生物碱III和IV的体外合成，如图2和图3所示。
第一步，将2290mg EGCG和630mg碳酸氢钠(NaHCO3)溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入过量的碘甲烷(CH3I)500μL，在常温下搅拌反应33h，随后加入0℃冰水终止反应。用乙酸乙酯萃取反应液三次，将乙酸乙酯部位蒸发浓缩，通过硅胶进行梯度洗脱，流动相为二氯甲烷(CH2Cl2和甲醇(MeOH)，反应中间产物EGCG4"Me在CH2Cl2：MeOH＝18：1时被洗脱得到，共600mg。
第二步，取529mg和174mg L型茶氨酸，溶于20％甲醇水，120℃油浴加热，搅拌反应48h。反应混合物用Sephadex LH-20凝胶柱分离，以80％乙醇水为流动相进行等度洗脱。随后用高效液相色谱进行半制备纯化，纯化方法如上所述。得到甲基化黄烷醇生物碱III(质量60mg)；甲基化黄烷醇生物碱IV(质量70mg)。
3.2甲基化黄烷醇生物碱V-VII的体外合成，如图4所示。
以553mg黄烷醇生物碱etc-pyrrolidinone G和etc-pyrrolidinone H混合物为反应底物，溶于16mL去离子水，加入1007mg无水硼砂(Na2B4O7)，得到混合物1。
在常温下搅拌12h后，加入370μL硫酸二甲酯(DMS)，并用NaOH调节pH至9.0，得到混合物2，混合物2继续常温下反应12h，加入硫酸(H2SO4)调节pH至6.0。酸性条件下反应3h后得到混合物3，加入10倍体积的水终止反应。
用CH2Cl2萃取得到目标组分，随后蒸发浓缩，通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，以80％乙醇水为流动相进行等度洗脱。随后用高效液相色谱进行半制备纯化，纯化方法如上所述。
得到甲基化黄烷醇生物碱V(质量40mg)；甲基化黄烷醇生物碱VI((–)-8-(5″′R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(7-O-methyl)epicatechin-3-O-gallate)(保留时间为20.526min，质量35mg)；甲基化黄烷醇生物碱VII((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(5-O-methyl)epicatechin-3-O-gallate)(保留时间为20.703min，质量40mg)。
实施例4甲基化黄烷醇生物碱的性状验证
4.1甲基化黄烷醇生物碱I的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
211，276；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3388,2921,2851,1614,1457,1366,1224,1096,1039,938,821,765；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝582.1586([M-H]-，C29H28NO12 -理论计算值为582.1617)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
4.2甲基化黄烷醇生物碱II的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
210，275；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3424,2921,2851,1618,1456,1343,1213,1091,1022,996,825,766；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝582.1556([M-H]-，C29H28NO12 -计算值为582.1617)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
4.3甲基化黄烷醇生物碱III的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
212，276；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3397,2920,2851,1614,1456,1366,1383,1231,1058,818,766,720；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝582.1558([M-H]-，C29H28NO12 -计算值为582.1617)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
4.4甲基化黄烷醇生物碱IV的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
210，264；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3417,2920,2851,1617,1458,1384,1219,1105,1041,814,764,721；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝582.1579([M-H]-，C29H28NO12 -计算值为582.1617)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
4.5甲基化黄烷醇生物碱V的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
207，278；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3406,2918,2851,1618,1459,1384,1263,1263,1105,973,807,768；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝566.1610([M-H]-，C29H28NO11 -计算值为566.1668)；
5)、核磁共振光谱数据见表2。
4.6甲基化黄烷醇生物碱VI的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
212，277；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3416,2918,2851,1618,1466,1383,1210,1117,1060,972,806,769；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝566.1604([M-H]-，C29H28NO11 -计算值为566.1668)；
5)、核磁共振光谱数据见表2。
4.7甲基化黄烷醇生物碱VII的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、
207，277；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3386,2926,2852,1622,1450,1371,1213,1122,1039,969,872,769；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝566.1613([M-H]-，C29H28NO11 -计算值为566.1668)；
5)、核磁共振光谱数据见表2。
表1甲基化黄烷醇生物碱I-IV的核磁共振光谱数据
注：1H NMR在500MHz，13C NMR在125MHz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代DMSO，s为单峰，d为双重峰，m为多重峰。
表2甲基化黄烷醇生物碱V-VII的核磁共振光谱数据
注：1H NMR在600MHz，13C NMR在150MHz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代DMSO，s为单峰，d为双重峰，m为多重峰。
由上述结果和图5-图12可以看出，上述七个新化合物(甲基化黄烷醇生物碱)均通过紫外光谱UV、红外光谱IR及1H NMR、13C NMR、ESI-HR-MS、1H-1H COSY，HSQC、HMBC和NOESY等二维核磁共振谱归属，证明了其结构。
实施例5黄烷醇生物碱的检测方法
检测仪器设备：安捷伦UPLC6545系列Q-TOF液质谱联用仪(安捷伦科技中国有限公司)，ACQUITY
HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)。
茶样制备：将鄂茶1号鲜叶冻干后，与鄂茶1号炒青绿茶一同粉碎，得粉末状茶样，鲜叶与成品茶粉末均均设三个平行，每个样品称取9g茶粉，并先后采用9mL石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次作为预处理，以减少植物色素和咖啡因的干扰。然后用9mL70％甲醇水超声提取6h。浸提结束后将茶样浸提液过一次0.22μm滤膜后即得待分析样品液。
采用UPLC-Q-TOF-MS检测方法，流速0.2mL/min。流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈，洗脱条件为：0-5min，5-15％乙腈水；5-12min，15-20％乙腈水；12-17min，20-25％乙腈水；17-18min，25-35％乙腈水；18-20min，35-45％乙腈水；20-21min，45-65％乙腈水；21-22min，65-95％乙腈水；22-24min，95％乙腈水；24-26min，95-5％乙腈水；26-28min，5％乙腈水。在负离子，Auto MS/MS模式下，分析甲基化黄烷醇生物碱I-VII混标，并确定他们的保留时间和合适的碰撞能。之后用相同的洗脱条件，在Target MS/MS模式下，分析鄂茶1号绿茶茶样和鄂茶1号鲜叶样品。最终在两种茶叶样品中均检测到甲基化黄烷醇生物碱I-V。
如图13-图17所示，检测到：
甲基化黄烷醇生物碱I去质子化离子分子量为582.1586，保留时间为14.824min；
甲基化黄烷醇生物碱II去质子化离子分子量为582.1556，保留时间为15.084min；
甲基化黄烷醇生物碱III去质子化离子分子量为582.1558，保留时间为15.574min；
甲基化黄烷醇生物碱IV去质子化离子分子量为582.1579，保留时间为16.618min；
甲基化黄烷醇生物碱V去质子化离子分子量为566.1610，保留时间为18.578min；
混标样品中，甲基化黄烷醇生物碱VI去质子化离子分子量为566.1604，保留时间为20.526min；甲基化黄烷醇生物碱VII去质子化离子分子量为566.1613，保留时间为20.703min。甲基化黄烷醇生物碱VI和甲基化黄烷醇生物碱VII在上述两个茶叶样品中均尚未被检测到。
实施例6抑制脂质积累
NGM培养基配制：2.8g琼脂+0.5g氯化钠+0.42g胰蛋白胨+150mL娃哈哈水，120℃高压灭菌20min。
线虫同步化：将产卵期野生型秀丽隐杆线虫转至含灭活大肠杆菌的NGM培养基中，12h后转走成虫，留下卵，生长至L1期。
高糖诱导：L1期线虫转入含10毫摩尔葡萄糖的NGM培养基中，生长至L4期。
加药：L4期线虫转移至含化合物的NGM培养基中，进行给药培养四天，每隔一天转一次板。化合物溶于0.2％DMSO，包括：甲基化黄烷醇生物碱I-VII、奥利司他、EGCG和ECG，设置100μmol/L和200μmol/L两个浓度。
分组：BK组(不加糖，加0.2％DMSO)，对照组(加糖，加0.2％DMSO)，实验组(加糖，加药)。每组三个平行，每个平行30只虫。
油红O染色：用1％PBST(主要由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，吐温20等组成)将线虫从培养基中洗下，用4％多聚甲醛溶液在4℃下固定20min，再经-80℃，25℃，反复冻融三次。之后用60％异丙醇脱水，加入稀释后的油红O染料(500毫克油红O溶于100mL异丙醇配成源液，按原液：水＝3：2的体积比进行稀释)，过夜染色。最后洗去染料，在倒置荧光显微镜下观察染色情况。
线虫相对脂肪含量测定：用软件Image Pro Plus计算线虫的积分光密度值(IOD)及线虫虫体总面积(Area)，用MOD表示平均光密度值(MOD＝IOD/Area)。实验组及空白组的MOD值除以对照组的MOD值即为线虫的相对脂肪含量，用1-相对脂肪含量表示抑制率。
数据分析：所有数据通过软件GraphPad Prism 9.0分析，最终数值用平均值±标准差(mean±SD)表示，并通过Tukey检验分析数据之间的显著性差异。
表3不同化合物对高糖诱导的秀丽隐杆线虫脂质积累的抑制率
注：所有数据表示为平均值±标准差(mean±SD)，通过Tukey检验分析数据之间的显著性差异，p＝0.1234(ns)，p＝0.0332(*)，p＝0.0021(**)，p＝0.0002(***)，p<0.0001(****)，奥利司他为阳性对照。
实验结果表明，甲基化黄烷醇生物碱I-VII对高糖诱导下的线虫脂质积累均有显著的抑制效果。其中，在100μmol/L的浓度下，化合物VII的抑制率最高，达到67.19％，其次是化合物III和V，抑制率分别为50.68％和49.34％。
本发明所得7个甲基化黄烷醇生物碱在100μmol/L浓度下，抑制率均极显著高于常见儿茶素EGCG和阳性对照奥利司他。在200μmol/L浓度下时，化合物VI的抑制效果最佳，其次是化合物III和VII，他们的抑制率分别为73.50％，68.66％和67.39％。
相比于EGCG和ECG，本发明的甲基化黄烷醇生物碱I-VII抑制效果更好，且除了II和III，均显著优于奥利司他。相比较而言，7个甲基化黄烷醇生物碱在200μmol/L时的抑制率均高于其在100μmol/L时的抑制率。
现代人的饮食总是难以避开一些高糖食物，这带来了很大的肥胖风险。因此，通过抑制脂质积累，可以降低肥胖发生率。开发抑制脂质代谢，减低脂肪含量，对治疗人类肥胖等疾病具有重要意义。
因此，本发明所得甲基化黄烷醇生物碱可应用于制备减肥药，具体地说，是将本发明所得甲基化黄烷醇生物碱按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种降脂减肥药物。该药物剂型包括口服型、外用型和注射型等。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉等。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.甲基化黄烷醇生物碱，其特征在于，如下列结构式所示：
其中，R1＝-H或-CH3；
R2＝-H或
R3＝-H或
R4＝-H或-CH3；
R5＝-H或-OH；
R6＝-H或-CH3；
R7＝-H或-CH3；
其中，当R2＝-H时，则
当
时，则R3＝-H。
2.根据权利要求1所述甲基化黄烷醇生物碱，其特征在于，
当R5＝-OH时，则R6和R7中一基团为-H，另一基团为-CH3；
当R5＝-H时，则R7＝-H。
3.根据权利要求1所述甲基化黄烷醇生物碱，其特征在于，其具体结构式如式I-VII之一所示：
4.如权利要求1-3任一项所述甲基化黄烷醇生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以炒青绿茶为原料，粉碎处理得到绿茶粉末：
(2)依次采用石油醚、乙酸乙酯、甲醇分步浸提得到浸提液；
(3)对步骤(2)所得浸提液进行萃取处理和减压浓缩处理，得到膏状浸提物；
(4)对膏状浸提物进行分离纯化处理，得到所述甲基化黄烷醇生物碱。
5.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(3)中，对浸提液采用二氯甲烷进行萃取，保留上层萃取清液。
6.根据权利要求5所述提取方法，其特征在于，分离纯化处理具体操作如下：将膏状浸提物依次经过MCI gel CHP20P柱层析、Toyopearl HW-40F柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和反向高效液相色谱柱洗脱。
7.如权利要求1-3任一项所述甲基化黄烷醇生物碱的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
将表没食子儿茶素没食子酸酯和碳酸氢钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入过量的碘甲烷，常温搅拌反应32-34h，随后加入0℃冰水终止反应；萃取，浓缩，洗脱得到反应中间产物EGCG4"Me；将EGCG4"Me和L型茶氨酸溶于体积分数为18-22％的甲醇水溶液，115-125℃油浴加热，搅拌反应43-53h，分离，洗脱，纯化得到甲基化黄烷醇生物碱；
采用黄烷醇生物碱etc-pyrrolidinone G和etc-pyrrolidinone H混合物为反应底物，与无水硼砂混合溶于水得到混合物1；常温搅拌10-14h后，加入硫酸二甲酯，调节pH至9.0，得到混合物2；混合物2继续常温反应10-14h，加入硫酸调节pH至6.0；酸性条件下反应3h后得到混合物3，加入水终止反应；萃取，浓缩，分离，洗脱，纯化得到甲基化黄烷醇生物碱。
8.如权利要求1-3任一项所述甲基化黄烷醇生物碱的检测方法，其特征在于，采用UPLC-Q-TOF-MS方法，流速0.2mL/min，流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈；
洗脱条件如下：0-5min，5-15％乙腈水；5-12min，15-20％乙腈水；12-17min，20-25％乙腈水；17-18min，25-35％乙腈水；18-20min，35-45％乙腈水；20-21min，45-65％乙腈水；21-22min，65-95％乙腈水；22-24min，95％乙腈水；24-26min，95-5％乙腈水；26-28min，5％乙腈水。
9.如权利要求1-3任一项所述甲基化黄烷醇生物碱在制备治疗肥胖药物中的应用。
10.一种用于治疗肥胖的药物，其特征在于，如权利要求1-3任一项所述甲基化黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
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Citations (5)
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| JP2013124230A (ja) * | 2011-12-14 | 2013-06-24 | Morinaga & Co Ltd | アルキル誘導体製造方法 |
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Patent Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN1980655A (zh) * | 2004-07-05 | 2007-06-13 | 三得利株式会社 | 脂肪酶抑制剂 |
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| 王翠云等: "肥胖儿童血清晚期糖基化终产物水平测定及意义", 《山东医药》, vol. 52, no. 23, pages 51 - 52 * |
Also Published As
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