CN115044483A - 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用 - Google Patents

青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115044483A
CN115044483A CN202210564272.9A CN202210564272A CN115044483A CN 115044483 A CN115044483 A CN 115044483A CN 202210564272 A CN202210564272 A CN 202210564272A CN 115044483 A CN115044483 A CN 115044483A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methanol
curvularin
rice
penicillium
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210564272.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115044483B (zh
Inventor
王鸿
范晔
应优敏
陈建伟
章华伟
魏斌
俞琰垒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN202210564272.9A priority Critical patent/CN115044483B/zh
Publication of CN115044483A publication Critical patent/CN115044483A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115044483B publication Critical patent/CN115044483B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D313/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than six members having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/08—Oxygen as only ring hetero atoms containing a hetero ring of at least seven ring members, e.g. zearalenone, macrolide aglycons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种青霉菌(Penicillium sp.)W21C371及其在发酵制备弯孢霉菌素中的应用。本发明首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度弯孢霉菌素的方法，使得弯孢霉菌素产率达到3.87g/kg大米，纯度达到98.34％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力，为弯孢霉菌素的制备提供了新的途径。

Description

青霉菌W21C371及其在制备弯孢霉菌素中的应用
(一)技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种青霉菌(Penicillium sp.)W21C371及其在微生物发酵法制备弯孢霉菌素中的应用，可为弯孢霉菌素的工业化生产提供新的菌株与方法。
(二)背景技术
苯二酚内酯类化合物是一类结构多样的真菌聚酮类次级代谢产物，广泛分布于旋鲍腔菌属、弯孢霉属、镰刀菌属、腐质霉属、二孢属、青霉属和普可尼亚属等真菌，其结构共性为具有间二羟基苯环-大环内酯环桥联母核。根据苯环和大环内酯骈合位置的不同，苯二酚内酯类化合物又可分为二羟基苯甲酸内酯和二羟基苯乙酸内酯两类，前者的苯环与内酯环的α、β为骈合，二后者的苯环与内酯环的β、γ位骈合。药效药理学研究表明，苯二酚内酯类化合物具有显著的热休克蛋白90(Heat Shock Protein 90,Hsp90)和激酶抑制活性，在抗肿瘤药物研发领域展现出了良好的应用前景。此外，该类化合物还表现出了良好的受体拮抗、杀线虫、免疫调节等活性，吸引了研究人员的广泛关注。
弯孢霉菌素，分子式为C16H20O5，相对分子质量292，熔点206℃，其化学结构式I如下所示：
Figure BDA0003657166690000011
弯孢霉菌素及其类似物是典型的二羟基苯乙酸内酯类化合物，主要由链格孢属、曲霉属、弯孢霉属、青霉属真菌产生，其结构特征为具有与间苯二酚骈合的12元内酯。弯孢霉菌素具有抗菌、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制、抗炎、抗氧化、除草等活性。因此，绿色、环保、高效、便捷的弯孢霉菌素规模化制备方法，可为以弯孢霉菌素类化合物为先导的创新药物研制提供原料。
截至目前，弯孢霉菌素的规模化制备方法鲜有报道。CN 110438193 A公开了一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法。该专利利用一株高产脱氢弯孢霉菌素的曲霉属真菌与一株半伏小薄孔菌混合发酵制备弯孢霉菌素。该方法首先需分别单独培养两株真菌制备种子液，然后再严格控制两种子液接种比例，接种过程相对繁琐，工艺较难控制。此外，由于采用混合菌发酵，发酵产物中干扰性代谢产物较多，增加后续目标产物分离纯化的难度。
(三)发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，另辟蹊径，提供一株新菌株——青霉菌(Penicillium sp.)W21C371及其在制备弯孢霉菌素中的应用，以海洋来源真菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到菌株Penicillium sp.W21C371，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，以高产率获得高纯度弯孢霉菌素(curvularin)，解决了现有技术的缺陷。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种海洋来源真菌新菌株——青霉菌(Penicillium sp.)W21C371，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为CCTCC NO：M2022063，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供了一种青霉菌W21C371在发酵制备弯孢霉菌素中的应用，所述应用的方法为：(1)将青霉真菌W21C371接种至大米固体培养基，在20-30℃条件下暗培养15-30天(优选28℃、20天)，获得大米发酵产物；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1-5mL/g(优选1.35mL/g)；(2)将大米发酵产物(优选捣碎)中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析(优选直径d＝4cm，高h＝60cm)，以体积浓度20-100％甲醇-水为洗脱液，收集体积浓度70％的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行胶柱层析(优选硅胶100-200目，直径d＝4cm，高h＝60cm)，以体积比为50:1、40:1、30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比40:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，即得到式(Ⅰ)所示的弯孢霉菌素；
Figure BDA0003657166690000031
优选的，步骤(1)所述青霉菌W21C371接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1-1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将青霉菌W21C371接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用体积浓度2％吐温80无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1×105-1×108个/mL，优选1×106个/mL；所述PDA培养基组成为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
优选的，步骤(1)中发酵培养条件为：28℃条件下暗培养20天。
优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2～8mL/g(优选5-6mL/g)；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天。
优选的，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5mL/g(优选3.1mL/g)；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-3；萃取3-5次，每次萃取用的有机溶剂与水体积比优选1:1。
优选的，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速10-20mL/min(优选15mL/min)；收集体积比70:30的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；所述甲醇体积用量以萃取物浸膏质量计为1-5mL/g(优选1.5mL/g)。
优选的，步骤(5)方法为：将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，依次以体积比为50:1、40:1、30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速10-20mL/min；收集体积比40:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，即得弯孢霉菌素；所述甲醇的体积用量以浓缩物质量计为1-5mL/g(优选1.3mL/g)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供一种经多年实验筛选获得的保藏编号为CCTCC M 2022063的海洋来源新菌株——青霉菌Penicillium sp.W21C371，并首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度弯孢霉菌素的方法，使得弯孢霉菌素产率达到3.87g/kg大米，纯度可达到98.34％，该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法为弯孢霉菌素规模化制备提供了新的途径，且为以弯孢霉菌素为先导化合物的创新药物研制奠定了基础。
(四)附图说明
图1是Penicillium sp.W21C371的菌落。
图2是弯孢霉菌素的1H-NMR谱图。
图3是弯孢霉菌素的13C-NMR谱图。
图4是弯孢霉菌素的高效液相色谱图。
(五)具体实施方式
本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所述室温是指25-30℃。所述PDA培养基组成为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
实施例1、菌株W21C371的筛选
1、样品的采集
样品为2017年1月从太平洋海域采集的原样海水。
2、菌株的分离
在无菌操作条件下，将海水用超滤膜(孔径为0.01μm)进行抽滤，滤毕将超滤膜过滤面朝上平放在PDA平板培养基上，于28℃暗培养3～7天，期间连续观察，有菌落长出，即用无菌棉棒挑取菌丝转入PDA平板培养基上继续培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA平板培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，，记为菌株W21C371。
实施例2菌株W21C371的鉴定
1、菌株形态特征
将实施例1筛选的菌株W21C371接入PDA培养基斜面，28℃暗培养4-7天，转至4℃冰箱内保存备用。菌落形态见图1所示。
如图1所示，培养起初，菌株W21C371菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养4-7天，菌落即铺满整皿，菌落呈墨绿色、干燥、不透明、边缘不平常，背面呈黄色。
2、分子生物学鉴定
(1)基因组DNA的提取
使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型，北京擎科生物科技有限公司)提取菌株W21C371基因组DNA，具体步骤如下：
1)将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μL Buffer BL，12000rpm离心1min活化硅胶膜；
2)挑取实例1平板上菌株W21C371于1.5mL离心管内，加入400μL Buffer gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴20min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
3)加入150μL Buffer gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min；
4)12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；
5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃废液；
6)向Spin Column中加入500μL Buffer Pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；
7)向Spin Column中加入500μL Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；
8)重复操作步骤7；
9)将Spin Column放回Collection Tube中，12000rpm离心2min，开盖晾干1min；
10)取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加75μL TEBuffer(65℃预热TE Buffer)，20℃放置2min，12,000rpm离心2min，获得基因组DNA。。
(2)ITS区序列的PCR扩增
1)引物序列如下：
ITS1:5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’
ITS4:5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’
2)PCR反应体系
PCR体系(50μL)构成为：基因组DNA模板(10P)1μL，Primer 1(10P)2μL，Primer 2(10P)2μL，1×TSE101金牌mix 45μL。
3)PCR程序设定为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸5min。
4)PCR扩增产物电泳纯化与测序
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μL样品+6μL溴酚蓝)，300V电压下12分钟。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经DNA凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。纯化产物由北京擎科生物科技有限公司采用Sanger法测序，测得ITS碱基序列(SEQ ID NO.1)为：
AACTTCCTTTGAAAGTAAAAAATGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGAGGGCCCCTCGGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTAACGAACCTTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTCCTGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCCCCCCCCTTGAACGCTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGAAACTAGCTAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCCCCTCTGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCAACCCTAAATTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGGAAGAAAA。
(3)数据处理
序列数据在美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA，NCBI)的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与GenBank中的序列比较，鉴定该菌株W21C371为青霉菌，命名为青霉菌(Penicillium sp.)W21C371，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为CCTCCNO:M 2022063，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例3青霉菌W21C371发酵制备弯孢霉菌素
1、菌株活化
取出保存于-80℃冰箱的Penicillium sp.W21C371菌株冻存管，于4℃解冻后，在超净台内用无菌棉棒从冻存管蘸取适量孢子悬液，接种至PDA培养基，于28℃恒温培养箱中静置培养7天，进行菌种活化。
2、菌株发酵
活化7天后，用10mL含有体积浓度2％吐温80的无菌水将菌株孢子洗下，置于装有100mL含体积浓度2％吐温80的无菌水中，得到孢子悬液(孢子浓度为1×106个/mL)；分别移取1mL孢子悬液，接种至45个装有大米培养基(大米100g，蒸馏水135mL，于121℃高温灭菌20min后，冷却)的1L三角瓶中，于28℃恒温暗培养20天，获得45瓶大米发酵产物。
3、弯孢霉菌素的提取分离
1)将步骤2制备的45瓶大米发酵产物混合并捣碎，加入95％乙醇20升室温浸提4天，过滤，滤饼重复浸提3次(每次加入3升95％乙醇，每次4天)，合并提取液并经减压浓缩至干，得提取物浸膏550g。
2)将步骤1)提取物浸膏(550g)用1.5L蒸馏水悬浮，用乙酸乙酯萃取，每次1.5L，共萃取3次，合并乙酸乙酯相，并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏64g。
3)将步骤2)乙酸乙酯萃取物浸膏64g溶解于100mL甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析(直径d＝4cm，高h＝60cm)，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1.5L(2个柱体积)，流速15mL/min；收集甲醇/水＝70:30(v/v)的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得浓缩物27g。
4)将步骤3)中的浓缩物27g用35mL的甲醇溶解后进行硅胶柱层析(硅胶100-200目，直径d＝4cm，高h＝60cm)，依次以体积50:1、40:1、30:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1.5L(2个柱体积)，流速15mL/min；收集二氯甲烷/甲醇＝40:1(v/v)的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得到白色粉末17.4g，即得式(I)所示化合物，产率达到3.87g/kg大米。
4、步骤3制备的白色粉末产物的结构鉴定
弯孢霉菌素：白色粉末。如图2、图3所示，其1H-NMR和13C-NMR数据如下：1H-NMR(600MHz,CDCl3)δH 1.11(3H,d,J＝6.4Hz,Me-15),1.25(1H,m,Ha-12),1.29(1H,m,Ha-13),1.39(1H,m,Hb-12),1.43(1H,m,Ha-14),1.47(1H,m,Hb-13),1.56(1H,m,Ha-11),1.59(1H,m,Hb-14),1.73(1H,m,Hb-11),2.75(1H,ddd,J＝2.8,9.6,15.6Hz,Ha-10),3.21(1H,ddd,J＝2.7,8.9,15.3Hz,Hb-10),3.61(1H,d,J＝15.8Hz,Ha-2),3.86(1H,d,J＝15.7Hz,Hb-2),4.91(1H,m,H-15),6.23(1H,d,J＝2.3Hz,H-4),6.26(1H,d,J＝2.3Hz,H-6)。13C-NMR(150MHz,CDCl3)δC 20.5(Me-15),23.8(C-11),24.9(C-13),27.7(C-12),33.0(C-14),40.5(C-2),44.6(C-10),73.8(C-15),102.7(C-6),112.2(C-4),120.9(C-8),137.2(C-3),159.5(C-7),161.2(C-5),172.8(C-1),209.8(C-9)。以上波谱数据与文献(Aust.J.Chem.,1993,46,571-575)报道的弯孢霉菌素一致。因此，步骤3制备的白色粉末即为式(I)所示弯孢霉菌素。
5、弯孢霉菌素的纯度检测
1)将上述步骤3制备所得的弯孢霉菌素用甲醇溶解，定量稀释配制成浓度为100μg/mL的样品溶液。
2)取样品溶液进行高校液相色谱分析，色谱条件如下。仪器：Agilent1200series；色谱柱：Cosmosil 5C18-PAQ(4.6mm I.D.×250mm)；流动相:乙腈-水(40:60,v/v)；流速：1mL/min；检测波长：225nm；进样量：20μL；柱温：室温。检测记录色谱图。
3)待测样品的高效液相色谱检测结果如图4所示。弯孢霉菌素的保留时间为11.491min，峰面积分析其纯度达98.34％。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 青霉菌W21C371及其在制备弯孢霉菌素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
aacttccttt gaaagtaaaa aatgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc 60
attactgagt gagggcccct cggggtccaa cctcccaccc gtgtttaacg aacctttgtt 120
gcttcggcgg gcccgcctca cggccgccgg ggggctcctg cccccgggcc cgcgcccgcc 180
gaagcccccc ccttgaacgc tgtctgaagt ttgcagtctg agaaactagc taaattagtt 240
aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 300
taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc 360
tctggtattc cggagggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgccctcaag cacggcttgt 420
gtgttgggcc cccgtccccc cctctgccgg ggggacgggc ccgaaaggca gcggcggcac 480
cgcgtccggt cctcgagcgt atggggcttc gtcacccgct cttgtaggcc cggccggcgc 540
cagccgaccc caaccctaaa tttttttcag gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc 600
tgaacttaag catatcaaaa ggcgggaaga aaa 633

Claims (10)

1.青霉菌(Penicillium sp.)W21C371，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为CCTCC NO：M 2022063，地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种权利要求1所述的青霉菌W21C371在发酵制备弯孢霉菌素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述弯孢霉菌素按如下步骤制备：(1)将青霉菌W21C371接种至大米固体培养基，在20-30℃条件下暗培养15-30天，获得大米发酵产物；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1-5mL/g；(2)将大米发酵产物中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，以体积浓度20-100％甲醇-水为洗脱液，收集体积浓度70％的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比为50:1、40:1、30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比40:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，即得到式(Ⅰ)所示弯孢霉菌素；
Figure FDA0003657166680000011
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述青霉菌W21C371接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1-1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将青霉菌W21C371接种至PDA培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用体积浓度2％吐温80无菌水重悬，得到菌悬液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中发酵培养条件为：28℃条件下暗培养20天。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2-8mL/g。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5mL/g；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-3；萃取3-5次。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速10-20mL/min；收集体积比70:30的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(5)方法为：将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，依次以体积比为50:1、40:1、30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速10-20mL/min；收集体积比40:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部位，减压浓缩至干，即得弯孢霉菌素。
CN202210564272.9A 2022-05-23 2022-05-23 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用 Active CN115044483B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210564272.9A CN115044483B (zh) 2022-05-23 2022-05-23 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210564272.9A CN115044483B (zh) 2022-05-23 2022-05-23 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115044483A true CN115044483A (zh) 2022-09-13
CN115044483B CN115044483B (zh) 2023-09-05

Family

ID=83159751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210564272.9A Active CN115044483B (zh) 2022-05-23 2022-05-23 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115044483B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013105909A1 (ru) * 2012-01-12 2013-07-18 Gavrilov Valeriy Aleksandrovych Применение курвуларина и анальцима в производстве средства с фунгицидным действиеем, композиция и способ ее получения (варианты)
WO2013151519A1 (ru) * 2011-09-14 2013-10-10 Gavrilov Valeriy Aleksandrovych Штамм гриба penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларина
CN103435590A (zh) * 2013-07-22 2013-12-11 中国科学院海洋研究所 一种弯孢霉菌素类衍生物及其制备方法和应用
US20210177796A1 (en) * 2017-11-16 2021-06-17 Korea Insititute Of Ocean Science And Technology Composition for preventing or treating inflammatory diseases, containing marine fungus penicillium sp. sf-5859-derived curvularin-type metabolites

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151519A1 (ru) * 2011-09-14 2013-10-10 Gavrilov Valeriy Aleksandrovych Штамм гриба penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларина
WO2013105909A1 (ru) * 2012-01-12 2013-07-18 Gavrilov Valeriy Aleksandrovych Применение курвуларина и анальцима в производстве средства с фунгицидным действиеем, композиция и способ ее получения (варианты)
CN103435590A (zh) * 2013-07-22 2013-12-11 中国科学院海洋研究所 一种弯孢霉菌素类衍生物及其制备方法和应用
US20210177796A1 (en) * 2017-11-16 2021-06-17 Korea Insititute Of Ocean Science And Technology Composition for preventing or treating inflammatory diseases, containing marine fungus penicillium sp. sf-5859-derived curvularin-type metabolites

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. F. VESONDER等: "Curvularin from Penicillium baradicum baghdadi NRRL 3754, and biological effects", JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE AND HEALTH, vol. 11, no. 4, pages 289 - 297, XP055082003, DOI: 10.1080/03601237609372044 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115044483B (zh) 2023-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753627B (zh) 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤剂中的应用
CN108660082B (zh) 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用
WO2016179735A1 (en) A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
CN107868757B (zh) 一种植物内生真菌及其应用
CN110863021B (zh) 一种细胞松弛素类化合物的制备方法和应用
CN111411045B (zh) 一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其制备方法
CN109810919B (zh) 一类安莎全碳环聚酮类抗生素及其在制备抗菌药物或抗肿瘤药物中的应用
CN108484626B (zh) 螺环化蒽醌类化合物及其制备方法和在制备钙通道激动剂中的应用
CN115044483B (zh) 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用
CN115261235B (zh) 土曲霉f6-3及其在制备6-羟基芦荟大黄素-8-甲醚中的应用
CN114058516B (zh) 一株海洋来源产布雷菲德菌素a青霉真菌n29及其应用
CN110790660B (zh) 一种聚酮化合物、制备方法、菌株及应用
CN114806888B (zh) 花斑曲霉zjute2及其在制备杂色曲霉毒素中的应用
CN110527632B (zh) 一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用
CN104004065B (zh) 一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法
CN112479799A (zh) 一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法
CN107354182B (zh) 一种灰毛豆内生真菌发酵制备(r)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法
CN110563740A (zh) 一种ɑ-吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用
CN113444737A (zh) 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用
CN105524848B (zh) 一株产抗病毒活性物质的真菌菌株及其应用
CN114934084B (zh) 一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法
CN114317296B (zh) 一种贝第高林的制备方法
CN115677634B (zh) 一种具有抗癌功能的红曲黄色素
CN111321083B (zh) 一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其在抗肿瘤剂中的应用
CN115043748B (zh) 一种长链脂肪酸甘油醇类化合物、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant