CN115040557A - 一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法 - Google Patents

一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，属于植物黄酮提取技术领域。本发明通过特定的酶解、灭酶、超声、离心等步骤，克服了现有技术中提取方法得率较低、活性成分损失等问题。本发明提供的中亚苦蒿总黄酮提取方法得到的总黄酮得率可达4.75％，提取得到的总黄酮中含有41种有效化合物，能够有效抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡。

Description

一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法
技术领域
本发明涉及植物黄酮提取技术领域，尤其涉及一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法。
背景技术
中亚苦蒿，属桔梗目，菊科，俗称艾草。它是一种重要的多年生药用植物，在我国主要分布在新疆、四川、云南等地。此外，中亚苦蒿中含有丰富的次生代谢产物，包括黄酮类、生物碱、酚类、萜类及衍生物等。具有多种药理活性(例如抗菌、抗炎、抗病毒、保肝、降血糖和心血管疾病等)，它还显示出广泛的抗氧化和抗癌作用。
生物总黄酮也称黄酮类化合物，是一种天然的植物成分。已从植物中鉴定和分离出8000多种，其结构通过两个酚羟基的苯环(A环和B环)，以三碳键相互连接所形成的一系列(C6-C3-C6)化合物。依据结构多样性可分为6类黄酮类、异黄酮类、萜类、生物碱类、花青素类。越来越多的研究报道，黄酮类化合物在肿瘤的治疗与预防方面具有显著作用。这归因于它们多样的结构和广泛的活性(如抗炎、抗氧化、抗高血脂等)。目前，黄酮类化合物提取方法主要包括加热回流提取法、有机溶剂萃取法、微波辅助提法、超声辅助法、酶解法等。
发明人日前研究发现，传统提取方法工艺设备虽然比较简单，但提取的时间长、效率不高，且易在高温下破坏热不稳定成分使其降解，并且由于中亚苦蒿中总黄酮的含量较低且及其复杂，不能实现较高得率，提取出的总黄酮活性较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，用以解决现有技术中提取方法得率较低、活性成分损失等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，包括如下步骤：
将中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液、复合酶混合，进行酶解，得到酶解液；
将酶解液依次进行灭酶、超声、离心，所得上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
优选的，所述中亚苦蒿粉末的粒径为90以下μm。
优选的，所述中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液的质量体积比为1g:20～30mL；
所述乙醇水溶液的质量体积浓度为80～100％。
优选的，所述复合酶的添加量为中亚苦蒿粉末质量的1.5～2.5％。
优选的，所述复合酶的种类为纤维素酶和果胶酶；
所述纤维素酶和果胶酶的添加比例为1:0.5～0.7。
优选的，所述纤维素酶的酶活为40～60U/mg，所述果胶酶的酶活为400～600U/mg。
优选的，所述酶解的pH为3～4，所述酶解的温度为40～50℃，所述酶解的时间为100～110min。
优选的，所述灭酶的温度为80～120℃，所述灭酶的时间为3～8min。
优选的，所述超声的功率为50～150W，所述超声的温度为20～40℃，所述超声的时间为10～30min。
优选的，所述离心的转速为10000～14000r/min，所述离心的时间为5～15min。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供的中亚苦蒿总黄酮提取方法得到的总黄酮得率可达4.75％，提取得到的总黄酮生物活性更高，其中含有41种有效化合物，能够有效抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡。
附图说明
图1为标准曲线；
图2为不同超声温度组比较结果图；
图3为不同纤维素酶和果胶酶比例组比较结果图；
图4为不同复合酶用量组比较结果图；
图5为不同酶解pH组比较结果图；
图6为不同乙醇体积百分数组比较结果图；
图7为不同料液比组比较结果图；
图8为不同酶解温度组比较结果图；
图9为不同酶解时间组比较结果图；
图10为中亚苦蒿总黄酮的离子流色谱图；
图11为总黄酮中各化合物结构式；
图12为不同浓度总黄酮处理H8、HeLa和SiHa细胞24h后的细胞活力图；
图13为不同浓度总黄酮处理HeLa细胞24h后的细胞形态图；
图14为不同浓度总黄酮处理HeLa细胞24h后细胞凋亡图A；
图15为不同浓度总黄酮处理HeLa细胞24h后细胞凋亡图B。
具体实施方式
本发明提供了一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，包括如下步骤：
将中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液、复合酶混合，进行酶解，得到酶解液；
将酶解液依次进行灭酶、超声、离心，所得上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
在本发明中，中亚苦蒿粉末优选由中亚苦蒿常温干燥后粉碎制得，所述中亚苦蒿粉末的粒径优选为90μm以下，进一步优选为70μm以下，以过筛目数计算粒径优选为200目以下，所述粉碎优选采用高速万能粉碎机进行。
在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为80～100％，进一步优选为85～95％，所述中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液的质量体积比优选为1g:20～30mL，进一步优选为1g:24～28mL；所述复合酶的种类优选为纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的添加比例优选为1:0.5～0.7，进一步优选为1:0.65～0.68，所述纤维素酶的酶活优选为40～60U/mg，进一步优选为45～55U/mg，所述果胶酶的酶活为400～600U/mg，进一步优选为450～550U/mg，还优选为480～520U/mg；所述复合酶的添加量优选为中亚苦蒿粉末质量的1.5～2.5％，进一步优选为中亚苦蒿粉末质量的1.8～2.2％；本发明所述酶解的pH优选为3～4，进一步优选为3.2～3.6，所述酶解的温度优选为40～50℃，进一步优选为43～47℃，所述酶解的时间优选为100～110min，进一步优选为103～107min；本发明在酶解过程中优选每20～40min混匀一次。
在本发明中，酶解后进行灭酶，所述灭酶的温度优选为80～120℃，进一步优选为90～110℃，所述灭酶的时间优选为3～8min，进一步优选为5～7min，所述灭酶优选采用水浴法进行。
在本发明中，灭酶后进行超声，所述超声的功率优选为50～150W，进一步优选为80～120W，所述超声的温度优选为20～40℃，进一步优选为25～35℃，所述超声的时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min；所述超声之后进行离心，所述离心的转速优选为10000～14000r/min，进一步优选为11000～13000r/min，所述离心的时间优选为5～15min，进一步优选为8～12min，离心所得上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入30mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在45℃、pH3.5条件下进行水浴酶解105min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
实施例2
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取4.0g中亚苦蒿粉末，加入120mL的无水乙醇，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2.2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH4.0条件下进行水浴酶解110min，期间每30min混匀一次，然后120℃水浴灭酶8min，在120W、30℃条件下对样品进行超声处理30min，最后对超声处理的样品溶液以14000r/min的转速离心15min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
实施例3
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取1.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为80％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入1.8％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在40℃、pH3.0条件下进行水浴酶解100min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶3min，在50W、20℃条件下对样品进行超声处理10min，最后对超声处理的样品溶液以10000r/min的转速离心5min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例1
其他步骤参数与实施例1保持一致，将超声温度替换为10℃。
对比例2
其他步骤参数与实施例1保持一致，将超声温度替换为20℃。
对比例3
其他步骤参数与实施例1保持一致，将超声温度替换为40℃。
对比例4
其他步骤参数与实施例1保持一致，将超声温度替换为50℃。
对比例5
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入1％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝1:3，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH4.0条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例6
其他步骤参数与对比例5保持一致，将纤维素酶和果胶酶的比例替换为2:3。
对比例7
其他步骤参数与对比例5保持一致，将纤维素酶和果胶酶的比例替换为1:1。
对比例8
其他步骤参数与对比例5保持一致，将纤维素酶和果胶酶的比例替换为3:2。
对比例9
其他步骤参数与对比例5保持一致，将纤维素酶和果胶酶的比例替换为3:1。
对比例10
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入0.5％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH4.0条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例11
其他步骤参数与对比例10保持一致，将复合酶用量替换为中亚苦蒿粉末的1％。
对比例12
其他步骤参数与对比例10保持一致，将复合酶用量替换为中亚苦蒿粉末的1.5％。
对比例13
其他步骤参数与对比例10保持一致，将复合酶用量替换为中亚苦蒿粉末的2％。
对比例14
其他步骤参数与对比例10保持一致，将复合酶用量替换为中亚苦蒿粉末的2.5％。
对比例15
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH3.0条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例16
其他步骤参数与对比例15保持一致，将酶解pH替换为3.5。
对比例17
其他步骤参数与对比例15保持一致，将酶解pH替换为4.0。
对比例18
其他步骤参数与对比例15保持一致，将酶解pH替换为4.5。
对比例19
其他步骤参数与对比例15保持一致，将酶解pH替换为5.0。
对比例20
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为10％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH3.5条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例21
其他步骤参数与对比例20保持一致，将乙醇的体积百分数替换为30％。
对比例22
其他步骤参数与对比例20保持一致，将乙醇的体积百分数替换为50％。
对比例23
其他步骤参数与对比例20保持一致，将乙醇的体积百分数替换为70％。
对比例24
其他步骤参数与对比例20保持一致，将乙醇的体积百分数替换为85％。
对比例25
其他步骤参数与对比例20保持一致，将乙醇的体积百分数替换为100％。
对比例26
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入20mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在50℃、pH3.5条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例27
其他步骤参数与对比例26保持一致，将中亚苦蒿粉末与乙醇的料液比替换为1g:12mL。
对比例28
其他步骤参数与对比例26保持一致，将中亚苦蒿粉末与乙醇的料液比替换为1g:15mL。
对比例29
其他步骤参数与对比例26保持一致，将中亚苦蒿粉末与乙醇的料液比替换为1g:18mL。
对比例30
其他步骤参数与对比例26保持一致，将中亚苦蒿粉末与乙醇的料液比替换为1g:20mL。
对比例31
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入30mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在35℃、pH3.5条件下进行水浴酶解90min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例32
其他步骤参数与对比例31保持一致，将酶解温度替换为40℃。
对比例33
其他步骤参数与对比例31保持一致，将酶解温度替换为45℃。
对比例34
其他步骤参数与对比例31保持一致，将酶解温度替换为50℃。
对比例35
其他步骤参数与对比例31保持一致，将酶解温度替换为55℃。
对比例36
将中亚苦蒿常温干燥后，采用高速万能粉碎机粉碎为200目，称取2.0g中亚苦蒿粉末置于50mL离心管中，加入30mL浓度为85％的乙醇溶液，根据中亚苦蒿粉末的质量比例加入2％的复合酶(纤维素酶和果胶酶＝3:2，纤维素酶的酶活为50U/mg，果胶酶的酶活为500U/mg)，在45℃、pH3.5条件下进行水浴酶解60min，期间每30min混匀一次，然后100℃水浴灭酶5min，在100W、30℃条件下对样品进行超声处理20min，最后对超声处理的样品溶液以12000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
对比例37
其他步骤参数与对比例36保持一致，将酶解时间替换为75min。
对比例38
其他步骤参数与对比例36保持一致，将酶解时间替换为90min。
对比例39
其他步骤参数与对比例36保持一致，将酶解时间替换为105min。
对比例40
其他步骤参数与对比例36保持一致，将酶解时间替换为120min。
实验例1检测总黄酮得率
1.1标准曲线绘制
以槲皮素作为黄酮共轭体系结构的代表，进行标准曲线绘制，方法如下：
精密称取槲皮素5.0mg，用甲醇定容至25mL，得到质量浓度为0.2mg/mL标准溶液，置于冰箱中，4℃保存待用。精密量取槲皮素对照溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，分别置于10mL容量瓶中，采用三氯化铝-乙酸钾显色法，各加入0.1mol/mLAlCl3溶液2mL，放置6min，再加入1mol/mL KAc溶液3mL，最后用甲醇溶液定容至刻度后混匀，静置15min。以不含槲皮素的相应溶液作为空白对照，吸取100μL，测定溶液在415nm处吸光度。以吸光度(y)为纵坐标、槲皮素浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，如图1所示。所得中亚苦蒿中总黄酮的线性回归方程为：y＝9.7675x-0.0164，线性相关系数R2＝0.9974，由数据分析得出标准品具有良好的线性关系。
1.2总黄酮得率检测
将实施例1、对比例1～40得到的上清液转移到5mL的新的离心管中，并通过三氯化铝-乙酸钾法在415nm下检测总黄酮提取液的吸光度值(A)，带入标准曲线回归方程计算总黄酮浓度，再换算成黄酮提取量以及提取率：
总黄酮提取量(mg/g)＝C×V×N/M
C：测得总黄酮的浓度(mg/mL)；
V：提取液体积(mL)；
N：稀释倍数；
M：原料质量(g)。
按照单一变量的不同，以实施例1、对比例1～4为一组；对比例5～9为一组；对比例10～14为一组；对比例15～19为一组；对比例20～25为一组；对比例26～30为一组；对比例31～35为一组；对比例36～40为一组，将其得率进行对比，绘制为折线图，结果如图2～9所示(为方便比较，横坐标按照对应单一变量大小排序)。
由图2可知，采用本发明技术方案参数得到的总黄酮得率达最高，可达到4.75％。其中，超声温度的提高对中亚苦蒿总黄酮提取有一定的促进作用。随着超声温度的延长，中亚苦蒿总黄酮提取率先增加后减小，这可能因为温度升高加快了分子间的运动，总黄酮类物质在提取溶剂中的扩散、溶解能力增强。其次，升高超声温度，能更好地破坏细胞壁，使得细胞内容物总黄酮溶出增加，随之总黄酮得率逐渐提高。然而，温度过高时，加剧了提取溶剂的挥发，使乙醇浓度降低，从而影响提取效果。另外，过高的温度导致总黄酮等物质的结构被破坏，同时加快了黄酮类物质的分解速率，使得总黄酮得率减少。
由图3可知，采用本发明提供的纤维素酶和果胶酶的配比，总黄酮得率最高，纤维素酶添加比例继续增加时，总黄酮得率呈下降趋势。可能是随着纤维素酶的比例增加，能更好地破坏中亚苦蒿的细胞壁及细胞间质，使得细胞中的总黄酮等活性成分更好地溶出，但随着纤维素酶比例的增加，底物浓度不能对复合酶达到饱和，复合酶的作用受到抑制，导致中亚苦蒿总黄酮得率并没有增加。
由图4可知，采用本发明提供的复合酶用量，总黄酮得率最高，复合酶用量进一步提高，总黄酮得率呈现下降趋势。可能是随着复合酶用量的增加能更好地破坏细胞壁，有助于总黄酮的溶出，总黄酮得率逐渐增加；随着复合酶的用量的进一步增加，底物浓度不能使酶达到饱和，导致了酶的作用受到抑制，总黄酮得率不再增加。
由图5可知，采用本发明提供的酶解pH，黄酮得率最高，pH为3.5时，纤维素酶和果胶酶的复合酶活力为最佳值，使得细胞壁及细胞间质破坏率高，总黄酮等活性成分能更好地溶出，总黄酮得率相对较大。
由图6可知，采用本发明提供的乙醇体积分数，黄酮得率最高，一般较低的乙醇适用于极性黄酮类化合物的提取，较高浓度的乙醇适用于非极性黄酮类化合物的提取。但在本发明中亚苦蒿总黄酮提取过程中，85％的乙醇实现了最高提取率，可能是因为总黄酮类物质溶出与提取溶剂的极性有关，随着乙醇浓度的升高，中亚苦蒿总黄酮与乙醇的极性逐渐接近，总黄酮类物质溶出较多，同时总黄酮与溶剂间的浓度梯度变大使得总黄酮的溶出更加顺利。当乙醇浓度超过85％后，再增加溶剂用量并未实现提升总黄酮得率的效果。相反，总黄酮的得率呈现下降趋势，可能是因为此时总黄酮已溶出完全，而其他杂质溶出较多，影响提取得率。
由图7可知，采用本发明提供的料液比，黄酮得率最高，料液比过低可能由于物料难以完全浸入溶剂中造成提取不完全。本发明提供的溶剂量能够满足总黄酮溶出需求，使得酶与底物反应更充分，酶解效果较好，总黄酮得率逐渐增加，中亚苦蒿中总黄酮得率达最大。
由图8可知，采用本发明提供的酶解温度，黄酮得率最高，可能由于此时复合酶活力较高，使得酶与底物反应速率较高，总黄酮得率较大。
由图9可知，采用本发明提供的酶解时间，黄酮得率最高，可能是随着酶解时间的增加，酶活力得到充分的利用，酶解反应更完全，总黄酮溶出增加，总黄酮得率逐渐增加；当酶解时间过长，不但不会提高提取效率，可能还会导致黄酮类物质遭到破坏。
实验例2中亚苦蒿总黄酮LC-MS分析
2.1代谢物提取
取实施例1所得中亚苦蒿总黄酮，涡旋30s，取200μL样本氮吹干燥；加入200μL提取液B(50％甲醇含0.1％甲酸)复溶；涡旋30s后冰水浴超声15min，4℃，12000rpm(离心力13800(×g)，半径8.6cm)离心15min；上清过0.22μm滤膜后，小心地取于2mL进样瓶；上机检测。
2.2色谱仪条件
使用的色谱柱为购自Waters的UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1*150mm)。柱温箱温度设为40℃，自动进样器温度设为8℃，进样体积为2μL。液相色谱流动相及色谱梯度。
2.3质谱仪条件
数据采集时，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：IonSprayVoltage：+5000/-4500V，Curtain Gas：35psi，Temperature：500℃，Ion Source Gas 1：55psi，Ion Source Gas 2：60psi。
2.4检测结果
中亚苦蒿总黄酮的离子流色谱图如图10所示，各化合物结构式如图11所示。
总黄酮中化合物的MS参数如表1所示：
表1总黄酮中化合物MS参数
Figure BDA0003714851380000121
Figure BDA0003714851380000131
Figure BDA0003714851380000141
Figure BDA0003714851380000151
Figure BDA0003714851380000161
实验例3中亚苦蒿总黄酮活性检测
以实施例1所得中亚苦蒿总黄酮作为样品进行以下实验。
3.1MTT检测细胞活力
选择对数期的HeLa、SiHa和H8细胞(购自ATCC细胞库)以5×103个/mL接种96孔板，用不同浓度(100～800μg/mL)的总黄酮处理细胞。设置Control(空白)、0.6％DMSO(阴性对照)及Cisplatin(阳性对照)，每组6个重复，孵育24h后，离心弃废液，各加入100μL MTT(0.5mg/mL)37℃避光孵育4h。离心去上清，使用150μL DMSO溶解后，检测490nm各孔OD值。按以下公式计算细胞存活率:细胞生存率(％)＝(实验组OD/Control组OD)×100％。
结果如图12所示，当用100～800μg/mL的提取物处理时，总黄酮能够以剂量依赖性方式抑制HeLa，SiHa和H8细胞的生长。24h半抑制浓度(IC50)值分别为396.0±54.2μg/mL和449.0±54.8μg/mL。
3.2细胞凋亡
HeLa细胞以2.5×105个/皿接种于60mm培养皿，通过不同浓度总黄酮处理细胞24h后，通过倒置显微镜观察细胞的形态变化，结果如图13所示，并收集消化后的各组细胞，以1200r/min离心7min，PBS(4～5mL)冲洗2次，弃上清，向每组细胞加入100μL结合缓冲液(1×binding buffer)重悬细胞，加入2.5μLAnnenxin V-FITC和5μL PI混合摇匀后冰浴避光10min，300μL1×binding buffer重悬细胞，FASC检测，数据采用FlowJo7.6软件进行分析，结果如图14～15所示。
由图12可知，24h后HeLa细胞显示出小而圆的形态，细胞数量显著减少。
由图14～15可知，低浓度和高浓度的中亚苦蒿总黄酮都抑制了HeLa细胞的增殖。与对照组相比，总黄酮处理组凋亡细胞的百分比显著增加。
由以上实施例可知，本发明提供了一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，与其他方法相比得到的总黄酮得率最高，可达4.75％，提取得到的总黄酮中含有41种有效化合物，能够有效抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
将中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液、复合酶混合，进行酶解，得到酶解液；
将酶解液依次进行灭酶、超声、离心，所得上清液即为中亚苦蒿总黄酮。
2.根据权利要求1所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述中亚苦蒿粉末的粒径为90μm以下。
3.根据权利要求2所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述中亚苦蒿粉末与乙醇水溶液的质量体积比为1g:20～30mL；
所述乙醇水溶液的体积浓度为80～100％。
4.根据权利要求3所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述复合酶的添加量为中亚苦蒿粉末质量的1.5～2.5％。
5.根据权利要求4所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述复合酶的种类为纤维素酶和果胶酶；
所述纤维素酶和果胶酶的添加比例为1:0.5～0.7。
6.根据权利要求5所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述纤维素酶的酶活为40～60U/mg，所述果胶酶的酶活为400～600U/mg。
7.根据权利要求6所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述酶解的pH为3～4，所述酶解的温度为40～50℃，所述酶解的时间为100～110min。
8.根据权利要求7所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述灭酶的温度为80～120℃，所述灭酶的时间为3～8min。
9.根据权利要求8所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述超声的功率为50～150W，所述超声的温度为20～40℃，所述超声的时间为10～30min。
10.根据权利要求9所述的中亚苦蒿总黄酮的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为10000～14000r/min，所述离心的时间为5～15min。
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