CN115029383A - Ms4a3蛋白在调控红细胞成熟中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用。本发明通过构建敲低MS4A3基因的慢病毒载体，并用MS4A3慢病毒处理红系祖细胞系HUDEP‑2，以敲低MS4A3基因，成功构建MS4A3敲低的HUDEP‑2细胞系。再经过对MS4A3敲低的HUDEP‑2细胞系的检测，发现MS4A3敲低促进了红系祖细胞分化为成熟的红细胞，而且CDK2可能是MS4A3作用的下游信号分子。从而验证了MS4A3蛋白是具有负调控红细胞成熟的作用的，这表明抑制MS4A3有望成为提高红细胞数量较低人群的一种有效的方法，也表明可望通过靶向MS4A3提高红细胞数量，意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种MS4A3的新应用，具体涉及MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用。
背景技术
红细胞起源于多功能造血干细胞（Hematopoietic stem cell, HSC），经历成红细胞阶段后，最后发育为成熟的红细胞。在成熟之前，成红细胞挤出其细胞核并发育为网织红细胞。网织红细胞离开骨髓并进入毛细血管参与氧气运输。当前，红细胞数偏低是全世界成年人最普遍的亚健康状况之一，这种现象在老年人中尤为常见。大约10%的 65岁以上的成年人和20%的 85岁以上的成年人出现红细胞生成不足，呈现贫血症状。红细胞产量低是由多种因素造成的。随着人类生理性衰老及病理特征的出现，如贫血、骨髓增生异常综合征、白血病或其他身体免疫受损的疾病等，生成红细胞的能力逐步下降。低红细胞数量还与许多其他疾病有关，包括心血管疾病、认知障碍、失眠、抑郁症和体能下降等。当然，体内红细胞的数量不是一成不变，而是动态调节的。动态的红细胞生成可以维持正常的血细胞比容水平，并根据需要产生新的红细胞以替换旧的或受损的红细胞。为了响应特殊状况，例如在骨髓移植、骨髓抑制或贫血时，机体会发生应激性红细胞生成。
除了机体自身的应激性造血外，多种细胞内分子具有促进红细胞生成的作用，包括EPO、铁、细胞因子、细胞调节剂和粘附分子等。EPO是一种主要在成人肾脏中表达的造血因子。EPO通常在氧气水平降低和失血的条件下被诱导升高表达。目前，除了输血和补充营养剂外，重组人促红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin, rHuEPO）一直是慢性肾病和癌症患者贫血主要的一线疗法。铁是红细胞生成的原料之一。2015年，有研究报道，转铁蛋白受体2（Transferrin receptor 2, TFR2）可以根据铁的可用性来调节红细胞的产生。铁调素是一种有效的铁调节激素，在维持体内整体铁稳态方面具有核心作用，能显著改善炎症性贫血。还有许多信号分子被认为可以促进红细胞生成，包括促炎细胞因子白细胞介素6（Interleukin-6, IL-6）、血红素加氧酶1（Heme oxygenase-1, HO-1）、GATA结合蛋白1（GATA binding protein 1, GATA-1）、刺猬（Hedgehog）信号、赤铁酮等。最近，基因编辑已被尝试用于治疗先天性贫血。然而，对于慢性低红细胞数量的成年人，一直没有有效的提高红细胞数量的医疗方案。
MS4A3基因是MS4A的四跨膜蛋白家族的成员之一。MS4A3基因编码的MS4A3是一个细胞周期负调控蛋白，与周期蛋白依赖性激酶CDK2的活化相关。MS4A3通过抑制CDK2磷酸化，从而抑制细胞周期转换，使细胞周期阻滞。至于抑制MS4A3基因能否通过抑制细胞周期，促进红细胞生成，未见文献报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用，通过抑制人体MS4A3蛋白的基因表达（MS4A3基因敲低），从而促使红系祖细胞分化为更多的成熟红细胞。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用。
进一步的，通过抑制MS4A3蛋白的基因表达，以促进成熟红细胞生成。
进一步的，通过敲低人体MS4A3蛋白基因，以促使红系祖细胞分化为更多的成熟红细胞。
本发明还提供了周期蛋白依赖性激酶（CDK2）作为在MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用中MS4A3作用的下游信号分子。
本发明还提供了MS4A3蛋白在制备促进红细胞生成并成熟的药物中的应用。
本发明还提供了MS4A3蛋白在构建MS4A3慢病毒载体中的应用。
本发明还提供了一种MS4A3慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
1）293T细胞培养至80%~90%融合时，传代至新的培养皿中；
2）倾去培养液，用PBS洗涤细胞；
3）加入 Trypsin-EDTA solution，混匀后，放置一段时间；
4）吸去胰酶溶液，加入含FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
5）将细胞悬液吸入离心管中，离心一段时间；
6）加入含FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
7）将细胞悬液接种于新的培养皿中，加入含 FBS的DMEM培养液，混匀后于培养箱中培养；
8）在无菌的离心管中加入无血清DMEM，按比例加入含MS4A3序列的穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），混匀，取另一支离心管，加入无血清DMEM，再加入RNAi-Matce，混匀后，室温放置一段时间，最后将两管液体混合，室温放置一段时间；
其中，所述MS4A3序列为GGTTCCTTGCAATACCCATAC；
9）吸除培养液后，加入无血清的DMEM培养液；
10）将转染混合物逐滴加入到培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿，以混匀复合物，在培养箱中温育一段时间；
11）吸除转染液，加入含FBS的DMEM培养液，于培养箱中继续培养育一段时间。
12）将细胞上清液吸入到离心管中，离心一段时间；
13）低速离心后，将上清液倒入注射器内，用过滤器过滤；
14）对滤液进行超速离心一段时间；
15）收集病毒浓缩液并分装；
16）对分装好的病毒液贴上标签，冰箱保存。
本发明还提供了一种MS4A3慢病毒载体的鉴定方法，包括病毒滴度检测和病毒侵染效果检测；
所述病毒滴度检测的步骤包括：
1）当293T细胞培养至80~90%融合时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞；
2）加入Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，放置一段时间；
3）再加入含FBS的DMEM培养液，吹打细胞，形成单细胞悬液；
4）将单细胞悬液吸入离心管中，离心一段时间；
5）按3×104细胞/孔的浓度，将细胞接种至96孔板中，混匀后，培养一段时间；
6）将慢病毒原液，用含FBS的DMEM稀释病毒原液；
7）吸去96孔板中的培养液，每孔加入稀释的病毒液，培养一段时间；
8）吸除96孔板中的培养基，每孔加入完全培养基，继续培养一段时间；
9）运用流式细胞分析仪，计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度；
所述病毒侵染效果检测的步骤包括：
1）用培养基稀释慢病毒原液，将病毒与培养基以一定比例进行病毒稀释；
2）对细胞进行计数，按20×105细胞/孔取出细胞，离心一段时间；沉淀用稀释的病毒悬液重悬，置于培养箱中培养；同时建立对照；
3）12~24 h后离心移去细胞培养液，加入完全培养基，继续培养过夜；
4）病毒侵染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察结果；
5）病毒侵染72 h后，运用流式细胞分析仪检测病毒侵染的阳性率。
本发明还提供了MS4A3慢病毒载体在在检测红系祖细胞HUDEP-2的成熟红细胞分化能力中的应用。
进一步的，所述的MS4A3慢病毒载体用于构建MS4A3敲低的红系祖细胞系HUDEP-2。
本发明的有益效果为：
本发明通过构建敲低MS4A3基因的慢病毒载体，并用MS4A3慢病毒处理红系祖细胞系HUDEP-2，以敲低MS4A3基因，成功构建MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系。再经过对MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系的检测，发现MS4A3敲低促进了红系祖细胞分化为成熟的红细胞，而且CDK2可能是MS4A3作用的下游信号分子。从而验证了MS4A3蛋白是具有负调控红细胞成熟的作用的，这表明抑制MS4A3有望成为提高红细胞数量较低人群的一种有效的方法，也表明可望通过靶向MS4A3提高红细胞数量，意义重大。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明构建的MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系鉴定结果示意图，其中，
图1a表示运用流式细胞分析仪检测病毒侵染的阳性率结果；
图1b表示表示运用流式细胞检测技术检测病毒侵染后MS4A3+细胞的比例结果；
图1c表示免疫印迹检测病毒侵染后MS4A3蛋白表达结果。
图2为本发明构建的MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系的成熟红细胞分化能力检测结果示意图，其中，
图2a表示qRT-PCR检测各组细胞血红素的表达情况；
图2b表示采用流式细胞技术检测HUDEP-2诱导分化前后成熟红细胞的数量情况。
图3为本发明检测MS4A3基因敲低后CDK2表达水平和CDK2磷酸化程度结果示意图，其中，
图3a表示免疫印迹检测MS4A3敲低后，CDK2和p-CDK2的表达情况；
图3b表示多色流式检测MS4A3敲低后，p-CDK2的表达情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
为了探究MS4A3蛋白是否负调控红细胞成熟，本发明首先构建了MS4A3慢病毒载体，然后用MS4A3慢病毒处理红系祖细胞系HUDEP-2，以敲低MS4A3基因。具体方法如下：
1. MS4A3慢病毒载体的构建及鉴定
1.1 病毒包装
1）293T细胞培养至80%~90%融合时，传代至新的培养皿中；
2）倾去培养液，用1 mL PBS洗涤细胞两次；
3）加入1 mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，37℃放置2~3 min；
4）吸去胰酶溶液，加入2 mL含10% FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
5）将细胞悬液吸入15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min；
6）加入1 mL含10% FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
7）将细胞悬液接种于新的培养皿中，加入9 mL含10% FBS的DMEM培养液，混匀后于37℃，5% CO2培养箱中培养；
8）在无菌的5 mL离心管中加入1.5 mL无血清DMEM，按比例加入含MS4A3序列的穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），混匀，取另一支5 mL离心管，加入1.5 mL无血清DMEM，再加入300μL RNAi-Matce，混匀后，室温放置5 min，最后将两管液体混合，室温放置20~25 min；
其中，所述MS4A3序列为GGTTCCTTGCAATACCCATAC；
9）吸除培养液后，加入8 mL无血清的DMEM培养液；
10）将转染混合物逐滴加入到培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿，以混匀复合物，在37℃，5% CO2培养箱中温育4~6 h；
11）吸除转染液，加入10 mL含10% FBS的DMEM培养液，于37℃，5% CO2培养箱中继续培养72 h。
1.2 病毒收集
1）将细胞上清液吸入到50 mL离心管中，4℃，4000 rpm离心4 min；
2）低速离心后，将上清液倒入50 mL注射器内，用0.45μm过滤器过滤；
3）对滤液进行超速离心，4℃，20000 rpm离心2 h；
4）收集病毒浓缩液并分装；
5）对分装好的病毒液贴上标签，-80℃冰箱保存。
1.3 病毒滴度检测
1）当293T细胞培养至80~90%融合时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞两次；
2）加入1 mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC放置3~5min；
3）再加入2 mL含10% FBS的DMEM培养液，吹打细胞，形成单细胞悬液；
4）将单细胞悬液吸入15 mL离心管中，1000 rpm 离心5min；
5）按3×104细胞/孔的浓度，将细胞接种至96孔板中，混匀后，培养24 h；
6）将慢病毒原液10μL，用10% FBS的DMEM稀释病毒原液；
7）吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μL稀释的病毒液，培养24 h；
8）吸除96孔板中的培养基，每孔加入100μL完全培养基，继续培养72 h；
9）运用流式细胞分析仪，计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
1.4 病毒侵染及其侵染效果检测
1）稀释病毒：用培养基稀释慢病毒原液，将病毒：培养基=1：20的比例进行病毒稀释；
2）细胞计数：对细胞进行计数，按20×105细胞/孔取出细胞，1000 rpm离心5 min。沉淀用500μL稀释的病毒悬液重悬，置于培养箱中培养。同时建立对照；
3）12~24 h后离心移去细胞培养液，加入500μL完全培养基，继续培养过夜；
4）病毒侵染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察结果；
5）病毒侵染72 h后，运用流式细胞分析仪检测病毒侵染的阳性率。
成功构建MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系
HUDEP-2细胞是从人脐带血CD34+细胞中构建的永生化的红细胞祖细胞系。本发明用MS4A3的慢毒病处理红系祖细胞系HUDEP-2，以敲低MS4A3基因，然后对构建的MS4A3敲低的HUDEP-2细胞系进行鉴定，结果如图1a-1c所示。
参见图1a所示，图1a表示运用流式细胞分析仪检测病毒侵染的阳性率，图1a中的数值均用Mean±SD表示，****代表P值＜0.0001。从图1a中可以看出，与对照组相比，病毒侵染组的绿色荧光蛋白阳性（GFP+）细胞比例显著增加，说明病毒成功侵染到目的细胞中。
并且参见图1b和图1c所示，图1b表示运用流式细胞检测技术检测病毒侵染后MS4A3+细胞的比例，图1c表示免疫印迹检测病毒侵染后MS4A3蛋白表达，图1b和图1c中的数值均用Mean±SD表示，*代表P值<0.05，**代表P值＜0.01，****代表P值＜0.0001。从图1b和图1c中可以看出，流式细胞分析和Western blottig的结果均显示，与对照组相比，MS4A3+细胞比例显著减少，MS4A3蛋白表达显著降低，提示MS4A3基因被成功敲低。
人MS4A3基因敲低后，红系祖细胞分化为更多的成熟红细胞
HUDEP-2细胞在红细胞分化培养基中培养后，可以被诱导分化为成熟的红细胞。红系祖细胞分化为成熟红细胞的过程中经历去核，因此可以通过红细胞特异性表面标志物GPA和Hoechst-33342（与DNA结合的染料）来判断成熟红细胞的数量。成熟的红细胞被标记为Hoechst-GPA+细胞。结果显示，在诱导分化后，HUDEP-2细胞分化成熟，产生大量去核红细胞（Hoechst-）。
更为重要的是，参加图2b所示，图2b表示采用流式细胞技术检测HUDEP-2诱导分化前后成熟红细胞的数量，图2b中数值均用Mean±SD表示，**代表P值＜0.01，****代表P值＜0.0001。从图2b中可以看出，与对照组相比，MS4A3敲低的HUDEP-2产生更多的Hoechst-去核红细胞，从而提示MS4A3蛋白可能负调控红系祖细胞成熟。
血红蛋白是红细胞内运输氧气的蛋白质，是红细胞中重要的功能分子。血红蛋白是由珠蛋白和血红素结合而成的。理论上，红细胞分化伴随着表征成熟红细胞的血红蛋白的合成。为了进一步研究MS4A3对红系祖细胞分化的影响，本发明检测了MS4A3基因敲低细胞中α-GLOBIN和γ-GLOBIN的表达。
检测结果如图2a所示，图2a表示qRT-PCR检测各组细胞血红素的表达情况，图2a中数值均用Mean±SD表示，**代表P值＜0.01， ***代表P值＜0.001，****代表P值＜0.0001。从图2a中可以看出，相较对照组，MS4A3敲低的HUDEP-2细胞α-GLOBIN和γ-GLOBIN表达水平显著增加。以上数据进一步表明，MS4A3敲低促进了红系祖细胞分化为成熟的红细胞。
人MS4A3基因敲低后，CDK2和p-CDK2水平增多
MS4A3参与细胞周期调节，与周期蛋白依赖性激酶CDK2的活化相关。MS4A3通过抑制CDK2磷酸化，从而抑制细胞周期转换，使细胞周期阻滞。本发明检测了MS4A3基因敲低后，CDK2表达水平和CDK2磷酸化程度，检测结果如图3a-3b所示。
参见图3a所示，图3a表示免疫印迹检测MS4A3敲低后，CDK2和p-CDK2的表达情况。从图3a中可以看出，与对照组相比，MS4A3基因敲低的HUDEP-2中，CDK2和p-CDK2的水平显著升高。
参见图3b所示，图3b表示多色流式检测MS4A3敲低后，p-CDK2的表达情况，图3b中数值均用Mean±SD表示，*代表P值<0.05，**代表P值＜0.01，***代表P值＜0.001。从图3b中可以看出，与对照组相比，MS4A3基因敲低的HUDEP-2中，p-CDK2+细胞显著增多，从而提示CDK2可能是MS4A3作用的下游信号分子。
综上所述，我们观察到MS4A3敲低促进了红系祖细胞分化为成熟的红细胞，而且CDK2可能是MS4A3作用的下游信号分子。这表明抑制MS4A3有望成为提高红细胞数量较低人群的一种有效的方法，也表明可望通过靶向MS4A3提高红细胞数量，因此具有重大意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.MS4A3蛋白在调控红细胞成熟中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过抑制MS4A3蛋白的基因表达，以促进成熟红细胞生成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过敲低人体MS4A3蛋白基因，以促使红系祖细胞分化为更多的成熟红细胞。
4.周期蛋白依赖性激酶作为如权利要求1-3所述的应用中MS4A3作用的下游信号分子。
5.MS4A3蛋白在制备促进红细胞生成并成熟的药物中的应用。
6.MS4A3蛋白在构建MS4A3慢病毒载体中的应用。
7.一种如权利要求6所述的应用中的MS4A3慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）293T细胞培养至80%~90%融合时，传代至新的培养皿中；
2）倾去培养液，用PBS洗涤细胞；
3）加入Trypsin-EDTA solution，混匀后，放置一段时间；
4）吸去胰酶溶液，加入含FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
5）将细胞悬液吸入离心管中，离心一段时间；
6）加入含FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；
7）将细胞悬液接种于新的培养皿中，加入含FBS的DMEM培养液，混匀后于培养箱中培养；
8）在无菌的离心管中加入无血清DMEM，按比例加入含MS4A3序列的穿梭质粒和包装质粒，混匀，取另一支离心管，加入无血清DMEM，再加入RNAi-Matce，混匀后，室温放置一段时间，最后将两管液体混合，室温放置一段时间；所述MS4A3序列为GGTTCCTTGCAATACCCATAC；
9）吸除培养液后，加入无血清的DMEM培养液；
10）将转染混合物逐滴加入到培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿，以混匀复合物，在培养箱中温育一段时间；
11）吸除转染液，加入含FBS的DMEM培养液，于培养箱中继续培养育一段时间；
12）将细胞上清液吸入到离心管中，离心一段时间；
13）低速离心后，将上清液倒入注射器内，用过滤器过滤；
14）对滤液进行超速离心；
15）超速离心后，收集病毒浓缩液并分装；
16）对分装好的病毒液贴上标签，冰箱保存。
8.一种如权利要求6中所述的应用中的MS4A3慢病毒载体的鉴定方法，其特征在于，包括病毒滴度检测和病毒侵染效果检测；
所述病毒滴度检测的步骤包括：
1）当293T细胞培养至80~90%融合时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞；
2）加入Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，放置一段时间；
3）再加入含FBS的DMEM培养液，吹打细胞，形成单细胞悬液；
4）将单细胞悬液吸入离心管中，离心一段时间；
5）按3×104细胞/孔的浓度，将细胞接种至96孔板中，混匀后，培养一段时间；
6）将慢病毒原液，用含FBS的DMEM稀释病毒原液；
7）吸去96孔板中的培养液，每孔加入稀释的病毒液，培养一段时间；
8）吸除96孔板中的培养基，每孔加入完全培养基，继续培养一段时间；
9）运用流式细胞分析仪，计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度；
所述病毒侵染效果检测的步骤包括：
1）用培养基稀释慢病毒原液，将病毒与培养基以一定比例进行病毒稀释；
2）对细胞进行计数，按20×105细胞/孔取出细胞，离心一段时间；沉淀用稀释的病毒悬液重悬，置于培养箱中培养；同时建立对照；
3）12~24 h后离心移去细胞培养液，加入完全培养基，继续培养过夜；
4）病毒侵染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察结果；
5）病毒侵染72 h后，运用流式细胞分析仪检测病毒侵染的阳性率。
9.如权利要求6所述的MS4A3慢病毒载体在检测红系祖细胞成熟红细胞分化能力中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的MS4A3慢病毒载体用于构建MS4A3敲低的红系祖细胞系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210422079.1A CN115029383B (zh) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | Ms4a3蛋白在调控红细胞成熟中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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Also Published As
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