CN116350761B - 一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法 - Google Patents

一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法，该疫苗是利用树突状细胞转染靶基因敲除慢病毒，并加入肿瘤抗原和佐剂组合刺激后进行细胞培养得到的。其构建方法包括：步骤（1）、利用生物信息学方法筛选树突状细胞中免疫抑制基因，确定靶基因；步骤（2）、筛选靶基因中的靶向敲除序列，并制备靶基因敲除慢病毒；步骤（3）、诱导分化获取树突状细胞；步骤（4）、利用诱导分化的树突状细胞和靶基因敲除慢病毒构建新型抗肺癌树突状细胞疫苗。本发明新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法操作简便，可显著提高树突状细胞疫苗的抗肿瘤活性，可对树突状细胞疫苗进行个性化订制，构建最符合病人需求的树突状细胞疫苗产品。

Description

一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法
技术领域
本发明涉及抗肺癌疫苗技术领域。具体地说是一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法。
背景技术
免疫细胞治疗是未来肿瘤治疗的重要发展领域之一，树突状细胞作为免疫应答的起始环节，可以摄取肿瘤抗原并递呈给T淋巴细胞，进而有效活化抗原特异性细胞免疫反应，在肿瘤治疗中起着不可或缺的作用。因此，树突状细胞疫苗成为了肿瘤免疫细胞治疗的重要手段。
树突状细胞疫苗的构建步骤主要包括树突状细胞的诱导，肿瘤相关抗原刺激及细胞回输等步骤，回输的树突状细胞可在体内活化抗肿瘤免疫反应。尽管多个临床实验均证实了树突状细胞疫苗的安全性和免疫原性，但临床响应效果依然不理想。出现这种结果的原因主要是树突状细胞抗原递呈不充分、迁移能力过低以及免疫活化程度不足以对抗体内的免疫抑制环境。因此，目前多项研究致力于提高树突状细胞疫苗的抗原承载能力及活化水平，以期提高其体内的抗肿瘤效果。采用腺病毒携带外源基因转染树突状细胞，提高其肿瘤抗原的承载能力是较常见的操作。尽管提高树突状细胞的抗原承载能力可在一定程度上提高治疗效果，但由于病人体内通常是一个免疫抑制的内环境，常规的树突状细胞疫苗并无法克服回输后面临的肿瘤免疫抑制作用。因此，有必要设计一种新的抗肺癌树突状细胞疫苗构建方法，以解决这个问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法，以解决现有抗肺癌树突状细胞疫苗大多针对提高树突状细胞的抗原承载能力，没有靶向其免疫抑制信号通路而被肿瘤细胞相关信号抑制的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗，利用树突状细胞转染靶基因敲除慢病毒，并加入肿瘤抗原和佐剂组合刺激后进行组合刺激后得到。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗，靶基因敲除慢病毒敲减的序列为靶基因PDCD10的CCAGGATGTTGAATGGGAT序列；加入的佐剂为TLR7/8激动剂R848和TLR3激动剂Poly（I:C）。
一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，包括如下步骤：
步骤（1）、利用生物信息学方法筛选树突状细胞中免疫抑制基因，确定靶基因；
步骤（2）、筛选靶基因中的靶向敲除序列，并制备靶基因敲除慢病毒；
步骤（3）、诱导分化获取树突状细胞；
步骤（4）、利用诱导分化的树突状细胞和靶基因敲除慢病毒构建新型抗肺癌树突状细胞疫苗。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（1）中，生物信息学方法为：基于GEO数据库，利用ARACNE算法建立树突状细胞状态转变的特异性调控网络；利用VIPER算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，利用VIPER算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因的方法为：
步骤（1-1）、整合下游靶标的调控模式，计算调控因子和靶标之间的统计置信度，并统计不同调控因子的靶标集合的重合程度，构建得到概率化框架；
步骤（1-2）、利用概率化框架计算各调控因子下游的靶标在差异表达基因上的富集情况，计算得到各调控因子的靶标富集得分；
步骤（1-3）、选取靶标富集得分在前20的调控因子，结合树突状细胞在肺癌微环境下状态变化的表达谱数据，筛选出表达差异较高的调控因子PDCD10，即选取PDCD10作为靶基因。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（2）包括如下步骤：
步骤（2-1）、根据靶基因的全序列设计siRNA序列；
步骤（2-2）、采用lipo3000将siRNA转染至树突状细胞，在转染后的24h和48h分别收集细胞抽提总RNA，反转录后用荧光定量PCR检测不同siRNA对靶基因的敲减效果进行验证；
步骤（2-3）、根据敲减效果的验证结果，确定靶向敲除序列；
步骤（2-4）、构建靶向敲除序列敲减后的载体质粒；
步骤（2-5）、利用载体质粒包装制备得到靶基因敲除慢病毒。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（4）包括如下步骤：
步骤（4-1）、取诱导分化的树突状细胞，加入靶基因敲除慢病毒以转染树突状细胞，获取靶基因稳定敲减的树突状细胞；
步骤（4-2）、转染结束后，加入肿瘤抗原，继续培养；
步骤（4-3）、向培养体系中加入佐剂后，继续培养；培养结束后即得到新型抗肺癌树突状细胞疫苗。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（4-1）中，树突状细胞为诱导分化至第4天的树突状细胞；转染时间为24h；
步骤（4-2）中，肿瘤抗原的加入量以培养基中肿瘤抗原的质量浓度达到50μg/mL为标准，加入肿瘤抗原后继续培养24h；
步骤（4-3）中，佐剂为TLR7/8激动剂R848和TLR3激动剂Poly（I:C）；加入佐剂后，培养基中R848的质量浓度为2.5μg/mL，Poly（I:C）的质量浓度为25μg/mL；加入佐剂后继续培养48小时。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（3）包括如下步骤：
步骤（3-1）、取外周血制备得到全血样品；
步骤（3-2）、将全血样品加入到Ficoll细胞分离液中，使得全血样品和Ficoll细胞分离液形成上下两层，然后离心；
步骤（3-3）、离心结束后，吸取离心管内的白膜层，获得单个核细胞，并将单个核细胞接种在培养板中；
步骤（3-4）、将培养板置于培养箱中培养，诱导分化获取树突状细胞。
上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（3）的具体操作方法为：
步骤（3-1）、采集健康志愿者的外周血25mL，用生理盐水按照体积比1:1稀释后，用移液器上下吹打混匀，得到全血样品；
步骤（3-2）、取50mL的离心管加入10mL Ficoll细胞分离液，沿着离心管的管壁在接近细胞分离液的液面处非常缓慢地加入全血样品，使得全血样品在Ficoll细胞分离液上面(切记不要混)，接着于2000rpm的离心20分钟；
步骤（3-3）、取出离心管于超净工作台中，离心管中液体自上而下分为血浆层、白膜层（即外周血单个核细胞PBMC）和红细胞层，用巴氏吸管吸掉三分之二的血浆层，不要搅动；
用巴氏吸管吸取白膜层于50mL离心管中，加入生理盐水30mL并充分混匀，于2500rpm离心5分钟，弃上清，收集；重复此步骤3次，第3次用AIM-V无血清培养基清洗,并计数；
在AIM-V无血清培养基中加入IL-4(Peprotech)至其浓度为100ng/mL，加入GM-CSF(Peprotech)至其浓度为200ng/mL,得到树突状细胞培养基；按2×106cells/孔接种在24孔培养板中，每孔1mL培养基；
步骤（3-4）、将24孔培养板摇匀后，置于培养箱中，于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养2.5h；培养结束后，取出培养板，收集悬浮细胞和培养基于新的15mL离心管中；
向去除了悬浮细胞和培养基的24孔培养板的各孔中重新加入1mL新鲜树突状细胞完全培养基继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养72h后，取出24孔培养板，每孔吸去500μL旧培养基，并补充500μL新鲜的DC完全培养基，继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养96h后结束培养，即获取得到诱导分化的树突状细胞。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法简便高效，包括树突状细胞靶基因筛选，树突状细胞的培养，基因敲减及肿瘤抗原刺激，疫苗效果评估等技术手段。该方法操作简便，可显著提高树突状细胞疫苗的抗肿瘤活性，可对树突状细胞疫苗进行个性化订制，构建最符合病人需求的树突状细胞疫苗产品。本发明筛选的靶向树突状细胞的免疫抑制基因，可总体提高树突状细胞疫苗的活化及细胞因子分泌水平；敲减树突状细胞疫苗中的免疫抑制基因可显著提高其活化水平，增强肿瘤杀伤效果。本发明有效解决了现有抗肺癌树突状细胞疫苗大多针对提高树突状细胞的抗原承载能力，没有靶向其免疫抑制信号通路而被肿瘤细胞相关信号抑制的问题。
附图说明
图1是本发明实施例中肺癌浸润失能DC细胞调控因子靶标富集谱示意图。
实施方式
本实施例中新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法包括如下步骤：
为了构建组织特异性调控网络，本实施例从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中获取了267例树突状细胞在不同状态下的mRNA表达数据。该数据集包含样本量较多，包括正常树突状细胞及肿瘤浸润的失活树突状细胞，适合构建转录调控网络。基于该数据集，利用ARACNE算法，本实施例建立了树突状细胞DC状态转变的特异性调控网络，该网络包含17,862个基因之间的130,629个调控关系。随后利用VIPER算法（基于调控因子富集分析的蛋白活性虚拟推断）来筛选出调控DC细胞从正常状态到失能状态转变的信号蛋白或者转录因子【即确定具有免疫功能抑制作用的靶基因】。该方法通过直接整合下游靶标的调控模式（即被激活还是被抑制），调控因子和靶标之间的统计置信度，以及不同调控因子靶标集合的重合程度来构建了一个概率化框架。接着应用该框架计算每个调控因子下游的靶标在差异表达基因上富集情况。例如若差异表达的基因中，上调的基因显著的富集在一个调控因子激活的靶标集合上，则可推断该调控因子活性增加的可能性较大；反之，若上调的基因显著的富集在一个调控因子抑制的靶标集合上，则该调控因子活性降低的可能性较大。借助该思想，可以计算出每个信号蛋白和转录因子的靶标富集得分，富集得分最高的调控因子则认为在树突状细胞的表型状态转变过程中起主导作用，也就是我们需要找的关键调控因子。结合树突状细胞在肺癌微环境下状态变化的表达谱数据进一步分析不同调控因子靶标集合之间的重合靶标富集情况，推断出可能有协同关系的调控因子对，为进一步挖掘DC细胞失能过程中的关键分子机制提供基础。利用该分析框架，本实施例对靶标个数大于20个调控因子进行分析（见图1），选取前20个打分显著性最高的调控因子或调控因子对。如图1所示，其中活性增加的有15个，活性降低的有5个。其中表达差异较高的PDCD10与PD-1处于同一家族，在免疫功能的抑制中起重要作用，但其对树突状细胞功能的影响尚无研究，因此，本实施例选取PDCD10作为靶基因。
图1中，左侧p-value表示富集分析的显著性，中间竖杠代表靶标集合在差异表达谱上的分布情况，其中蓝色代表被抑制的靶标，红色代表被激活的靶标；从左至右则代表基因表达量上调程度越来越高。Set中显示的是富集显著性得分最高的调控因子或调控因子对。Act代表该调控因子的活性改变情况，红色代表活性增加，蓝色代表活性降低。EXp代表树突状细胞表型改变过程中mRNA表达量的改变。
根据PDCD10全序列设计多段siRNA序列，转染DC后进行敲减效果验证，最终选取敲减效果最好的CCAGGATGTTGAATGGGAT序列构建载体质粒，包装慢病毒备用，具体来说，包括如下步骤：
步骤（2-1）、根据靶基因PDCD10的全序列设计siRNA序列；
步骤（2-2）、构建各siRNA序列敲减后的转染质粒，利用各转染质粒分别转染树突状细胞进行敲减效果的验证；本实施例采用lipo3000将siRNA转染至树突状细胞，在转染后的24h和48h分别收集细胞抽提总RNA，反转录后用荧光定量PCR检测不同siRNA对靶基因的敲减效果；
步骤（2-3）、根据敲减效果的验证结果，确定CCAGGATGTTGAATGGGAT序列为靶向敲除序列；
步骤（2-4）、构建靶向敲除序列敲减后的载体质粒；
步骤（2-5）、利用载体质粒包装制备得到靶基因敲除慢病毒。
步骤（3-1）、采集健康志愿者的外周血25mL，用生理盐水按照体积比1:1稀释后，用移液器上下吹打混匀，得到全血样品；
步骤（3-2）、取50mL的离心管加入10mL Ficoll细胞分离液，沿着离心管的管壁在接近细胞分离液的液面处非常缓慢地加入全血样品，使得全血样品在Ficoll细胞分离液上面，接着于2000rpm的离心20分钟；
步骤（3-3）、取出离心管于超净工作台中，离心管中液体自上而下分为血浆层、白色环状层和红细胞层，用巴氏吸管吸掉三分之二的血浆层，不要搅动；
用巴氏吸管吸取白色环状层于50mL离心管中，加入生理盐水30mL并充分混匀，于2500rpm离心5分钟，弃上清，收集；重复此步骤三次，第三次用AIM-V无血清培养基清洗,并计数；
在AIM-V无血清培养基中加入IL-4至其浓度为100ng/mL，加入GM-CSF至其浓度为200ng/mL,得到树突状细胞培养基；按2×106cells/孔接种在24孔培养板中，每孔1mL培养基；
步骤（3-4）、将24孔培养板摇匀后，置于培养箱中，于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养2.5h；培养结束后，取出培养板，收集悬浮细胞和培养基于新的15mL离心管中；
向去除了悬浮细胞和培养基的24孔培养板的各孔中重新加入1mL新鲜树突状细胞完全培养基继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养至72h后，取出24孔培养板，每孔吸去500μL旧培养基，并补充500μL新鲜的DC完全培养基，继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养至96h结束培养，即获取得到诱导分化的树突状细胞。
步骤（4-1）、取诱导分化至第四天的树突状细胞，加入靶基因敲除慢病毒以转染树突状细胞，获取靶基因稳定敲减的树突状细胞，转染24小时；
步骤（4-2）、转染结束后加入肿瘤抗原，继续培养24h；肿瘤抗原的加入量以培养基中肿瘤抗原的质量浓度达到50μg/mL为标准；
步骤（4-3）、向培养体系中加入佐剂后，继续培养48小时；佐剂为TLR7/8激动剂R848和TLR3激动剂Poly（I:C）；加入佐剂后，培养基中R848的质量浓度为2.5μg/mL，Poly（I:C）的质量浓度为25μg/mL；培养结束后收集细胞及培养上清用于下游效果评估实验。
对本实施例构建的新型抗肺癌树突状细胞疫苗的效果进行评估：
1）ELISA检测树突状细胞疫苗培养上清中细胞因子的表达：采用达科为公司预包被IL-12的ELISA试剂盒检测上清中IL-12的表达水平。
2）流式细胞术检测树突状细胞疫苗表面共刺激分子的表达水平：采用Biolegend流式抗体检测树突状细胞疫苗表面CD80、CD86、CD83的表达水平。
3）树突状细胞疫苗对肿瘤抗原的摄取效率检测：免疫荧光检测抗原吞噬。
4）树突状细胞疫苗对T淋巴细胞及肿瘤杀伤的功能检测：混合淋巴细胞反应。
经上述检测评估后发现，相比于传统树突状细胞疫苗，本实施例构建的新型抗肺癌树突状细胞疫苗可显著提高树突状细胞疫苗的IL-12分泌水平，并促进树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD83和CD86的表达水平，此外，树突状细胞的抗原吞噬效率也显著提高。
本实施例新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法包括树突状细胞中免疫抑制基因的筛选、树突状细胞的获取、靶基因的敲减、树突状细胞疫苗的构建、树突状细胞疫苗的活性评估五部分。肿瘤浸润树突状细胞中免疫抑制基因的筛选、靶向敲除序列的设计筛选及树突状细胞疫苗构建过程中佐剂的组合刺激是构建新型抗肺癌树突状细胞疫苗的关键技术手段。本实施例中，PDCD10基因的CCAGGATGTTGAATGGGAT序列敲减显著提高了树突状细胞的活化水平，提升抗原及佐剂刺激效果，增强肿瘤杀伤效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）、利用生物信息学方法筛选树突状细胞中免疫抑制基因，确定靶基因；
步骤（1）中，生物信息学方法为：基于GEO数据库，利用ARACNE算法建立树突状细胞状态转变的特异性调控网络；利用VIPER算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因;
利用VIPER算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因的方法为：
步骤（1-1）、整合下游靶标的调控模式，计算调控因子和靶标之间的统计置信度，并统计不同调控因子的靶标集合的重合程度，构建得到概率化框架；
步骤（1-2）、利用概率化框架计算各调控因子下游的靶标在差异表达基因上的富集情况，计算得到各调控因子的靶标富集得分；
步骤（1-3）、选取靶标富集得分在前20的调控因子，结合树突状细胞在肺癌微环境下状态变化的表达谱数据，筛选出表达差异较高的调控因子作为靶基因;
步骤（2）、筛选靶基因中的靶向敲除序列，并制备靶基因敲除慢病毒；
步骤（2）包括如下步骤：
步骤（2-1）、根据靶基因的全序列设计siRNA序列；
步骤（2-2）、采用lipo3000将siRNA转染至树突状细胞，在转染后的24h和48h分别收集细胞抽提总RNA，反转录后用荧光定量PCR检测不同siRNA对靶基因的敲减效果；
步骤（2-3）、根据敲减效果的验证结果，确定靶向敲除序列；
步骤（2-4）、构建靶向敲除序列敲减后的载体质粒；
步骤（2-5）、利用载体质粒包装制备得到靶基因敲除慢病毒;
步骤（3）、诱导分化获取树突状细胞；
步骤（4）、利用诱导分化的树突状细胞转染靶基因敲除慢病毒，并加入肿瘤抗原和佐剂进行组合刺激，即构建得到新型抗肺癌树突状细胞疫苗;
步骤（4）包括如下步骤：
步骤（4-1）、取诱导分化的树突状细胞，加入靶基因敲除慢病毒以转染树突状细胞，获取靶基因稳定敲减的树突状细胞；
步骤（4-2）、转染结束后，加入肿瘤抗原，继续培养；
步骤（4-3）、向培养体系中加入佐剂后，继续培养；培养结束后即得到新型抗肺癌树突状细胞疫苗;
靶基因敲除慢病毒敲减的序列为靶基因PDCD10的CCAGGATGTTGAATGGGAT序列；加入的佐剂为TLR7/8激动剂R848和TLR3激动剂Poly（I:C）。
2.根据权利要求1所述的新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，其特征在于，步骤（4-1）中，树突状细胞为诱导分化至第4天的树突状细胞；转染时间为24h；
步骤（4-2）中，肿瘤抗原的加入量以培养基中肿瘤抗原的质量浓度达到50μg/mL为标准，加入肿瘤抗原后继续培养24h；
步骤（4-3）中，佐剂为TLR7/8激动剂R848和TLR3激动剂Poly（I:C）；加入佐剂后，培养基中R848的质量浓度为2.5μg/mL，Poly（I:C）的质量浓度为25μg/mL；加入佐剂后继续培养48小时。
3.根据权利要求1所述的新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，其特征在于，步骤（3）包括如下步骤：
步骤（3-1）、取外周血制备得到全血样品；
步骤（3-2）、将全血样品加入到Ficoll细胞分离液中，使得全血样品和Ficoll细胞分离液形成上下两层，然后离心；
步骤（3-3）、离心结束后，吸取离心管内的白膜层，获得单个核细胞，并将单个核细胞接种在培养板中；
步骤（3-4）、将培养板置于培养箱中培养，诱导分化获取树突状细胞。
4.根据权利要求3所述的新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，其特征在于，步骤（3）的具体操作方法为：
步骤（3-1）、采集健康志愿者的外周血25mL，用生理盐水按照体积比1:1稀释后，用移液器上下吹打混匀，得到全血样品；
步骤（3-2）、取50mL的离心管加入10mL Ficoll细胞分离液，沿着离心管的管壁在接近细胞分离液的液面处非常缓慢地加入全血样品，使得全血样品在Ficoll细胞分离液上面，接着于2000rpm的离心20分钟；
步骤（3-3）、取出离心管于超净工作台中，离心管中液体自上而下分为血浆层、白色环状层和红细胞层，用巴氏吸管吸掉三分之二的血浆层，不要搅动；
用巴氏吸管吸取白色环状层于50mL离心管中，加入生理盐水30mL并充分混匀，于2500rpm离心5分钟，弃上清，收集；重复此步骤三次，第三次用AIM-V无血清培养基清洗,并计数；
在AIM-V无血清培养基中加入IL-4至其浓度为100ng/mL，加入GM-CSF至其浓度为200ng/mL,得到树突状细胞培养基；按2×106cells/孔接种在24孔培养板中，每孔1mL培养基；
步骤（3-4）、将24孔培养板摇匀后，置于培养箱中，于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养2.5h；培养结束后，取出培养板，收集悬浮细胞和培养基于新的15mL离心管中；
向去除了悬浮细胞和培养基的24孔培养板的各孔中重新加入1mL新鲜树突状细胞完全培养基继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养至72h后，取出24孔培养板，每孔吸去500μL旧培养基，并补充500μL新鲜的DC完全培养基，继续于37℃的温度下，5% CO2浓度的环境下培养；
培养至96h结束培养，即获取得到诱导分化的树突状细胞。
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