CN115025281A

CN115025281A - 糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115025281A
Application number: CN202210831535.8A
Authority: CN
Inventors: 董常明; 滕林
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本发明公开了糖基化聚赖氨酸‑聚乙二醇水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料领域。该水凝胶由糖基化聚赖氨酸和聚乙二醇衍生物在室温下快速固化而成，其中糖基化聚赖氨酸选自式(1)或(2)，聚乙二醇衍生物选自式(3)、(4)、(5)和(6)。本发明的糖基化聚赖氨酸‑聚乙二醇水凝胶具有优异的动脉止血和生物活性促进愈合双重功能，作为伤口敷料具有重要的临床转化潜力，解决目前动脉止血水凝胶敷料存在抗血管的爆破压力不可控、动脉止血效果差以及缺少促进伤口愈合生物活性的问题。

Description

糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

不可控出血尤其是主动脉出血，由于血压大、血流速度快，容易造成失血过多，从而严重危及生命安全。临床中主要通过结扎方式控制出血，但是不适合院前治疗。因此开发一种使用便捷的动脉止血剂具有重要的临床实用价值。目前，虽已经开发一些动脉止血材料，包括明胶、丝素蛋白、壳聚糖、聚丙烯酸等，但是在生物相容性、止血效果、伤口愈合性能、材料使用方法等方面，仍存在不足。例如，中国专利CN201710115545.0公布了基于可快速降解化学键的PEG水凝胶及其制备方法与应用，该水凝胶由胺基化聚乙二醇与醛基化聚乙二醇或琥珀酰亚胺聚乙二醇酯组成，虽然具有动脉血管封闭性能，但是由胺基、醛基形成的交联网络易于变质，且醛基存在生物毒性，特别是其缺乏生物活性，作为伤口敷料需要负载活性物质才能实现良好的促进伤口愈合效果。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的主要目的是提供糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，解决目前动脉止血水凝胶敷料存在抗血管的爆破压力不可控、动脉止血效果差以及缺少促进伤口愈合的生物活性等问题，具有优异的动脉止血和促进愈合双重功能，作为伤口敷料具有重要的临床转化潜力。

本发明的另一目的是提供糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶作为或者在制备动脉止血和伤口愈合的药物或医疗用品中的应用。

本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其由糖基化聚赖氨酸和聚乙二醇衍生物在室温下快速固化而成。

作为优选，所述糖基化聚赖氨酸选自式(1)或(2)中的一种或多种：

式(1)和(2)中，R选自

x、y和z相同或不相同，且均为正整数。

作为优选，式(1)和(2)所示糖基化聚赖氨酸中糖基团的接枝率为10％–60％，优选的接枝率为25％；式(1)所示的糖基化聚赖氨酸中儿茶酚基团的接枝率为10％–40％，优选的接枝率为20％。

作为优选，所述聚乙二醇衍生物选自式(3)、(4)、(5)和(6)中的一种或多种：

式(3)至(6)中，m为正整数。

作为优选，所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的组织粘附强度为10–20kPa，爆破压力为50–160mmHg。

作为更优选，所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的质量浓度为4％，爆破压力＞120mmHg。

本发明的第二方面提供所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制糖基化聚赖氨酸的溶液为混合液A；

(2)配制聚乙二醇衍生物的溶液为混合液B；

(3)混合液A和混合液B等体积或非等体积混合或注射混合，在室温下10–60s内快速固化形成水凝胶。

作为优选，所述混合液A的质量浓度为1％–15％，优选质量浓度为4％；

所述混合液B的质量浓度为1％–15％，优选质量浓度为4％；

所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的质量浓度为1％–15％，优选质量浓度为4％。

本发明的第三方面提供上述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶作为或者在制备动脉止血和伤口愈合的药物或医疗用品中的应用。

作为优选，所述动脉止血和伤口愈合的药物以所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶为活性成分，剂型包括敷剂、凝胶剂或注射剂。

作为优选，所述医疗用品为纱布，其包含所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶在4％的质量浓度下爆破压力超过120mmHg，表现出良好的封闭动脉血管能力，并在大鼠肝脏、股动脉和兔子动脉出血模型中均表现出优于Fibrin glue和纱布的止血性能，不足20s即能完成动脉止血。

(2)本发明的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶具有诱导巨噬细胞极化为M2表型的生物活性，有助于调节伤口微环境，为组织再生创造更有利的条件。在大鼠皮肤全层缺损模型中，12天便实现伤口愈合，病理学切片也表明该水凝胶处理的伤口具有很低的炎症反应，再生出更厚的肉芽组织和整皮层、更高的胶原表达和毛囊密度。

(3)本发明的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶不仅具有出色的动脉止血性能，而且表现出诱导巨噬细胞极化的生物活性促进愈合，即具有优异的动脉止血和促进愈合的双重功能，作为动脉止血和创面愈合敷料具有重要的临床转化潜力。

附图说明

图1为实施例中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶体外诱导巨噬细胞极化为M2表型的比例。

图2为实施例中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的大鼠股动脉止血时间。

图3为实施例中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的大鼠股动脉相对失血量。

图4为实施例中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的兔子股动脉止血时间。

图5为实施例中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的兔子股动脉相对失血量。

图6为实施例中不同时间点的伤口愈合率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种质量浓度为4％的甘露糖修饰聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶(HPMD)，制备方法如下：

(1)将20.0mg甘露糖/儿茶酚修饰的聚赖氨酸(PMD)溶于500μL PBS(10mM，pH7.4)，得到混合液A。

(2)20.0mg双端琥珀酰亚胺聚乙二醇酯溶于500μL PBS(10mM，pH 7.4)，得到混合液B。

(3)混合液A与混合液B通过双通道注射器等体积混合，得到浓度为4％的甘露糖修饰聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶。

实施例2体外巨噬细胞极化实验

在6孔板底部制备300μL水凝胶，并使用PBS清洗三次，然后经254nm紫外灯照射15min杀死细菌。将巨噬细胞(RAW264.7细胞)种植到水凝胶表面(3×10⁵细胞/孔)，共培养48h，消化、收集孔板中的细胞，并用无菌PBS清洗2次。使用APC anti-mouse CD206和PEanti-mouse CD86试剂盒对细胞进行染色处理，用PBS清洗两次去除残留的抗体。用PBS再次分散细胞，并进行流式细胞仪测试，并计算M2表型的极化比例，其中商品Fibrin glue作为阳性对照组。

实施例3大鼠股动脉止血实验

通过腹腔注射戊巴比妥钠(1.5％，2mL/kg)对SD大鼠(雄性，200–250g)进行麻醉，小心切开SD大鼠皮肤以暴露出股动脉，并使用20G针头刺破动脉血管；然后快速将300μL水凝胶注射到出血部位，使用纱布收集流出的血液，观察并记录伤口的止血时间。纱布按压伤口和商品Fibrin glue分别作为阳性对照组，未经任何处理的伤口作为阴性对照组。相对失血量(％)＝M_样品/M_阴性×100％，M为失血量，单位mg，其中M_阴性为阴性对照组2min的失血量，每组样品重复三次。

实施例4兔子股动脉止血实验

通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠(1.5％，2mL/kg)麻醉新西兰白兔(雄性，2–3kg)。将兔子固定在手术台上，小心切开后腿内侧皮肤暴露其股动脉，并用20G针头在股动脉上创建出血模型；将300μL水凝胶注射到出血部位，用已称重的纱布收集流失的血液，并记录止血时间。通过如下公式计算相对失血量：相对失血量(％)＝M_样品/M_阴性×100％，M为失血量，单位为mg，其中M_阴性为阴性对照组2min的失血量。未处理的伤口作为阴性对照组，纱布按压和Fibrin glue分别作为阳性对照组，每组实验重复3次。

实施例5伤口愈合实验

通过腹腔注射戊巴比妥钠(1.5％，2mL/kg)麻醉SD大鼠(雄性，200–250g)，然后在其背部创建直径1cm的圆形皮肤全层缺损模型。然后用无菌PBS快速制备水凝胶并填充伤口，每隔一定时间对伤口进行拍照，并用Image J软件测量伤口面积，计算伤口愈合率。伤口愈合率(％)＝(S₀–S_t)/S₀×100％，S₀和S_t分别代表伤口的初始面积和t时间的面积，PBS和商品Fibrin glue分别作为阴性和阳性对照组，所有样品重复4次，在第3、7、14天，取材伤口部位的组织，并固定在4％多聚甲醛溶液，经石蜡包埋后用切片，并对切片进行病理学分析。

结果

如图1至图6所示，HPMD组M2表型比例显著上调至37.7±6.75％，而空白对照组和商品化粘合剂Fibrin glue组M2的比邻分别为0.04±0.03％和1.29±0.35％(图1)。纱布按压和Fibrin glue组分别需要136±16s和101±11s才能实现股动脉止血，而HPMD良好的组织粘附强度和血管封闭性能，止血时间显著下降至14±2s(图2)。HPMD组相对失血量为5.4±1.0％，远低于纱布和Fibrin glue组，后两者的相对失血量分别为60.3±5.4％和39.0±1.9％(图3)。在兔子股动脉出血模型中，纱布按压5分钟无法完成动脉止血，使用Fibringlue需要131±10s，但HPMD仅需19±2s就能完成止血(图4)。面对兔子股动脉出血，使用纱布按压和Fibrin glue处理的相对失血量分别达到42.3±2.9％和28.9±3.2％，而HPMD组的相对失血量明显下降至12.5±0.5％(图5)。经HPMD处理的SD大鼠皮肤全层缺损伤口，14天伤口愈合率达到100％，已经完全愈合，而PBS组和Fibrin glue的14天伤口愈合率仅分别为80％和98％(图6)。可见上述实施例制备的质量浓度为4％的甘露糖修饰聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶作为动脉止血材料，大鼠股动脉止血时间10–20s，相对失血量5–8％；兔子股动脉止血时间15–30s，相对失血量10–14％；用于伤口愈合敷料，甘露糖修饰水凝胶与巨噬细胞共培养48h，可以将38％巨噬细胞极化为M2表型，14天伤口愈合率达到100％。

综上所述，本发明中糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶表现出良好的封闭动脉血管能力，在大鼠肝脏、股动脉和兔子动脉出血模型中均表现出优于Fibrin glue和纱布的止血性能，不足20s即能完成动脉止血。同时，该水凝胶还具有诱导巨噬细胞极化为M2表型的生物活性，有助于调节伤口微环境，为组织再生创造更有利的条件，在大鼠皮肤全层缺损模型中12天便实现伤口愈合，病理学切片也表明该水凝胶处理的伤口具有很低的炎症反应，再生出更厚的肉芽组织和整皮层、更高的胶原表达和毛囊密度，进一步证明本发明的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶作为动脉止血和创面愈合敷料具有重要的临床转化潜力。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其由糖基化聚赖氨酸和聚乙二醇衍生物在室温下快速固化而成，其中所述糖基化聚赖氨酸选自式(1)或(2)中的一种或多种：

式(1)和(2)中，R选自

x、y和z相同或不相同，且均为正整数。

2.根据权利要求1所述的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其特征在于，式(1)所示的糖基化聚赖氨酸中糖基团的接枝率为10％–60％、儿茶酚基团的接枝率为10％–40％；式(2)所示的糖基化聚赖氨酸中糖基团的接枝率为10％–60％。

3.根据权利要求2所述的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其特征在于，式(1)所示的糖基化聚赖氨酸中糖基团的接枝率为25％、儿茶酚基团的接枝率为20％；式(2)所示的糖基化聚赖氨酸中糖基团的接枝率为25％。

4.根据权利要求1所述的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物选自式(3)、(4)、(5)和(6)中的一种或多种：

式(3)至(6)中，m为正整数。

5.根据权利要求1所述的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其特征在于，所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的组织粘附强度为10–20kPa，爆破压力为50–160mmHg。

6.根据权利要求5所述的糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶，其特征在于，所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的质量浓度为4％，爆破压力＞120mmHg。

7.权利要求1至6任一项所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制糖基化聚赖氨酸的溶液为混合液A；

(2)配制聚乙二醇衍生物的溶液为混合液B；

8.根据权利要求7所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的制备方法，其特征在于，所述混合液A的质量浓度为1％–15％；所述混合液B的质量浓度为1％–15％；所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶的质量浓度为1％–15％。

9.权利要求1至6任一项所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶作为或者在制备动脉止血和伤口愈合的药物或医疗用品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物以所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶为活性成分，剂型包括敷剂、凝胶剂或注射剂；

和/或所述医疗用品为纱布，其包含所述糖基化聚赖氨酸-聚乙二醇水凝胶。