CN115025111A - 一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于添加剂制备技术领域，具体涉及一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法及其应用。该方法通过以下步骤实现：将中药组方研磨成粉后加入藻朊酸钠和水，搅拌均匀后，得浆料；进行一次、二次发酵；将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥即可。本发明制备的免疫增强剂，低聚糖含量高达65%，具有提高细胞活力、广谱抗病毒的作用；提取率高，添加量少，具有提升白羽肉鸡成活率，改善肠道菌群，提升饲料转化率的作用，大大节省了养殖成本。本发明制备的免疫增强剂能够明显加强H9和新城疫血清中的抗体水平，能够增强免疫应答、提高疫苗免疫后抗体水平的效果。

Description

一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于添加剂制备技术领域，具体涉及一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法及其应用。
背景技术
近几年，随着养殖业突飞猛进的发展，疾病的数量和种类明显增多，免疫抑制性疾病普遍流行。对于养禽业来说，增强禽类机体免疫力，提高饲料转化率是是促进我国养禽业健康发展的重大问题。已有研究表明：低聚糖对免疫功能提高和饲料转化率提升具有正向影响，因此低聚糖类产品养殖业中发挥着越来越重要的作用。
中医是我国的传统瑰宝，中药材体系包含了真菌、矿物质、动物源和植物源等材料。中药材体系是我们筛选免疫增强剂的宝库。将中药材组方后进行发酵并提取低聚糖，一方面能够促进动物体的吸收、增加有益菌群从而抑制有害菌的生长，另一方面，发酵后能够降低药物毒性，提高中药的药效。
但是，目前市场的提取方法，更多的是将中药进行粉碎后，加入如枯草芽孢杆菌、乳酸菌类等菌种或者其代谢产物，其药效究竟能够提高多少，无从得知。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法。
本发明还提供了上述复合低聚糖免疫增强剂在养殖业上应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明提供了一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将中药组方研磨成粉后加入藻朊酸钠和水，搅拌均匀后，得浆料；
（2）浆料中加入酵母菌，进行一次发酵；
（3）一次发酵结束后，加入少量植酸，搅拌均匀后，再次加入桦褐孔菌和香菇菌，进行二次发酵；
（4）将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥即可。
进一步的，步骤（1）中，所述藻朊酸钠的加入量占中药组方重量的3%；所述中药组方和水的质量比为1：5。
本发明发酵所使用的中药组方为：炒莱菔子1-3g、连翘1-3g、麦芽1-3g、附子1-3g、黄连1-3g、黄芩1-3g、神曲2-4g、大黄2-4g、白芍2-4g、防风2-4g、陈皮2.5-3g、半夏3-5g、茯苓3-5g、白术3-5g、山楂6-10g。
进一步的，步骤（2）中，所述酵母菌的接种量为2%。
进一步的，所述一次发酵的条件为：在37-40℃温度下发酵8-10d。
进一步的，步骤（3）中，所述植酸的加入量为至发酵体系的pH值为6.0-6.5；所述桦褐孔菌和香菇菌的接种量为2%；所述桦褐孔菌和香菇菌的比例为1：1。
进一步的，所述二次发酵的条件为：在25-28℃下发酵5-6d。
进一步的，步骤（4）中，所述喷雾干燥的压力为2.8-3.0MPa，孔径为0.5mm。
本发明还提供了一种利用上述制备方法制备得到的复合低聚糖免疫增强剂在养殖业中作为添加剂的应用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的复合低聚糖免疫增强剂，低聚糖含量高达65%，具有提高细胞活力、广谱抗病毒的作用。
（2）本发明制备的复合低聚糖免疫增强剂，提取率高，养殖过程中，添加量少，具有提升白羽肉鸡成活率，改善肠道菌群，提升饲料转化率的作用，大大节省了养殖成本。
（3）本发明制备的复合低聚糖免疫增强剂能够明显加强H9和新城疫血清中的抗体水平，能够增强免疫应答、提高疫苗面以后抗体水平的效果。
附图说明
图1为实施例1复合低聚糖免疫增强剂细胞活力检测图。
图2为复合低聚糖免疫增强剂对PEDV病毒抑制作用图。
图3为复合低聚糖免疫增强剂对药物代谢影响图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
（1）称取炒莱菔子1份、连翘1份、麦芽1份、附子1份、黄连1份、黄芩1份、神曲2份、大黄2份、白芍2份、防风2份、陈皮2.5份、半夏3份、茯苓3份、白术3份、山楂6份，以kg计，混合均匀，得混合物；
（2）将中药混合物研磨成粉后加入占其重量3%藻朊酸钠及5倍重量的水，搅拌均匀后，得浆料；
（3）浆料中加入2%的酵母菌，在37-40℃温度下发酵10d；
（3）一次发酵结束后，加入植酸调节PH至6.1，搅拌均匀后，再次加入2%的桦褐孔菌和香菇菌（1:1），然后在26-28℃下发酵6d；
（4）将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥（2.8MPa，孔径为0.5mm）即可。
实施例2
（1）将中药混合物（配方同实施例1）研磨成粉后加入占其重量3%藻朊酸钠及5倍重量的水，搅拌均匀后，得浆料；
（3）浆料中加入2%的酵母菌，在37-40℃温度下发酵8d；
（3）一次发酵结束后，加入植酸调节PH至6.5，搅拌均匀后，再次加入2%的桦褐孔菌和香菇菌（1：1），然后在26-28℃下发酵5d；
（4）将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥（2.8MPa，孔径为0.5mm）即可。
对比例1
（1）称取炒莱菔子1份、连翘1份、麦芽1份、附子1份、黄连1份、黄芩1份、神曲2份、大黄2份、白芍2份、防风2份、陈皮2.5份、半夏3份、茯苓3份、白术3份、山楂6份，以kg计，混合均匀，得混合物；
（2）将中药混合物研磨成粉后加入5倍重量的水，搅拌均匀后，得浆料；
（3）浆料中加入2%的酵母菌，在37-40℃温度下发酵10d；
（3）一次发酵结束后，加入植酸调节PH至6.1，搅拌均匀后，再次加入2%的桦褐孔菌和香菇菌，然后在26-28℃下发酵6d；
（4）将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥（2.8MPa，孔径为0.5mm）即可。
对比例2
（1）称取炒莱菔子1份、连翘1份、麦芽1份、附子1份、黄连1份、黄芩1份、神曲2份、大黄2份、白芍2份、防风2份、陈皮2.5份、半夏3份、茯苓3份、白术3份、山楂6份，以kg计，混合均匀，得混合物；
（2）将中药混合物研磨成粉后加入占其重量3%藻朊酸钠及5倍重量的水，搅拌均匀后，得浆料；
（3）浆料中加入2%的酵母菌，在37-40℃温度下发酵10d；
（3）一次发酵结束后，加入2%的桦褐孔菌和香菇菌，然后在26-28℃下发酵6d；
（4）将发酵后的产物，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥（2.8MPa，孔径为0.5mm）即可。
效果实施例1
将实施例1及对比例1和对比例2制备的发酵液进行喷雾干燥后，统计出粉率，具体计算方法为：出粉率（%）=最终产物（喷雾后）/料液固形物的量（喷雾前）×100%，具体结果见表1。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
效果实施例2
将实施例1得到的复合低聚糖免疫增强剂针对细胞活力进行检测。将复合低聚糖免疫增强剂使用培养基按照10-1至10-6的比例进行稀释，随后加到含有细胞的96孔板中，置于37摄氏度细胞培养箱中培养。培养24和48小时时，测定细胞活力，统计数据分析。具体结果如图1所示。
通过图1可以看出，10倍稀释的复合低聚糖免疫增强剂，在24h和48h时，对细胞活力略有抑制作用，100倍以上稀释后，在24h和48h，具有增加细胞活力的作用。
效果实施例3
A组将实施例1复合低聚糖免疫增强剂制备成浓度为0.0625g/mL的溶液，37℃处理细胞1h后，按照1μL病毒液的剂量接种Vero细胞，感作1h后，PBS洗涤3遍，更换培养基培养；
B组用实施例1复合低聚糖免疫增强剂制备成终浓度为0.0625g/mL的溶液与PEDV病毒液37℃孵育1h，随后接种病毒，感作1h后PBS洗涤，更换培养基培养；
C组用对比例2复合低聚糖免疫增强剂制备成浓度为0.0625g/mL的溶液，37℃处理细胞1h后，按照1μL病毒液的剂量接种Vero细胞，感作1h后，PBS洗涤3遍，更换培养基培养；
D组用对比例2复合低聚糖免疫增强剂制备成终浓度为0.0625g/mL的溶液与PEDV病毒液37℃孵育1h，随后接种病毒，感作1h后PBS洗涤，更换培养基培养；
E组对病毒不做任何处理，按照正常接毒方式接毒培养。
通过图2可以看出，复合低聚糖免疫增强剂对PEDV具有良好的抑制作用。
具体结果见表2。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
效果实施例4
将实施例1制备得到的复合低聚糖免疫增强剂对肉鸡进行饲喂试验（1g兑水1000L），从而验证其对白羽肉鸡生产性能、鸡群免疫等方面的影响。实验地点选择在临沂费县某养殖场，鸡苗购自民和，管理方式相同，时间为21.11.23-22.1.5。
（1）实验分组及处理
具体如表3所示。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE006
（2）具体生产性能结果见表4。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过表4可以看出，实验组多出栏111只鸡，成活率高于对照组0.62%。且实验组肉料比为1.475，低于对照组的1.525，饲料按照4元/kg，鸡按2.5kg/只计算，每只鸡节省饲料0.5元；实验组出栏体重比对照组高135g；欧洲值差异显著，表明药粉能够显著提升养殖效益。
（3）免疫后抗体应答情况
免疫程序为：7天注射免疫新流二联，点眼免疫新支；21天饮水免疫新城疫四系；自14日龄起，饮水中加入本发明制备的复合低聚糖免疫增强剂。
具体应答情况如表5所示。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE010
通过表5可以看出，该复合低聚糖能够提高机体免疫，增强疫苗的免疫应答，提升抗体效价。
（4）调控肠道菌群
将实验出栏前鸡只的空肠和盲肠，通过肠道微生物宏基因组测序寻找差异的菌株，具体结果见表6。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
通过表6可以看出，在含量前10的微生物中，双歧杆菌增加14倍，副拟杆菌增加157倍，巨单胞菌由0%增加至5%。
（5）棚舍内气味
使用复合低聚糖免疫增强剂后，1舍3.94斤，且舍内气味明显减轻，粪便成形为深灰色。
效果实施例5
验证实施例1制备的复合低聚糖免疫增强剂对肉鸡药物代谢的影响。将30日龄的竹丝鸡（公母各半），饮水给药，连续给药（强力霉素）5d，停药后饲喂复合低聚糖免疫增强剂（1g兑水60L），饲喂不同时间后，屠宰并收集肌肉、肝脏、脂肪和肾脏，然后采用HPLC-MS测定上述组织中的强力霉素含量，具体如图3所示。
从图3中可以看出，除肾脏浓度增加外，其他组织中药物含量均低于对照组（仅饮用水），表明本发明制备的复合低聚糖免疫增强剂具有增强机体代谢，促进药物排出的作用。

Claims (9)

1.一种复合低聚糖免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将中药组方研磨成粉后加入藻朊酸钠和水，搅拌均匀后，得浆料；
（2）浆料中加入酵母菌，进行一次发酵；
（3）一次发酵结束后，加入少量植酸，搅拌均匀后，再次加入桦褐孔菌和香菇菌，进行二次发酵；
（4）将发酵后的产物加入碳酸氢钠调节至中性，搅拌均匀，静置30min后，挤压过滤，然后将发酵液进行喷雾干燥即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述藻朊酸钠的加入量占中药组方重量的3%；所述中药组方和水的质量比为1：5。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述中药组方为：炒莱菔子1-3g、连翘1-3g、麦芽1-3g、附子1-3g、黄连1-3g、黄芩1-3g、神曲2-4g、大黄2-4g、白芍2-4g、防风2-4g、陈皮2.5-3g、半夏3-5g、茯苓3-5g、白术3-5g、山楂6-10g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酵母菌的接种量为2%。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述一次发酵的条件为：在37-40℃温度下发酵8-10d。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述植酸的加入量为至发酵体系的pH值为6.0-6.5；所述桦褐孔菌和香菇菌的接种量为2%；所述桦褐孔菌和香菇菌的接种量比例为1:1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述二次发酵的条件为：在25-28℃下发酵5-6d。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述喷雾干燥的压力为2.8-3.0MPa，孔径为0.5mm。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的复合低聚糖免疫增强剂在养殖业中作为添加剂的应用。
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