CN115023232A - 使用莫洛替尼治疗关节炎症的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了使用莫洛替尼(MMB)在受试者中治疗关节炎症，包括类风湿性关节炎的方法。

Description

使用莫洛替尼治疗关节炎症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年1月29日提交的美国临时申请第62/967,376号；以及2020年6月1日提交的美国临时申请第63/033,082号的优先权，两者均通过引用整体并入本文。

背景技术

Janus激酶(JAK)充当协调炎症、先天性和适应性免疫以及红细胞生成的信号传导枢纽。因此，JAK抑制剂(JAKi)已被批准用于包括关节炎症在内的多种适应症，而其他适应症则处于后期临床开发阶段。不幸的是，其中一些药物会抑制JAK依赖性红细胞生成，从而加剧炎症相关性贫血，导致潜在的剂量不足和治疗益处降低。

例如，批准的类风湿性关节炎口服疗法，包括JAK抑制剂类，与一系列副作用有关，包括骨髓抑制和贫血，它们在慢性病性贫血(ACD)的情况下可能会加剧。ACD，有时称为炎症性贫血，可导致循环铁减少，从而导致红细胞生成的铁限制性抑制。高达65％的类风湿性关节炎患者也可能出现ACD。目前，这些副作用是通过标签驱动的剂量修改来管理的，这可能导致次优暴露和潜在的临床益处降低。

临床上，ACD可与其他形式的贫血区别开(Madu,Med Princ Pract.2017；26(1):1-9.)。ACD和缺铁性贫血(IDA)之间的主要区别在于，在IDA中，铁绝对缺乏(血清铁蛋白低于30ng/mL)(Poggiali,Eur J Intern Med.2014；25:12-17.)，而ACD的发病机制是多因素的，由于铁被隔离，因此不能用于红细胞生成。在ACD中，转铁蛋白增加，而血清铁和转铁蛋白饱和度降低，而无红细胞原卟啉、血清铁蛋白和骨髓染色铁增加(Spivak,Oncology 2002；16:25-33.)。铁调素也增加了(Ganz,N Engl J Med.2019；381:1148-1157.)。这些生物标志物可能有助于识别类风湿性关节炎患者，这些患者也患有慢性病铁限制性贫血，其可从目前批准的JAK抑制剂中获得有限的临床益处。

斯蒂尔病(Still’s disease,SD)是一种自身炎症性疾病，其特征是峰热(spikingfever)、皮疹、多关节痛、喉咙痛，甚至危及生命的并发症，如巨噬细胞活化综合征和暴发性肝炎。细胞因子的过度和不当产生是SD发病机制的基石。血清铁蛋白被认为是斯蒂尔病有用的诊断和疾病活动标志物(Hu,Annals of the Rheumatic Diseases 2020；79:842-844.)。血清铁蛋白水平通常高于任何其他自身免疫性疾病或炎症性疾病，并且3,000-30,000μg/L之间的非常高水平并不少见(Bagnari,Rheumatol Int.2010；30(7):855-62.)。在许多研究中，1,000μg/L的铁蛋白水平临界值已被用于指示斯蒂尔病(Fautrel,Joint BoneSpine 2002；69(4):355-7.)。铁调素也可在这种疾病中增加(Lopez-Aparicio,EJCRIM2015；2(6).)。阻断多种细胞因子的促炎作用的JAK抑制剂可能对SD患者有益。能够阻断多种细胞因子的促炎作用并且也能够通过ACVR1抑制降低铁调素的JAK抑制剂可能对这种疾病更有益。

JAK抑制剂莫洛替尼(momelotinib，MMB)已被证明可以纠正大鼠模型中的贫血，这种效果已在接受MMB治疗的骨髓纤维化患者中得到临床重现。随后，MMB对贫血有益的分子基础被确定是由于其对1型激活素受体(ACVR1)的有效抑制，导致铁调素减少，从而增加全身铁可用性并改善红细胞生成。

治疗和预防关节炎症，包括类风湿性关节炎，同时治疗和预防炎症相关性贫血的方法是令人感兴趣的。

治疗和预防类风湿性关节炎，同时治疗和预防炎症相关性贫血的方法是令人感兴趣的。

治疗和预防斯蒂尔病，同时治疗和预防炎症相关性贫血的方法是令人感兴趣的。

发明内容

本文公开了治疗关节炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的莫洛替尼(MMB)或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，受试者患有关节炎。在一些实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，改善关节炎的一种或多种症状包括减少关节体积。在一些实施方案中，与施用治疗有效量的MMB之前的关节体积相比，关节体积减少至少2％。在一些实施方案中，与施用治疗有效量的MMB之前的关节体积相比，关节体积减少至少5％。

在一些实施方案中，治疗关节炎症包括改善受影响组织的肿胀，如通过发炎关节的直径减小所测量的。在一些实施方案中，与施用治疗有效量的MMB之前的发炎关节的直径相比，发炎关节的直径减小至少2％。

在一些实施方案中，治疗关节炎症包括在施用治疗有效量的MMB后减少受试者的血液嗜中性粒细胞计数。在一些实施方案中，治疗关节炎症包括减少脾和/或滑膜组织中的骨髓细胞浸润。在一些实施方案中，治疗关节炎症包括减少滑膜组织中的粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞中的至少一种。在一些实施方案中，炎性巨噬细胞是CD11b⁺。

在一些实施方案中，将减少滑膜组织中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量与施用MMB之前来自受试者的滑膜组织中的粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量进行比较。在一些实施方案中，粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少10％。在一些实施方案中，粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。

在一些实施方案中，施用治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐导致受试者脾脏中产生IL-17A的辅助性T淋巴细胞(Th17细胞)的数量与施用MMB或其药学上可接受的盐之前受试者的脾脏中Th17细胞的数量相比减少。

在一些实施方案中，施用治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐导致受试者发炎关节的滑膜组织中CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的数量与施用MMB或其药学上可接受的盐之前发炎关节的滑膜组织中CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的数量相比减少。

在一些实施方案中，口服施用MMB或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天或每周施用MMB或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，间歇施用MMB或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，MMB或其药学上可接受的盐的治疗有效量为25-500mg/天。在一些实施方案中，治疗有效量选自：25mg/天、50mg/天、100mg/天、200mg/天、300mg/天、400mg/天和500mg/天。在一些实施方案中，治疗有效量是200mg/天。

在一些实施方案中，治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐被施用1周或更长时间。在一些实施方案中，治疗有效量被施用2周或更长时间或3周或更长时间。在一些实施方案中，治疗有效量被施用3周或更长时间。

在本公开的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。

本文还公开了治疗受试者的关节炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的莫洛替尼(MMB)或其药学上可接受的盐，以及向所述受试者施用一种或多种额外的抗炎剂。在一些实施方案中，一种或多种额外的抗炎剂是抗关节炎剂。

附图说明

本发明的这些和其他特征、方面和优点将通过以下描述和附图得到更好的理解，其中：

图1A显示了JAK和ACVR1信号传导的示意图；图1B显示了通过JAK和ACVR1的信号传导的下游效应子的示意图。

图2A是用和不用MMB治疗的大鼠后肢的照片；图2B是用卡尺测量的用媒介物或各种浓度的MMB治疗的大鼠的后肢直径的图形表示(给出的两个后肢的总和)；图2C是来自用媒介物或MMB治疗的未免疫和PG-PS免疫大鼠的后肢踝关节的H&E染色切片的代表性照片。

图3A显示了用不同浓度的MMB治疗后PG-PS大鼠中粒细胞数量占CD45⁺脾白细胞百分比的变化；图3B显示了从用和不用MMB治疗的大鼠的后肢踝关节对分离的样品中滑膜粒细胞、CD11b⁺巨噬细胞和单核细胞的数量的变化。

图4A显示了用MMB治疗后PG-PS大鼠中脾Th1、Th17和Treg细胞数量占CD45⁺脾T细胞百分比的变化；图4B显示用MMB治疗后大鼠后肢踝关节中滑膜CD4⁺和CD8⁺T细胞数量的变化。

图5是概述通过注射胶原抗体在小鼠中诱导关节炎的实验过程的示意图。

图6A-6C显示用媒介物、地塞米松、依那西普或MMB(20、30或50mg/kg)治疗的CAIA小鼠中平均总关节炎评分(图6A)、平均后爪关节炎评分(图6B)和平均后爪厚度(图6C)的变化。

图7A-7F显示MMB减少PG-PS大鼠RA中的全身炎症、关节损伤和Th17细胞分化。显示的是热呈递脾脏和肝细胞因子表达、血液白细胞和粒细胞计数(图7A)，代表性照片和总后肢厚度表明MMB治疗减少了后肢关节肿胀(图7B)、代表性H&E染色的后肢关节切片表明MMB治疗减轻了软骨损伤(图7C)、流式细胞术数据表明MMB治疗21天后减少了动物后肢滑膜中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞的浸润(图7D)、流式细胞术数据表明MMB治疗21天后抑制了脾Th17细胞的分化而不影响Th1和调节性Treg细胞(图7E)，以及流式细胞术数据描绘了MMB治疗21天后显著降低了后肢滑膜组织中CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润(图7E，7F)。

图8显示MMB在PG-PS大鼠RA中降低铁调素并纠正贫血。

图9A-9C显示了MMB在CAIA鼠关节炎中的临床活性和非劣效性(non-inferiority)。显示了动物的平均临床评分(图9A)、平均后爪评分(图9B)和平均后爪厚度(图9C)。

具体实施方式

定义

除非另有说明，否则在权利要求和说明书中使用的术语定义如下。

术语“改善”是指在疾病状态例如关节炎疾病状态的治疗中的任何治疗上有益的结果，包括预防、减轻其严重性或进展、缓解或治愈。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列当比较和比对以获得最大对应时具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比，如使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其他算法)或通过目测测量的。根据应用，“同一性”百分比可以存在于被比较序列的一个区域中，例如，存在于功能域中，或者，存在于要比较的两个序列的全长中。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要的话指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

出于本文的目的，百分比同一性和序列相似性使用BLAST算法进行，该算法描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

如本文所用，术语“受试者”泛指任何动物，包括但不限于人类和非人类动物(例如，狗、猫、牛、马、羊、猪、家禽、鱼、甲壳类动物等)。

如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益或期望结果的组合物(例如，合成肽)的量。有效量可以在一次或多次给药、应用或剂量中施用，并且是不意欲限于特定的制剂或给药途径。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

如本文所用，术语“施用”和“给药”是指向受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其他药剂或治疗性处理(例如肽)的行为。对人体的示例性给药途径可以是通过脑或脊髓的蛛网膜下的空间(鞘内)、眼睛(眼科)、嘴(口腔)、皮肤(局部或透皮)、鼻(鼻子)、肺(吸入)、口腔粘膜(颊或舌)、耳、直肠、阴道、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。

如本文所用，术语“治疗”是指获得有益或预期临床结果的方法。有益或预期临床结果可以包括减轻症状、降低疾病的严重程度、抑制疾病或病症的根本原因、将疾病稳定在非晚期状态、延缓疾病的进展，和/或改善或减轻疾病状况。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性成分与惰性或活性载体的组合，使得该组合物特别适用于体外、体内或离体的治疗或诊断用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于受试者时基本上不产生不良反应，例如毒性、过敏或免疫反应的组合物。

必须注意，如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

莫洛替尼(MMB)

一方面，本公开提供了化合物莫洛替尼(MMB)的使用方法。MMB有时称为CYT387。化合物MMB也通过化学名称识别：N-(氰基甲基)-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺。MMB的盐，包括药学上可接受的盐，溶剂化物、水合物和/或多晶型物形式可用于本文公开的主题方法中。

MMB是一种在国际专利申请第PCT/US2015/035316号和国际专利公开第WO2008/109943号中公开的化合物，其公开内容通过引用并入本文。本领域技术人员将在国际专利公开第WO2008/109943号中找到可用于合成MMB的方法。

表1显示了MMB化合物的结构。

在一些情况下，使用MMB的药学上可接受的盐。在一些情况下，可用于本发明方法的MMB盐是盐酸盐。在一些情况下，MMB盐是二盐酸盐。在一些情况下，MMB盐是单盐酸盐。在一些情况下，MMB盐是水合物，例如一水合物。

“溶剂化物”是由溶剂和化合物的相互作用形成的。还提供了本文所述化合物的盐的溶剂化物。当溶剂为水时，溶剂化物可称为水合物。MMB或MMB盐的水合物也可用于主题方法。

在一些实施方案中，MMB盐是MMB二盐酸盐一水合物。

在一些实施方案中，MMB盐是无水MMB二盐酸盐。

在一些实施方案中，施用的MMB或MMB盐组合物以多晶型物形式存在，例如美国专利第9,469,613号中描述的多晶型物形式，其公开内容通过引用并入本文。

在一些情况下，MMB多晶型物形式是MMB二盐酸盐一水合物形式II。所述MMB二盐酸盐一水合物形式II的晶型可以具有在T＝100°K具有以下晶胞参数的晶体：

α＝83.297(2)°、β＝87.649(2)°、y＝67.445(2)°和三斜P-1空间群。MMB二盐酸盐一水合物形式II的晶型可以通过基本上如美国专利第9,469,613号的图5中所示的X射线粉末衍射(XRPD)图来表征。MMB二盐酸盐一水合物形式II的晶型可以通过在约7.7°、19.3°、24.0°、25.7°和29.6°2-θ±0.2°2-θ处具有峰的X射线粉末衍射(XRPD)图来表征。MMB二盐酸盐一水合物形式II的晶型可以通过基本上如美国专利第9,469,613号的图8中所示的差示扫描量热法(DSC)图来表征。MMB二盐酸盐一水合物形式II的晶型可以通过基本上如美国专利第9,469,613号的图14中所示的动态蒸气吸附(DVS)图来表征。

在一些情况下，本公开的MMB可以具有1至n个被氘原子(D)取代的氢原子，其中n是化合物中氢原子的数目。此类氘代MMB化合物可增加对代谢的抵抗力，因此可用于增加本文所述的化合物在施用于哺乳动物时的半衰期。例如，参见Foster,“Deuterium IsotopeEffects in Studies of Drug Metabolism,”Trends Pharmacol.Sci.,5(12):524-527(1984)。

类风湿性关节炎伴慢性病性贫血(ACD)

同样患有慢性病铁限制性贫血的类风湿性关节炎患者或斯蒂尔病患者可能从目前批准的JAK抑制剂中显示出有限的临床益处。这些患者可以通过测量一些生物标志物来识别。在一些实施方案中，这些患者可能具有高于正常范围的转铁蛋白水平。在一些实施方案中，这些患者还可能具有低于正常范围的血清铁和转铁蛋白饱和度。在一些实施方案中，这些患者的铁调素水平也可能高于正常范围。

给药

如本文所公开，本发明的方法包括施用有效量的MMB。在一个实施方案中，有效量的MMB作为单一疗法施用。本公开提供了一种治疗方法，其中将有效量的MMB施用于受试者。术语“有效量”或“治疗有效量”是指有效改善疾病症状的量，例如，如本文所述。

在本文所述的疾病和病症的治疗或预防中，MMB的合适剂量水平通常为每天每kg患者体重约0.01至500mg，其可以单剂量或多剂量给药。在一些情况下，剂量水平为每天约0.1至约250mg/kg；例如每天约0.5至约100mg/kg。合适的剂量水平可以是每天约0.01至250mg/kg、每天约0.05至100mg/kg或每天约0.1至50mg/kg。在此范围内，剂量可以是每天0.05至0.5、0.5至5或5至50mg/kg。对于口服施用，组合物优选以含有1.0至1000毫克活性成分的片剂形式提供，特别是1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的活性成分。可以选择剂量，例如任何这些范围内的任何剂量，用于治疗效果和/或对要治疗的患者的剂量的症状调整。MMB可以每天1至4次，优选每天一次或两次的方案施用。

应当理解，任何特定患者的具体剂量水平和给药频率可以变化，并取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、特定病症的严重程度以及接受治疗的宿主。

本文还公开了，本公开的方法包括联合治疗，其施用有效量的MMB和共同施用第二有效量的进一步治疗。进一步的治疗包括但不限于施用可用于治疗与CKD相关的疾病或病症的任何方便的额外药剂。在一些情况下，额外药剂是抗高血压剂、抗血脂剂或抗糖尿病剂。

共同给药包括同时施用MMB和所述进一步治疗的方法，其中依次施用MMB和进一步治疗，以及间歇或连续或以下的任何组合：同时、顺序、间歇和/或连续施用MMB和进一步治疗之一或两者。本领域技术人员将认识到间歇施用不一定与顺序施用相同，因为间歇还包括第一次施用药剂，然后在稍后时间再次施用同样的药剂。此外，本领域技术人员理解间歇施用在一些方面还包括顺序施用，因为间歇施用确实包括在再次施用第一药剂之前用不同药剂的施用中断药剂的第一次施用。此外，本领域技术人员还将知道可以通过多种途径实现连续给药，包括静脉滴注或饲管等。

此外，并且以更一般的方式，术语“共同施用”涵盖在任何时间范围内单独施用MMB和单独施用对受试者的进一步治疗重叠的任何和所有方法。

一方面，对受试者施用MMB或进一步治疗的频率包括但不限于Q1d、Q2d、Q3d、Q4d、Q5d、Q6d、Q7d、Q8d、Q9d、Q10d、Q14d、Q21d、Q28d、Q30d、Q90d、Q120d、Q240d或Q365d。术语“QnD或qnd”是指每“n”天一次给药。例如，QD(或qd)是指每天一次或每天一次给药，Q2D(或q2d)是指每两天一次给药，Q7D是指每7天一次或每周一次给药，Q5D是指每5天一次给药，以此类推。一方面，MMB和进一步的治疗以不同的时间表给药。

在一些方面，本公开提供其中通过选自以下的途径施用MMB和/或进一步治疗之一或两者或其任何组合的方法：静脉内、皮下、皮肤、口服、肌肉内和腹膜内。在一些方面，本公开提供了其中MMB和/或进一步治疗之一或两者或其任何组合被静脉内施用的方法。在一些方面，本公开提供其中MMB和/或进一步治疗之一或两者或其任何组合被口服施用的方法。

本领域技术人员应理解，本公开的单位剂型可以相同或不同的物理形式给药，即通过胶囊或片剂口服和/或通过液体经静脉输注等。此外，每次给药的单位剂型可能因特定的给药途径而不同。对于MMB和进一步治疗中的一种或两种，可能存在几种不同的剂型。因为不同的医疗条件可能需要不同的给药途径，本文所述的MMB和进一步治疗的组合的相同成分在组成和物理形式上可能完全相同，但可能需要以不同的方式并且可能在不同的时间施用以缓解病症。病症，例如持续性恶心(尤其伴随呕吐)的可能会导致难以使用口服剂型，在这种情况下，可能需要施用另一种单位剂型，该单位剂型甚至可能与之前或之后使用的其他剂型相同，通过吸入、口腔、舌下或栓剂途径代替或同时使用。特定剂型可能是MMB和进一步治疗的一些组合的要求，因为可能存在各种因素如化学稳定性或药代动力学的问题。

在一些方面，MMB的有效量小于或等于最大耐受剂量(MTD)、小于或等于最高非严重毒性剂量(HNSTD)、或小于或等于未观察到的不良反应水平(NOAEL)。

一般而言，本公开的化合物将以治疗有效量通过对于具有相似效用的药剂的任何可接受的给药方式给药。本技术化合物(即活性成分)的实际量将取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力、给药途径和形式，以及技术人员熟知的其他因素。该药物可以每天至少给药一次，优选每天一次或两次。

此类药剂的有效量可以通过常规实验容易地确定，最有效和最方便的给药途径和最合适的制剂也可以确定。本领域中可获得各种制剂和药物递送系统。参见，例如，Gennaro,A.R.,ed.(1995)Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,MackPublishing Co.

最初可以使用本领域熟知的多种技术来估计治疗有效剂量。动物研究中使用的初始剂量可能基于细胞培养试验中确定的有效浓度。例如，可以使用从动物研究和细胞培养测定中获得的数据来确定适合人类受试者的剂量范围。

药剂如MMB的有效量或治疗有效量或剂量是指导致受试者症状改善或存活延长的药剂或化合物的量。此类分子的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，通过确定最大耐受剂量(MTD)、最高非严重毒性剂量(HNSTD)、未观察到的不良反应水平(NOAEL)，或LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性与疗效的剂量比是治疗指数，可以表示为MTD、HNSTD、NOAEL或LD₅₀与ED₅₀的比值。优选表现出高治疗指数的药剂。

有效量或治疗有效量是研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的将引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物或药物组合物的量。剂量特别落在循环浓度范围内，包括毒性很小或没有毒性的ED₅₀。根据所用剂型和/或所用给药途径，剂量可在此范围内变化。应根据本领域已知的方法，考虑到受试者病情的具体情况，选择确切的制剂、给药途径、剂量和给药间隔。

可以单独调整剂量和间隔以提供足以实现所需效果的活性部分的血浆水平；即最小有效浓度(MEC)。每种化合物的MEC会有所不同，但可以根据例如体外数据和动物实验进行估算。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。

给药的药剂或组合物的量可以取决于多种因素，包括接受治疗的受试者的性别、年龄和体重、疾病的严重程度、给药方式和开药医生的判断。

单位剂型是本领域技术人员通常理解的术语。单位剂型是针对特定用途销售的药物产品。药物产品包括活性成分和任何非活性成分，最常见的是药学上可接受的载体或赋形剂。可以理解，多单位剂型是不同的药物产品。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含MMB二盐酸盐一水合物的单位剂型。在一些实施方案中，单位剂型包含MMB或其药学上可接受的盐，其量相当于约10mg至约1000mg、约10mg至约800mg、约10mg至约700mg、约10mg至约500mg、约10mg至约400mg、约10mg至约300mg、约10mg至约250mg、约10mg至约200mg、约10mg至约150mg、约10mg至约100mg、约10mg至约50mg、约50mg至约1000mg、约50mg至约800mg、约50mg至约700mg、约50mg至约500mg、约50mg至约400mg、约50mg至约300mg、约50mg至约250mg、约50mg至约200mg、约50mg至约150mg、约50mg至约100mg、约100mg至约1000mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约250mg、约100mg至约200mg、约150mg至约300mg、约150mg至约250mg、约150mg至约200mg、约200mg至约300mg、约200mg至约250mg，或者约200mg至约300mg。在一些情况下，该量是根据存在的MMB游离碱确定的。

药物组合物

本文描述了用于治疗关节炎症(例如，类风湿性关节炎)的方法。本公开的所述方法包括施用治疗有效量的MMB。MMB可以配制成药物组合物。除了活性化合物之外，这些组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且不应该干扰活性成分的效力。载体或其他材料的确切性质可取决于给药途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内、腹膜内途径。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在痛苦部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液形式，该水溶液无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

本技术不限于任何特定的组合物或药物载体，因为它们可以变化。一般而言，本技术的化合物将作为药物组合物通过以下途径中的任一种给药：口服、全身(例如，透皮、鼻内或通过栓剂)或肠胃外(例如，肌内、静脉内或皮下)给药。优选的给药方式是口服，使用方便的每日给药方案，可以根据痛苦程度进行调整。组合物可以采取片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉末、缓释制剂、溶液、混悬剂、酏剂、气雾剂或任何其他合适的组合物的形式。施用本技术化合物的另一种优选方式是吸入。

制剂的选择取决于多种因素，例如给药方式和原料药的生物利用度。对于通过吸入递送，该化合物可以配制成液体溶液、悬浮液、气溶胶推进剂或干粉并装入合适的分配器中用于给药。有几种类型的药物吸入装置——雾化吸入器、计量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。雾化器装置产生高速气流，导致治疗剂(以液体形式配制)以雾状喷出，并被带入受试者的呼吸道。MDI通常是用压缩气体包装的配方。在启动时，该装置通过压缩气体排出测量量的治疗剂，从而提供了一种可靠的方法来管理一定量的治疗剂。DPI以自由流动的粉末形式分配治疗剂，该粉末可以通过设备在呼吸期间分散在受试者的吸气气流中。为了获得自由流动的粉末，治疗剂与赋形剂如乳糖一起配制。测量量的治疗剂以胶囊形式储存并在每次启动时分配。

本技术化合物的药物剂型可以通过本领域熟知的任何方法制备，例如通过常规混合、筛分、溶解、熔融、制粒、糖衣丸制备、压片、悬浮、挤出、喷雾干燥、研磨、乳化、(纳米/微米)封装、包埋或冻干过程。如上所述，本技术的组合物可以包括一种或多种生理上可接受的非活性成分，其有助于将活性分子加工成药物用途的制剂。

基于通过增加表面积(即减小颗粒大小)可以增加生物利用度的原理，已经开发了特别用于生物利用度差的药物的药物制剂。例如，美国专利第4,107,288号描述了一种药物制剂，其颗粒尺寸范围为10至1,000nm，其中活性材料负载在大分子的交联基质上。美国专利第5,145,684号描述了药物制剂的生产，其中药物在表面改性剂的存在下被粉碎成纳米颗粒(平均粒径为400nm)，然后分散在液体介质中，得到显示出非常高的生物利用度的药物制剂。

组合物通常由本技术的化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂组合而成。可接受的赋形剂是无毒的，有助于给药，并且不会对要求保护的化合物的治疗益处产生不利影响。这种赋形剂可以是本领域技术人员通常可获得的任何固体、液体、半固体或在气溶胶组合物的情况下是气体赋形剂。

固体药用赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选的液体载体，特别是用于注射溶液的载体，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇。

压缩气体可用于以气溶胶形式分散本技术的化合物。适合此目的的惰性气体是氮气、二氧化碳等。其他适合的药物赋形剂及其制剂描述于Remington's PharmaceuticalSciences,E.W.Martin编辑(Mack Publishing Company,18th ed.,1990)。

如果需要，本发明的组合物可以装在含有一种或多种含有活性成分的单位剂型的包装或分配装置中。例如，这种包装或装置可以包括例如金属或塑料箔，例如泡罩包装或玻璃，以及橡胶塞，例如在小瓶中。包装或分配装置可能附有给药说明。包含配制在相容的药物载体中的本技术化合物的组合物也可以被制备，放置在合适的容器中，并标记用于治疗指示的病症。

制剂中化合物的量可以在本领域技术人员使用的全部范围内变化。通常，该制剂将包含基于总制剂的重量百分比(wt％)约0.01-99.99wt％的本技术化合物，余量为一种或多种合适的药用赋形剂。优选地，该化合物以约1-80wt％的水平存在。

实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供的实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但当然应该允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。

方法

动物房

Lewis大鼠和DBA/1小鼠购自Charles River。Lewis大鼠在到达后最多3天被免疫。在断奶年龄购买小鼠，并在开始实验前适应3周。所有动物都在12:12小时的光照:黑暗循环中饲养，随意提供标准动物食物(SNIFF，166mg/kg铁)。每天至少监测一次动物的健康状况和福利。

PG-PS大鼠关节炎模型

用腹膜内(IP)给药的15mg/kg链球菌肽聚糖-多糖(PG-PS)对六周大的雌性Lewis大鼠进行免疫。两周后开始使用感兴趣的抗炎药进行治疗，并持续7天(短期)至21天(长期)。如下所述监测疾病进展(参见关节病理学、临床评分和生物成像)。每周收集一次血样并如下所述进行处理。在实验结束时，如本文所述收集和处理血液、血清和器官样品。

胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型

六周大的雄性小鼠用在完全弗氏佐剂(CFA，每只小鼠200μL乳液)中的鸡II型胶原蛋白(200μg/剂量/动物)进行免疫，在14天内在尾基处皮内施用两次。感兴趣的抗炎药治疗将在第一次免疫后第28天开始，并再持续7天(短期)或21天(长期)。通过卡尺测量后肢关节直径和确定基于动物关节肿胀的临床评分来活体监测症状的发展。在实验结束时，如本文所述收集和处理血液、血清和器官样品。

组织处理和细胞分离

脾脏和淋巴结细胞通过PBS中的100μm细胞过滤器(Corning)对器官进行机械加压分离。为了分离大鼠滑膜浸润，后肢没有皮肤、骨骼和主要肌腱。将剩余的组织切碎并用0.16U Liberase TM、10μg/mL Dnase I和60U透明质酸酶I在RPMI中在37℃消化1小时。将血液收集到肝素化试管中并直接用于血细胞计数测定。对于血液白细胞的免疫表型分析，通过用ACK缓冲液(150mM NH₄Cl、10mM KHCO₃、0.1mM EDTA)裂解从红细胞中去除血样。

血液学和铁参数测定和组织学染色

用Scil ABC Vet Counter(Horiba Medica)测量血细胞计数。

转铁蛋白和铁调素浓度用商业ELISA试剂盒评估。使用来自BioAssay Systems的商业试剂盒测量血清/血浆和器官非血红素铁浓度。

使用市售试剂盒(QuantiChrom)测定血清和组织铁含量。使用Pearls的普鲁士蓝染色法在福尔马林固定、石蜡包埋材料的3-5μm厚切片中使用Iron Stain Kit(Sigma)观察脾脏和肝脏中的铁沉积物。

流式细胞术

流式细胞术染色如在Parajuli等人Int.J.Cancer 126:896-908,2010中所述进行，其通过引用整体并入本文。使用Cytoflex S设备(Beckman Coulter)和FACS Symphony(Beckton Dickinson)进行测量，分别能够检测13和52个荧光参数，以及自动绝对细胞计数测定。

对于细胞内细胞因子/转录因子染色，在Golgi Stop(BD Bioscience)的存在下，用佛波醇12,13-二丁酸酯(PDBu)和离子霉素(分别为50ng/mL和500ng/mL)重新刺激大鼠和鼠T细胞4小时。总之，每个物种(大鼠、小鼠)建立了五个多色抗体组(血液白细胞、器官白细胞、Th细胞亚型的细胞内染色、血液网织红细胞、骨髓红细胞生成)。使用FlowJo软件进行数据分析。

免疫荧光显微镜

免疫荧光(IF)显微镜被用作观察小鼠关节T细胞和粒细胞浸润的主要技术。由于酶促组织消化后细胞产量低，使用流式细胞术对小鼠滑膜组织进行更精确的免疫表型分析并不实用。

IF显微镜检查是用福尔马林固定的石蜡包埋的小鼠踝关节材料进行的，如Tymoszuk等人Eur.J.Immunol.44:2247-2262,2014和Tymoszuk等人BMC Cancer 14:257,2014中所述，其每一个在此通过引用整体并入。简而言之，将3-5μm样品切片脱蜡、再水化并在柠檬酸盐缓冲液(在95℃ pH 6.0)中进行抗原修复。染色使用抗CD3(克隆17A2)、抗CD4(GK1.5)、抗IL-17A(TC11-18H10)、抗Ly6G(1A8)、抗Ly6C(HK1.4)和F4/80(BM8)抗体和适当的二级试剂进行。用Axioscope(Zeiss)荧光显微镜对样品进行拍照。

细胞因子测定

将如Asshoff等人Blood 129:1823-1830,2017中所述进行RNA和蛋白质分离、qRTPCR和用器官样品(肝脏、脾脏、滑膜组织)进行蛋白质印迹，该文献通过引用整体并入本文。简而言之，qRT PCR用于确定选定的铁转换蛋白(如Fpn1/Slc40a1、TfR1和铁调素)、JAK/STAT的转录靶标(Irf1、Socs1、Socs3、Stat1、Stat3)和AVCR1/SMAD途径(Smad1/2/3/4、Fos、Pdgfb、Dusp1)以及选定的细胞因子、炎症和Th亚群标志基因(Il1b、Il2、Il4、IL5、Il6、Il8、Il10、IL12a、IL12b、Il17a、Il21、Il22、Tgfb1、Tnf、CRP、iNOS、Arg1、Rankl、MMP1、MMP4、MMP6、MMP9、BMP4)的转录水平。蛋白质印迹用于评估铁转换蛋白(FPN1、铁蛋白、TfR1)的蛋白质水平、JAK/STAT活性(磷酸化和总STAT1和STAT3)和AVCR1/SMAD途径(磷酸化和总SMAD1/2/3、总SMAD4)。

血清和回忆(recall)培养上清液细胞因子水平使用ProcartaPlex细胞因子组(小鼠Th细胞因子亚群：EPX170-26087-901，大鼠：EPX140-30120-901，均来自Thermo Fisher)和因斯布鲁克医科大学提供的多重检测管道测定。

Th17回忆测定

从对照和药物处理的CAIA动物中分离出的脾细胞和淋巴结细胞在96孔板中培养，其中含有50μg/mL鸡胶原蛋白的RPMI1640培养基补充有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸和β-巯基乙醇。在培养开始两天后，通过细胞因子多重分析(cytokine multiplex)检测培养上清液中的细胞因子浓度。

关节病理学、临床评分和生物成像

通过用游标卡尺测量后肢踝关节直径来定期监测所有动物模型中的关节炎进展(体积＝D×d²π/6，D和d是在垂直轴上测量的踝关节直径，D>d)。在鼠关节炎模型中，动物还通过评估每只动物肢体肿胀和活动性的系统进行临床评分，如Inglis等人ArthritisRes.Ther.8:R113,2007中所述，将其通过引用整体并入本文。实验动物的每只爪子分别评估如下：0-正常，1-轻微肿胀或红斑，2-明显肿胀，3-关节僵硬。将每只动物的爪子得分相加，每只小鼠最多得到12分。评分由对小组分配不知情的评分者进行。

两种非侵入性生物成像工具——微CT和MRI(磁共振成像)——与图像数据分析结合使用，以追踪关节炎啮齿动物模型中的疾病进展。

在尸检时，选定的代表性动物肢体脱去皮毛和皮肤，并固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。在用HE(小鼠和大鼠)和IF显微镜(仅小鼠)染色的3-5μm厚组织载玻片上研究关节病理学和参数，例如白细胞浸润、肌腱、骨和软骨损伤。

疾病监测和活体血样检查

每周测量关节体积，并对来自每个治疗组的选定代表性动物进行微CT扫描。在CAIA模型中，小鼠也以每周间隔进行临床评分。对于活体采集的血样，确定以下参数：血细胞计数(Hb、WBC、RBC、MCV和网织红细胞)、血浆TF-Sat、铁和铁调素浓度、通过流式细胞术进行的血液白细胞免疫表型分析以及通过细胞因子复合物进行的血浆细胞因子浓度。可以对冷冻血浆样本进行额外的测量。

实施例1：在大鼠模型中评估莫洛替尼(MMB)对关节炎的治疗

使用大鼠慢性关节炎模型(PG-PS诱导)来评估JAK1/2和ACVR1双重抑制剂莫洛替尼(MMB)在体内的效力。在通过PG-PS免疫诱导关节炎后两周，大鼠每天口服MMB(5、10和25mg/kg)或媒介物治疗3周。

通过关节厚度测量和爪评分进行关节炎的连续评估。治疗3周后，通过多色流式细胞术对滑膜免疫细胞浸润和T细胞亚群分化进行量化。通过实时PCR分析细胞因子基因表达。通过测定血红蛋白和血清、脾脏和肝铁水平来评估贫血。

在治疗的最后一天通过卡尺测量，通过每天施用10和25mg/kg的MMB，观察到后肢关节的平均总直径(±SEM[n＝8/组])显著减小(图2A和图2B)。使用Bonferroni事后检验(**p<0.01，***p<0.001)通过单向ANOVA确定统计显著性。图2C显示了来自未免疫大鼠和用媒介物或MMB(10mg/kg)治疗的PG-PS免疫大鼠的后肢踝关节的H&E染色切片的代表性照片。结果表明，双重JAK1/2和ACVR1抑制剂MMB显著抑制关节炎后肢关节的肿胀和软骨破坏。

从所有动物采集脾脏和滑膜组织样本并通过流式细胞术进行评估，以评估在存在和不存在MMB治疗的情况下每个组织中的骨髓细胞群。用25mg/kg MMB治疗3周的PG-PS免疫大鼠显示脾粒细胞(CD45⁺、CD11b/c⁺、粒细胞⁺)显著减少(图3A)。MMB治疗还显著减少在从用PG-PS免疫的大鼠的后肢踝关节对分离的滑膜组织中的粒细胞(CD45⁺、CD11b/c⁺、粒细胞⁺)、炎性CD11b/c⁺巨噬细胞(CD45⁺粒细胞^-CD11b/c⁺巨噬细胞⁺)和单核细胞(CD45⁺粒细胞^-CD11b/c⁺巨噬细胞^-)(图3B)。通过流式细胞术测定脾粒细胞(总脾CD45⁺白细胞的百分比)和滑膜髓细胞(每对踝关节的总计数)，并以平均值±SEM(每组n＝6-10)表示。使用Bonferroni事后检验(*p<0.05，***p<0.001)使用单向ANOVA确定统计显著性。这些结果表明，MMB治疗后的抗关节炎活性是由于炎性骨髓细胞浸润到滑膜中的显著减少。

来自脾脏组织的样本也用于评估未免疫大鼠以及用PG-PS免疫并每天用媒介物或各种浓度的MMB治疗3周的大鼠脾脏中Th1、Th17和Treg细胞的水平。结果显示，MMB治疗导致脾Th17细胞(CD45⁺、CD3⁺、CD8^-、CD4⁺、FOXP3^-、IFN-γ^-、IL17A⁺)显著减少和脾Th1细胞(CD45⁺、CD3⁺、CD8^-、CD4⁺、FOXP3^-、IFN-γ⁺、IL17A^-)减少(图4A)。在MMB治疗后，脾Treg细胞(CD45⁺、CD3⁺、CD8^-、CD4⁺、FOXP3⁺)没有显著改变。

来自大鼠后肢踝关节的滑膜组织样本用于评估用媒介物或各种浓度的MMB治疗的动物中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的水平。MMB治疗导致滑膜CD4⁺和CD8⁺T细胞显著减少(图4B)。

通过流式细胞术测定脾脏T细胞百分比(CD4⁺T细胞)(图4A)和每个后肢踝关节的绝对T细胞计数(图4B)。即使在用最低测试剂量的MMB(5mg/kg)进行治疗后，观察到关节炎踝关节滑膜中CD4⁺T细胞的减少(图4B)。数据表示为平均值±SEM(每组n＝6-10)。使用Bonferroni事后检验(*p<0.05，***p<0.001)使用单向ANOVA确定统计显著性。数据表明，MMB治疗的抗关节炎活性至少部分是通过抑制Th17细胞分化和T细胞募集到滑膜组织中来实现的。

与PG-PS动物中的媒介物治疗相比，在所有测试剂量下，MMB治疗使滑膜组织中的炎性粒细胞和巨噬细胞浸润减少了多于60％。MMB治疗从最低测试剂量(5mg/kg)开始有效地降低了滑膜中的致关节炎Th17细胞分化和整体CD4⁺T细胞，并且在25mg/kg实现关节肿胀的完全缓解。

实施例2：评估莫洛替尼(MMB)治疗DBA/1小鼠中胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)的 效力

为了评估MMB治疗在第二种关节炎动物模型中的效力，通过在第0天静脉注射胶原抗体混合物，然后在第3天腹膜内注射脂多糖(LPS)，在DBA/1小鼠中诱导关节炎。从第0天开始，在整个研究过程中，每天一次用媒介物、MMB(20或50mg/kg)或每天两次用MMB(30mg/kg)口服治疗小鼠。比较对照地塞米松(1mg/kg)或TNF-α抑制剂依那西普(10mg/kg)从第0天开始每天通过腹膜内注射给药。概述实验策略的示意图显示在图5中。

从第5天开始，与媒介物相比，在每日施用MMB(每天50mg/kg或者每天两次30mg/kg)或依那西普后，观察到平均总分(图6A)和后爪关节炎评分(图6B)和平均后爪厚度(图6C)显著降低。与媒介物相比，MMB治疗(每天20mg/kg)还导致第7天和第12天的平均后爪厚度减少(图6C)。地塞米松治疗导致从第4天到第12天的所有测量值减少(图6A-6C)。这些结果证实了MMB的抗关节炎活性，关节炎评分显著且持续降低，这在小鼠胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型中证明了与TNF-α抑制剂依那西普相比的非劣效性。

MMB的抗关节炎活性通过关节炎评分的显著和持续降低得到证实，这在CAIA模型中与TNF-α抑制剂依那西普相比显示非劣效性。与其对ACVR1-铁调素轴的抑制活性一致，MMB降低循环铁调素水平并动员全身铁，从而显著改善大鼠RA相关性贫血。

实施例3：在大鼠模型中评估莫洛替尼(MMB)对类风湿性关节炎的治疗

大鼠类风湿关节炎(RA)模型

用腹膜内(IP)给药的15mg/kg链球菌肽聚糖-多糖(PG-PS)对雌性Lewis大鼠进行免疫，以产生类风湿性关节炎的大鼠模型。大鼠用于评估JAK1/2和ACVR1双重抑制剂莫洛替尼(MMB)在体内的效力。通过用PG-PS免疫诱导类风湿性关节炎两周后，大鼠每天口服MMB(5、10、25mg/kg)或媒介物3或21天治疗。

使用Bonferroni事后检验(N＝5-10每组，*p<0.05，**p<0.01)用单向ANOVA确定RA动物的统计显著性。

通过实时PCR分析细胞因子基因表达。获得血液白细胞的免疫表型和粒细胞计数。通过测定血红蛋白和血清、脾脏和肝铁水平来评估贫血。

治疗3天后，MMB治疗显著降低脾和肝细胞因子表达、血液白细胞和粒细胞计数(图7A)。数据被归一化，分组方式以热图的形式呈现。

治疗21天后，MMB减轻了后肢关节肿胀。图7B显示了健康的、类风湿性关节炎和MMB10(10mg/kg)治疗的大鼠的代表性照片和总后肢厚度。

治疗21天后，MMB疗法减轻了软骨损伤。图7C显示了代表性的H&E染色后肢关节切片。

治疗21天后，MMB减少了动物后肢滑膜中的嗜中性粒细胞(CD45⁺CD11b/c⁺粒细胞⁺)和巨噬细胞(CD45⁺粒细胞-CD11b/c⁺巨噬细胞⁺)的浸润。图7D显示了接受MMB治疗的大鼠的关节嗜中性粒细胞和关节巨噬细胞的流式细胞术(FC)数据。

图7E呈现流式细胞术数据，显示与健康大鼠相比，MMB在治疗21天后抑制脾Th17细胞(CD45⁺、CD3⁺、CD4⁺、FOXP3^-、IFN-γ^-、IL17A⁺)的分化，而不影响RA大鼠的Th1(CD45⁺、CD3⁺、CD4⁺、FOXP3^-、IFN-γ⁺、IL17A^-)和调节性Treg细胞(CD45⁺、CD3⁺、CD8^-、CD4⁺、FOXP3⁺)。

图7F呈现流式细胞术数据，显示MMB在治疗21天后显著降低后肢滑膜组织中的CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润。

治疗21天后，与健康大鼠和RA大鼠相比，MMB在PG-PS大鼠RA中降低了铁调素并纠正了贫血(图8)。

Janus激酶(JAK)协调炎症、免疫和红细胞生成。数种JAK抑制剂(JAKi)被批准用于RA治疗。RA相关性贫血的恶化是JAKi的常见副作用。MMB是一种JAK1/2和激活素受体1(ACVR1)抑制剂，改善了PG-PS大鼠RA模型和骨髓纤维化患者的贫血。

在这里，MMB在大鼠PG-PS关节炎模型中显示出显著的抗RA活性。在大鼠PG-PS模型中，MMB改善了全身炎症、免疫细胞至滑膜组织中的浸润并抑制致关节炎Th17细胞的分化。除了抗关节炎活性外，MMB治疗还减少了铁调素，提高铁的利用率并纠正RA相关性贫血。此外，MMB通过ACVR1抑制减少了炎症驱动的铁调素产生，提高了铁的可用性和红细胞生成。

实施例4：莫洛替尼(MMB)在CAIA鼠类风湿性关节炎中的临床活性和非劣效性

鼠类风湿性关节炎(RA)模型

BALB/C小鼠在第0天用腹膜内(IP)施用的2mg抗胶原蛋白II抗体进行免疫接种，然后在第3天腹膜内注射100μg脂多糖(LPS)。从RA诱导开始，在整个研究过程中，小鼠接受每天一次媒介物、MMB(50mg/kg)、每天两次MMB(30mg/kg)的口服治疗，或每天腹膜内施用依那西普(ETA)(10mg/kg)。

通过动物和后爪评分以及后爪厚度测量进行类风湿性关节炎的连续评估。

从第6天开始，与媒介物相比，在每日施用MMB(每天50mg/kg或者每天两次30mg/kg)或依那西普后，观察到平均总动物(图9A)和后爪类风湿性关节炎评分(图9B)和平均后爪厚度(图9C)的显著降低。这些结果支持MMB的抗关节炎活性，具有显著和持续降低的类风湿性关节炎评分，这在小鼠胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型中证明了与TNF-α抑制剂依那西普相比的非劣效性。用重复测量ANOVA确定统计显著性，用于RA治疗比较(每组N＝10-13，***p<0.001)。

MMB在鼠CAIA RA模型中显示出显著的抗关节炎活性，并且证明至少与依那西普同样有效。总的来说，这些数据强烈表明MMB治疗可以解决啮齿动物关节炎模型中的局部和全身炎症以及随之而来的贫血。

6.等价物和通过引用并入

尽管已经参照优选实施方案和各种替代实施方案具体地示出和描述了本发明，但是相关领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对其中的形式和细节进行各种改变。

出于所有目的，在本说明书的正文中引用的所有参考文献、颁发的专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

Claims (40)

1.一种治疗关节炎症的方法，该方法包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的莫洛替尼(MMB)或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有关节炎。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有类风湿性关节炎。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗关节炎症包括至少改善关节炎的一种或多种症状。

5.根据权利要求4所述的方法，其中至少改善关节炎的一种或多种症状包括减少关节体积。

6.根据权利要求5所述的方法，其中与施用治疗有效量的MMB之前的关节体积相比，关节体积减少至少2％。

7.根据权利要求6所述的方法，其中与施用治疗有效量的MMB之前的关节体积相比，关节体积减少至少5％。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗关节炎症包括改善受影响组织的肿胀，如通过发炎关节的直径减小所测量的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中与施用治疗有效量的MMB之前的发炎关节的直径相比，所述发炎关节的直径减少至少2％。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗关节炎症包括在施用治疗有效量的MMB之后减少所述受试者的血液嗜中性粒细胞计数。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗关节炎症包括减少脾脏和/或滑膜组织中的骨髓细胞浸润。

12.根据权利要求11所述的方法，其包括减少滑膜组织中的粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述炎性巨噬细胞是CD11b⁺。

14.根据权利要求12所述的方法，其包括与施用MMB之前来自受试者的滑膜组织中的粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量相比，减少滑膜组织中粒细胞或巨噬细胞中的至少一种的量。

15.根据权利要求14所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少10％。

16.根据权利要求15所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少15％。

17.根据权利要求16所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少20％。

18.根据权利要求17所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少30％。

19.根据权利要求18所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少40％。

20.根据权利要求19所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少50％。

21.根据权利要求20所述的方法，其中粒细胞或巨噬细胞中至少一种的量减少至少60％。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与施用MMB或其药学上可接受的盐之前受试者脾脏中Th17细胞的数量相比，施用治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐导致受试者脾脏中产生IL-17A的辅助T淋巴细胞(Th17细胞)的数量减少。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与施用MMB或其药学上可接受的盐之前发炎关节的滑膜组织中的CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的数量相比，施用治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐导致受试者发炎关节的滑膜组织中CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的数量减少。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MMB或其药学上可接受的盐是口服施用的。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MMB或其药学上可接受的盐每天施用。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述MMB或其药学上可接受的盐是每周施用的。

27.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述MMB或其药学上可接受的盐是间歇性施用的。

28.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中MMB或其药学上可接受的盐的治疗有效量为25-500mg/天。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐选自：25mg/天、50mg/天、100mg/天、200mg/天、300mg/天、400mg/天和500mg/天。

30.根据权利要求29所述的方法，其中MMB或其药学上可接受的盐的治疗有效量为200mg/天。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐被施用1周或更长时间。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐被施用2周或更长时间。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐被施用3周或更长时间。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述治疗有效量的MMB或其药学上可接受的盐被施用1个月或更长时间。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

37.一种治疗受试者关节炎症的方法，该方法包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的莫洛替尼(MMB)或其药学上可接受的盐，和

向所述受试者施用一种或多种额外的抗炎剂。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种额外的抗炎剂是抗关节炎剂。

39.一种在治疗受试者的关节炎症的同时治疗炎症相关性贫血的方法，该方法包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的莫洛替尼(MMB)或其药学上可接受的盐。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者具有高于正常范围的转铁蛋白或铁调素水平以及低于正常范围的血清铁和转铁蛋白饱和度。

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