CN115011700A - 用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于猪品种鉴定领域，涉及淮南猪种质资源的鉴定，特别是指用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证及应用。本申请通过分子生物学技术发现了用于鉴别淮南猪品种的特异分子身份证，能够揭示品种间存在的标志性遗传差异。利用生物技术开展地方猪珍贵遗传资源特性的挖掘，有利于促进河南省地方猪遗传资源保护及创新利用，推进种业的高质量发展。

Description

用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证及应用
技术领域
本发明属于猪品种鉴定领域，涉及淮南猪种质资源的鉴定，特别是指用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证及应用。
背景技术
河南地方猪优良特性的形成与所处的地理环境和人为的选择密切相关。因此，通过分子生物学技术在基因组水平筛选的品种特异性分子标记，或许能够揭示品种间存在的标志性遗传差异。近年来，随着生物信息学技术的发展使得基于基因组信息的地方猪分子身份证形成成为可能。
在应用全基因关联分析时，结果中常会出现假阴性和假阳性的SNP位点，这在很大程度上影响了最终的判断，为避免出现影响全基因组关联分析检验效力的情况，可使用基因组控制法、主成分分析法和多种多重假设检验方法等。同时，也可以采用组合多种分析方法，以降低结果的误差。例如全基因组关联分析和选择信号的组合策略，可提高基因定位的效率和准确性，以达到相互验证的作用。
从分子层面对河南省地方猪品种进行种质资源分析和区别，探索一种能高效、精准鉴别淮南猪的分子身份证，有助于进一步了解品种特异的变异和遗传结构特征，制定具体的保护方案和完善品种的鉴定工作。
发明内容
为实现上述目的，本发明提出一种用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证及应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证，所述特异分子身份证为等位基因频率较高的SNP位点的集合。
进一步，所述特异分子身份证位于猪参考基因组Ensembl Sscrofa 11.1版本上。
进一步，所述SNP位点的集合包括CNC10010500、CNC10010865、CNC10010911、CNC10013894、CNC10014112、CNC10014662、CNC10014900、CNC10014919、CNC10015519、CNC10020827、CNC10021138、CNC10021522、CNC10021729、CNC10021730、CNC10023047、CNC10030056、CNC10030704、CNC10031464、CNC10040602、CNC10041374、CNC10042724、CNC10050348、CNC10060818、CNC10060867、CNC10061010、CNC10061259、CNC10061391、CNC10062505、CNC10062590、CNC10062745、CNC10062777、CNC10062926、CNC10070739、CNC10070797、CNC10070799、CNC10071021、CNC10071232、CNC10071354、CNC10071586、CNC10071639、CNC10072325、CNC10072326/CNC10080556、CNC10080573、CNC10080681、CNC10081051、CNC10081763、CNC10081844、CNC10081880、CNC10090326、CNC10090634、CNC10091624、CNC10091676、CNC10092648、CNC10100053、CNC10100634、CNC10110699、CNC10110782、CNC10111310、CNC10111520、CNC10130866、CNC10131089、CNC10131950、CNC10133684、CNC10133697、CNC10133908、CNC10133909、CNC10134079、CNC10134173、CNC10142116、CNC10142634、CNC10150394、CNC10150460、CNC10150774、CNC10152162、CNC10152163、CNC10152316、CNC10152925、CNC10152958、CNC10170796、CNC10170918和CNC10171012。
进一步，所述CNC10010500位点的突变型为G/A、CNC10010865位点的突变型为G/A、CNC10010911位点的突变型为C/T、CNC10013894位点的突变型为G/A、CNC10014112位点的突变型为G/A、CNC10014662位点的突变型为T/A、CNC10014900位点的突变型为C/T、CNC10014919位点的突变型为A/G、CNC10015519位点的突变型为A/C、CNC10020827位点的突变型为C/T、CNC10021138位点的突变型为G/T、CNC10021522位点的突变型为C/G、CNC10021729位点的突变型为T/C、CNC10021730位点的突变型为T/C、CNC10023047位点的突变型为A/G、CNC10030056位点的突变型为G/C、CNC10030704位点的突变型为T/G、CNC10031464位点的突变型为T/C、CNC10040602位点的突变型为A/G、CNC10041374位点的突变型为G/A、CNC10042724位点的突变型为G/A、CNC10050348位点的突变型为G/A、CNC10060818位点的突变型为T/C、CNC10060867位点的突变型为C/T、CNC10061010位点的突变型为C/G、CNC10061259位点的突变型为C/G、CNC10061391位点的突变型为C/T、CNC10062505位点的突变型为T/G、CNC10062590位点的突变型为T/A、CNC10062745位点的突变型为T/G、CNC10062777位点的突变型为T/C、CNC10062926位点的突变型为A/G、CNC10070739位点的突变型为T/C、CNC10070797位点的突变型为G/T、CNC10070799位点的突变型为G/A、CNC10071021位点的突变型为T/C、CNC10071232位点的突变型为T/C、CNC10071354位点的突变型为T/C、CNC10071586位点的突变型为G/C、CNC10071639位点的突变型为T/C、CNC10072325位点的突变型为T/C、CNC10072326位点的突变型为A/G、CNC10080556位点的突变型为T/C、CNC10080573位点的突变型为T/C、CNC10080681位点的突变型为T/C、CNC10081051位点的突变型为G/C、CNC10081763位点的突变型为C/A、CNC10081844位点的突变型为T/C、CNC10081880位点的突变型为G/C、CNC10090326位点的突变型为G/C、CNC10090634位点的突变型为G/A、CNC10091624位点的突变型为C/T、CNC10091676位点的突变型为T/C、CNC10092648位点的突变型为G/C、CNC10100053位点的突变型为C/T、CNC10100634位点的突变型为G/A、CNC10110699位点的突变型为A/T、CNC10110782位点的突变型为G/C、CNC10111310位点的突变型为A/G、CNC10111520位点的突变型为C/A、CNC10130866位点的突变型为C/G、CNC10131089位点的突变型为C/T、CNC10131950位点的突变型为T/G、CNC10133684位点的突变型为C/T、CNC10133697位点的突变型为C/T、CNC10133908位点的突变型为T/C、CNC10133909位点的突变型为T/G、CNC10134079位点的突变型为T/C、CNC10134173位点的突变型为G/C、CNC10142116位点的突变型为G/T、CNC10142634位点的突变型为C/A、CNC10150394位点的突变型为G/A、CNC10150460位点的突变型为T/A、CNC10150774位点的突变型为T/C、CNC10152162位点的突变型为C/T、CNC10152163位点的突变型为T/G、CNC10152316位点的突变型为G/A、CNC10152925位点的突变型为A/C、CNC10152958位点的突变型为C/T、CNC10170796位点的突变型为A/T、CNC10170918位点的突变型为G/C和CNC10171012位点的突变型为C/T。
用于识别上述的特异分子身份证的基因芯片。
上述的基因芯片在鉴定淮南猪品种中的应用。
上述应用的步骤为：
（1）采集待测猪的组织样本，并提取基因组DNA；
（2）利用基因芯片对步骤（1）的基因组DNA进行SNP分型，获得待测猪的基因型数据；
（3）利用PLINK软件将待检测猪的基因型数据和淮南猪的基因型数据合并，提取特异分子身份证上的SNP位点基因型，再进行主成分分析。
优选的，所述步骤（1）中基因组DNA在A260/280的光吸收比在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升。
优选的，所述步骤（3）中SNP分型的主成分分析的结果与淮南猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，即为淮南猪。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过分子生物学技术发现了用于鉴别淮南猪品种的特异分子身份证，能够揭示品种间存在的标志性遗传差异。利用生物技术开展地方猪珍贵遗传资源特性的挖掘，有利于促进河南省地方猪遗传资源保护及创新利用，推进种业的高质量发展。
2、基因型填充作为全基因组关联分析的重要部分，目的是预测研究样本中没有被分型的SNP，增加可用于检测关联的SNP数量，从而提高GWAS的检测能力，以及全基因组关联分析和选择信号分析的组合策略，进一步提高了鉴定分子标记的效率和准确性，以达到相互验证的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为淮南猪的GWAS分析结果的曼哈顿图（左）和QQ图（右）。
图2为淮南猪的选择信号分析结果的曼哈顿图。
图3为淮南猪品种特异性位点的主成分分析验证图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
淮南猪品种的特异性分子身份证的获得，包括以下步骤：
（1）耳样采集
试验群体为1117头猪，共10个猪品种，包括7个中国猪品种：南阳黑猪（n=10，NY），淮南猪（n=10，HN），豫农黑猪（n=1036，YN），确山黑猪（n=10，QS），莱芜猪（n=10，LWH），二花脸猪（n=10，EHL），民猪（n=6，MIN）；西方商品猪种3个：杜洛克猪（n=10，DU），大白猪（n=10，LW），长白猪（n=5，LR）。使用75%的酒精清洁猪只的耳朵，使用耳样钳剪取少量耳组织，放置在装有75%酒精的2ml离心管中，保存在-20℃冰箱。
（2）总DNA提取、质量检测及基因分型
①、采用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，采用DYY-6C型电泳仪，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测；采用Nanodrop-2000紫外分光光度计检测DNA的浓度，保留光吸收比（A260/280）在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升的基因组DNA样本。用于IlluminaPorcine SNP50 BeadChip（北京康普森生物技术有限公司，中芯一号）进行全基因组芯片分型，具体操作为：
a、利用Tn5转座酶对样品猪建立基因文库，并进行50 K基因芯片扫描。
b、对步骤a中的50 K芯片和全基因组重测序结果使用Beagle进行基因型填充。
c、对所有个体通过步骤③获得的基因型填充数据进行全基因组关联分析和选择信号分析。
d、对步骤c获得的显著位点，进行品种间的等位基因频率计算，保留南阳黑猪等位基因频率较高的SNP位点，该SNP位点的集合，作为南阳黑猪品种特异性分子身份证。
（3）基因型数据填充及质量控制
经芯片测序共获得1,117头，51,315个SNPs。使用 PLINK软件对芯片数据进行质量控制。通过以下参数对基因型数据进行过滤：个体基因型检出率（--mind）>90%，标记基因型（--geno）检出率>95%，最小等位基因频率（--maf）>1%，最小哈代温伯格平衡（--hwe）为10-6，位于常染色体。采用隐马尔科夫模型（Hidden Markov Model，HMM）算法，在 BEAGLE软件中执行对缺失基因型的填充。
（4）全基因组关联分析筛选SNP特异位点
采用GEMMA软件进行全基因组关联分析，试验组为10头淮南猪（case），对照组为其余9个品种（control）。其中淮南猪的曼哈顿图见图1左和QQ图见图1右，曼哈顿图中有两条阈值线，其中实线的阈值为0.05/N（N为所使用的芯片位点个数），在实线上方的位点为全基因组显著水平，虚线的阈值为1/N，在虚线上方的位点为染色体显著水平，QQ图中的λ值越接近1，表明全基因组关联分析的结果越可信；使用班费罗尼矫正方法鉴定与品种显著相关的SNPs，该显著SNPs的集合为A组。
（5）选择信号分析筛选SNP特异位点
采用VCFtools软件进行遗传分化指数（genetic differentiation index, Fst）的计算，使用滑动窗口取均值的计算方法，结果见图2，图2中的阈值线为Fst值经排序后较大的前1%，在该阈值线以上的位点为显著位点（红色标记）。具体参数如下：滑动窗口的大小（--fst-window-size）为100,000 bp，滑动窗口的步长（--fst-window-step）为40,000 bp。将窗口按Fst值从大到小排序，定义前1%的窗口为显著窗口，再利用PLINK软件提取显著窗口内的SNPs，该显著SNPs的集合为B组。
（6）等位基因频率筛选SNP特异位点
利用PLINK软件合并A组和B组的显著SNPs，并计算每个SNP在10个品种中的等位基因频率，筛选等位基因频率在试验组的分布较其他9个品种高的SNP集合作为淮南猪品种的特异性分子身份证。
表1淮南猪品种的特异性分子标记集合
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（7）利用PLINK软件对10个品种的上述82个SNPs进行提取，进行主成分分析验证，结果如图3所示，由图3可知该82个SNP位点可用于鉴定淮南猪品种，所述SNP位点位于基因组版本Ensembl Sscrofa 11.1。
应用例
一种待测猪种质的鉴定方法，具体包括以下步骤：
1. 提取待检猪的耳组织样本，提取组织样本的基因组DNA，质量和浓度检测合格的基因组DNA送至北京康普森生物技术有限公司（下述基因分型操作由该公司进行），进行针对地方猪的“中芯一号”（Axiom）芯片，进行SNP分型。芯片进行SNP分型的试验原理是基于连接反应，其中有两种探针发挥作用。第一种是芯片上的捕获探针，探针长度为30 bp，起到把目标DNA片段固定到芯片表面的作用。第二种是显色探针，负责对SNP芯片进行着色（红色和绿色荧光）。试验共进行两轮杂交。第一轮杂交，是目标DNA与芯片进行杂交，捕获探针会抓取匹配的目标DNA片段；显色探针在第二轮杂交中，杂交到DNA片段上。然后利用连接酶的识别作用，只有与目标DNA片段互补的显色探针才会被连接到捕获探针上。通过荧光标记的染色，在激光扫描下进行SNP分型，得到待测猪的基因型数据。
2. 使用PLINK软件将待测猪和淮南猪的基因型数据进行合并，并提取数据中的以上82个位点，之后进行主成分分析和R语言结果可视化，待检测猪个体与淮南猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，可以判定待检测猪为淮南猪。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于鉴定淮南猪品种的特异分子身份证，其特征在于：所述特异分子身份证为等位基因频率较高的SNP位点的集合。
2.根据权利要求1所述的特异分子身份证，其特征在于：所述特异分子身份证位于猪参考基因组Ensembl Sscrofa 11.1版本上。
3.根据权利要求2所述的特异分子身份证，其特征在于：所述SNP位点的集合包括CNC10010500、CNC10010865、CNC10010911、CNC10013894、CNC10014112、CNC10014662、CNC10014900、CNC10014919、CNC10015519、CNC10020827、CNC10021138、CNC10021522、CNC10021729、CNC10021730、CNC10023047、CNC10030056、CNC10030704、CNC10031464、CNC10040602、CNC10041374、CNC10042724、CNC10050348、CNC10060818、CNC10060867、CNC10061010、CNC10061259、CNC10061391、CNC10062505、CNC10062590、CNC10062745、CNC10062777、CNC10062926、CNC10070739、CNC10070797、CNC10070799、CNC10071021、CNC10071232、CNC10071354、CNC10071586、CNC10071639、CNC10072325、CNC10072326、CNC10080556、CNC10080573、CNC10080681、CNC10081051、CNC10081763、CNC10081844、CNC10081880、CNC10090326、CNC10090634、CNC10091624、CNC10091676、CNC10092648、CNC10100053、CNC10100634、CNC10110699、CNC10110782、CNC10111310、CNC10111520、CNC10130866、CNC10131089、CNC10131950、CNC10133684、CNC10133697、CNC10133908、CNC10133909、CNC10134079、CNC10134173、CNC10142116、CNC10142634、CNC10150394、CNC10150460、CNC10150774、CNC10152162、CNC10152163、CNC10152316、CNC10152925、CNC10152958、CNC10170796、CNC10170918和CNC10171012。
4.根据权利要求3所述的特异分子身份证，其特征在于：所述CNC10010500位点的突变型为G/A、CNC10010865位点的突变型为G/A、CNC10010911位点的突变型为C/T、CNC10013894位点的突变型为G/A、CNC10014112位点的突变型为G/A、CNC10014662位点的突变型为T/A、CNC10014900位点的突变型为C/T、CNC10014919位点的突变型为A/G、CNC10015519位点的突变型为A/C、CNC10020827位点的突变型为C/T、CNC10021138位点的突变型为G/T、CNC10021522位点的突变型为C/G、CNC10021729位点的突变型为T/C、CNC10021730位点的突变型为T/C、CNC10023047位点的突变型为A/G、CNC10030056位点的突变型为G/C、CNC10030704位点的突变型为T/G、CNC10031464位点的突变型为T/C、CNC10040602位点的突变型为A/G、CNC10041374位点的突变型为G/A、CNC10042724位点的突变型为G/A、CNC10050348位点的突变型为G/A、CNC10060818位点的突变型为T/C、CNC10060867位点的突变型为C/T、CNC10061010位点的突变型为C/G、CNC10061259位点的突变型为C/G、CNC10061391位点的突变型为C/T、CNC10062505位点的突变型为T/G、CNC10062590位点的突变型为T/A、CNC10062745位点的突变型为T/G、CNC10062777位点的突变型为T/C、CNC10062926位点的突变型为A/G、CNC10070739位点的突变型为T/C、CNC10070797位点的突变型为G/T、CNC10070799位点的突变型为G/A、CNC10071021位点的突变型为T/C、CNC10071232位点的突变型为T/C、CNC10071354位点的突变型为T/C、CNC10071586位点的突变型为G/C、CNC10071639位点的突变型为T/C、CNC10072325位点的突变型为T/C、CNC10072326位点的突变型为A/G、CNC10080556位点的突变型为T/C、CNC10080573位点的突变型为T/C、CNC10080681位点的突变型为T/C、CNC10081051位点的突变型为G/C、CNC10081763位点的突变型为C/A、CNC10081844位点的突变型为T/C、CNC10081880位点的突变型为G/C、CNC10090326位点的突变型为G/C、CNC10090634位点的突变型为G/A、CNC10091624位点的突变型为C/T、CNC10091676位点的突变型为T/C、CNC10092648位点的突变型为G/C、CNC10100053位点的突变型为C/T、CNC10100634位点的突变型为G/A、CNC10110699位点的突变型为A/T、CNC10110782位点的突变型为G/C、CNC10111310位点的突变型为A/G、CNC10111520位点的突变型为C/A、CNC10130866位点的突变型为C/G、CNC10131089位点的突变型为C/T、CNC10131950位点的突变型为T/G、CNC10133684位点的突变型为C/T、CNC10133697位点的突变型为C/T、CNC10133908位点的突变型为T/C、CNC10133909位点的突变型为T/G、CNC10134079位点的突变型为T/C、CNC10134173位点的突变型为G/C、CNC10142116位点的突变型为G/T、CNC10142634位点的突变型为C/A、CNC10150394位点的突变型为G/A、CNC10150460位点的突变型为T/A、CNC10150774位点的突变型为T/C、CNC10152162位点的突变型为C/T、CNC10152163位点的突变型为T/G、CNC10152316位点的突变型为G/A、CNC10152925位点的突变型为A/C、CNC10152958位点的突变型为C/T、CNC10170796位点的突变型为A/T、CNC10170918位点的突变型为G/C和CNC10171012位点的突变型为C/T。
5.用于识别权利要求1-4任一项所述的特异分子身份证的基因芯片。
6.权利要求5所述的基因芯片在鉴定淮南猪品种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤为：
（1）采集待测猪的组织样本，并提取基因组DNA；
（2）利用基因芯片对步骤（1）的基因组DNA进行SNP分型，获得待测猪的基因型数据；
（3）利用PLINK软件将待检测猪的基因型数据和淮南猪的基因型数据合并，提取特异分子身份证上的SNP位点基因型，再进行主成分分析。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中基因组DNA在A260/280的光吸收比在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中SNP分型的主成分分析的结果与淮南猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，即为淮南猪。
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