CN115011493A - 西藏曲卓木地区热泉土壤分离产sod酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

西藏曲卓木地区热泉土壤分离产sod酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了西藏曲卓木地区热泉土壤分离产SOD酿酒酵母菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的耐高温酿酒酵母SC‑QZM1分离自西藏山南地区的曲卓木乡热泉地区土壤，已于2022年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.24900。采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC‑QZM1发酵制备得到SOD酶，所述SOD酶具有良好的耐热性，90℃热处理120min无酶活损失，100℃热处理30min酶活保留70％以上，100℃处理60min酶活保留45％以上。本发明提供的酿酒酵母SC‑QZM1可以应用于生产耐热SOD，有助于SOD应用于食品、医疗等领域。

Description

西藏曲卓木地区热泉土壤分离产SOD酿酒酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及西藏曲卓木地区热泉土壤分离产SOD酿酒酵母菌株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
生物体内各种分子受到的氧化损伤会随着年龄的增长而增加，被认为是导致各种生理功能障碍或疾病的主要因素。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)广泛存在于自然界生物体内，能够有效的清除细胞内代谢产生的氧自由基，被称为细胞内的清道夫。研究表明，SOD在美白、抗衰老和抗炎症等方面表现出极大的应用潜力：Goodla Lavanya etal.,研究表明，桃金娘中提取物中富含的丰富SOD赋予了它美白，美化皮肤的能力；YangZhou et al.,以及Jiangquan Yang et al.,在老鼠中进行的动物实验也证明了SOD通过通过清除自由基，提高老鼠寿命；Rui Tang et al.,和X.M.Li et al.,研究表明，枸杞可以通过提高生物内SOD水平来提高细胞抗氧化能力。目前，SOD已经被广泛应用于医疗、美容、保健等领域，也受到食品、饲料、化工等领域众多研究者关注。
SOD经过50年的研究，衍生了多个研究方向和研究领域，其中，耐热SOD是研究的热点之一。SOD在制备成终端产品的过程中，会涉及高温处理过程；同时做为蛋白质，普通SOD储存易受到环境影响，使得SOD在产品制备过程中或运输储存中变性，丧失应有的抗氧化能力。耐热SOD的研制有效的解决了SOD在生产、运输、储存等过程中可能造成的酶活丧失问题，但耐热SOD生产菌株构建依赖于转基因技术，极大得限制了其在食品、医药等领域得应用。
微生物在高温压力筛选下，其内部的蛋白质在保持自身功能时，也进化成了更稳定的结构形态，获得更好的热稳定性。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛存在于环境中，被应用于酿酒及面包制造中的微生物，其超过千年的使用保证了其安全性，在全世界范围内均被认证为“一般认为安全”(generally recognized as safe,GRAS)。
西藏曲卓木地区具有丰富的地热资源，形成了众多天然的热泉。因此从曲卓木热泉地区收集土壤样本，并富集筛选耐高温酿酒酵母，可以为耐高温SOD的生产提供可能的天然菌株，拓展SOD的应用场景。
发明内容
本发明提供了一株的产耐高温SOD酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1。发明人从西藏山南曲卓木地区热泉旁的土壤中分离到一株耐高温酿酒酵母SC-QZM1，其胞内SOD氨基酸序列具有较高的酶活，并具有良好的热稳定性。
本发明提供了一株耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1，已于2022年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.24900。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1采集自西藏山南曲卓木地区热泉旁的土壤；所述酿酒酵母的单克隆菌落形态特征为乳白色，边缘光滑、平坦，菌落质地均匀。所述菌株的形态特征符合酿酒酵母，通过ITS测序(序列如SEQ ID NO.3所示)，在NCBI数据库比对分析菌株与酿酒酵母的相似度同源性为：99.9％，可以鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1。
本发明提供了一种耐高温SOD酶，所述SOD酶是采用上述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SC-QZM1发酵制备得到的，所述耐高温SOD酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码上述耐高温SOD酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，编码所述耐高温SOD酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述耐高温SOD酶的制备方法，所述方法为：
将上述耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1接种于YPD培养基试管中，在42℃，200rpm条件下培养12～48h，制备得到发酵液，将制备得到的发酵液在5000rpm条件下离心10min，收集菌体，弃掉上清，并向菌体细胞中加入1mL pH 7.0，50mMPBS缓冲液，重悬菌体，利用超声破碎仪在10000rpm条件下离心10min后将菌体破碎，获得上清即为SOD粗酶液。
本发明还提供了含有上述耐高温SOD酶或上述耐高温SOD酶基因的重组载体。
本发明还提供了表达上述耐高温SOD酶，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1或其发酵液，或含有经冷冻干燥得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1干菌体，或含有经固体化技术得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1细胞。
本发明还提供了含有上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1，或上述微生物菌剂的产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
本发明还提供了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1，或上述含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1的微生物菌剂在制备发酵制品中的应用。
有益效果
(1)本发明提供了一种的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1，该酿酒酵母具有较好范围的温度耐受性，在38～45℃范围内菌株仍有较好的生长状况，最适温度为42℃，能够满足高温条件下发酵的生产需求。
(2)本发明提供了一种耐高温SOD酶，所述SOD酶是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SC-QZM1发酵制备得到的，所述SOD酶具有良好的耐热性，90℃热处理120min无酶活损失，100℃热处理30min酶活保留70％以上，100℃处理60min酶活保留45％以上。
生物材料保藏
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1，分类学命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2022年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.24900，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1的平板形态。
图2：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1的最适生长温度测定。
图3：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1在42℃下的生长曲线。
图4：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1自身SOD酶活测定。
图5：采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1制备得到的SOD酶在90℃条件下的热稳定。
图6：SOD酶在100℃条件下的热稳定检测。
具体实施方式
本发明中涉及的培养基、实验材料以及实验仪器等均为常见商业化产品。下述实施例中所有实验未作特殊声明均设置3个平行实验组，保证获得数据真实可靠。
关于附图说明如下：附图当中的酿酒酵母Sc-QZM1同本申请的酿酒酵母SC-QZM1是同一株菌株。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
SOD酶活测定方法：
采用GB/T5009.171-2003中方法，SOD酶活定义为25℃时抑制邻苯三酚自氧化速度50％时所需的SOD量为1个活力单位。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
YPD培养基：1L培养基包含：10g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，若制固体培养基，加入1.5％琼脂粉(葡萄糖接种前滤灭加入)。
实施例1：酿酒酵母SC-QZM1菌株的筛选与鉴定
具体步骤如下：
1、酿酒酵母分离
(1)土壤处理
将西藏曲卓木热泉地区采集的土壤称取0.5g，溶于装有50mL YPD培养基的三角瓶中，42℃，200rpm培养条件培养24h，培养完毕后吸取1mL培养液再次进行同样条件的传代培养，共传代5次后，吸取1mL培养液供后续涂布筛选。
(2)分离菌株
上述1mL培养液分别稀释100，1000，10000倍后涂布于孟加拉红培养基平皿上，置于42℃的培养箱中，培养2～4天后，随机选取具有典型酵母菌落特征的单菌落于装有5mLYPD培养基试管中，42℃，200rpm培养12h获得候选酵母菌株。
(3)初筛
使用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)做为显色剂，进行双层培养基显色培养，具体方法如下：首先在培养皿内倒入10mL含2％琼脂糖的YPD培养基，待凝固降温后，将上述获得的候选酵母菌株稀释10000倍，接种于培养基上，至于42℃培养箱培育36h，后将混有TTC显色剂和2％琼脂糖的YPD培养基10mL覆盖在前述培养过的培养皿上，于42℃培养箱避光培养4h，取出后立刻观察菌落颜色，将程红色的单菌落转接到装有5mL YPD培养基试管中，42℃，200rpm培养24h，获得初筛酵母菌株。
(4)鉴定
对初筛得到的酵母菌株，根据《酵母菌分类学研究》中的酵母菌鉴定标准方法，利用显微镜和体视镜进行细胞的形态学指标观察，做出初步的形态学鉴定。选取菌株标准为：表面光滑、湿润、枪头点击有粘稠，整个菌体质地均匀，颜色统一，菌落特征表现为乳白色。
同时针对酿酒酵母ITS设计测序引物对菌株进行PCR，引物如下：
F：5’-AAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTT-3’；
R：5’-ACTTTAAGAACATTGTTGCCTAGAC-3’。
将获得的产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序，经过基因序列比对分析后，通过ITS测序(序列如SEQ ID NO.3所示)；在NCBI数据库比对分析菌株与酿酒酵母的相似度同源性为：99.9％，可以鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1。最终划线获得酵母菌株形态如图1所示。
实施例2：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1的温度耐受性
具体步骤如下：
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1接种至YPD培养基中，分别在38℃，42℃，45℃条件下进行培养30h，检测其对于温度的耐受性，结果如图2所示。
使用全自动微生物生长曲线分析仪(Lab Systems Helsinki,Finland)对SC-QZM1菌株在38℃，42℃，45℃下的生长曲线，结果显示，在38℃～45℃之间酿酒酵母SC-QZM1均可生长，42℃为最适生长温度。
实施例3：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1菌株的生长曲线
具体步骤如下：
(1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1菌株接种于5mL YPD培养基试管中，42℃，200rpm培养24h，制备得到种子液。
(2)将步骤(1)制备得到的种子液按照1％(v/v)的接种量，接种到装有100mL YPD培养基的三角瓶中，42℃，200rpm恒温摇床培养，观察72h内菌株的生长情况，在接种前期每间隔2h取样，后期间隔4h、6h和12h取样，并用分光光度计测定其在560nm波长处的吸光度，重复3次，绘制出菌株生长曲线(参见图3)。
实施例4：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1发酵产SOD基因
具体步骤如下：
1、发酵产酶
(1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-QZM1菌株接种于5mL YPD培养基试管中，42℃，200rpm条件下分别培养12h，24h，36h，48h，分别制备得到发酵液。
(2)分别将步骤(1)制备得到的发酵液在5000rpm条件下离心10min收集菌体，弃掉上清，并向菌体细胞中加入1mL pH 7.0，50mM PBS缓冲液，重悬菌体，利用超声破碎仪在10000rpm条件下离心10min后将菌体破碎，分别获得上清，即为SOD粗酶液。
(3)分别检测上述粗酶液的酶活，结果如图4所示。
结果显示，发酵36h时酿酒酵母SC-QZM1的SOD活力单位达到最高，为580.3±3.6U/mL。
(4)SOD基因序列的确定
对酿酒酵母SC-QZM1进行全基因组测序后，以NCBI公开数据库中酿酒酵母SOD序列(编号：NC_001142.9)为出发序列，对测序结果进行比对分析，获得酿酒酵母SC-QZM1中SOD酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸与NC_001142.9相比覆盖度为100％，相似度为59.76％。
实施例5：SOD酶的酶学性质的检测
具体步骤如下：
1、热稳定性测定
(1)将酿酒酵母SC-QZM1菌株接种于5mL YPD培养基试管中，42℃，200rpm培养36h后，制备得到发酵液，将发酵液在5000rpm条件下离心10min收集菌体，弃掉上清。
(2)向步骤(1)得到的菌体细胞中加入1mL pH 7.0，50mM PBS缓冲液重悬菌体，利用超声破碎仪在10000rpm条件下离心10min后将菌体破碎，获得上清即为SOD粗酶液。
(3)将所得SOD粗酶液分为对照组和实验组，对照组不做处理放置于室温；
实验组置于90℃沸水中，煮沸10min，30min，60min，120min，进行SOD酶活测定，结果如图5所示。
结果显示，置于室温样品在10min，30min，60min，120min的SOD酶活分别为：570±1.7U/mL，562±2.1U/mL，568±7U/mL，572±3.2U/mL。
在90℃条件下热处理10min，30min，60min，120min后，实验组SOD酶活分别为：568±2.4U/mL，566±1.5U/mL，565±4.7U/mL，564±5.5U/mL。
由实验结果可知，实验组SOD酶活参比对照组SOD酶活基本没有损失，可见，采用酿酒酵母SC-QZM1发酵制备得到的SOD酶表现出了超高的耐热性。
(4)具体实施方式同步骤(1)～(3)，区别在于，步骤(3)中，实验组置于100℃的沸水中，煮沸0min，30min，60min，90min，120min后，分别进行SOD酶活测定，结果如图6所示。
结果显示，100℃热处理0min，30min，60min，90min，120min的SOD酶活分别为：577.3±3.2U/mL，415.6±7.5U/mL，266±2.1U/mL，210±3.7U/mL，170±4.8U/mL。
可见，采用100℃条件下进行热处理30min，SOD酶的酶活保留70％以上，采用100℃条件下热处理60min，SOD酶的酶活保留45％以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司
<120> 西藏曲卓木地区热泉土壤分离产SOD酿酒酵母菌株及其应用
<130> BAA220611A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Val Glu Ala Glu Ala Leu Lys Ala Val Ile Leu Arg Gly Ala Gly
1 5 10 15
Val Tyr Gly Val Ile Met Lys Glu Gln Glu Ser Glu Cys Gly Pro Thr
20 25 30
Thr Val Ser Tyr Glu Thr Ala Gly Asn Asn Pro Asn Ala Leu Arg Lys
35 40 45
Phe His Met His Glu Phe Lys Val Ala Thr Gly Arg Cys Val Ser Arg
50 55 60
Asn Asn Gly Ile Asn His Phe Lys Lys Ile His Gly Ala Pro Thr Val
65 70 75 80
Asp Val Arg Arg Val Gly Asn Thr Gly His Val Glu Thr Glu Glu Lys
85 90 95
Pro Leu Ala Lys Gly Ser Phe Lys Asp Pro Leu Ile Lys Leu Ile Gly
100 105 110
Pro Met Thr Gly Leu Gly Gly Gly Val Val Ile Gln Asp Gly Gln Tyr
115 120 125
Asp Leu Gly Lys Gly Asp Ala Glu Asp Ser Trp Arg Thr Gly Asn Ala
130 135 140
Ala Arg Trp Asn Thr Gly Ala Asn Arg Ala Cys Gly Val Ile Gly Leu
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 2
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggttgaag ctgaagcttt gaaggctgtt atcttgagag gtgctggtgt ttacggtgtt 60
atcatgaagg aacaagaatc tgaatgtggt ccaactactg tttcttacga aactgctggt 120
aacaacccaa acgctttgag aaagttccac atgcacgaat tcaaggttgc tactggtaga 180
tgtgtttcta gaaacaacgg tatcaaccac ttcaagaaga tccacggtgc tccaactgtt 240
gacgttagaa gagttggtaa cactggtcac gttgaaactg aagaaaagcc attggctaag 300
ggttctttca aggacccatt gatcaagttg atcggtccaa tgactggttt gggtggtggt 360
gttgttatcc aagacggtca atacgacttg ggtaagggtg acgctgaaga ctcttggaga 420
actggtaacg ctgctagatg gaacactggt gctaacagag cttgtggtgt tatcggtttg 480
acttcttaa 489
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gatttctgtg cttttgttat aggacaatta aaaccgtttc aatacaacac actgtggagt 180
tttcatatct ttgcaacttt ttctttgggc attcgagcaa tcggggccca gaggtaacaa 240
acacaaacaa ttttatctat tcattaaatt tttgtcaaaa acaagaattt tcgtaactgg 300
aaattttaaa aatattaaaa actttcaacc acggatctct tggttctcgc atcgatgaag 360
aacgcagcga aatgcgatac gtaatgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca tcgaatcttt 420
gaacgcacat tgcccccttg gtattccagg gggcatgcct gtttgagcgt catttccttc 480
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tttcattgga tgtttttttt ccaaagagag gtttctctgc gtgcttgagg tataatgcaa 600
gtacggtcgt tttaggtttt accaactgcg gctaatcttt tttatactga gcgtattgga 660
acgttat 667

Claims (10)

1.一株耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24900，保藏日期为2022年5月17日。
2.一种耐高温SOD酶，其特征在于，所述SOD酶是采用权利要求1所述的酿酒酵母发酵制备得到的，所述耐高温SOD酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.编码权利要求2所述的耐高温SOD酶的基因。
4.含有权利要求2所述耐高温SOD酶或权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达权利要求2所述的耐高温SOD酶或含有权利要求3所述的基因或含有权利要求4所述的重组载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的酿酒酵母或其发酵液，或含有经冷冻干燥得到的酿酒酵母干菌体，或含有经固体化技术得到的酿酒酵母细胞。
8.含有权利要求1所述的酿酒酵母或权利要求7所述的微生物菌剂的产品。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为化学品。
10.权利要求1所述的酿酒酵母，或权利要求7所述的微生物菌剂在制备发酵制品中的应用。
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