CN115010748A - 硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法。所述方法采用硅胶柱层析法,以24~28:24~28:24~28:10~12:9~14的二氯甲烷‑异丙醇‑乙酸甲酯‑甲醇‑水体系为第一个洗脱剂,5:5:1~1.55的二氯甲烷‑甲醇‑水体系为第二个洗脱剂,对粗磷脂进行梯度洗脱。本发明工艺简单、能耗低、成本低廉,能够同时在粗磷脂中分离出磷脂酰胆碱和鞘磷脂,且获得的磷脂酰胆碱纯度在95%以上,鞘磷脂的纯度在85%以上,适用于不同来源的粗磷脂的分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法,属于分离纯化技术领域。
背景技术
磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)的主链是甘油,其sn-3位羟基易被磷酸酯化形成磷脂酸,磷脂酸的磷酸羟基再被胆碱代替,成为PC。鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的结构与PC相似,但其主链是长链氨基醇鞘氨醇。PC和SM均是乙酰胆碱最基本的合成源,大脑中的各个细胞则通过乙酰胆碱来传递信息。补充外源性PC和SM即增加乙酰胆碱可使神经细胞信息传递速度加快,从而提高记忆力,具有强大功效。并且这两者为婴儿提供了近17%的生长所必需的营养物质胆碱,是维持婴儿快速发育及合成体内生物膜必不可少的物质。因此,PC和SM被普遍认为是磷脂中最具价值的营养物质。在医药领域中,这两者可作为脂质体的乳化剂,递送活性组分,增加药效,同时提高了脂肪和胆固醇在血液中的溶解度,改善脂肪的吸收和降低体内胆固醇含量,有效地防治动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病。由此可见,PC和SM在食品、化工、医药等领域应用前景广阔。
目前对提取SM的研究仍处于初级阶段,主要有普通溶剂分级法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。中国专利申请CN110294774A公开了一种富含鞘磷脂的脂质的制备方法,该方法采用普通溶剂分级法,利用特定的乳品种类、溶剂温度、乳品与提取剂比例,提高鞘磷脂在脂质中的富集效果,但得到的SM纯度低,仅38.29%。中国专利申请CN102099453B通过不断利用溶剂分级且使用了磷脂酶最终获得了纯度高于90%的SM,但由于磷脂酶价格昂贵,不适合用于工业生产。薄层色谱法和高效液相色谱法虽然均可获得纯度高的SM,但两者的处理量均不大,且薄层色谱法需要对分离后的SM进行刮板提取,后续处理较繁琐,液相设备也因其维护费用高不宜用于大量制备(姚云平.乳脂肪球的组成结构,体外消化及抗菌特性[D].江南大学,2017.)。另外,对于PC的制备方法已有大量文献报道。中国专利申请CN102633832B通过醇处理、氧化铝柱层析乙醇洗脱和硅胶柱层析乙醇梯度洗脱制备了纯度高达90~100%的PC,但是该方法需经历两种填料的柱层析洗脱,较繁琐且增加了成本。中国专利申请CN104558020B经过硅胶柱层析两次洗脱得到纯度为98~99.9%的PC,但是其所用原料是PC>72%的蛋黄卵磷脂,成本较高,具有局限性,不适用于工业生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法,该方法工艺简单、成本较低,且能够同时得到高纯磷脂酰胆碱和鞘磷脂,既高效又充分利用了原料,且对原料的选择广泛,适合工业化生产。
实现本发明目的的技术方案如下:
硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法,包括以下步骤:
按硅胶与粗磷脂的重量比为150:1~300:1,以硅胶为柱层析固定相,用第一个洗脱剂溶解粗磷脂,上样,依次利用第一个洗脱剂和第二个洗脱剂进行梯度洗脱,用自动部分收集器收集流出液,期间通过薄层层析色谱(TLC)实时监测,其中梯度洗脱的具体方法为:先通过第一个洗脱剂洗脱出非SM部分,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再通过第二个洗脱剂快速洗脱SM部分,合并相同的含单一的SM斑点流份,第一个洗脱剂为体积比24~28:24~28:24~28:10~12:9~14的二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水体系,第二个洗脱剂为体积比5:5:1~1.55的二氯甲烷-甲醇-水体系;最后分别对合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,分别得到高纯PC和高纯SM。
优选地,粗磷脂的提取来源主要为富含PC和/或SM的物质,例如磷脂富集物、乳制品(动物乳、酪乳粉、黄油、乳清等)、植物油料(大豆、菜籽、葵花籽等)、蛋黄等。
优选地,柱层析所用硅胶为200~300目,装填硅胶径高比为1:5~1:8。
优选地,粗磷脂与第一个洗脱剂的质量体积比为1g:25~40mL。
优选地,上样后,使粗磷脂溶液上液面降至硅胶填料上界面,使粗磷脂与硅胶充分吸附30min~60min。
优选地,梯度洗脱具体步骤为:先用第一个洗脱剂洗脱3~3.8倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂洗脱1.2~1.6倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。
优选地,TLC实时监测条件为:薄层板固定相为硅胶,展开剂为第一个洗脱剂体系,显色剂为碘蒸汽。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明采用硅胶柱层析法,以特定比例范围的两种洗脱剂体系进行两次洗脱,同时制备了纯度在95.0~99.9%的PC和纯度在85.0~95.0%的SM,该方法步骤简单、成本低、能耗低、效率高,对原料的选择不受限,适用于不同提取来源的粗磷脂。
附图说明
图1为实施例1中柱层析洗脱部分PC和SM的TLC图,其中SM:鞘磷脂,PC:磷脂酰胆碱,PS:磷脂酰丝氨酸,PI:磷脂酰肌醇,PE:磷脂酰乙醇胺,SULPH:硫脂,FFA:游离脂肪酸,TAG:甘油三酯。
图2为实施例1(A)、实施例2(B)和对比例1(C)、对比例2(D)、对比例3(E)、对比例4(F)的柱层析洗脱过程的TLC定性结果示意图。
图3为实施例1中所得PC和SM的31P-NMR图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详细描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
下述实施例中的粗磷脂采用现有方法制备,参考文献【A Simple Method for theIsolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues】和【The Effectof Cold Acetone Fractionation on the Total Phospholipid Valoe and theLecithin/Sphingomyelin Ratio of Amniotic Fluid】,具体步骤如下:原料中加入20倍体积的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入1/4体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
实施例1
在1g乳磷脂中加入20mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入5mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入7mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取30g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(25:25:25:10:11,体积比)浸泡活化,装柱(Φ3cm×20cm),填料径高比为1:5。称取0.1g粗磷脂(即上样量为300:1),用4mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:40mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测(图1和图2A所示),其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.8倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1)洗脱1.3倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,经31P-NMR分析可知得到的PC纯度为99%,SM纯度为90%,如图3所示。
实施例2
在4g乳磷脂中加入80mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入20mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入30mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取300g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(24:24:24:10:9)浸泡活化,装柱(Φ5cm×100cm),填料径高比为1:8。称取2g粗磷脂(即上样量为150:1),用50mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:25mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测(图2B所示),其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.15倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份;再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1.55)洗脱1.4倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,得到的PC纯度为95%,SM纯度为85%。
实施例3
在50g酪乳粉中加入1000mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入250mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入3mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取30g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(28:28:28:12:14)浸泡活化,装柱(Φ3cm×20cm),填料径高比为1:5。称取0.2g粗磷脂(即上样量为150:1),用6mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:30mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附40min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测,其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.8倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1.55)洗脱1.3倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,得到的PC纯度为96%,SM纯度为89%。
实施例4
在50g酪乳粉中加入1000mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入250mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入3mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取30g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(26:25:26:10:12)浸泡活化,装柱(Φ3cm×20cm),填料径高比为1:5。称取0.15g粗磷脂(即上样量为200:1),用6mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:40mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测,其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.8倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1.55)洗脱1.4倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,得到的PC纯度为98%,SM纯度为89%。
对比例1
在1g乳磷脂中加入20mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入5mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入7mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取30g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(25:25:25:10:11)浸泡活化,装柱(Φ3cm×20cm),填料径高比为1:5。称取0.3g粗磷脂(即上样量为100:1),用9mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:30mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测(图2C所示),其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱4.3倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1)洗脱1.1倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。从图2C可知,上样量超过特定范围即过载导致PC和SM洗脱谱带大量重叠,大大降低了高纯PC和高纯SM的提取率。
对比例2
在1g乳磷脂中加入20mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入5mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入7mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取30g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(25:25:25:14:15)浸泡活化,装柱(Φ3cm×20cm),填料径高比为1:5。称取0.1g粗磷脂(即上样量为300:1),用4mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:40mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测(图2D所示),其展开剂为二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(25:25:25:10:11)。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.6倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,再用第二个洗脱剂二氯甲烷-甲醇-水(5:5:1)洗脱1倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。从图2D可知,第一个洗脱剂比例超过特定范围,导致PC和SM洗脱谱带大量重叠,大大降低了高纯PC和高纯SM的提取率。这是由于PC和SM极性大小非常相近,洗脱剂极性变大使得两者均较快洗脱。
对比例3
在4g乳磷脂中加入80mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入20mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入30mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取300g硅胶,用洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(24:24:24:10:9)浸泡活化,装柱(Φ5cm×100cm),填料径高比为1:8。称取2g粗磷脂(即上样量为150:1),用50mL洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:25mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行洗脱,TLC实时监测(图2E所示),其展开剂即为洗脱剂,从中合并相同的含单一的PC斑点流份,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,得到的PC纯度为98%,SM纯度为90%。对比图2E和图2B可知,无梯度洗脱导致整个洗脱时间大大延长,效率变低,是因为SM与硅胶吸附紧密。
对比例4
在4g乳磷脂中加入80mL的二氯甲烷:甲醇(2:1,v/v)超声提取30min,然后4000r/min离心10min,收集有机相,在其中加入20mL体积食盐水(NaCl 1%,w/w)涡旋2min,再通过3000r/min离心5min加速相分离过程,收集下层二氯甲烷相,35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入30mL冷丙酮,所得沉淀即为粗磷脂。
称取300g硅胶,用第一个洗脱剂二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水(24:24:24:10:9)浸泡活化,装柱(Φ5cm×100cm),填料径高比为1:8。称取2g粗磷脂(即上样量为150:1),用50mL第一个洗脱剂溶解(即上样浓度为1g:25mL),上样,使粗磷脂溶液与硅胶充分吸附30min。然后进行梯度洗脱,TLC实时监测(图2F所示),其展开剂为第一个洗脱剂。梯度洗脱具体为先用第一个洗脱剂洗脱3.4倍柱体积,从中合并相同的含单一的PC斑点流份;再用第二个洗脱剂甲醇洗脱2.6倍柱体积,合并相同的含单一的SM斑点流份。最后分别将合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥,得到的PC纯度为95%,SM纯度为86%。对比图2F和图2B可知,以甲醇为第二个洗脱剂进行洗脱并未明显缩短洗脱时间。
Claims (8)
1.硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法,其特征在于,包括以下步骤:
按硅胶与粗磷脂的重量比为150:1~300:1,以硅胶为柱层析固定相,用第一个洗脱剂溶解粗磷脂,上样,依次利用第一个洗脱剂和第二个洗脱剂进行梯度洗脱,用自动部分收集器收集流出液,期间通过薄层层析色谱实时监测,其中梯度洗脱的具体方法为:先通过第一个洗脱剂洗脱出非鞘磷脂部分,从中合并相同的含单一的磷脂酰胆碱斑点流份,再通过第二个洗脱剂快速洗脱鞘磷脂部分,合并相同的含单一的鞘磷脂斑点流份,第一个洗脱剂为体积比24~28:24~28:24~28:10~12:9~14的二氯甲烷-异丙醇-乙酸甲酯-甲醇-水体系,第二个洗脱剂为体积比5:5:1~1.55的二氯甲烷-甲醇-水体系;最后分别对合并的磷脂酰胆碱斑点流份和鞘磷脂斑点流份浓缩干燥,分别得到高纯磷脂酰胆碱和高纯鞘磷脂。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,粗磷脂的提取来源为磷脂富集物、乳制品、植物油料、蛋黄。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,乳制品为动物乳、酪乳粉、黄油或乳清;植物油料为大豆、菜籽或葵花籽。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,柱层析所用硅胶为200~300目,装填硅胶径高比为1:5~1:8。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,粗磷脂与第一个洗脱剂的质量体积比为1g:25~40mL。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,上样后,使粗磷脂溶液上液面降至硅胶填料上界面,使粗磷脂与硅胶充分吸附30min~60min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,梯度洗脱具体步骤为:先用第一个洗脱剂洗脱3~3.8倍柱体积,从中合并相同的含单一的磷脂酰胆碱斑点流份,再用第二个洗脱剂洗脱1.2~1.6倍柱体积,合并相同的含单一的鞘磷脂斑点流份。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,TLC实时监测条件为:薄层板固定相为硅胶,展开剂为第一个洗脱剂体系,显色剂为碘蒸汽。
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