CN114965829A

CN114965829A - 富集epa/dha型磷脂酰胆碱的柱层析法

Info

Publication number: CN114965829A
Application number: CN202210469216.7A
Authority: CN
Inventors: 薛静; 沈清
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，包括以下步骤：S1、准备硅胶作为吸附剂，二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，湿法装柱，得到层析柱；S2、将南极磷虾粉经95％乙醇重复提取3～5次后，合并提取液并真空脱溶，再采用无水乙醇复提2～3次，取上清液真空脱溶后制得富含PC的南极磷虾油，南极磷虾油经冷丙酮离心取沉淀，反复清洗沉淀至上清液澄清无色，沉淀物采用乙醇复溶后真空脱溶，获得南极磷虾PC；S3、将南极磷虾PC加入二氯甲烷溶解，并加入层析柱中，利用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行洗脱，将仅含有PC组分的流出液进行旋蒸脱溶，得PC_EPA/DHA。本发明具有有效富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的特点。

Description

富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法

技术领域

本发明涉及一种EPA/DHA型磷脂酰胆碱的富集方法，特别是一种富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法。

背景技术

优化和创新制备高纯度EPA和DHA的方法都是现代食品、药品领域重要的研究方向，而高纯度的乙酯型EPA和DHA单体的制备技术已经较为成熟，高纯度甘油三酯型EPA和DHA的制备也取得了较好的进展。如He等人先以Lipozyme TL IM酶催化醇解甘油三酯得到乙酯和甘油酯混合物，再以150℃的温度进行分子蒸馏以分离乙酯，最终产物中甘油酯型DPA和DHA的含量分别为17.9％和70.3％。相比于乙酯型和甘油三酯型，磷脂型EPA和DHA的分离纯化相关研究进展较为缓慢，相关研究报道较少。

柱层析法又被称为柱层析色谱法，其分离原理即根据目标化合物在固定相上的吸附力大小进行分离，一般而言，极性较大的化合物与固定相吸附较为牢固，而极性较小的化合物不易被吸附，而柱层析洗脱过程即不断的吸附、解离、再吸附和再解离的过程。柱层析法一般以硅胶、氧化铝等吸附材料为固定相，并因固定相和洗脱液对目标化合物的吸附能力不同来实现分离样品的目的，是天然活性成分的分离纯化的重要方法。硅胶因其对复杂有机化合物具有较好的分离效率，故成为生物油的柱层析分离固定相的主要材料。而固定相颗粒大小，柱子的长径比，洗脱液极性，上样量以及样品特性等均影响柱层析的分离效果。

各磷脂亚类的极性因其头部基团的差异而存在显著差别，故依据极性差异进行磷脂亚类的分离纯化已经成为普遍采用的方法。然而，脂肪酰基的极性也因碳链长短和不饱和键数量而有所差异，不饱和键的存在也会增加脂肪酸链的弯曲和空间位阻效应，脂肪酰基的差异或对PC分子的洗脱行为产生一定影响。南极磷虾磷脂中含有大量结合EPA和/或DHA的磷脂酰胆碱(PC)分子种，尤其是双链型PC 20:5/20:5、PC 20:5/22:6和PC 22:6/22:6，这均为PCEPA/DHA的富集提供了良好的基础条件。目前，有关磷脂分子种在柱层析过程中的变化规律鲜有关注，且尚未检索到采用柱层析法对EPA/DHA型磷脂进行富集的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法。本发明具有有效富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的特点。

本发明的技术方案：富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，包括以下步骤：

S1、层析柱准备：准备硅胶作为吸附剂，二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为2:3～3:2，通过湿法装柱，得到层析柱；

S2、样品准备：将南极磷虾粉经95％乙醇重复提取3～5次后，合并提取液并真空脱溶，再采用无水乙醇复提2～3次，取上清液真空脱溶后制得富含PC的南极磷虾油，南极磷虾油经冷丙酮离心取沉淀，反复清洗沉淀至上清液澄清无色，沉淀物采用乙醇复溶后真空脱溶，获得纯度大于80％的南极磷虾PC；

S3、层析分离：将南极磷虾PC加入二氯甲烷溶解，并加入层析柱中，上样质量为硅胶质量的1/60～1/40，利用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行洗脱，将仅含有PC组分的流出液进行旋蒸脱溶，得EPA/DHA型磷脂酰胆碱。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，S1步骤中，硅胶的颗粒粒径为200～300目。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，S1步骤中，二氯甲烷与甲醇的体积比为3:2或者1:1。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，S1步骤中，所述吸附剂的处理方法为：向硅胶中依次加入二氯甲烷、甲醇进行溶胀预处理，20～40min后倒出上层溶剂，将经溶胀处理后的硅胶于105～115℃活化1.5～2.5h，取出后冷却至室温，得活化硅胶吸附剂。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，S1步骤中，所述湿法装柱的具体操作方法为：将活化硅胶吸附剂与二氯甲烷/甲醇洗脱液混合，硅胶与洗脱液的比例为1:10～20，m/v，充分搅拌均匀至呈稀糊状，沿层析柱的内壁倒入，去除活化硅胶吸附剂中的气泡，使活化硅胶吸附剂均匀沉降，待活化硅胶吸附剂不再下降后，静置。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，柱层析洗脱前，预先使用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行平衡，二氯甲烷/甲醇洗脱液的洗脱体积为3倍的柱体积。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，S3步骤中，上样质量为硅胶质量的1/50。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，步骤S3中，二氯甲烷与南极磷虾PC的比例为1:5，m/v。

前述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法中，步骤S3中，洗脱速度为80～120ml/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首先采用极性较大的95％乙醇对南极磷虾PC进行富集提取，再结合柱层析法对南极磷虾PC进行分离纯化，根据南极磷虾PC分子种特征，通过优化柱层析参数，依据洗脱液中二氯甲烷和甲醇的配比，导致洗脱液的极性不同，洗脱液对不同组分的洗脱能力不同，从而扩大各个组分之间的迁移位移，实现对PC_EPA/DHA的富集。

本研究结果显示，采用发明的柱层析法，PC纯度达97.32％，回收率达83.17％。通过气相色谱数据可知，随着洗脱过程的延长，回收得到的PC中的EPA和DHA含量逐渐下降。而液相质谱的数据则进一步解释了气相色谱数据呈现的变化，结合不同脂肪酸的南极磷虾PC分子在柱层析洗脱过程中发生不同程度的迁移：双链均为长链多不饱和脂肪酸的PC分子迁移速度最快，被最早洗脱出来，其次为单链为长链多不饱和脂肪酸的PC分子，而不含长链多不饱和脂肪酸的PC分子迁移速度最慢，最后被洗脱出来。多元统计分析结果也证实了洗脱过程中存在质核比依赖，质核比接近的PC分子种具有类似的洗脱规律，而高质核比的PC分子种与低质核比的PC分子种呈显著负相关关系。因此，本发明的柱层析法通过扩大三类PC分子种之间的迁移位移，从而移除不含EPA和DHA的PC分子种，实现了PC_EPA/DHA的有效富集。

附图说明

图1是不同硅胶粒径对PC纯度和回收率的影响图；

图2是不同上样量对PC纯度和回收率的影响图；

图3是不同洗脱液比例对PC纯度和回收率的影响图；

图4是不同洗脱阶段PC气相色谱图(部分)；

图5是不同洗脱阶段PC脂肪酸组成图(部分)；

图6是不同洗脱阶段PC质谱图(部分)；

图7是不同洗脱阶段回收PC的相关性矩阵；

图8是PCA得分图；

图9是PCA载荷图；

图10是PC特征分子种相关性网络图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例：

富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，包括以下步骤：

S1、层析柱准备：准备颗粒粒径为200～300目的硅胶作为吸附剂，二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为3:2，通过湿法装柱，得到层析柱；

其中，吸附剂的处理方法为：向200～300目的硅胶中依次加入二氯甲烷、甲醇进行溶胀预处理，30min后倒出上层溶剂，将经溶胀处理后的硅胶置于烘箱中，110℃活化2h，取出后迅速转移至干燥器中冷却至室温，得活化硅胶吸附剂。

湿法装柱的具体操作方法为：将活化硅胶吸附剂与二氯甲烷/甲醇洗脱液混合，活化硅胶与洗脱液的比例为1:15，m/v，充分搅拌均匀至呈稀糊状，沿层析柱的内壁缓慢倒入，并用洗耳球轻轻敲打层析柱去除活化硅胶吸附剂中的气泡，并使活化硅胶吸附剂均匀缓慢沉降，待活化硅胶吸附剂的液面不再下降后，静置过夜，沉降充分。

在采用柱层析洗脱前，预先使用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行平衡，二氯甲烷/甲醇洗脱液的洗脱体积为3倍柱体积。

S2、样品准备：将南极磷虾粉经95％乙醇重复提取3次后，合并提取液并真空脱溶，再采用无水乙醇复提2次，取上清液真空脱溶后制得富含PC的南极磷虾油，南极磷虾油经冷丙酮离心取沉淀，反复清洗沉淀至上清液澄清无色，沉淀物采用乙醇复溶后真空脱溶，获得纯度大于80％的南极磷虾PC；

S3、层析分离：将南极磷虾PC加入二氯甲烷溶解，二氯甲烷与南极磷虾PC的比例为1:5，m/v，然后缓慢加入层析柱中，上样质量为硅胶质量的1/50，利用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行洗脱，洗脱速度为100ml/min，利用薄层层析结果判断PC流出的范围，将仅含有PC组分的流出液进行旋蒸脱溶，得高含量的EPA/DHA型磷脂酰胆碱。

具体的，从第一条有色条带到达层析柱下缘开始接收流出液，每500mL接一管流出液记为1号，后续每管依次顺序编号为2、3、4……。对每管流出液进行薄层层析检测，从第17管开始检出PC单一组分，一直收集到第57管检测不到PC结束，完成PC组分的收集。对17～57管回收的PC进行气相色谱检测，计算EPA和DHA含量。第17管，即第一管PC的EPA和DHA含量最高，往后逐渐下降，至36管基本和上样原料接近，即第17～35管的回收的PC的EPA和DHA含量均高于原料，即实现原料的富集。

将不同管回收的PC进行混合就可以获得不同含量的EPA/DHA型磷脂酰胆碱。

其中，薄层色谱(TLC)检验方法为：取分离产物100mg溶解于1mL三氯甲烷中，毛细管点样于TLC硅胶板上，以三氯甲烷:甲醇:乙酸:水(75:40:8:3，v/v/v/v)为展开液，碘蒸气显色。

气相色谱检测的检测方法为：将TLC硅胶板上对应的条带刮下，并加入5mL0.5mol·L^–1氢氧化钾-甲醇溶液，于65℃水浴30min，冷却后加入2mL三氟化硼-甲醇溶液(14％)，于65℃水浴5min，超声提取10min后加入2mL正己烷，振摇后用2mL饱和氯化钠淋洗上层，取上层用无水硫酸钠脱水，过滤待测。

气相色谱条件：HP-88毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.20μm)；升温程序：初温70℃保持1min，以4℃·min^–1升至180℃，保持5min；再以3℃·min^–1升至230℃，保持5min，进样口温度250℃，分流比30:1，进样量1μL，载气流速1mL·min^–1。采用峰面积归一化法分析各脂肪酸组分的相对含量。每组样品重复测试3次。

柱层析的各项参数条件均经过单因素条件优化，具体为：

取硅胶颗粒的粒径分别为100～200目、200～300目和300～400目进行单因素试验。如图1所示，随着硅胶颗粒粒径的减小，回收得到的PC的纯度逐渐提高。其中，使用200～300目和300～400目的硅胶回收的PC纯度差异不显著，分别为95.22％和96.33％，100～200目的硅胶为90.97％，与其他两组差异显著。而随着硅胶颗粒粒径的减小，PC回收率呈现先增大后下降的趋势。使用200～300目的硅胶的PC回收率为85.25％，显著高于100～200目(72.10％)和300～400目(74.43％)的硅胶。

由于100～200目的硅胶比表面积小，硅胶颗粒之间的空隙大，洗脱液流动速度快，目标化合物未能与硅胶充分进行吸附和解离，故分离效果较差，收集到的PC的纯度和回收率均较低。随着硅胶颗粒粒径的减小，硅胶颗粒的比表面积增大，吸附能力增强，目标化合物进行吸附-解离的过程充分，分离效率提高。但由于300～400目的硅胶颗粒粒径过小，目标化合物在进行常压柱层析时较难洗脱，且在相同洗脱条件下，洗脱时间延长，从而导致回收率的下降。因此，优选200～300目的硅胶。

取上样量分别为硅胶量的1/60、1/50、1/40、1/30和1/20进行单因素试验。如图2所示，随着上样量的增加，回收得到的PC的纯度和回收率呈先上升后下降的趋势。其中上样量为硅胶量的1/50时回收得到的PC纯度最高，为96.48％。上样量为硅胶量的1/60、1/50、1/40和1/30时回收的PC的纯度差异不显著，但均显著高于上样量为硅胶量的1/20时。上样量为硅胶量的1/40时回收得到的PC回收率最高，为85.25％。上样量为硅胶量的1/50、1/40和1/30时回收的PC的回收率差异不显著，但均显著高于上样量为硅胶量的1/60和1/20时。

由于上样量为硅胶量的1/20时，硅胶对样品的吸附能力过饱和，部分未能被硅胶吸附的物质随着洗脱液下行，导致样品中不同化合物柱层析起点不一致，而随着吸附-解离的过程的不断进行，位移的误差被逐渐放大，从而造成分离效率的降低和目标化合物纯度的下降。当上样量逐渐下降，样品中的化合物被硅胶充分吸附，经历的吸附-解离次数增加，硅胶的分离效率逐渐提高。但当上样量超过硅胶量的1/60时，硅胶的吸附能力远大于样品量，随着洗脱时间延长，出现拖尾现象，从而导致分离效率和目标化合物纯度下降。因此，选择上样量为硅胶量的1/50。

取洗脱液中的二氯甲烷和甲醇的体积比分别为2:1、3:2、1:1和2:3进行单因素试验。如图3所示，随着洗脱液中甲醇比例的增加，回收得到的PC的纯度和回收率均呈现先增加后降低的趋势。洗脱比例为3:2(v/v)时回收得到的PC的纯度最高，为97.32％。洗脱液比例为1:1(v/v)时回收得到的PC的回收率最高，为84.44％。洗脱液比例为3:2(v/v)和1:1(v/v)时回收得到的PC的纯度和回收率差异不显著，但均显著高于其他两组。

由于磷脂类物质为极性脂质，与硅胶结合能力较好，当洗脱液二氯甲烷：甲醇为2:1(v/v)时，洗脱液极性偏低，将目标化合物从硅胶上洗脱下来的能力较弱，目标化合物迁移速度较慢，保留时间延长造成目标化合物与硅胶之间的死吸附增加，从而导致回收率的进一步下降；随着洗脱液中甲醇比例的逐渐增加，洗脱液的洗脱能力逐渐增强，柱层析效率和样品回收率逐渐提高；而当洗脱液二氯甲烷：甲醇进一步增加至2:3(v/v)时，洗脱液极性偏高，洗脱能力较强，目标化合物和其他杂质之间的Rf值差距缩小，目标化合物和杂质在洗脱过程中出现部分重叠，导致目标化合物纯度和回收率下降。因此，洗脱液中二氯甲烷:甲醇为3:2(v/v)和1:1(v/v)时均获得较好的纯度和回收率。

进一步，比较二氯甲烷:甲醇比例为3:2(v/v)和1:1(v/v)两组实验的气相色谱柱数据发现，当二氯甲烷：甲醇比例为3:2(v/v)时，回收PC中EPA+DHA>40％的得率为61.32％；回收EPA+DHA>50％的得率为32.11％，回收EPA+DHA>70％的得率为7.43％。当二氯甲烷：甲醇比例为1:1(v/v)时，回收PC中EPA+DHA>40％的得率为70.21％；回收EPA+DHA>50％的得率为43.07％，回收EPA+DHA>70％的得率为4.21％。因此，以EPA+DHA含量为主要参考指标时，柱层析最优洗脱液比例为3:2(v/v)。这一结果也表明，该方法可根据不同EPA+DHA含量需求进行调整，当对含量要求较高时，宜采用极性相对较低的洗脱液，而对含量要求较低时，宜采用极性稍高的洗脱液。

柱层析过程中PC的脂肪酸组成及含量变化：

对柱层析不同阶段(即不同流出液收集管的编号)回收的PC的脂肪酸组成及含量变化进行分析：

部分气相色谱图见图4，分析结果见图5。图4中的编号即为流出液的收集管编号。

由图4可知，随着柱层析洗脱体积的增加，接收液中PC主要脂肪酸种类基本相同，而相对含量发生了明显的变化。南极磷虾磷脂酰胆碱原料(KPC)的脂肪酸主要包括C20:5、C22:6、C16:0、C18:1、C18:3、C18:2、C16:1、C18:0和C14:0，随着吸附-解离过程的进行，主要脂肪酸由出峰时间较长的长链脂肪酸(如DHA)逐渐向出峰时间较短的中链脂肪酸(如C16:0)过渡。

KPC所含EPA、DHA、C16:0和C18:1的相对含量较高，分别为25.32％、15.31％、24.42％和13.41％，其余脂肪酸含量均小于2％。

比较柱层析不同阶段接收液中PC脂肪酸含量，由图5可知，随着柱层析洗脱的进行，EPA和DHA的相对含量整体呈下降趋势，且DHA的相对含量在洗脱初期下降迅速，而C14、C16和C18系列中长链脂肪酸的相对含量整体呈上升趋势，其中C18:1相对含量虽然有所波动，但总体较为稳定。具体为：

(1)EPA和DHA的相对含量：第17管接收液中PC的EPA和DHA相对含量最高，分别为39.30％和36.86％，合计76.16％；至第22管时，EPA和DHA的相对含量为36.28％和18.51％，合计54.79％；至第36管时，EPA和DHA相对含量为31.32％和8.89％，合计40.21％；至第50管时，EPA和DHA相对含量仅为25.21％和6.67％，合计31.88％。

(2)C14、C16和C18系列脂肪酸的相对含量：第17管接收液中PC的C16:0、C18:1、C18:3、C18:2和C16:1的相对含量为7.36％、8.05％、0.90％、0.73％和0.69％，C14:0和C18:0未检出，合计17.73％；至第22管时，C16:0、C18:1、C18:3、C18:2、C16:1、C14:0和C18:0的相对含量为22.23％、8.83％、2.17％、0.24％、0.67％、1.27％和4.12％，合计39.53％；至第37管时相对含量分别为30.54％、7.99％、4.12％、1.34％、1.48％、1.51％和7.56％，合计51.64％；至第50管时，相对含量依次为33.71％、8.70％、4.85％、1.76％、2.08％、2.55％和9.30％，合计62.95％。

柱层析过程中PC的分子种含量变化：

LC-MS/MS测定PC分子种组成及含量的方法为：取分离产物采用氯仿-甲醇溶液(2:1，v/v)进行复溶，以0.2μm有机滤膜过滤后立即用于液相质谱分析。

液相条件：色谱柱：Cosmosil HILIC色谱柱(4.6mm×250mm，2.5μm)；流动相A：超纯水(20mmol·L^–1甲酸铵，18mmol·L^–1甲酸)；流动相B：乙腈(18mmol·L^–1甲酸)。梯度洗脱程序：0min(95％B)，3min(95％B)，18min(70％B)，23min(50％B)，28min(50％B)，29min(95％B)，32min(95％B)。流量0.6mL·min^–1；进样量2μL。

质谱条件：电喷雾离子源ESI负离子模式；离子源电压(IS)-4500V；毛细管温度500℃；气帘气(CUR)25psi；雾化气(GS1)24psi；辅助气(GS2)30psi；扫描范围400～1000m/z。采用峰面积归一化法分析各PC分子种组分的相对含量。每组样品重复测试3次。

对不同洗脱阶段回收的PC进行液相质谱分析，部分质谱图谱见图6。由图6可知，KPC主要分子种的质核比分布在m/z 804.9至m/z 850.8之间，还包含少量的m/z 896.9，其中m/z 824.7的信号强度最高。随着洗脱的进行，接收液中PC逐渐向质核比减小的方向移动，具体为：

第17管接收液中所含PC的质核比主要分布在m/z 870.8至m/z 922.9之间，信号最强的为m/z 896.8；随后，以m/z 850.8和m/z 824.8为代表的中质核比离子信号强度逐渐增强，而以m/z 922.9和m/z 896.8为代表的高质核比离子信号强度逐渐下降；至第20管时，洗脱液中PC的质核比主要分布在m/z 824.8至m/z 896.9之间，且m/z 824.8和m/z 850.8的信号强度最高；接着，以m/z 796.8、m/z 776.9和m/z 804.9为代表的低质核比离子的信号强度逐渐增加，而以m/z850.8和m/z 824.8为代表的中质核比离子信号强度逐渐降低；至第50管时，质核比主要分布在m/z 776.9和m/z 824.8之间，且m/z 804.9的信号强度最高。

洗脱过程中回收PC分子种的结构及含量的变化：

对不同洗脱阶段回收的PC进行液相质谱分析，分析结果见表1。由表1可知：随着柱层析洗脱的进行，回收获得的PC分子种的种类逐渐丰富，主要分子种由高质核比向中质核比过渡，并最终由低质核比成为优势组分。具体为：

(1)对PC主要分子种的种类和相对含量进行分析：第17管接收液中所含PC中相对含量最高的3个分子种依次为m/z 896.8(PC 20:5/22:6)、m/z 922.9(PC 22:6/22:6)和m/z870.8(PC 20:5/20:5)，相对含量依次为28.15％、15.94％和13.87％。第20管至第24管中相对含量最高的3个分子种均为m/z 824.8(PC 16:0/20:5)、m/z 850.7(PC 18:1/20:5&PC16:0/22:6)和m/z 840.8(PC O-18:0/20:4)，相对含量分别在11.65％至16.94％、9.92％至11.36％和8.31％至9.40％之间；第26管至第38管中相对含量最高的3个分子种均为m/z824.8(PC 16:0/20:5)、m/z 850.7(PC 18:1/20:5&PC 16:0/22:6)和m/z 796.7(PC 14:0/20:5)，相对含量分别在15.45％至19.07％、8.70％至10.19％和6.07％至8.02％之间；第50管中相对含量最高的3个分子种为m/z 804.8(PC 16:0/18:1)、m/z 824.8(PC 16:0/20:5)和m/z 776.8(PC 16:0/16:1&14:0/18:1)，相对含量分别为17.52％、12.54％和10.25％。

(2)对KPC主要分子种的变化趋势进行分析：KPC分子种中的主要PC分子种为m/z824.8(PC 16:0/20:5)、m/z 850.7(PC 18:1/20:5&PC 16:0/22:6)、m/z 804.8(PC 16:0/18:1)、m/z 798.8(PC 14:0/20:4&16:0/18:4)和m/z 896.8(PC 20:5/22:6)等。其中以m/z896.8(PC 20:5/22:6)为代表的质核比≥870.8的高质核比组分主要在洗脱初期便开始出现，并总体呈现下降或短暂上升后快速下降的趋势；以m/z 850.7(PC 18:1/20:5&PC 16:0/22:6)和m/z 824.8(PC 16:0/20:5)为代表的质核比介于822.7和868.9之间的中质核比组分主要洗脱初期或中期开始出现，并总体呈现先上升后下降的趋势；而以m/z 804.8(PC16:0/18:1)和m/z 776.8(PC 16:0/16:1)为代表的低质核比组分则主要出现在洗脱中期或后期开始出现，并总体呈上升的趋势。

(3)对特殊PC分子种的变化趋势进行分析：上样样品中的PC分子种中包含少量特殊结构的PC，如PC 20:5/22:6、PC 22:6/22:6和PC 20:5/20:5，相对含量分别为4.39％、1.88％和1.28％，合计7.55％。第17管接收液中PC的PC 20:5/22:6、PC 22:6/22:6和PC 20:5/20:5，相对含量分别为28.15％、15.95％和13.87％，合计57.96％，较上样PC分别提高23.76、14.07和12.59个百分点，合计提高50.41个百分点。至第18管，PC 20:5/22:6、PC 22:6/22:6和PC 20:5/20:5的相对含量分别为12.49％、7.29％和11.91％，合计31.69％，较第17管分别减少15.66％、8.65％和1.96％，合计减少26.27％。随着洗脱的进行，PC 20:5/22:6、PC 22:6/22:6和PC 20:5/20:5的相对含量均呈现下降的趋势，至第32管时相对含量仅为1.94％、1.16％和1.17％，第34管仅检出PC 20:5/22:6，相对含量为1.31％，此后均未检出3种特殊PC分子种。

表1不同阶段洗脱液中PC分子种的结构及含量(％)

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对不同洗脱阶段回收的PC分子种信息进行相关性分析，结果见图7。图7中标注的数字为相关系数。

以KPC为参考，由图可知，随着洗脱管编号的增大，回收获得的PC与KPC之间的相关性系数总体呈现先迅速增大后逐渐稳定再迅速下降的趋势，说明随着洗脱的进行，回收获得的PC与原料PC之间的差异先迅速缩小，随后扩大。以第17管回收的PC为参考，样品管编号越大，与第17管之间的相关性越小，如第18管与第17管之间的相关性系数为0.843，至第28管时下降至0.005，至第50管时低至-0.177，说明随着洗脱的进行，回收的PC与最开始收集的PC之间的差异逐渐变大。

此外，除17和18管外，编号邻近的回收PC之间的相关性系数均大于0.900，表明洗脱过程具有较好的连续性，并未出现较大的波动。该结果提示洗脱过程中PC的组成与洗脱顺序相关。

根据不同洗脱阶段回收的PC分子种的种类和含量等信息进行PCA统计分析，绘制得分图(Score plot)见图8，载荷图(Loading plot)见图9。由图8可知，15组PC样品组内聚类较好，集群间存在不同程度的聚集和离散，其中KPC位于中心位置，14组洗脱样品随着编号的增大呈逆时针方向分布，且与KPC之间的距离呈现先逐渐缩小后逐渐增大的趋势。由图9可知，m/z 870.8、m/z 912.8、m/z872.8、m/z 898.8、m/z 922.9、m/z 896.8、m/z 924.8、m/z 886.8、m/z 884.9、m/z 914.8、m/z 910.8、m/z 956.9和m/z 938.9对主成分PC1正向贡献最大，而m/z 824.8、m/z 826.9、m/z 810.8、m/z 798.8和m/z 852.8对主成分PC1负向贡献最大。m/z 822.7、m/z 840.8、m/z 876.8、m/z 864.7、m/z 866.9、m/z 878.8、m/z 868.9、m/z 842.8和m/z 850.7对主成分PC2正向贡献最大，而m/z 804.8、m/z 830.9、m/z 776.8、m/z806.9、m/z 790.9、m/z 832.9、m/z 802.8、m/z 828.9和m/z 778.9对主成分PC2负向贡献最大。

结合得分图和载荷图可知，分子种质核比以逆时针方向由高向低逐渐递减，得分图中样品编号以逆时针方向由小到大逐渐增加，具体为：第17、18管的得分主要受m/z870.8、m/z 912.8、m/z 872.8、m/z 898.8、m/z 922.9、m/z 896.8、m/z 924.8、m/z 886.8、m/z 884.9、m/z 914.8、m/z 910.8、m/z 956.9和m/z 938.9等高质核比分子种的影响；第20管至第36管的位置主要受m/z 822.7、m/z 864.7、m/z 840.8、m/z 866.9、m/z 876.8、m/z850.7、m/z 878.8、m/z 796.7、m/z 852.8和m/z 824.8等中、高质核比分子种的影响；而第38管至第50管的位置主要受m/z 776.8、m/z 800.8、m/z 802.8、m/z 804.8和m/z 830.9等中、低质核比分子种的影响。

依据不同洗脱阶段回收PC的分子种信息建立PLS-DA模型，R2(Y)和Q2均大于0.8。基于PLS-DA模式下计算VIP值：共有21个分子种的VIP值≥1，根据VIP值从大到小依次为m/z824.8、m/z 896.8、m/z 804.8、m/z 836.8、m/z 840.8、m/z 796.7、m/z 922.9、m/z 870.8、m/z 850.7、m/z 776.8、m/z 748.9、m/z 826.9、m/z 770.6、m/z 800.8、m/z 798.8、m/z866.9、m/z 774.7、m/z 808.9、m/z 898.8、m/z 852.8和m/z 802.8，以上分子种为区分不同洗脱阶段PC的特征因子。

以线条粗细表示相关性强弱，以棕色实线代表正相关，以灰色虚线代表负相关，以圆圈大小表示建立相关关系的多少，并以P<0.05为筛选标准，绘制可视化相关性网络图，见图10。由图10可知：

以质核比m/z 870.8为分界线，高质核比分子种m/z 922.9、m/z 898.8、m/z 896.8和m/z 870.8之间呈两两显著正相关，且与其他中、低质核比分子种较多呈现显著负相关关系。

m/z 866.9与m/z 840.8之间呈显著正相关关系，其中m/z 866.9与m/z 802.8、m/z800.8、m/z 776.8、m/z 774.7、m/z 770.6、m/z 748.9呈显著负相关，m/z 840.8与m/z802.8、m/z 800.8和m/z 776.8呈显著负相关；

m/z 852.8与m/z 850.7、m/z 826.9、m/z 824.8、m/z 808.9、m/z 798.8和m/z796.7之间呈显著正相关，且m/z 826.9、m/z 824.8、m/z 808.9、m/z 798.8和m/z 796.7两两显著正相关；m/z 802.8、m/z 800.9、m/z 776.8、m/z 774.7、m/z 770.6、m/z 748.9和m/z804.8之间呈两两显著正相关关系。

由以上检测可知，通过本发明的柱层析法，回收得到的PC纯度达到97.32％，回收率达到83.17％，较现有的回收方法，达到的纯度更高，回收率更高，效果更佳。

回收PC中EPA+DHA>40％的得率为61.32％；回收EPA+DHA>50％的得率为32.11％，回收EPA+DHA>70％的得率为7.43％.

因此，柱层析法可以有效富集PC_EPA/DHA，且高效富集的关键在于扩大三类PC分子种之间的迁移位移，从而移除不含EPA和DHA的PC分子种。高质核比PC分子与低质核比PC分子的含量在柱层析过程中呈显著负相关，双链均为PUFAs的PC分子在柱层析中的迁移速度更快。

Claims

1.富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：S1步骤中，硅胶的颗粒粒径为200～300目。

3.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：S1步骤中，二氯甲烷与甲醇的体积比为3:2或者1:1。

4.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：S1步骤中，所述吸附剂的处理方法为：向硅胶中依次加入二氯甲烷、甲醇进行溶胀预处理，20～40min后倒出上层溶剂，将经溶胀处理后的硅胶于105～115℃活化1.5～2.5h，取出后冷却至室温，得活化硅胶吸附剂。

5.根据权利要求4所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：S1步骤中，所述湿法装柱的具体操作方法为：将活化硅胶吸附剂与二氯甲烷/甲醇洗脱液混合，活化硅胶与洗脱液的比例为1:10～20，m/v，充分搅拌均匀至呈稀糊状，沿层析柱的内壁倒入，去除活化硅胶吸附剂中的气泡，使活化硅胶吸附剂均匀沉降，待活化硅胶吸附剂不再下降后，静置。

6.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：柱层析洗脱前，预先使用二氯甲烷/甲醇洗脱液进行平衡，二氯甲烷/甲醇洗脱液的洗脱体积为3倍的柱体积。

7.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：S3步骤中，上样质量为硅胶质量的1/50。

8.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：步骤S3中，二氯甲烷与南极磷虾PC的比例为1:5，m/v。

9.根据权利要求1所述的富集EPA/DHA型磷脂酰胆碱的柱层析法，其特征在于：步骤S3中，洗脱速度为80～120ml/min。