CN114989999A - 一种大肠杆菌培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌培养基及培养方法。本发明培养基由胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾按照特定比例组成。实验表明，本发明培养基可以显著提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的产量和质粒DNA菌比含量，效果明显优于现有的培养基。
Description
优先权声明
本申请要求2021年3月2日提交的申请号为202110230492.3的中国专利申请的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌培养基及培养方法。
背景技术
质粒属于环形双链DNA，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。随着近年来重组DNA技术和基因组测序的发展，质粒DNA作为一种可携带外源基因的非病毒转基因载体，可作为基因治疗和基因疫苗的生物药剂。质粒DNA作为主要的药物载体，其优点是安全可靠、稳定、对外源基团的容纳量大、无载体免疫原性及易于生产等。
在基因治疗中，与病毒载体相比，质粒DNA载体转染细胞的效率较低，持续时间短，若要质粒DNA能够高效表达治疗疾病，其临床用量需达到mg级。目前，一般在质粒DNA的生产中都采用发酵罐发酵的方法来提高质粒DNA总产量，而发酵法通常是通过优化菌的生长情况，提高每升培养基的菌体量来提高质粒DNA产量。在质粒DNA在临床上的应用中，宿主基因组DNA、RNA、宿主蛋白和内毒素的含量对于质粒DNA的转染效率有极大的影响，因此，单纯提高每升培养基的菌体量会对后续的质粒分离和纯化流程带来更大的挑战。
在质粒DNA的生产中，对于大肠杆菌工程菌而言，培养基组分的不同会启动大肠杆菌工程菌胞内不同的代谢途径。不同于蛋白质，质粒DNA是由糖-磷酸骨架和含氮的核苷酸(ATGC)组成，主要组成元素是C、H、O、P、N，目前质粒DNA生产多采用的是蛋白质工程菌的发酵培养基，该类培养基并不是质粒DNA的最佳培养基，普遍存在质粒DNA的菌比含量较低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种培养大肠杆菌的培养基及培养方法。本发明培养基可有效地促进大肠杆菌工程菌的生长，提高质粒DNA的菌比含量，效果明显优于现有的其他培养基。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种培养大肠杆菌的培养基，包括水和如下组分：
本发明针对大肠杆菌工程菌生长和质粒DNA复制所需的营养物质对培养基中的胰蛋白胨的浓度、酵母提取物浓度进行了优化，通过优化培养基中的营养物质达到一个平衡状态(胰蛋白胨8.0-20g/L，酵母提取物19.0-35g/L)同时满足了大肠杆菌工程菌生长以及质粒DNA复制的需求平衡。
一个具体实施例中，比较了同一大肠杆菌工程菌在不同培养基中相同培养条件下培养后菌液的OD600值、质粒抽提浓度和质粒DNA的菌比含量，并对质粒DNA的纯度进行了分析。结果显示，本发明培养基可以提高大肠杆菌工程菌胞内的质粒DNA含量，对大肠杆菌工程菌生长具有明显促进作用，明显优于其他培养基的培养效果。
在一些实施方案中，所述培养基包括水和如下组分：
在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
在一些实施方案中，本发明所述培养基还包括抗生素。添加抗生素的作用在于筛选能够表达抗性基因的大肠杆菌工程菌，成功转化外源质粒DNA。
在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为30-150μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为50-100μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为50μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为100μg/mL。
在一些实施方案中，所述抗生素的种类为本领域技术人员熟知的种类即可，包括但不仅限于氨苄青霉素或卡那霉素，本领域技术人员可根据外源质粒DNA携带的抗性基因选择对应的抗生素种类进行添加。
在一些具体实施例实施中，所述抗生素为氨苄青霉素。
在一些实施方案中，本发明所述培养基的pH为6.8～7.2。在一些实施方案中，本发明所述培养基的pH为6.8。在一些实施方案中，本发明所述培养基的pH为7.0。在一些实施方案中，本发明所述培养基的pH为7.2。
本发明还提供了大肠杆菌的培养方法，将大肠杆菌单菌落或大肠杆菌菌液接种至本发明所述的培养基中培养。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌工程菌。根据外源质粒DNA携带的抗性基因，在本发明培养基中添加相应的抗生素，从而实现对大肠杆菌工程菌的增殖培养。
在一些实施方案中，所述培养为37℃，200-300rpm培养。
本发明培养基包括水和如下组分：胰蛋白胨8.0～20.0g/L、酵母提取物19.0～35.0g/L、氯化钠0.0～10.0g/L、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾3.0～15.0g/L、磷酸二氢钾2.0～5.0g/L、蔗糖2.5～8.0g/L。实验表明，本发明培养基可以显著提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的产量和质粒DNA菌比含量，同时保证了质粒DNA具有较高纯度，效果明显优于现有的培养基。
如本文所用，术语“质粒”指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。
术语“胰蛋白胨”又称胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一种优质蛋白胨，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。含有丰富的氮源、氨基酸等，可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。
术语“酵母提取物”又称酵母味素，根据国际通用用法，将其缩写为YE。主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素，是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，其功效与8倍的酵母相当，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率。
术语“蔗糖”是一种双糖，晶体白色，具有旋光性，但无变旋。易被酸水解，水解后产生等量的D-葡萄糖和D-果糖。
术语“抗生素”是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。
术语“OD600”是将波长设定为600nm时测定的光密度值。
术语“菌比含量”是每单位OD的大肠杆菌中质粒DNA的含量。
具体实施方式
本发明提供了一种大肠杆菌培养基及其培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明培养基的制备
制备方法：称取胰蛋白胨12.0g、酵母提取物24.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠7.0g、磷酸二氢钾5.0g、蔗糖8.0g，用900mL的纯水溶解以上组分，待所有组分溶解后，用纯水将溶液定容至1000mL；将配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，其灭菌条件为115℃，30min；灭完菌的培养基，待其自然冷却至60-70℃时，加入100μg/mL氨苄青霉素抗生素，混匀后分装存放于4℃备用。
实施例2本发明培养基的制备
制备方法参照实施例1。
实施例3本发明培养基的制备
制备方法参照实施例1。
实施例4本发明培养基的制备
制备方法参照实施例1。
实施例5比较不同培养基对大肠杆菌工程菌的培养效果
1、实验材料：
含有带氨苄青霉素抗性质粒DNA的Top10/pUC57工程菌。
2、分组
设置实验组和对照组1～3，其中：
实验组：实施例1-4的培养基。
对照组1：培养基配方源于英文文献Production Optimization andCharacterization of Recombinant Cutinases from Thermobifida fusca sp.NRRL B-8184：12.0g/L胰蛋白胨、24.0g/L酵母提取物、12.5g/L磷酸氢二钾、2.3g/L磷酸二氢钾、4.0g/L蔗糖。用900mL的纯水溶解以上组分，待所有组分溶解后，用纯水将溶液定容至1000mL；将配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，灭完菌的培养基，待其自然冷却至60-70℃时，加入100μg/mL氨苄青霉素抗生素，混匀后分装存放于4℃备用。
对照组2：培养基配方源于改良型LB培养基：10.0g/L胰蛋白胨、5.0g/L酵母提取物、10.0g/L氯化钠、0.98g/L甘油、10.0g/L蔗糖、6.4g/L硫酸铵。用900mL的纯水溶解以上组分，待所有组分溶解后，用纯水将溶液定容至1000mL；将配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，灭完菌的培养基，待其自然冷却至60-70℃时，加入100μg/mL氨苄青霉素抗生素，混匀后分装存放于4℃备用。
对照组3：培养基配方源于英文文献Growth Medium Selection and ItsEconomic Impact on Plasmid DNA Production：7.9g/L胰蛋白胨、4.4g/L酵母提取物、12.8g/L七水合磷酸氢二钠、3.0g/L磷酸氢二钾、0.5g/L氯化铵、0.24g/L硫酸镁、10.0g/L葡萄糖。用900mL的纯水溶解以上组分，待所有组分溶解后，用纯水将溶液定容至1000mL；将配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，灭完菌的培养基，待其自然冷却至60-70℃时，加入100μg/mL氨苄青霉素抗生素，混匀后分装存放于4℃备用。
3、单菌落的制备及液体培养
将含有带氨苄青霉素抗性质粒DNA的Top10/pUC57工程菌菌液涂布于LB固体平板上进行37℃过夜培养，随后进行挑取单个菌落于1.4mL上述实验组和对照组液体培养基中分别进行37℃的培养。
4、对培养结束的菌液进行OD600的测定，大肠杆菌工程菌在不同配方培养基中培养结束后的菌液OD600结果比较如表1所示。从表1可以看出，本发明的培养基相比于对照组的培养基，OD600提高了13％-136％。
表1菌液OD600
5、通过碱裂解法对收集的菌液进行质粒抽提(具体可参照杨献光，齐志广，赵宝存等在生物技术通报“碱裂解法提取质粒DNA的研究”一文中报道的方法)。对抽提的质粒进行浓度测定，不同配方培养基中质粒的抽提浓度对比结果如表2所示，表2可以看出本发明培养基和对照组相比，质粒抽提浓度提高了9％-336％，因此本发明的培养基和对照组相比，质粒DNA的产量明显提高。培养基中的质粒DNA菌比含量如表3所示，表3可以看出本发明培养基和对照组相比，质粒DNA菌比含量最高提高了151％。
表2质粒抽提浓度(ng/μL)
表3质粒DNA菌比含量
6、通过Nanodrop分光光度计对抽提出的质粒进行纯度分析，当质粒DNA的OD260/OD280值在1.8-2.0范围内表明质粒DNA的纯度较高。不同培养基抽提出质粒DNA的OD260/OD280均在1.8-2.0范围内。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种培养大肠杆菌的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：
胰蛋白胨 8.0～20g/L；
酵母提取物 19.0～35g/L；
氯化钠 0.0～10.0g/L；
磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 3.0～15.0g/L；
磷酸二氢钾 2.0-5.0g/L；
蔗糖 2.5～8.0g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：
胰蛋白胨 10.0～20g/L；
酵母提取物 24.0～35g/L；
氯化钠 5.0～10.0g/L；
磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 7.0～12.5g/L；
磷酸二氢钾 3.0-5.0g/L；
蔗糖 2.5～8.0g/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：
胰蛋白胨 约12.0g/L；
酵母提取物 约24.0g/L；
氯化钠 约5.0g/L；
磷酸氢二钠 约7.0g/L；
磷酸二氢钾 约5.0g/L；
蔗糖 约8.0g/L。
4.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：胰蛋白胨 约20.0g/L；
酵母提取物 约35.0g/L；
氯化钠 约5.0g/L；
磷酸氢二钾 约12.5g/L；
磷酸二氢钾 约5.0g/L；
蔗糖 约2.5g/L。
5.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：
胰蛋白胨 约10.0g/L；
酵母提取物 约24.0g/L；
氯化钠 约10.0g/L；
磷酸氢二钠 约7.0g/L；
磷酸二氢钾 约3.0g/L；
蔗糖 约5.0g/L。
6.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：
胰蛋白胨 约14.0g/L；
酵母提取物 约24.0g/L；
氯化钠 约5.0g/L；
磷酸氢二钠 约7.0g/L；
磷酸二氢钾 约3.0g/L；
蔗糖 约5.0g/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH为6.8～7.2。
8.根据权利要求1～6任一项所述的培养基，其特征在于，还包括抗生素；所述抗生素的浓度为30-150μg/mL。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述抗生素为氨苄青霉素或卡那霉素。
10.大肠杆菌的培养方法，其特征在于，将大肠杆菌单菌落或大肠杆菌菌液接种至权利要求1～9任一项所述的培养基中培养。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌工程菌。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养为37℃，200-300rpm培养。
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