CN114984037A - 一种低分子量褐藻胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种低分子量褐藻胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低分子量褐藻胶及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供了一种低分子量褐藻胶在制备抑制肾透明癌细胞活性的药物中的应用，所述低分子量褐藻胶的分子量为10~100kDa。本发明提供的低分子量褐藻胶对肾透明癌细胞的细胞活性具有明显的抑制作用，可以作为治疗肾透明细胞癌的药物使用。

Description

一种低分子量褐藻胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种低分子量褐藻物及其制备方法和应用。
背景技术
肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是最常见的原发性细胞瘤。肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占肾细胞癌的80%以上，并且是最致命的泌尿系统恶性肿瘤之一。目前，对肾透明细胞癌具有治疗作用的一线治疗药物主要包括舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和帕唑帕尼。
褐藻是一类高级藻类，主要包括海带、裙带菜、马尾藻、墨角藻、泡叶藻等。有研究显示，褐藻的提取物褐藻胶对肝癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞具有抑制作用。但目前尚无褐藻胶抑制肾透明癌细胞活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低分子量褐藻胶在制备抑制肾透明癌细胞活性的药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种低分子量褐藻胶在制备抑制肾透明癌细胞活性的药物中的应用。
优选的，所述低分子量褐藻胶的分子量为10~100kDa。
本发明还提供了一种低分子量褐藻胶的制备方法，包括如下步骤：
（1）褐藻胶经冷冻干燥、粉碎后，得到褐藻胶粉；
（2）将褐藻胶粉溶于水，制成褐藻胶溶液后进行酶解，得到褐藻胶酶解液；
（3）褐藻胶酶解液经超声处理后，收集分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶，得到低分子量褐藻胶。
优选的，所述冷冻干燥的温度为-50~-80℃，所述冷冻干燥的时间为0.5~1h。
优选的，所述褐藻胶粉的粒径为300~800目。
优选的，所述褐藻胶粉与水的质量体积比为1g:100~150ml。
优选的，所述酶解的酶为褐藻胶裂解酶；所述褐藻裂解酶的添加量为2500~3500U/g。
优选的，所述酶解的温度为35~45℃，所述酶解的时间为20~40min。
优选的，所述超声处理的频率为30~50kHz，所述超声处理的时间为15~35min。
本发明还提供了一种低分子量褐藻胶。
本发明提供的低分子量褐藻胶对肾透明癌细胞的细胞活性具有明显的抑制作用，可以作为治疗肾透明细胞癌的药物使用。其对肾透明癌细胞的IC50抑制浓度为8~10μM，抑制作用明显。
附图说明
图1为不同浓度低分子量褐藻胶对肾透明癌细胞活性的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种低分子量褐藻胶在制备抑制肾透明细胞癌活性的药物中的应用。
在本发明中，所述低分子量褐藻胶的分子量优选为10~100kDa，进一步优选为20~80kDa，再进一步优选为60kDa。
本发明还提供了一种低分子量褐藻胶的制备方法，包括如下步骤：
（1）褐藻胶经冷冻干燥、粉碎后，得到褐藻胶粉；
（2）将褐藻胶粉溶于水，制成褐藻胶溶液后进行酶解，得到褐藻胶酶解液；
（3）褐藻胶酶解液经超声处理后，收集分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶，得到低分子量褐藻胶。
本发明先将褐藻胶经冷冻干燥、粉碎，得到褐藻胶粉。
在本发明中，所述褐藻胶优选从褐藻中提取得到。
在本发明中，所述褐藻优选为海带、裙带菜、马尾藻、墨角藻、泡叶藻中的一种。
在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-50~-80℃，进一步优选为-60~-70℃，再进一步优选为-65℃。
在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为0.5~1h，进一步优选为40~50min，再进一步优选为45min。
在本发明中，所述粉碎优选采用超微粉碎机粉碎。
在本发明中，所述粉碎后的褐藻胶粉的粒径优选为300~800目，进一步优选为400~600目，再进一步优选为500目。
本发明制备得到褐藻胶粉后，将褐藻胶粉溶于水中，制成褐藻胶溶液，进一步对褐藻胶溶液进行酶解，得到褐藻胶酶解液。
在本发明中，所述褐藻胶粉与水的质量体积优选为1g:100~150ml，进一步优选为1g:120ml。
在本发明中，所述水的温度优选为35~45℃，进一步优选为40℃。
在本发明中，所述酶解所用的酶优选为褐藻胶裂解酶。
在本发明中，所述褐藻胶裂解酶的添加量按照褐藻胶粉质量添加，优选为2500~3500U/g，进一步优选为2800~3200U/g，再进一步优选为3000U/g。
在本发明中，所述酶解的温度优选为35~45℃，进一步优选为38~42℃，再进一步优选为40℃。
在本发明中，所述酶解的时间优选为20~40min，进一步优选为25~35min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述酶解优选在搅拌的条件下进行。
在本发明中，所述搅拌的转速优选为300~500rpm，进一步优选为350~450rpm，再进一步优选为400rpm。
本发明制备得到褐藻胶溶液后，褐藻胶酶解液经超声处理，然后收集分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶，即得到低分子量褐藻胶。
在本发明中，所述超声处理的频率优选为30~50kHz，进一步优选为35~45kHz，再进一步优选为40kHz。
在本发明中，所述超声处理的时间优选为15~35min，进一步优选为20~30min，再进一步优选为25min。
在本发明中，收集分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶时优选采用透析袋截留分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶。
在本发明中，优选先采用截留分子量为100~150kDa透析袋进行透析，进一步优选为采用截留分子量为120kDa透析袋进行透析，取透过液；再将透过液优选采用截留分子量为5~10kDa透析袋进行透析，进一步优选为采用截留分子量为8kDa透析袋进行透析，取截留液，即得到分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取从海带中提取得到的褐藻胶（分子量在1500~1900kDa之间），置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，设定冷冻温度-80℃，时间为45min。然后放入超微粉碎机中进行粉碎，粉碎物过500目筛，取筛下物，得到褐藻胶粉。按照1g:120ml的质量体积比将1份褐藻胶粉加入40℃的温水中搅拌溶解，得到褐藻胶溶液。在褐藻胶溶液中按照3000U/g褐藻胶粉加入褐藻胶裂解酶，混合均匀，在40℃水浴、400rpm搅拌条件下酶解30min，然后加热至85℃下灭酶5min，得到褐藻胶酶解液。将褐藻胶酶解液用超声处理，设定超声的频率为40kHz，超声处理的时间为25min，然后用截留分子量为100kDa透析袋进行透析，取透析液用截留分子量为8kDa透析袋进行透析，取截留液，得到低分子量褐藻胶。
实施例2
取从海带中提取得到的褐藻胶（分子量在1500~1900kDa之间），置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，设定冷冻温度-65℃，时间为60min。然后放入超微粉碎机中进行粉碎，粉碎物过300目筛，取筛下物，得到褐藻胶粉。按照1g:100ml的质量体积比将1份褐藻胶粉加入35℃的温水中搅拌溶解，得到褐藻胶溶液。在褐藻胶溶液中按照3000U/g褐藻胶粉加入褐藻胶裂解酶，混合均匀，在35℃水浴、300rpm搅拌条件下酶解20min，然后加热至85℃下灭酶5min，得到褐藻胶酶解液。将褐藻胶酶解液用超声处理，设定超声的频率为45kHz，超声处理的时间为20min，然后用截留分子量为120kDa透析袋进行透析，取透析液用截留分子量为10kDa透析袋进行透析，取截留液，得到低分子量褐藻胶。
实施例3
取从海带中提取得到的褐藻胶（分子量在1500~1900kDa之间），置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，设定冷冻温度-50℃，时间为60min。然后放入超微粉碎机中进行粉碎，粉碎物过800目筛，取筛下物，得到褐藻胶粉。按照1g:150ml的质量体积比将1份褐藻胶粉加入45℃的温水中搅拌溶解，得到褐藻胶溶液。在褐藻胶溶液中按照3000U/g褐藻胶粉加入褐藻胶裂解酶，混合均匀，在45℃水浴、500rpm搅拌条件下酶解40min，然后加热至85℃下灭酶5min，得到褐藻胶酶解液。将褐藻胶酶解液用超声处理，设定超声的频率为30kHz，超声处理的时间为30min，然后用截留分子量为100kDa透析袋进行透析，取透析液用截留分子量为5kDa透析袋进行透析，取截留液，得到低分子量褐藻胶。
实施例4
以人肾透明细胞癌786-0细胞作为研究对象。786-0细胞是从美国典型培养物保藏中心（ATCC, Manassas, VA）获得的。786-0细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和0.03% L-氨酰胺的DMEM培养基中，在37℃，5% CO2的条件下培养。
将培养至指数生长期的786-0细胞接种到96孔板中，接种量为2×104个细胞/孔，在37℃，5% CO2的条件下培养至80%细胞贴壁后，用不同浓度（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）的低分子量褐藻胶（实施例1制备得到）处理细胞，0.1μL/孔。并以未添加药物的处理为空白对照。每个处理设置3个复孔。在37℃，5% CO2的条件下继续培养48h后，测定细胞活力。结果如图1所示。
从图1中可以看出，相对于空白对照组，实验处理组对786-0细胞的细胞活力均具有抑制作用，表明低分子量的褐藻胶对肾透明癌细胞的786-0细胞的细胞活力具有抑制作用。并且可以得到低分子量褐藻胶抑制786-0细胞的IC50浓度为8~10μmol/L。
其中，在配置不同浓度（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）的低分子量褐藻胶（实施例1制备得到）时，是先以不同相对分子质量（M，2500Da、4600Da、7100Da、10000Da、21400Da、44600Da）的右旋糖酐对照品作为对照，采用分子排阻色谱法测定对照品的保留时间。并以保留时间为横坐标，以对照品相对分子质量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=-0.3653x+9.6858，R2=0.999。测定实施例1制备的低分子量褐藻胶的保留时间为15.15min，通过回归方程求解其平均分子量的对数值为4.15，因此低分子量褐藻胶的平均分子量为14174Da。
配置1μmol/L的低分子量褐藻胶溶液时，即称取1μmol×14174Da的低分子量褐藻胶，即14.174mg，然后用DMEM培养基配置成1μmol/L的低分子量褐藻胶溶液。其他浓度的配置方法以此类推。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种低分子量褐藻胶在制备抑制肾透明癌细胞活性的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述低分子量褐藻胶的分子量为10~100kDa。
3.一种权利要求1或2所述的低分子量褐藻胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）褐藻胶经冷冻干燥、粉碎后，得到褐藻胶粉；
（2）将褐藻胶粉溶于水，制成褐藻胶溶液后进行酶解，得到褐藻胶酶解液；
（3）褐藻胶酶解液经超声处理后，收集分子量在10~100kDa范围内的褐藻胶，得到低分子量褐藻胶。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-50~-80℃，所述冷冻干燥的时间为0.5~1h。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶粉的粒径为300~800目。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶粉与水的质量体积比为1g:100~150ml。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的酶为褐藻胶裂解酶；所述褐藻裂解酶的添加量为2500~3500U/g。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为35~45℃，所述酶解的时间为20~40min。
9.如权利要求3~8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的频率为30~50kHz，所述超声处理的时间为15~35min。
10.一种权利要求3~9任一项所述的制备方法得到的低分子量褐藻胶。
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