CN114959014B - 血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用 - Google Patents

血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用。本发明采用高通量基因芯片技术对PMOP患者血清miRNAs异常表达谱进行检测，并与绝经后非骨质疏松人群进行对比，筛选两者之间差异表达miRNAs，通过实时荧光定量PCR技术进一步验证所选miRNAs在PMOP患者和n‑PMOP之间的差异水平，确认所筛选标志物的临床应用价值，最终为临床PMOP的诊断提供简便易行、高精确度的生物标志物。

Description

血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及分子诊断，涉及血清微小RNA的新应用，特别涉及血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用。
背景技术
绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是由雌激素撤退引起的最常见的原发性骨质疏松症，威胁着全球近一半的中老年妇女。由于早期缺乏典型临床表现，PMOP的延迟诊断在临床诊疗实践中十分常见，尤其是在外科系统。脆性骨折是PMOP最严重的并发症之一，致残率和死亡率高。仅在中国，预计到2050年应对骨质疏松性骨折的投入成本将达到254亿美元。因此，早期发现对减轻PMOP给中老年妇女带来的危害至关重要。
双能X线骨密度仪(Dual-energy X-ray Absorptiometry，DXA)、定量计算机断层扫描(Quantitative Computed Tomography)或定量超声(Quantitative Ultrasound，Q-US)评估的骨密度(Bone Mineral Density，BMD)被广泛认为是诊断PMOP的重要指标之一。然而，由于发达地区和欠发达地区在医疗服务供应方面的发展不平衡，短期内普及BMD测量十分困难。同时，作为一类评估方法，阳性影像学特征往往滞后于骨代谢的持续异常，这也削弱了基于影像学检查的经典方法在早期骨病诊断中的应用价值。骨转换标志物(bo neturnover markers，BTMs)是骨稳态变化的直接反映。近年来针对BTMs的再研究似乎为PMOP的辅助诊断提供了新希望。然而，包括我们研究在内的近期多项研究证实，血清BTMs水平与BMD变化之间的相关性有限，用于BMD评估时的误差较大。遗憾的是，目前临床上很少有应用方便、且结果准确的生物标志物用于疾病诊断。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度在18-24个核苷酸的非编码单链小RNA。作为调控基因表达的表观遗传机制之一，miRNA介导靶基因的转录后沉默、调控翻译抑制或信使RNA的降解。miRNA作为新型生物标志物在早期诊断、治疗和预后监测方面的潜在价值已经在癌症、肥胖和糖尿病等疾病中得到了较好的验证。然而，尽管一些研究已经发现在骨质疏松诱导的细胞和动物模型中存在异常表达的miRNAs，由于缺乏临床验证，它们都没有被广泛推荐用于临床疾病诊疗目的。
发明内容
本发明的目的之一是提供血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用。
本发明采用高通量基因芯片技术对PMOP患者血清miRNAs异常表达谱进行检测，并与绝经后非骨质疏松(n-PMOP)人群进行对比，筛选两者之间差异表达miRNAs，通过实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)进一步验证所选miRNAs在PMOP患者和n-PMOP之间的差异水平，确认所筛选标志物的临床应用价值，最终为临床PMOP的诊断提供简便易行、高精确度的生物标志物。
本发明的血清miRNAs包括hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p中的两种以上的组合。优选地，血清miRNAs为hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p的组合。
本发明目的之二是提供至少特异性检测hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p中的两种miRNAs的产品在制备诊断绝经后骨质疏松的工具中的应用。优选地，特异性检测hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p的产品在制备诊断绝经后骨质疏松的工具中的应用。
所述产品至少包括荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p中的两种的表达水平的制剂。这些制剂包括特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物、特异性扩增hsa-miR-506-3p的引物以及包含这些引物的诊断试剂盒；包括特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物、特异性扩增hsa-miR-6851-3p的引物以及包含这些引物的诊断试剂盒；包括特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物、特异性扩增hsa-miR-506-3p的引物、特异性扩增hsa-miR-6851-3p的引物以及包含这些引物的诊断试剂盒。
作为本发明的一个实施例，特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物如下：
GSP:5’GGGGGGGGATATCATCATATAC3’；
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
作为本发明的一个实施例，特异性扩增hsa-miR-506-3p的引物如下：
GSP:5’GGGATAAGGCACCCTTCTG3’
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
作为本发明的一个实施例，特异性扩增hsa-miR-6851-3p的引物如下：
GSP:5’GGATGGCCCTTTGTACCC3’
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
本发明具有以下优点：
1.本发明通过高通量芯片技术评估了PMOP患者血清中的miRNA异常表达谱[6例PMOP患者和4例绝经后非骨质疏松(postmenopausal without osteoporosis，n-PMOP)参与者]，并采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技术在独立队列(47例PMOP患者和26例n-PMOP参与者)中进行了验证。结果表明，hsa-miR-144-5p，hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p在PMOP患者血清中高表达，基于三者构建的联合模型在诊断PMOP时具有较高的准确性[曲线下面积(Area Under the Curve)＝0.938]，结果独立于传统影像学检查和BTMs，且重复性和再现性良好。该发明不仅为临床医生在有限条件下评估绝经后妇女BMD提供有效的标志物，也为基于hsa-miR-144-5p，hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p构建PMOP快速诊断试剂盒提供了科学依据。
2.以hsa-miR-144-5p，hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p为标志物，诊断PMOP不受传统BMD检查设备及医疗条件限制，微创抽血即可，方便易操作，省时省力，可行性强，还避免传统影像学检查带来的辐射。
3.以hsa-miR-144-5p，hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p为标志物，构建诊断模型临床实用性强，转化潜力巨大。
附图说明
图1是根据|Log2FC|≥2和P<0.05的筛选标准，获得5个候选关键miRNAs。
图2是候选关键miRNAs在训练集中的相对表达水平。
图3是训练集中单个miRNAs的独立诊断ROC曲线。
图4是4个关键miRNAs的联合诊断在训练集中显示出最高的准确性。
图5是验证集中4个关键miRNAs的相对表达水平。
图6是3个关键miRNAs(hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p)的联合诊断在验证集中显示出最高的准确性。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明通过高通量芯片技术对6例PMOP患者和4例绝经后非骨质疏松(postmenopausal without osteoporosis，n-PMOP)参与者血清miRNAs表达谱进行检测，评估PMOP患者血清中的miRNA异常表达谱，并采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PC R，qRT-PCR)技术在独立队列(47例PMOP患者和26例n-PMOP参与者)中进行了验证，验证hsa-miR-144-5p，hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p对PMOP的诊断能力。
第一部分 试验方法
一、研究对象
2020年6月至2021年8月期间，从中山大学附属第一医院门诊部或住院病房招募了83名居住在中国南方无血缘关系的汉族女性。纳入标准：(1)年龄≥50岁；(2)绝经年限≥1年；(3)入组时签署知情同意书。排除标准：①任何可显著影响骨代谢的共病，如甲状腺疾病、糖尿病、癌症、肾病或强直性脊柱炎等；②曾服用抗骨质疏松药物或激素(如雌激素、糖皮质激素等)；③近一年内有吸烟或饮酒史等。
参与者入院均行DXA检查[包含腰椎1–4(LS 1–4)、全髋(TH)和股骨颈(FN)三个部位]，同时纳入研究的临床资料包括：(1)年龄(Age)；(2)身高(Height)；(3)体重(Weight)；(4)体质量指数(Body Mass Index，BMI)；(5)绝经年限；(6)血清BTMs及一般生化指标，包括25(OH)D、N-MID、P1NP、β-CTX、UA、ALP、Calcium、Phosphorus等。本研究依据《赫尔辛基宣言》的准则进行，并经中山大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准(批号：伦审[2020]291–2号)。
二、实验设计
参考中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病学分会《原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)》的建议，将参与者分为两类：(1)PMOP患者：T值≤–2.5；(2)n-PMOP参与者：T值>–2.5。
整个研究分为三个部分：
(1)发现阶段。采用miRNA微阵列芯片探索PMOP患者血清miRNA表达谱，筛选PMOP患者(n＝6)和n-PMOP参与者(n＝4)之间的差异表达miRNAs(Differentiall y ExpressedmiRNAs，DEmiRNAs)。采用qRT-PCR技术对miRNA微阵列芯片结果进行验证。以微阵列和qRT-PCR结果中|log2 Fold Change(log2FC)|>2和P<0.05为筛选标准，筛选出候选关键miRNAs。
(2)训练阶段。在包含38例血清样本的独立训练集中检测候选关键miRNAs在PM OP患者(n＝24)和n-PMOP参与者(n＝14)之间的相对表达水平差异。有显著统计学差异(P<0.05)的miRNAs被进一步筛选为关键miRNAs。建立诊断模型，通过计算不同miRNAs组合的受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线，分析不同组合对PMOP的识别能力。选择AUC最大的前三个诊断模型供后续验证。
(3)验证阶段。在包含35例血清样本的独立验证集中验证关键miRNAs在PMOP患者(n＝23)和n-PMOP参与者(n＝12)之间的相对表达水平差异。随后验证训练集所筛选的三个诊断模型的有效性和可重复性，自其中进一步筛选AUC最大的模型作为疾病最终诊断模型。
人体测量
参与者身着轻薄衣物，赤足进行人体测量。身高、体重采用校正后的机械体重身高秤(RGZ-120,Suhong Medical Instruments Co.,Jiangsu,China)进行测量。仪器身高测量最小精度为0.1cm，体重测量最小精度为0.1kg。取三次测量平均值作为最终参数。
采用DXA(Lunar iDXA,GE Healthcare,IL,USA)测量LS 1–4、TH和FN的面积BMD。所有的评估都由经验丰富的影像科医师进行。根据制造商的说明，使用标准校准模型对设备进行日常校准。根据前期测量结果，成人BMD测量的变异系数分别为：LS 1–4，0.8％；FN，0.8％；TH，1.4％。
生化和免疫学分析
参与者禁食至少8h后通过肘静脉穿刺采集血样。全血室温静置30min后离心采集血清(1200g，4℃，10min)。
分析仪在每天分析血清样本之前通过制造商指南进行校准。采用AU5800全自动生化分析仪及其配套试剂(Beckman Coulter,CA,USA)检测UA、ALP、Calcium和Phospho rus等临床生化指标，测量批内和批间变异系数在0.5％～4.9％之间。采用Cobas 6000系列分析仪及其配套试剂(Roche,Basel,CH)进行25(OH)D、N-MID、P1NP和β-CTX等临床免疫指标的检测，测量批内和批间变异系数在0.6％～4.3％之间。
血清RNA的提取
参考制造商说明书，使用TRlzol LS试剂(Invitrogen,Life technologies,CA,USA)自血清中提取总RNA。采用ND-1000分光光度计(ND-1000,NanoDrop Technologies,DE,USA)测定所提取RNA的质和量。
miRNA微阵列分析
miRNA微阵列委托商业服务公司实施(Kangcheng Biotech Co.,Shanghai,China)。过程简述如下：使用人类Agilent miRNA微阵列系统进行miRNA表达分析(8×60Karray，Agilent Technologies,CA,USA)，该系统包含基于miRBase数据库(http://www.mirbase.org,version 21.0)的2549个人类miRNA探针。采用Agilent Quick Amp标记试剂盒(Agilent p/n：5190-0442)和Agilent基因表达杂交试剂盒(Agilent p/n:5188-5242)对微阵列芯片进行RNA标记和杂交。杂交图像由Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n：G2565BA)捕获，并通过Agilent Feature Extraction(version 11.0.1.1)进行数字化。
qRT-PCR
为了证实miRNA芯片结果，使用QuantStudio5 Real-time PCR系统(AppliedBiosys tems,CA,USA)进行qRT-PCR分析。利用M-MuLV逆转录酶(Enzyme p/n：P7040L)从150ng总RNA中获得cDNA。PCR扩增程序按制造商指南进行，每个结果重复三次。使用2-ΔΔCt法将miRNAs的相对表达水平通过内参基因hsa-miR-425-5p进行标准化。本研究涉及qRT-PCR引物序列见表1。
表1用于qRT-PCR的引物序列
Figure BDA0003700639830000071
GSP是miRNA对应的特异性引物；R是RT引物。
三、统计学方法
数据分析采用SPSS软件(version 22，IBM，Armonk，New York，NY)。连续变量以均值±标准差表示。组间比较采用独立样本t检验。采用二元Logistic回归分析计算不同诊断组合的预测概率。构建ROC曲线，评价所构建模型对PMOP的识别效果。AUC作为评价模型诊断性能的准确性指标。计算每种诊断模型的敏感性(Sensitivity)、特异性(Specificity)、阳性预测值(Positive Predictive Value，PPV)和阴性预测值(Negative Pre dictiveValue，NPV)。P<0.05认为差异有统计学意义。
第二部分 试验结论
一、参与者临床特征
发现集、训练集和验证集的参与者特征见表2。在发现集和训练集中，PMOP患者与n-PMOP参与者在年龄、BMI、绝经年龄和绝经年限等方面无显著差异(P>0.05)。在验证集中，23名PMOP患者的年龄和绝经时间显著高于12名n-PMOP对照组(分别为67.5±8.8和58.3±8.1，P＝0.005；16.0±8.5和6.3±6.1，P＝0.001)。除了发现集中Calcium在组间存在差异(2.10±0.13vs.2.35±0.06，P＝0.006)，其余生化指标和BTMs在PMOP患者和n-PMOP参与者之间均无显著统计学差异(P>0.05)，说明BTMs和常规血清生化指标不具有自参与者中识别PMOP的能力。
表2参与者的一般临床资料、血清BTMs及生化指标的特征
Figure BDA0003700639830000081
数据以均值±标准差表示。所有P值均采用t-test检测计算。P<0.05被认为差异具有统计学意义(粗体显示)。–表示无参考值。
BTMs，骨转换标记物；BMI，体质指数；LS，腰椎；TH，全髋关节；FN，股骨颈；BMD，骨密度；25(OH)D，25-羟基维生素D；N-MID，N端中段骨钙素；P1NP，Ⅰ型前胶原N端前肽；β-CTX，β胶联降解产物；UA，尿酸；ALP，碱性磷酸酶。
二、关键miRNA的筛选
采用miRNA微阵列在发现集中检测了2 549个miRNAs的表达水平。以P<0.05和|Log2FC|>1为筛选标准，共筛选出198个差异表达miRNAs。与n-PMOP对照组相比，PMOP患者中148个miRNAs显著上调，50个miRNAs显著下调。选择差异表达倍数最高的前10个miRNAs作为候选miRNAs，进行原始芯片样本的qRT-PCR验证。结果表明，qRT-PCR检测与芯片结果基本一致(图1)。为了进一步选择组间差异表达倍数最大的miRNAs供后续模型构建使用，以|Log2FC|≥2和P<0.05作为筛选标准，获得5个候选关键miRNAs，即hsa-miR-144-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-506-3p、hsa-miR-8068和hsa-miR-6851-3p。
随后，在包含24名PMOP患者和14名n-PMOP对照的独立训练队列中进一步评估候选关键miRNAs的表达水平差异，结果见图2。除hsa-miR-340-5p(P＝0.371)外，其余4个候选关键miRNAs的相对表达水平在组间差异显著(P<0.05)。因此，研究最终将hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p、hsa-miR-8068和hsa-miR-6851-3p作为关键miRNAs纳入随后的模型构建和验证中。
三、关键miRNAs的诊断性能
研究首先验证了关键miRNAs的独立诊断性能。随后，利用Logistic回归建立联合诊断模型，探讨生物标志物组合是否能提高诊断效能。通过计算每种模型的AUC、敏感性、特异性、PPV和NPV以寻找最佳的诊断组合。所有4个关键miRNAs均显示出良好的独立诊断效能(AUC范围在0.747–0.832之间；图3)。
通过4种miRNAs的不同组合评估发现，以4种关键miRNAs的联合诊断具有最高的AUC[AUC：0.845，95％可信区间(confidence interval，CI)，0.691–0.942；敏感性：91.7％，95％CI：73.0–99.0％；特异性：64.3％，95％CI：35.1–87.2％；PPV，81.5％，95％CI：61.9–93.7％；NPV，81.8％，95％CI：48.2–97.7％；图4)。其中，模型1(hsa-miR-144-5p+hsa-miR-506-3p+hsa-miR-8068+hsa-miR-6851-3p，AUC：0.845)、模型2(hsa-miR-144-5p+hsa-miR-506-3p+hsa-miR-6851-3p，AUC：0.836)、模型3(并列第二，hsa-miR-144-5p+hsa-miR-8068+hsa-miR-6851-3p，AUC：0.836)和模型4(hsa-miR-506-3p，AUC：0.832)为排名前3的诊断模型，因此将其纳入后续筛选过程。
在验证组中，首先证实了PMOP患者与n-PMOP对照组之间4个关键miRNAs相对表达水平的显著差异(图5)。结果显示上述miRNAs在验证集组间差异依然显著(P＜0.05)。
将以上筛选的4个模型应用于验证集，结果见表3。可见由hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p组成的联合诊断模型(模型2)具有最高的诊断价值(AUC：0.938，95％CI：0.802-0.992；敏感性：100.0％，95％CI：85.2-100.0％；特异性：75.0％，95％CI：42.8-94.5％；PPV：88.5％，95％CI：69.8-97.6％；NPV：100.0％，95％CI：66.4-100.0％；图6)，高于训练集中由4个关键miRNAs组成的诊断模型(模型1)。在灵敏度、特异度、PPV和NPV相同的情况下，最终择优确定模型2(hsa-miR-144-5p+hsa-miR-506-3p+hsa-miR-6851-3p)为PMOP诊断的最佳模型。
表3验证集中用于诊断PMOP的模型的性能特征
Figure BDA0003700639830000101
Data are presented as value，value(95％CI)or％(95％CI).Pvalue＜005 wasconsidered to indicate a statistically significant difference(highlighted inbold).PMOP，postmenopausal osteoporosis；AUC，area under the curve；CI，confidenceinterval；PPV，positive predictive value；NPV，negative predictive value.
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> 血清miRNAs作为绝经后骨质疏松联合诊断标志物的应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggggagag attggtagaa a 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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gtgcgtgtcg tggagtcg 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggggaaagg gattctgtag 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggggcttgag atgacactg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggttataa agcaatgaga 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggataaggc acccttctg 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggggtgttt gttgtaagga t 21
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agggggtgag gtagtaggtt gt 22
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatggccct ttgtaccc 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggggaatgac acgatcactc 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgcgtgtcg tggagtcg 18

Claims (6)

1.特异性检测血清miRNAs中hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p的产品在制备诊断绝经后骨质疏松的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述产品至少包括荧光定量PCR检测hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-6851-3p的表达水平的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述制剂包括特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物、特异性扩增hsa-miR-506-3p的引物、特异性扩增hsa-miR-6851-3p的引物以及包含这些引物的诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述特异性扩增hsa-miR-144-5p的引物如下：
GSP:5’GGGGGGGGATATCATCATATAC3’；
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述特异性扩增hsa-miR-506-3p的引物如下：
GSP:5’GGGATAAGGCACCCTTCTG3’
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述特异性扩增hsa-miR-6851-3p的引物如下：
GSP:5’GGATGGCCCTTTGTACCC3’
R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。
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CN106834442A (zh) * 2016-12-30 2017-06-13 王春庆 miR‑144‑3p在制备骨质疏松诊断标志物中的应用
JP7125782B2 (ja) * 2018-02-22 2022-08-25 国立大学法人大阪大学 Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法
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CN114807341A (zh) * 2022-01-20 2022-07-29 中山大学附属第一医院 hsa-miR-144-5p作为绝经后骨质疏松诊断标志物的应用

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