CN114958849A - lncRNACACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用 - Google Patents

lncRNACACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNACACF吸附miR‑520b‑3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。本发明采用细胞生物学的方法第一次证实了长链非编码RNA CACF在人脐静脉内皮细胞中竞争性吸附miR‑520b‑3p，并通过Annexin V‑FITC/PI技术以及miR‑520b‑3p和lncRNA CACF超表达载体共转染回复实验，证实了lncRNA CACF吸附miR‑520b‑3p促进人脐静脉内皮细胞周期进程中的应用。

Description

lncRNACACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期 中的应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及lncRNA CACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。
背景技术
心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是一种严重危害人类健康的心血管疾病。促进MI后的血管新生能改善MI后的心脏功能。新生的血管是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而来，主要包括血管内皮细胞的增殖、出芽和迁移。细胞的增殖是通过细胞周期(cell cycle)来完成的，细胞周期指的是从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束的全过程。细胞周期依次分为G1期、S期(DNA合成期)、G2期和M期(有丝分裂)四个时期。
长链非编码RNA(Long Non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA，可作为重要调节因子参与到包括MI在内的各种疾病的发生和/或发展中。研究表明，lncRNA可以通过竞争性吸附miRNA，抑制微小核糖核酸(microRNA，miRNA)对mRNA的降解作用，进而发挥其生理功能。lncRNA CACF(Cardiac autophagy contributory factor，暂命名)测序编号为lncRNA XLOC_083933在心肌梗死后促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、凋亡和血管成型。但其对HUVECs细胞周期的调控尚没有报道。
miRNA是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid，mRNA)的3’非翻译区(untranslated region，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。目前尚无关于miR-520b-3p对人脐静脉内皮细胞周期调控的相关报道。
发明内容
为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供lncRNA CACF在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。
本发明的另一目的在于提供miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。
本发明的再一目的在于提供lncRNA CACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
lncRNA CACF在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，体外环境下，lncRNA CACF正调控人脐静脉内皮细胞周期进程；通过调节lncRNA CACF的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控；所述的lncRNA CACF如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，增加外源性lncRNA CACF，S期和G2期细胞占比增加，人脐静脉内皮细胞周期进程加快；抑制lncRNA CACF的表达，细胞周期阻滞在G1期，人脐静脉内皮细胞周期进程阻滞。
进一步地，所述的lncRNA CACF通过竞争性吸附miR-520b-3p，实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控。
miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，体外环境下，miR-520b-3p负调控人脐静脉内皮细胞周期进程；通过调节miR-520b-3p的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控。
进一步地，增加外源性miR-520b-3p，细胞周期阻滞在G1期，人脐静脉内皮细胞周期进程阻滞；抑制miR-520b-3p表达，G1期细胞占比降低，人脐静脉内皮细胞周期进程加快。
lncRNA CACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，体外环境下，由增加外源性LncRNA CACF引起的促进人脐静脉内皮细胞细胞周期进程的功能表型，能在增加外源性miR-520b-3p后回复。
进一步地，上述应用中：
所述的增加外源性lncRNA CACF通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
(1)提取人脐静脉内皮细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
(2)将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
PCR-CACFForward：5′-GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG-3′；
PCR-CACF Reverse：5′-GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC-3′。
所述的抑制lncRNA CACF表达降低通过反义寡核苷酸实现，反义寡核苷酸序列如下：
5′-CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAGAAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGACAUUACCUGATT-3′。
所述的增加外源性miR-520b-3p通过miR-520b-3p模拟物实现，采用的miR-520b-3pmimic的序列如下：
5′-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3′。
所述的抑制miR-520b-3p表达降低通过miR-520b-3p核酸抑制物实现，采用的miR-520b-3p inhibitor的序列如下：
5′-CCCUCUAAAAGGAAGCACUUU-3′。
本发明通过基因工程技术改变lncRNA CACF在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞周期中的作用。
本发明通过比对lncRNA CACF与miRbase数据库中成熟miRNAs的序列，筛选出与lncRNA CACF(SEQ ID NO：1)存在序列匹配的miR-520b-3p(SEQ ID NO：2)，通过RNA pulldown实验和双荧光素酶实验分别在细胞外和细胞内验证了两者之间的结合。
本发明通过基因工程技术改变miR-520b-3p在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用。
miR-520b-3p对lncRNA CACF在调控人脐静脉内皮细胞周期作用的回复验证。
本发明的验证结果如下：
1、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程，发现超表达lncRNA CACF后，与对照组(pcDNA3.1)相比，人脐静脉内皮细胞的G1期占比显著降低(P<0.01)，S期细胞占比显著上升(P<0.05)，沉默lncRNA CACF后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的S期细胞占比显著降低(P<0.05)，G2期占比显著期占比显著上升(P<0.01)(图2)。
2、本发明通过RNA pull-down qRT-PCR和双荧光素酶报告实验检测lncRNA CACF与miR-520b-3p的结合，lncRNA CACF Sense可以与miR-520b-3p结合，而lncRNA CACFAntisense不能(图3)，miR-520b-3p与WT-CACF的结合活性显著降低(P<0.05)，其他三组差异不显著(图4)。
3、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程，发现转染miR-520b-3p mimic后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞显著阻滞在G1期(P<0.05)，后，转染miR-520b-3p inhibitor与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的G1期细胞占比显著降低(P<0.05)(图5)。
4、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程，发现共转染lncRNA CACF超表达载体和miR-520b-3p mimic后，可以回复超表达lncRNA CACF对人脐静脉内皮细胞的G1期占比降低和S期占比的升高(图6)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明采用细胞生物学的方法第一次证实了长链非编码RNA CACF在人脐静脉内皮细胞中竞争性吸附miR-520b-3p，并通过Annexin V-FITC/PI技术以及miR-520b-3p和lncRNA CACF超表达载体共转染回复实验，证实了lncRNA CACF吸附miR-520b-3p促进人脐静脉内皮细胞周期进程的应用。
附图说明
图1是qRT-PCR检测lncRNA CACF转染效率的结果图；
图2是Annexin V-FITC法检测超表达和干扰lncRNA CACF后调控人脐静脉内皮细胞周期进程的结果图；
图3是RNA pull-down qRT-PCR结果图；
图4是miR-520b-3p序列与WT-CACF和MUT-CACF序列之间的对比图(其中显示了miR-520b-3p的mimic和NC与WT-CACF和MUT-CACF之间的结合活性)；
图5是Annexin V-FITC法检测miR-520b-3p的mimic和inhibitor调控人脐静脉内皮细胞周期进程的结果图；
图6是Annexin V-FITC法检测miR-520b-3p mimic回复lncRNA CACF调控人脐静脉内皮细胞周期进程的结果图；
图7是lncRNA CACF与miR-520b-3p的序列比对图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
本发明中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值±标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01)。
实施例1：人脐静脉内皮细胞的培养
(1)将从液氮罐中取出的装有人脐静脉内皮细胞(购自ScienCell公司)的冻存管，置于37℃水浴锅中使其迅速融化；
(2)细胞转移至离心管中，室温下1000rpm离心5min，倒掉上清液；
(3)加入预热的PBS清洗，离心后倒掉PBS；
(4)配置ECM完全培养基：93％(w/w)内皮细胞培养基ECM(购自ScienCell公司)+5％(w/w)FBS(胎牛血清)+1％(w/w)内皮细胞生长添加物ECGS(购自ScienCell公司)+1％(w/w)双抗；
(5)加入ECM完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
所述的双抗为青霉素和链霉素。
实施例2：人脐静脉内皮细胞的接种和转染
(1)人脐静脉内皮细胞的密度达到90％左右时，倒掉培养基，用预热的PBS清洗细胞2次；
(2)加入0.25％胰蛋白酶消化5min，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量ECM完全培养基终止消化；
(3)用枪头将附壁细胞吹下并吹打均匀，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清液；
(4)加入PBS清洗2遍，1000rpm离心5min；
(5)用ECM完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用ECM完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；
(6)24h左右，观察细胞状态，待细胞汇合度达75～90％左右时准备转染；
(7)转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0003664586340000051
3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；
(8)转染后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养；
(9)转染24～48h后，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。
实施例3：细胞RNA抽提及反转录
人脐静脉内皮细胞(购自ScienCell公司)的RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)人脐静脉内皮细胞培养至合适密度，弃培养基，PBS清洗细胞两次，再按每10cm2的细胞培养板底面积直接加入1mL TRIzol；
(2)冰上静置10min以充分裂解组织/细胞，4℃12000rpm离心5min，弃沉淀吸上清于新1.5mL RNase-free管中；
(3)加入200μL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，冰上静置15min，4℃12000rpm离心15min；
(4)吸取上层水相置于新1.5mL RNase-free EP管中；
(5)加入0.5mL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在冰上静置10min，4℃12000rpm离心10min；
(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％(v/v)乙醇-DEPC(每1mL TRIzol)以洗涤RNA，4℃、12000rpm离心5min后弃上清；
(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；
(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。
cDNA第一链的合成参照Thermo公司的SuperScriptTM First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR kit试剂盒进行。
实施例4：构建LncRNA CACF超表达载体
以人脐静脉内皮细胞cDNA为模板，PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1(-)载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，命名为pcDNA3.1(-)-CACF。
lncRNA CACF核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
TCACGGAAAGGGGCGGGGCCGCGTGGCAAAGCCGATCTGATGGGTTGGGGTCCGAATCCACTTTCGCTTCTGCCTTTGGAACATGCCCGTGTTTTTGCCCTAGTTTTCCTTTTCCTGAGGGCATTTAGTTTGGGCTCCCGTTAAAATCTGTGCATTTCTTTCGCACACCGCAAGCACGTGAGAGCTGAGAGGTGGGGCTCCGGCCAGAGACCCGGCTGGTCCTACAGGCTGTGCACCTCGGAACCAAGTGATGCTGCCAGGGCGAGTCTGTCCTGAGGCAGTGTCCCCGAGGAGGCTGGATGGGGCAGCTGGACAGCACAGCCCGACCAGCTGGGTGGCCCCCACACCCCTGACCACACTGCTGGCCCTCGGCCTGTGCCTGGAGGTGTGGGCTTGTCTGAGATTCACCGGCCTCACAAGTCTGTCCCTCCGGCATCTCTGCCGTCCCCTCCTGTGTCTTCCAGAGGCTACCAAATAGGAGAAAGTTTGCCGGGGCTTTTGTAGTTTCCAGCCTGGCACCCCAAGGGGTTGTCTCCACGGGGCCCCGGAAGCTCTGTCTCTCGTGGGGTGACGGTCTGAGCCCTGGACCCCTGGCTCATCTTCCTGCCAGCCACGCTGTCTGCGGGTGTAACCATGTGGTCCTCTGCCCTCTCCCTGGGCCCCTGGGTGGGGCCTCGGGGCCGACTGGGCCTCTTGCAGGGCAGGGCACTGGCAGCCTGCAAGGACGCATCTAGGAGCAGGCAGTCCTCCGTGAACCTGCAGCTGCTGGCACCTCTGTCTTGGATGTCCAGCTTCCCGAACTGCGAGGAGTAAGAGCCTGTGTGAGGGCTGGCCACGTGGCGGTCTGTGACAGTGGCTCGAGCTAAGACAGTTGCCCTCAGAGATGGTCAGCCCAGGAAGGCACAGTGTGGCTGTCTGCCCTCTGTTCCTGGCACCTCTTCCCTGGGATTCTCCAGAAACACACCAGGGTCTGCTCCTGAGCCCCCTTTGTTCTGCTGT AGAGGCAGGCCTGGGTGGCCAAGCTGGAGTGGGTCTGTCCTGAGTGTGTCTGTCCCTCCTGGTCAGGCTGGAGTGGGTCTTAGTCACCCTGGCGTTCAGCGCAGTCACTCATCTTGTGAGATGTGACGGCAGGTGCACAAATGGGCAAGCCCTTCTCGGAAACCTGCCCTGCATACCCCCCTTCTGGGGGCTCCCCCAAACCTGGGCATGCTCTCGTGTGATGGCTCCGTTCCAGACCTCTGCGCTGGCCCTGGGCTAGACCTTGTAGCCTCGGACCAGTGTCAGGCTCGGACCCCCAGTCACCATCAGAGTGCCTGGGCAGACATTACCTGAGCGCTCAGCCCGTCCCCCATGCCGGG。
PCR扩增引物如下：
PCR-CACF Forward：5′-GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG-3′(SEQ ID NO.2)；
PCR-CACF Reverse：5′-GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC-3′(SEQ ID NO.3)。
实施例5：人脐静脉内皮细胞周期检测
本发明使用Annexin V-FITC/PI技术检测细胞周期，参照广州科易达生物科技有限公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)将细胞培养板放置在室温，用PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS；
(2)加入0.25％胰蛋白酶消化5min，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(即ECM完全培养基；配置方法同实施例2步骤(4))终止消化；
(3)1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS清洗细胞两次。
(4)加入500μL PI/RNase Staining Buffer染色液，轻轻混匀；
(5)37℃避光孵育30min后，随即进行流式细胞仪检测分析。
实施例6：RNA pull downqRT-PCR实验检测与lncRNA CACF Sense和Antisense结合的mir-520b-3p
(1)探针获取，加T7启动子(斜体部分)序列引物如下：
CACF Sense-F：5′-AAAATAATACGACTCACTATAGGtcacggaaaggggcgg-3′(SEQ IDNO.4)
CACF Sense-R：5′-cccggcatgggggac-3′(SEQ ID NO.5)
CACF Antisense-F：5′-tcacggaaaggggcgg-3′(SEQ ID NO.6)
CACF Antisense-R：5′-AAAATAATACGACTCACTATAGGcaggcccggcatgggggac-3′(SEQID NO.7)。
(2)以lncRNA CACF全长为模板，PCR扩增，胶回收纯化得到lncRNA CACF Sense和Antisense。
(3)DNA体外转录并标记生物素，将得到的lncRNA CACF Sense和Antisense DNA进行体外转录后，加入1μg Biotin标记的RNA，适量Structure Buffer(10mM Tris pH＝7.0，0.1mM KCl，10mM MgCl2)，使得RNA形成二级结构。然后将RNA置于95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。
(4)链霉素亲和磁珠与生物素标记的RNA结合，将磁珠与生物素标记并变性的RNA混合，4℃过夜，3000rpm离心1min，去上清。
(5)磁珠复合物与RNA结合，往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液(约含蛋白1mg)，裂解液中加入适量Rnase抑制剂，室温放置1h，低速离心，上清回收(作为系统的阴性对照)，使用Wash BufferII冲洗3次，每次1mL，进行RNA纯化获得与lncRNA CACF Sense和Antisense结合的RNA。
(6)按照广州锐博生物公司miDETECT A TrackTM miRNA qPCR Primer进行RNA反转录和qRT-PCR。
实施例7：荧光素酶报告实验检测CACF与mir-520b-3p的结合活性
按照PromeGa的Dual-
Figure BDA0003664586340000081
Reporter Assay System(E1960)试剂盒说明书在荧光化学发光微孔板检测仪上操作，步骤如下：
(1)5×PLB室温解冻后，使用ddH2O按1:4的比例将其稀释成1×PLB；
(2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200uL PBS，轻轻晃动培养板，吸除PBS，此PBS清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；
(3)每孔加入100uL 1×PLB；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；
(4)将裂解的细胞取75uL转移到96孔酶标板中，每孔加入75uL LARⅡ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Firefly luciferase荧光强度；
(5)再加入75uLStop&Glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Ranilla luciferase荧光强度；
(6)Firefly luciferase与Ranilla luciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组3个重复)。
结果分析
1、合成lncRNA CACF超表达载体(pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA CACF Silencer)，检测转染效率。与阴性对照组(Silencer NC组)相比，转染lncRNA CACF Silencer的人脐静脉内皮细胞(Silencer组)中的CACF表达量显著下调；与阴性对照组(pcDNA3.1(+)组)相比，转染pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF的人脐静脉内皮细胞中的CACF表达量显著上调，结果如图1所示。上述lncRNA CACF Silencer由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照组NC来自广州市锐博生物科技有限公司。
lncRNA CACF Silencer：
5′-CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAGAAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGACAUUACCUGATT-3′(SEQ ID NO.8)。
2、将lncRNA CACF超表达载体(pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA CACF Silencer)，转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程。结果显示，超表达lncRNA CACF后，与对照组(pcDNA3.1)相比，人脐静脉内皮细胞的G1期占比显著降低(P<0.01)，S期细胞占比显著上升(P<0.05)，沉默lncRNA CACF后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的S期细胞占比显著降低(P<0.05)，G2期占比显著期占比显著上升(P<0.01)(图2)。
3、合成lncRNA CACF Sense和Antisense探针，通过RNA pull down实验分别拉取lncRNA CACF Sense和Antisense探针结合的RNA，使用qRT-PCR检测拉取的RNA中miR-520b-3p的表达，结果显示，lncRNA CACF Sense拉取的RNA中有miR-520b-3p表达，lncRNA CACFAntisense拉取的RNA中没有miR-520b-3p表达(图3)。
4、比对lncRNA CACF与miRbase数据库中成熟miRNAs的序列，筛选出与lncRNACACF存在序列匹配的miR-520b-3p(Gene ID:574473)，将CACF野生型和与miR-520b-3p匹配序列位点突变序列连接到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶活性检测，发现野生型CACF(WT-CACF)上游报告基因受到miR-520b-3p调控，而突变型CACF(MUT-CACF)不受miR-520b-3p调控(图4)。
5、合成hsa-miR-520b-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)检测转染效率。与阴性对照组(inhibitor NC组)相比，转染miR-520b-3p inhibitor的人脐静脉内皮细胞(inhibitor组)中的miR-520b-3p表达量显著下调；于阴性对照组(mimics NC组)相比，转染miR-520b-3p mimics的人脐静脉内皮细胞(mimics组)中的miR-520b-3p表达量显著上调，结果如图1所示。上述miRNA产品由广州市锐博生物科技有限公司合成。
hsa-miR-520b-3pmimic：5′-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3′(SEQ ID NO.9)
hsa-miR-520b-3pinhibitor：5′-CCCUCUAAAAGGAAGCACUUU-3′(SEQ ID NO.10)。
6、将hsa-miR-520b-3p模拟物(miR-520b-3p)和抑制剂(inhibitor)转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程，结果显示，转染miR-520b-3p mimic后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞显著阻滞在G1期(P<0.05)，后，转染miR-520b-3p inhibitor与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的G1期细胞占比显著降低(P<0.05)(图5)。
7、分别将阴性对照(pcDNA3.1(+))、lncRNA CACF超表达载体(pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF)和pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF+miR-520b-3p miR-520b-3p转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后明通过Annexin V-FITC/PI技术检测人脐静脉内皮细胞的周期进程，结果显示，发现共转染lncRNA CACF超表达载体和miR-520b-3p mimic后，可以回复超表达lncRNA CACF对人脐静脉内皮细胞的G1期占比降低和S期占比的升高(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
广东省实验动物监测所
<120> lncRNACACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1358
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lncRNA CACF核苷酸序列
<400> 1
tcacggaaag gggcggggcc gcgtggcaaa gccgatctga tgggttgggg tccgaatcca 60
ctttcgcttc tgcctttgga acatgcccgt gtttttgccc tagttttcct tttcctgagg 120
gcatttagtt tgggctcccg ttaaaatctg tgcatttctt tcgcacaccg caagcacgtg 180
agagctgaga ggtggggctc cggccagaga cccggctggt cctacaggct gtgcacctcg 240
gaaccaagtg atgctgccag ggcgagtctg tcctgaggca gtgtccccga ggaggctgga 300
tggggcagct ggacagcaca gcccgaccag ctgggtggcc cccacacccc tgaccacact 360
gctggccctc ggcctgtgcc tggaggtgtg ggcttgtctg agattcaccg gcctcacaag 420
tctgtccctc cggcatctct gccgtcccct cctgtgtctt ccagaggcta ccaaatagga 480
gaaagtttgc cggggctttt gtagtttcca gcctggcacc ccaaggggtt gtctccacgg 540
ggccccggaa gctctgtctc tcgtggggtg acggtctgag ccctggaccc ctggctcatc 600
ttcctgccag ccacgctgtc tgcgggtgta accatgtggt cctctgccct ctccctgggc 660
ccctgggtgg ggcctcgggg ccgactgggc ctcttgcagg gcagggcact ggcagcctgc 720
aaggacgcat ctaggagcag gcagtcctcc gtgaacctgc agctgctggc acctctgtct 780
tggatgtcca gcttcccgaa ctgcgaggag taagagcctg tgtgagggct ggccacgtgg 840
cggtctgtga cagtggctcg agctaagaca gttgccctca gagatggtca gcccaggaag 900
gcacagtgtg gctgtctgcc ctctgttcct ggcacctctt ccctgggatt ctccagaaac 960
acaccagggt ctgctcctga gccccctttg ttctgctgta gaggcaggcc tgggtggcca 1020
agctggagtg ggtctgtcct gagtgtgtct gtccctcctg gtcaggctgg agtgggtctt 1080
agtcaccctg gcgttcagcg cagtcactca tcttgtgaga tgtgacggca ggtgcacaaa 1140
tgggcaagcc cttctcggaa acctgccctg catacccccc ttctgggggc tcccccaaac 1200
ctgggcatgc tctcgtgtga tggctccgtt ccagacctct gcgctggccc tgggctagac 1260
cttgtagcct cggaccagtg tcaggctcgg acccccagtc accatcagag tgcctgggca 1320
gacattacct gagcgctcag cccgtccccc atgccggg 1358
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR-CACF Forward
<400> 2
ggggtacccc tcacggaaag gggcgg 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR-CACF Reverse
<400> 3
ggaattcgcc cggcatgggg gac 23
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CACF Sense-F
<400> 4
aaaataatac gactcactat aggtcacgga aaggggcgg 39
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CACF Sense-R
<400> 5
cccggcatgg gggac 15
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CACF Antisense-F
<400> 6
tcacggaaag gggcgg 16
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CACF Antisense-R
<400> 7
aaaataatac gactcactat aggcaggccc ggcatggggg ac 42
<210> 8
<211> 119
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lncRNA CACF Silencer
<400> 8
cgaauccacu uucgcuucug agauucaccg gccucacacu accaaauagg agaaaguaau 60
cugugcauuu cuuucgcguc ugagauucac cggccucccu gggcagacau uaccugatt 119
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hsa-miR-520b-3pmimic
<400> 9
aaagugcuuc cuuuuagagg g 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hsa-miR-520b-3pinhibitor
<400> 10
cccucuaaaa ggaagcacuu u 21

Claims (10)

1.lncRNA CACF在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，其特征在于：体外环境下，lncRNA CACF正调控人脐静脉内皮细胞周期进程；通过调节lncRNA CACF的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控；所述的lncRNA CACF如SEQID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：增加外源性lncRNA CACF，S期和G2期细胞占比增加，人脐静脉内皮细胞周期进程加快；抑制lncRNA CACF的表达，细胞周期阻滞在G1期，人脐静脉内皮细胞周期进程阻滞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的lncRNA CACF通过竞争性吸附miR-520b-3p，实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控。
4.miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，其特征在于：体外环境下，miR-520b-3p负调控人脐静脉内皮细胞周期进程；通过调节miR-520b-3p的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞周期进程调控。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：增加外源性miR-520b-3p，细胞周期阻滞在G1期，人脐静脉内皮细胞周期进程阻滞；抑制miR-520b-3p表达，G1期细胞占比降低，人脐静脉内皮细胞周期进程加快。
6.lncRNA CACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用，其特征在于：体外环境下，由增加外源性LncRNA CACF引起的人脐静脉内皮细胞周期进程的功能表型，能在增加外源性miR-520b-3p后回复。
7.根据权利要求2、3、5任一项所述的应用，其特征在于：
所述的增加外源性lncRNA CACF通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
(1)提取人脐静脉内皮细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
(2)将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
PCR-CACF Forward：5′-GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG-3′；
PCR-CACF Reverse：5′-GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC-3′。
9.根据权利要求2、3、5任一项所述的应用，其特征在于：
所述的抑制lncRNA CACF表达降低通过反义寡核苷酸实现，反义寡核苷酸序列如下：
5′-CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAGAAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGACAUUACCUGATT-3′。
10.根据权利要求2、3、5任一项所述的应用，其特征在于：
所述的增加外源性miR-520b-3p通过miR-520b-3p模拟物实现，采用的miR-520b-3pmimic的序列如下：
5′-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3′；
所述的抑制miR-520b-3p表达降低通过miR-520b-3p核酸抑制物实现，采用的miR-520b-3p inhibitor的序列如下：
5′-CCCUCUAAAAGGAAGCACUUU-3′。
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