CN114958811A - ACE2-Fc融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及ACE2胞外区与能使ACE2二聚化的多肽片段连接而形成的融合蛋白,其中优选人IgG1抗体的Fc片段,与人ACE2的胞外区连接形成融合蛋白。该蛋白可以很强的亲和力与RBD结合,同时,可以很好地抑制分子和细胞层面RBD与ACE2蛋白的结合。可以用于新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地涉及血管紧张素转化酶2(ACE2)蛋白与抗体的Fc片段的融合蛋白及其治疗性应用。
背景技术
ACE2是血管紧张素转化酶家族成员之一,其作为一种羧肽酶主要参与催化脯氨酸与疏水性氨基酸或碱性C末端氨基酸间的水解。在人体内ACE2最重要的功能是催化血管紧张素1-8(Ang1-8)水解形成Ang1-7。研究表明Ang1-7具有促进血管舒张、抑制细胞恶性增殖以及抑制血管生成,抑制炎性反应等效果。因此ACE2重组蛋白可能被用于与Ang1-8病理性升高相关的疾病治疗,如:急性肺损伤、肺动脉高压、急性呼吸窘迫症、糖尿病性肾病等疾病的治疗。
目前,已有ACE2重组蛋白用于肺动脉高压、急性肺损伤等疾病的临床研究,并显示出很好的安全性。体内药代动力学研究显示ACE2的体内半衰期仅有10小时,因此在实际用药过程中需要每天给药。
ACE2在机体内除作为一种酶发挥其酶促功能外,还是一些病毒入侵机体的一个关键受体。已有研究表明2019年爆发的SARS-CoV-2新型冠状病毒是通过ACE2入侵机体。病毒表面的Spike蛋白(S蛋白)通过其受体结合区域(RBD)与宿主细胞表面的ACE2结合,进而介导病毒的入侵。但是目前尚没有特效药物治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19),有必要尽快探寻可以有效治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的药物。
发明内容
本发明提供一种ACE2融合蛋白,其包含ACE2蛋白胞外区和可促进融合蛋白二聚化的多肽。
在一些方面,本发明提供如前所述的ACE2融合蛋白,其中所述可促进融合蛋白二聚化的多肽是抗体的Fc片段,优选人IgG抗体Fc片段,更优选人IgG1抗体Fc片段。
在一些方面,本发明提供如前所述的ACE2融合蛋白,其中所述ACE2蛋白胞外区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在一些方面,本发明提供如前所述的ACE2融合蛋白,其中所述人IgG1抗体Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在一些方面,本发明提供如前所述的ACE2融合蛋白,其中所述ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供一种核酸分子,其编码根据如如前所述的ACE2融合蛋白。
本发明还提供一种表达载体,其包含如前所述的核酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞,其包含如如前所述的表达载体,并可表达如前所述的融合蛋白。
本发明还提供一种药物组合物,其包含如前所述的ACE2融合蛋白及药学可接受的载体。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其还包含抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区,其中:
a)所述重链可变区与SEQ ID NO.8所示重链可变区具有相同的HCDR1、HCDR2和HCDR3,及所述轻链可变区与SEQ ID NO.7所示轻链可变区具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
b)所述重链可变区与SEQ ID NO.10所示重链可变区具有相同的HCDR1、HCDR2和HCDR3,及所述轻链可变区与SEQ ID NO.9所示轻链可变区具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3及LCDR1、LCDR2和LCDR3根据Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或ABM规则进行定义。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区,其中:
c)所述重链可变区具有如SEQ ID NO.14所示的HCDR1、SEQ ID NO.15所示的HCDR2和SEQ ID NO.16所示的HCDR3,及所述轻链可变区具有相同的SEQ ID NO.11所示的LCDR1、SEQ ID NO.12所示的LCDR2和SEQ ID NO.13所示的LCDR3;或
d)所述重链可变区具有如SEQ ID NO.20所示的HCDR1、SEQ ID NO.21所示的HCDR2和SEQ ID NO.22所示的HCDR3,及所述轻链可变区具有相同的SEQ ID NO.17所示的LCDR1、SEQ ID NO.18所示的LCDR2和SEQ ID NO.19所示的LCDR3。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区,其中:
e)所述重链可变区为如SEQ ID NO.8所示的重链可变区和所述轻链可变区为如SEQ ID NO.7所示的轻链可变区;或
f)所述重链可变区为如SEQ ID NO.10所示的重链可变区和所述轻链可变区为如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体的全长抗体由抗体重链和轻链组成,其中,所述抗体重链恒定区选自人IgG1、IgG2或IgG4的恒定区,所述抗体轻链恒定区选自人抗体λ链或κ链。
在一些方面,如前所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体的全长抗体由抗体重链和轻链组成,其中:
g)所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示,及所述抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示;或
h)所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示,及所述抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
本发明还提供一种预防或治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的方法,所述方法在于给予新型冠状病毒肺炎(COVID-19)易感人群或感染患者施用有效量的根据如前所述ACE2融合蛋白或如前所述的药物组合物。
本发明还提供一种阻断新型冠状病毒感染的方法,所述方法在于给予新型冠状病毒肺炎(COVID-19)易感人群或感染患者施用有效量的根据如前所述ACE2融合蛋白或如前所述的药物组合物。
本发明还提供如前所述ACE2融合蛋白或如前所述的药物组合物在制备预防或治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的药物的用途,所述用途在于给予新型冠状病毒肺炎(COVID-19)易感人群或感染患者施用有效量的根据如前所述ACE2融合蛋白或如前所述的药物组合物。
本发明还提供如前所述ACE2融合蛋白或如前所述的药物组合物在制备阻断新型冠状病毒感染的药物中的用途,所述用途在于给予新型冠状病毒肺炎(COVID-19)易感人群或感染患者施用有效量的根据如前所述ACE2-Fc融合蛋白或如前所述的药物组合物。
通常ACE2重组蛋白的半衰期较短,本发明hACE2-Fc的半衰期会显著延长。
Fc片段可通过二硫键使hACE2-Fc形成二聚体,更接近天然ACE2蛋白的构象。
本发明hACE2-Fc可与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)表面的Spike蛋白结合从而抑制病毒对宿主细胞的入侵,最终达到抗病毒感染的效果。
hACE2-Fc用于新型冠状病毒感染患者密切接触者,或有病毒暴露史人群的预防。
附图说明
图1.hACE2-Fc与RBD-His的结合亲和力结果
图2.hACE2-Fc对RBD-Fc与ACE2-His的结合的阻断作用
图3.hACE2-Fc对RBD-Fc与细胞膜上的全长ACE2结合的阻断作用
图4.图4A:0.5μg/ml ACE2-Fc分别与不同浓度抗体P17-A11联合阻断病毒感染检测结果;图4B:0.05μg/ml抗体P17-A11分别与不同浓度ACE2-Fc联合阻断病毒感染检测结果。
图5.图5A:正常病毒量时P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白联合处理的中和药效;图5B:5倍病毒量时P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白联合处理的中和药效。
图6.经ACE2-Fc融合蛋白治疗的SARS-CoV-2感染的小鼠的存活曲线。
图7A-7B.抗体P17-A11+ACE2-Fc融合蛋白组合的体内药效。
具体实施方式
本发明提供了以二聚体形式存在的ACE2融合蛋白,其包括ACE2蛋白胞外区和人抗体IgG1抗体的Fc片段连接形成的融合蛋白(hACE2-Fc)。可溶性的hACE2-Fc重组蛋白可以竞争性的与病毒表面的Spike蛋白结合,使得病毒无法与细胞表面的ACE2结合,最终抑制病毒对机体的入侵。由于病毒侵入机体后需要一定时间的潜伏期才会发病,如提前给与冠状病毒暴露者或高危人群一定剂量的hACE2-Fc可能有抑制发病的效果。对于已感染患者,病毒会在其体内不断复制扩增以感染更多的细胞,给与hACE2-Fc治疗后,新扩增的病毒将无法进一步感染新的细胞,从而抑制病情的恶化。
定义
本文中术语“抗体”以其最广泛的含义使用,并且涵盖多种抗体结构,这些抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段,只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
在本文中“中和抗体”指能够阻断人ACE2与SARS-CoV-2病毒的S蛋白之间的识别与结合作用的抗体。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区对抗原结合负责。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环,称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR(或称LCDR),包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR(或称HCDR))。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过以下惯例来定义或鉴定:Kabat、Chothia或Al-Lazikani(Al-Lazikani 1997;Chothia 1985;Chothia 1987;Chothia 1989;Kabat 1987;Kabat 1991)。重链或轻链的三个CDR被插入称为框架区(FR)的侧翼区段之间,它们比CDR更为高度保守,并形成了支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合,但是表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分别以存在α、δ、ε、γ和μ重链为特征。几种主要抗体类别分为亚类,例如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段,其包括例如双特异抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、多特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双特异抗体(ds双特异抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由抗体的包含一个或多个CDR的部分形成的多特异性抗体、骆驼化的单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如,亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施例中,抗原结合片段可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR,所述CDR嫁接到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
“Fv”是最小抗体片段,其含有完整抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(各自来自重链和轻链的3个环),该高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体与抗原结合特异性。然而,甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力,虽然通常以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中,scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一种多肽接头,该多肽接头使得scFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scFv的综述,参见Plückthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)。
如本文使用的,术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于:Kabat等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],252:6609-6616(1977);Kabat等人,美国卫生与公共服务部,“Sequences ofproteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]”(1991);Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987);Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-948(1997);MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262:732-745(1996);Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.[分子免疫学],45:3832-3839(2008);Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发展与比较免疫学],27:55-77(2003);以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],309:657-670(2001),其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而,应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的,包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.[分子免疫学],45:3832-3839(2008);Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],38:D301-D307(2010);和Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],43:D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用以其整体并入本文,以用于本申请中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。
除抗体的ABM规则确定的CDR外,还有多种抗体常规CDR确定方式,如下表所示。
表1:CDR定义
Kabat<sup>1</sup> | Chothia<sup>2</sup> | MacCallum<sup>3</sup> | IMGT<sup>4</sup> | AHo<sup>5</sup> | |
V<sub>H</sub> CDR1 | 31-35 | 26-32 | 30-35 | 27-38 | 25-40 |
V<sub>H</sub> CDR2 | 50-65 | 53-55 | 47-58 | 56-65 | 58-77 |
V<sub>H</sub> CDR3 | 95-102 | 96-101 | 93-101 | 105-117 | 109-137 |
V<sub>L</sub> CDR1 | 24-34 | 26-32 | 30-36 | 27-38 | 25-40 |
V<sub>L</sub> CDR2 | 50-56 | 50-52 | 46-55 | 56-65 | 58-77 |
V<sub>L</sub> CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-96 | 105-117 | 109-137 |
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(同上)。
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(同上)。
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(同上)。
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(同上)。
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法(同上)。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于上文Kabat等人的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统,实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或高变区(HVR)的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如,重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如,根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
除非本文另有说明,否则涵盖全长抗体(例如,本文公开的抗S蛋白抗体)的CDR的氨基酸残基是根据上文Kabat等人的Kabat命名法定义的,并且免疫球蛋白重链例如Fc区中的残基编号是如上文Kabat等人所述的EU索引的编号,除了涵盖任何共有序列的CDR的氨基酸残基是根据Kabat命名法定义的,其中修饰基于实验条件。“如Kabat所述的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文定义的CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体,其含有衍生自非人抗体的最小序列。大多数情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体高变区(HVR)的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有所希望的抗原特异性、亲和力和容量的高变区(供体抗体)的残基替换。在一些实例中,人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外,人源化抗体可以包括未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常,人源化抗体将包括至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部,其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些,并且全部或基本上全部的FR是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。有关进一步的细节,参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,(1986);Riechmann等人,Nature[自然],332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[生物学现状]2:593-596(1992)。
“S蛋白”、“Spike蛋白”指新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的结构蛋白“棘突蛋白”,与人体细胞表面受体——ACE2蛋白结合,进而使病毒包膜与细胞膜融合,感染细胞。
“hACE2-Fc融合蛋白”是指人血管紧张素转化酶2(ACE2)的胞外区与人IgG抗体的Fc区连接后形成的融合蛋白。
“亲和力”是指分子(例如,ACE2)的单个结合部位与其结合配偶体(例如,SARS-CoV-2病毒的Spike蛋白)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文所用,“结合亲和力”是指内部结合亲和力,其反映出结合对(例如,受体与配体)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
本发明的人ACE2的胞外区氨基酸序列的非限制性实例如下[SEQ ID NO:1]:QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS
ACE2蛋白还可以是完整人ACE2蛋白或人ACE2蛋白胞外区的自然变体或功能变体。所述ACE2蛋白的功能变体可以包括在SEQ ID NO.1所示的ACE2胞外区中含有保守性突变,且不丧失或不减弱ACE2与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白亲和力。
将“关于本文鉴定的多肽和融合蛋白序列的氨基酸序列同一性百分比(%)”或“同源性”定义为在对齐序列(考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后,候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的,可以用本领域技术中的多种方式来实现比对,例如使用公众可得的计算机软件,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而,出于本文的目的,使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性%值(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5):1792-1797,2004;Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]5(1):113,2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中两个的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如,如果两个DNA分子中的每一个的一个位置被腺嘌呤占据,则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的,那么两个序列是60%同源的。举例来说,DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50%的同源性。通常,当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分,其相对于免疫球蛋白的另一部分,即可变结构域,具有更保守的氨基酸序列,其包含抗原结合位点。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CL结构域。
本文中的术语“Fc区”或“Fc片段”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域,包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化,但是通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可以例如抗体的生产或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此,完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基的抗体群体,没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
Fc片段的氨基酸序列的非限制性示例如下氨基酸序列[SEQ ID NO.2]所示:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR,包括等位基因变体和这些受体的剪接形式,FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]15:203-234(1997)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论],9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods[免疫方法]4:25-34(1994);和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.[实验与临床医学杂志]126:330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR,包括将来鉴定的FcR。
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的融合蛋白。在某些实施例中,分离的多肽在其生产环境中没有或基本上没有与所有其他组分缔合。
编码本文所述的构建体、融合蛋白的“分离的”核酸分子是与在其生产环境中从通常与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。在某些实施例中,分离的核酸没有或基本没有与生产环境有关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和融合蛋白的分离的核酸分子的形式不同于天然存在的形式或背景。因此,分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和融合蛋白的核酸。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时,该核酸是“可操作地连接的”。例如,如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录,则该启动子或增强子可操作地连接至该序列;或者如果核糖体结合位点被定位成使得有助于翻译,则该核糖体结合侧可操作地连接至编码序列。通常,“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的,并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读框中。然而,增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果不存在此类位点,则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用,是指哺乳动物,包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中,受试者是人。
药剂的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。该特定剂量可以根据以下各项中的一种或多种来改变:所选择的具体药剂、随后的给药方案(无论它是否与其他化合物组合)、施用时间、成像的组织、以及其中携带它的物理递送系统。
本申请的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据例如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发希望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。
“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的预防结果的有效的量。典型地,但非必需的,因为预防的剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的,所以这种预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用,“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的,有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种:缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如,预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如,转移)、预防或延迟疾病的重现、延迟或减缓疾病的进展,改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重增长和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(像例如,肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。“治疗”并不一定意味着所治疗的疾病将得到治愈。
应当理解,本文所述的申请的实施例包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”。
取代、插入和缺失变体
在某些实施例中,提供了具有一个或多个氨基酸取代的融合蛋白变体。保守取代示于表1中“优选取代”标题之下。表1中在“示例性取代”的标题下提供了更实质的变化,并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸取代可以引入目的融合蛋白中,并针对所希望的活性(例如保留/改善的受体与配体结合)筛选产物。
表2.氨基酸取代
原始残基 | 示例性取代 | 优选取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Asp、Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu;Asn | Glu |
Cys(C) | Ser;Ala | Ser |
Gln(Q) | Asn;Glu | Asn |
Glu(E) | Asp;Gln | Asp |
Gly(G) | Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 | Leu |
Leu(L) | 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val;Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
氨基酸可以根据常见的侧链特性进行分组:(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)碱性:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;和(6)芳香族的:Trp、Tyr、Phe。在某些实施例中,非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
Fc区变体
在某些实施例中,可将一个或多个氨基酸修饰引入融合蛋白部分的Fc区(例如scFv-Fc)内,从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含一个人Fc区序列(例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区),该序列包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如,取代)。
在某些实施例中,具有一些(但非全部)效应子功能的Fc片段,此类功能使该片段成为适合应用的理想候选物,在所述应用中,融合蛋白在体内的半衰期很重要,但某些效应子功能(例如,补体和ADCC)是非必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定确保抗体没有FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性),但可以保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,在Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]9:457-492(1991)的第464页的表2中。在美国专利号5,500,362中描述了用于评估感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例(例如,参见Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],82:1499-1502(1985);5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志],166:1351-1361(1987))。可替代地,可以采用非放射性测定方法(例如,参见用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(细胞技术公司(CellTechnology,Inc.)山景城(Mountain View),加利福尼亚州;以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(普洛麦格公司(Promega),麦迪逊,威斯康星州)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地,可以在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,如Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:652-656(1998)中披露的。还可以进行C1q结合测定确认抗体不能结合C1q,并且因此缺乏CDC活性。例如,参见在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可以进行CDC测定(参见例如,Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood[血液]101:1045-1052(2003);以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood[血液]103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(例如,参见:Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.[国际免疫学]18(12):1759-1769(2006))。
含抗体Fc区的融合蛋白的生产方法
可以使用本领域中任何可用的或已知的技术来产生本文公开的含抗体Fc区的融合蛋白。例如但不限于,可以使用重组方法和组合物产生含抗体Fc区的融合蛋白,例如,如美国专利号4,816,567中所述。产生抗体的详细程序在以下实例中描述。
本发明的主题还提供了编码本文公开的含抗体Fc区的融合蛋白的分离的核酸。
在某些实施例中,核酸可以存在于一种或多种载体(例如表达载体)中。如本文所用,术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中,并且从而随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。一般而言,用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒(载体)形式。但是,所公开的主题旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体,例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中构建本文公开的抗体的不同部分。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于多种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES,例如,FGF-l IRES,FGF-2IRES,VEGF IRES,IGF-II IRES,NF-kBIRES,RUNX1 IRES,p53 IRES,甲型肝炎IRES,丙型肝炎IRES,瘟病毒IRES,口蹄疫病毒IRES,小核糖核酸病毒IRES,脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可裂解的接头(例如2A肽,例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装线的组合也是合适的,其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种产生两性病毒的细胞系,包括但不限于PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:431-437);PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]6:2895-2902);和CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:6460-6464)。非两亲性颗粒也是合适的,例如用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域中任何其他已知的假型颗粒。
在某些实施例中,可以将编码本发明的抗体的核酸和/或包括该核酸的一种或多种载体引入宿主细胞。在某些实施例中,可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞中,这些方法包括但不限于转染,电穿孔,显微注射,用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染,细胞融合,染色体介导的基因转移,微细胞介导的基因转移,原生质球融合等。在某些实施例中,宿主细胞可以包括,例如,已经用以下载体转化的宿主细胞:该载体包含编码包含hACE2-Fc融合蛋白的氨基酸序列的核酸。在某些实施例中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如,YO、NSO、Sp20细胞)。
在某些实施例中,制备本文公开的融合蛋白的方法可以包括在适合于蛋白表达的条件下培养其中已经引入了编码融合蛋白的核酸的宿主细胞,以及任选地从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中回收融合蛋白。在某些实施例中,通过色谱技术从宿主细胞回收融合蛋白。
为了重组产生本发明的融合蛋白,可以分离编码如上所述的融合蛋白的核酸,并将其插入一种或多种载体中,以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如,通过使用能够特异性结合编码融合蛋白的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。用于克隆或表达编码融合蛋白的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如,可以在细菌中产生融合蛋白,特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达融合蛋白,参见例如,美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第248卷(B.K.C.Lo,编辑,哈门那出版社(Human Press),托托瓦(Totowa),新泽西州(NJ),2003),第245-254页,描述了融合蛋白片段在大肠杆菌中的表达)表达后,可以从细菌细胞糊中分离出可溶级分的融合蛋白,并可以进一步纯化。
在某些实施例中,脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如但不限于,适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的非限制性实例是由SY40(COS-7)转化的猴肾CV1系;人胚胎肾系(293或293细胞,如例如在Graham等人,J GenViral.[普通病毒学杂志]36:59(1977)中描述);幼仓鼠肾细胞(BHK);小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞,例如在Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980)中描述);猴肾细胞(CV 1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK;水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep 02);小鼠乳房肿瘤(MMT 060562);TRI细胞,例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]383:44-68(1982)中描述;MRC 5细胞;和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFK CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:42I6(1980));和骨髓瘤细胞系(例如YO、NSO和Sp2/0)。对于某些适合抗体产生的哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如,Yazaki和Wu,Methods in MolecularBiology[分子生物学方法],第248卷(B.K.C.Lo编辑,哈门那出版社(Human Press),托托瓦(Totowa),新泽西州(NJ)),第255-268页(2003)。
本发明的主题进一步提供了使用公开的融合蛋白的方法。在某些实施例中,这些方法涉及当前公开的融合蛋白的治疗用途。
治疗方法
本发明提供了本文公开的hACE2-Fc融合蛋白用于预防或治疗疾病和病症或用于制备用于预防或治疗疾病的药物的用途。在某些实施例中,可以通过本文公开的融合蛋白治疗的疾病和病症包括但不限于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
取决于待治疗的适应症和本领域技术人员熟悉的与给药相关的因素,本文提供的融合蛋白将以在最小化毒性和副作用的同时有效治疗该适应症的剂量施用。对于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的治疗,典型的剂量可以是例如在0.001至1000μg的范围内;然而,低于或高于该示例性范围的剂量在本发明的范围内。日剂量可以是总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg,总体重的约0.1μg/kg至约100μg/kg或总体重的约1μg/kg至约100μg/kg。如上提到的,可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于经若干天或更长时间的重复施用,取决于病症,重复进行治疗直至发生所希望的疾病症状抑制。然而,其他剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。所希望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或通过连续输注施用组合物来递送。
在某些实施例中,该制品可以包括(a)第一容器,该第一容器中装有组合物,其中该组合物包含本发明的融合蛋白;以及(b)第二容器,其中装有组合物,其中该组合物包含其他细胞毒性或治疗剂。在某些实施例中,所述制品可以进一步包含包装插入物,其指示所述组合物可以用于治疗特定病症。
可替代地或另外地,制品可以进一步包括另外的容器,例如第二或第三容器,其包括药学上可接受的缓冲剂,例如但不限于注射用抑菌水(BWFI)或生理盐水。该制品可以包括从商业和用户角度所希望的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
抗体部分的纯化
可以通过任何合适的方法纯化抗S抗体(例如,抗S蛋白全长抗体或其抗原结合片段)。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱。合适的亲和配体包括结合抗体恒定区的配体。例如,蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可用于结合所述恒定区并纯化包含Fc片段的抗S蛋白抗体。疏水相互作用色谱,例如丁基或苯基柱,也可以适用于纯化某些多肽,例如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可以适用于纯化某些多肽,例如抗体。混合模式色谱(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可以适用于纯化某些多肽,例如抗体。纯化多肽的许多方法是本领域已知的。
本发明除公开能够抑制新型冠状病毒与人ACE-2结合和病毒感染的新的ACE2-Fc融合蛋白之外,还意外地发现ACE2-Fc融合蛋白与新型冠状病毒的抗S蛋白中和抗体具有协同阻断新型冠状病毒与人ACE2的结合,以及抑制病毒感染作用。为新型冠状病毒的防治提供新的更有力的方法。
以下实例仅是对当前公开的主题的说明,不应以任何方式视为限制。
实例
实例1 ACE2-Fc融合蛋白,ACE2蛋白的制备
质粒的构建与蛋白表达
对hACE2-Fc融合蛋白和ACE2-His蛋白的编码核酸进行克隆和表达。根据氨基酸序列按照表达宿主CHO-S细胞进行密码子优化后构建到pAS-Pruo表达载体上。构建稳转CHO-S细胞株用于蛋白的表达。
融合蛋白的纯化
将表达融合蛋白的培养上清进行高速离心,收取上清后用0.22um的滤膜过滤后备用。用0.1M NaOH清洗Protein A亲和柱(3-5倍柱体积),随后用1×PBS清洗亲和柱,清洗时间为5倍柱体积。利用上样平衡液(PBS pH 7.4)对亲和柱平衡3-5倍柱体积后开始上样,控制流速以保证保留时间在1min以上,上样结束后用pH 7.4的PBS清洗亲和柱直至紫外吸收回落至基线水平。利用0.1M甘氨酸盐酸pH 3.4的缓冲液进行样品洗脱,根据紫外吸收峰收集洗脱产物。洗脱结束后用1M Tris-HCl(pH 8.0)快速将洗脱产物的pH回调至5.5暂存,后续可根据需要利用超滤或透析等方式置换到其他缓冲体系中。
所制备的hACE2-Fc融合蛋白、ACE2-His蛋白的氨基酸序列,及其在克隆和表达时所使用的信号肽序列如下:
>信号肽序列[SEQ ID NO.3]:MGWSLILLFLVAVATRVHS
>hACE2-Fc融合蛋白氨基酸序列(人ACE2胞外区(ECD)与人IgG1的Fc片段的融合蛋白)[SEQ ID NO.4]:
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
注:正体部分为人ACE2胞外区,下划线部分为人IgG1的Fc片段。本文实例中使用的ACE2-Fc的具体分子均为SEQ ID NO.4所示ACE2-Fc融合蛋白,除有具体限定外,实例并非对本公开权利的限制。
>ACE2-His[SEQ ID NO.5]:
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSHHHHHH
注:正体部分为人ACE2胞外区,下划线部分为His标签
>ACE2全长蛋白氨基酸序列[SEQ ID NO.6]
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF
实例2 hACE2-Fc与RBD的结合亲和力检测
100μl 2μg/ml RBD-His(近岸生物货号:DRA42)加入96孔板中4℃包被过夜,PBST清洗三遍后用含5%牛血清白蛋白(BSA)的1×PBS(pH 7.4)室温封闭1h。PBST清洗三遍,加入100μl起始浓度20μg/ml 4倍梯度稀释的hACE2-Fc重组蛋白室温孵育1h。PBST清洗三遍,加入Anti-hFc-HRP室温孵育30min,PBST清洗五遍后开始显色,加入终止液后利用酶标仪(TECAN Spark)检测吸光值。
经检测,确定hACE2-Fc与RBD-His的亲和力为0.54nM,显示出与RBD-Fc具有很强的亲和力。
实例3 hACE2-Fc对RBD与ACE2-His的结合的阻断作用检测
方法:100μl 2μg/ml RBD-Fc(义翘神州,40592-V05H,其中RBD是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)表面刺突糖蛋白(Spike蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD))包被96孔板4℃过夜,PBST清洗三遍后用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS室温封闭1h。PBST清洗三遍,将50ng/ml的ACE2-His与梯度稀释的hACE2-Fc混合后同时加入96孔板中室温孵育1h。PBST清洗后加入anti-his-HRP室温孵育30min,PBST清洗五遍后加入底物显色,加入终止液后利用酶标仪(TECAN Spark)读数。
经检测,确定hACE2-Fc对ACE2-His与RBD-Fc的结合的阻断IC50为5.02nM,显示出hACE2-Fc能够很好地阻断ACE2-His与RBD-Fc的结合。
实例4 hACE2-Fc对RBD与细胞膜上的ACE2结合的阻断作用检测
方法:根据生产商的说明用PEI将含有hACE2全长的质粒(载体为pAS-Puro)转入HEK-293T细胞中备用。具体方法:将HEK-293T接种至6孔板中,当细胞密度长至70%左右时,根据聚乙烯亚胺(PEI)的说明书,DNA:PEI比例为1:3,每孔4μg质粒的量转染细胞,转染8h后换液。37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h后加入4μg/ml的puromycin进行抗性筛选,得到过表达hACE2的HEK-293T(hACE2-293T)备用。胰酶消化hACE2-293T,PBS清洗2遍后离心去上清,将0.1μg/ml的RBD-Fc与梯度稀释的hACE2-Fc重组蛋白混合后加入hACE2-293T中,重悬细胞后冰上孵育1h,PBS清洗2遍后加入PE标记的anti-hFc抗体冰上孵育30min,PBS清洗后重悬细胞,流式细胞仪(Beckman CytoFLEX)检测细胞荧光强度。
经检测,确定hACE2-Fc对细胞膜上表达的ACE2与RBD-Fc的结合的阻断IC50为7.6nM,显示出hACE2-Fc能够很好地阻断细胞膜表面表达的ACE2与RBD-Fc的结合作用。
实例5抗SARS-CoV-2的S蛋白中和抗体
根据中国专利申请CN202010236256.8所记载的方法制备P17-A11等抗S蛋白抗体。上述专利申请中的所有内容同时引入本申请。
抗体P17-A11和P16-A3的相关氨基酸序列如下所示:
>P16-A3 VL[SEQ ID NO.7]:
NIQLTQSPVSLSASVGDRVTLTCRASQGIGYSLVWYQKKPGTAPKLLIFDASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQVIHYPLTFGGGTKVEIK
>P16-A3 VH[SEQ ID NO.8]:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYSSSWLLQSFYYYGMDVWGQGTTVTVSS
>P17-A11 VL[SEQ ID NO.9]:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK
>P17-A11 VH[SEQ ID NO.10]:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHATLMNNKDIWGQGTLVTVSS
表3根据ABM规则确定的抗S蛋白抗体的CDR序列
>P16-A3重链[SEQ ID NO.23]:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYSSSWLLQSFYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>P16-A3轻链[SEQ ID NO.24]:
NIQLTQSPVSLSASVGDRVTLTCRASQGIGYSLVWYQKKPGTAPKLLIFDASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQVIHYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>P17-A11重链[SEQ ID NO.25]:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHATLMNNKDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>P17-A11轻链[SEQ ID NO.26]:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实例6抗SARS-CoV-2的S蛋白抗体与ACE2-Fc融合蛋白对细胞毒性的研究
2)观察细胞状态,细胞汇合度达到约50%时,将ACE2-Fc及P17-A11用含2%FBS的DMEM培养基进行2倍比稀释(ACE2-Fc浓度设置为:16,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625μg/ml;P17-A11浓度设置为:0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125,0.00625,0.003125μg/ml);
3)以100μl/孔加至细胞板中,每种浓度设4个重复;同时设置对照组(不含药物组)和空白组(不含细胞组),置于37℃,5%CO2的培养箱中培养;
4)于加药后48h,在细胞培养液中直接加入1/10体积的Cell Counting Kit-8(CCK-8),充分混合,但避免气泡产生。于37℃培养箱中培养1小时至颜色变为橙色。以空白组调零,用多功能酶标仪测量在450nm处的吸收光,按以下公式计算:存活率(%)=加药组OD450/对照组OD450×100%。同时计算药物的半数毒性浓度(CC50)。
蛋白对细胞的半数毒性浓度如下表所示。
表4.ACE2-Fc及P17-A11对Vero-E6细胞的半数毒性浓度
结果显示(见表4),ACE2-Fc融合蛋白对Vero-E6细胞毒性很低,抗体P17-A11和在Vero-E6细胞模型中未检测到细胞毒性。
实例7抗SARS-CoV-2的S蛋白抗体与ACE2-Fc融合蛋白在Vero-E6细胞模型中抑制SARS-CoV-2病毒复制的效果评价
在Vero-E6细胞模型上进行抗病毒活性测定,每次试验均设4复孔,共重复3次。
1)于24孔细胞培养板每孔中接种8×104个Vero-E6细胞,在37℃,5%CO2培养条件下,待汇合度达到70%~80%时,将ACE2-Fc用含2%FBS的DMEM培养基进行2倍比稀释,弃孔中培养基,分别向每孔中加入1ml含有SARS-CoV-2病毒液(按照感染复数MOI为0.005)以及对应浓度药物的DMEM培养基(ACE2-Fc浓度设置为:1.0,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125μg/ml;P17-A11浓度设置为:0.05,0.025,0.0125,0.00625,0.003125,0.0015625μg/ml),同时设置对照组(不含药物组),于感染后24h收集上清病毒液。
2)利用real-time RT-PCR(qRT-PCR)对收集的病毒进行RNA定量:
收集的上清病毒液分别取200μl,按照QIAamp viral RNA mini kit试剂盒说明书进行RNA提取。用新型冠状病毒核酸检测(荧光定量PCR)试剂盒进行qRT-PCR检测(Taqman探针法)。
3)计算每种浓度下的药物抑制率。抑制率(%)=1-实验组病毒RNA拷贝数/不含药物组病毒RNA拷贝数×100%。同时使用GraphPad PrisM6.0软件分析计算药物抑制SARS-CoV-2病毒的半数有效浓度(EC50)和90%有效浓度(EC90)。
表5.不同浓度的ACE2-Fc融合蛋白及P17-A11对SARS-CoV-2病毒的抑制率
表6.ACE2-Fc及P17-A11在Vero-E6细胞模型中抑制SARS-CoV-2病毒复制的半数有效浓度(EC50)和90%有效浓度(EC90)
结果显示,P17-A11和ACE2-Fc对病毒具有很强的新型冠状病毒抑制活性。
实例8抗SARS-CoV-2的S蛋白抗体与ACE2-Fc融合蛋白联合抑制SARS-CoV-2病毒的效果评价
利用流式细胞术检测ACE2-Fc,抗S蛋白单独和联合阻断SARS-CoV-2感染的效果。
A、0.5μg/ml ACE2-Fc分别与不同浓度抗体P17-A11混合后加入0.1μg/ml RBD-Fc预孵育20min,然后加入293-hACE2细胞悬液中室温孵育30min。PBS清洗细胞后加入PE标记的anti-Fc抗体检测细胞膜上RBD-Fc的含量,并计算阻断效率。结果参见图4A。
B、0.05μg/ml抗体P17-A11分别与不同浓度ACE2-Fc混合后加入0.1μg/ml RBD-Fc预孵育20min,然后加入293-hACE2细胞悬液中室温孵育30min。PBS清洗细胞后加入PE标记的anti-Fc抗体检测细胞膜上RBD-Fc的含量,并计算阻断效率。结果参见图4B。
结果显示,抗SARS-CoV-2的S蛋白的抗体P17-A11和ACE2-Fc融合蛋白联合应用时,可以更有效地协同阻断病毒对细胞的感染。
实例9中和抗体P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白联合抑制SARS-CoV-2对Vero细胞的侵染研究
将P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白按1:5,1:10,1:30的比例混合后用细胞维持液将其做5倍梯度稀释,然后与等体积的新型冠状病毒混合(病毒株:BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020,加入病毒的量要保证阳性对照组的空斑数在50-100个/孔),37℃孵育1小时;将病毒-抗体混合液(200μL/孔)加入含单层致密Vero细胞的24孔培养板中,37℃培养1小时,其间轻轻摇动数次;弃病毒抗体混合液,每孔加入适当体积预热的营养琼盖,37℃5%CO2孵箱继续培养,在感染后第2天加入适当体积的固定液,室温固定1小时,弃固定液和营养琼盖,用固定液清洗1次;加入适当体积的1%结晶紫溶液,室温染色1小时,弃结晶紫溶液,用固定液清洗1次,计数出斑数。并按照公式计算抑制率(抑制率=(1-抗体组/对照组)*100%)。实验结果(见图5A和表7)显示P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白按不同比例联合处理后均能显著提高抗病毒效果,具有明显的协同效应。当组合比例为1:5时的中和活性为EC50=0.001nM,与P17-A11单独处理组相比中和活性提高了7倍。
为进一步评估P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白的病毒中和活性,我们将感染细胞的病毒量提高了5倍,然后研究不同比例P17-A11与ACE2-Fc联合处理后的病毒中和效果。结果(见图5B和表7)显示当病毒浓度提高5倍后P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白仍有明显的协同效应,且在比例为1:5时协同作用最强EC50=0.41nM。与抗体P17-A11单独处理相比中和活性提高了约3倍。
表7不同病毒量条件下P17-A11与ACE2-Fc融合蛋白联合处理时的半数有效浓度
实例10抗体P17-A11和ACE2-Fc融合蛋白联用对广泛的S蛋白RBD突变体的中和有效性的研究
1)样品准备:
1.1)假病毒包装:
按照骨架质粒pNL4-3.Luc/包膜质粒pV-S(nCoV)=4:1的比例用LipofectamineTM3000(Thermo Fisher Scientific)转染到密度约1x105/cm2的293T细胞。转染后约8h更换新鲜的培养液,换液后12~16h,收集细胞上清液,离心后取上清作为假病毒上清液。
1.2)假病毒滴度测定:
准备54μL假病毒上清液和其10~108梯度稀释液,置于96孔板,将50μL,4x105/mL的稳定细胞系293T-ACE2加到上述病毒的稀释液中,37℃,5%CO2培养20~24h,每孔补填加25μL含10%FBS的DMEM培养基,继续培养至48h。在每孔中加入100μL的Luc检测试剂,室温裂解2分钟后,转移100μL至96孔白板中利用酶标仪检测。
1.3)用无FBS的DMEM培养基将样品浓度稀释至所需初始浓度过滤备用,所需初始浓度如表8所示:
表8.样品初始浓度
样品类型 | 抗体P17-A11 | ACE2-Fc融合蛋白 | 抗体P17-A11+ACE2-Fc融合蛋白 |
浓度(μg/ml) | 100 | 2000 | 50+250 |
2)取一块透明的96孔板,在第1行加入初始浓度的抗体112μl,第2-7行加入无FBS的DMEM培养基84μl/孔(三个复孔的量)。将第1行抗体吹打混匀15次后取28μl液体至第2行,轻柔吹打混匀15次后取28μl至第3行,依次进行4倍比稀释至第8行,吹打混匀后弃去28μl抗体稀释液;另选一个孔加84μl无血清的DMEM培养基作为病毒对照;随后在上述处理孔中加入滴度测定中的半数有效感染浓度的假病毒溶液84μl,轻柔混匀后将96孔透明板在37℃、5%的CO2培养箱孵育1h;
3)取293-ACE2细胞,计数并将密度调至0.4×106cells/mL,随后根据实验所需细胞量取足量细胞;孵育1h后将96孔透明板中混合液一分为三转至96孔白透板中,每孔50μl。另外选取三个孔加入50μl含10%FBS的DMEM培养基作为阴性对照,随后每孔加50μl调整密度后的细胞,最后放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;在培养24小时后进行补液,每孔加含10%FBS的DMEM培养基25μl,继续培养24h;培养结束后每孔加入100μl Bright-LightLuciferase Assay System检测试剂,用多功能酶标仪检测发光值(RLU);
4)数据处理:将数据带入GraphPad Prism软件进行数据分析,输出IC50值和R2值。
结果显示,38个自然产生的S蛋白突变体中有5个(V483A,E484K,G485D,F490L和F490P)表现出对抗体P17-A11的抗性(表9)。而ACE2-Fc融合蛋白单独处理和联合抗体P17-A11处理可以有效地中和所有38个S蛋白突变体,包括上述5个抗药性突变体。这说明ACE2-Fc融合蛋白及其与抗体P17-A11的联合应用可能提供针对各种SARS-CoV-2病毒突变体的有效疗法。
表9.抗体P17-A11、ACE2-Fc融合蛋白和抗体P17-A11+ACE2-Fc融合蛋白组合对SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD突变体的中和有效性
实例11 ACE2-Fc融合蛋白在hACE2-IRES-luc转基因小鼠模型中的体内药效研究
将6-8周龄的雌性hACE2-IRES-luc转基因小鼠(来源:上海南方模式生物科技股份有限公司)随机分为3组,经鼻感染致死剂量的SARS-CoV-2病毒(nCoV-SH01,GenBank:MT121215.1)。2小时后,分别向病毒感染的转基因小鼠腹腔注射单剂量的ACE2-Fc融合蛋白(15和50mg/kg)或PBS对照。每天记录小鼠的生存率,持续5天。
结果显示,所有动物均表现出致死剂量的病毒感染导致的感染性临床症状。然而在接受50mg/kg剂量的ACE2-Fc融合蛋白治疗组中,没有小鼠在预定的安乐死之前死亡(图6),这表明ACE2-Fc融合蛋白对SARS-CoV-2病毒感染具有治疗潜力。
实例12抗体P17-A11和ACE2-Fc融合蛋白在BALB/c小鼠模型中的体内药效研究
在抗体P17-A11和ACE2-Fc融合蛋白联合用药的体内研究中,使用1.6×104PFU的MASCp6(含N501Y突变的SARS-CoV-2第6代的小鼠适应株,来源:Beijing Institute ofMicrobiology and Epidemiology)感染BALB/c小鼠,2小时后,用抗体P17-A11(5mg/kg),ACE2-Fc融合蛋白(25mg/kg)或抗体P17-A11+ACE2-Fc融合蛋白(5+25mg/kg)处理感染的小鼠。5天后,处死小鼠以分析肺部和气管中的病毒负荷量。病毒滴度以每克组织的RNA拷贝数表示。*p<0.05。
结果显示,与抗体P17-A11或ACE2-Fc融合蛋白单药治疗相比,5mg/kg抗体P17-A11加25mg/kg ACE2-Fc融合蛋白的组合可以显着提高体内病毒清除率(图7A-7B),这说明抗体P17-A11和ACE2-Fc融合蛋白联合治疗对MASCp6感染具有潜在有效性。
Claims (10)
1.一种ACE2融合蛋白,其包含ACE2蛋白胞外区和可促进融合蛋白二聚化的多肽。
2.根据权利要求1所述的ACE2融合蛋白,其中所述可促进融合蛋白二聚化的多肽是抗体的Fc片段,优选人IgG抗体Fc片段,更优选人IgG1抗体Fc片段,最优选如SEQ ID No.2所示的Fc片段。
3.根据权利要求1所述的ACE2融合蛋白,其中所述ACE2蛋白胞外区氨基酸序列如SEQID No.1所示。
4.根据权利要求1所述的ACE2融合蛋白,其中所述ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.4所示。
5.一种核酸分子,其编码如权利要求1至4任一项所述的ACE2融合蛋白。
6.一种表达载体,其包含如权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞,其包含如权利要求6所述的表达载体,并可表达如权利要求1至4任一项所述的ACE2融合蛋白。
8.一种药物组合物,其包含如权利要求1至4任一项所述的ACE2融合蛋白及药学可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其还包含抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,其中所述抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白的中和抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区,其中:
a) 所述重链可变区与SEQ ID NO.8所示重链可变区具有相同的HCDR1、HCDR2和HCDR3,及所述轻链可变区与SEQ ID NO.7所示轻链可变区具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
b) 所述重链可变区与SEQ ID NO.10所示重链可变区具有相同的HCDR1、HCDR2和HCDR3,及所述轻链可变区与SEQ ID NO.9所示轻链可变区具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
Priority Applications (2)
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