CN114958794B

CN114958794B - 一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用

Info

Publication number: CN114958794B
Application number: CN202210670499.1A
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 孙金娣; 陈可泉; 冯娇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN114958794A

Abstract

本发明涉及一种苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。克隆出具有如SEQID No.2所示核苷酸序列的苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54基因，并转入E.coliBL21(DE3)中表达，获得了苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54酶。对hPNMT54酶学性质研究表明，在温度50℃、pH7.5时活力最佳；Ni²⁺对酶活抑制作用较大。此外，苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54在催化合成肾上腺素时，其制备方法简单、环境友好、反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

Description

一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。

背景技术

肾上腺素(Adrenaline)，化学名为(R)-1-(3’,4’-二羟基苯基)-2-甲胺基乙醇，由美国Forest Labs公司研发。肾上腺素具有两个对映体，R-(-)和S-(+)，其中R-(-) -肾上腺素具有生理活性，是危重患者的一种抢救药品，肾上腺素的需求量也集聚扩增。因此，(R)-肾上腺素的绿色生物合成将为拯救更多危重患者提供药物保障，同时为其它以1,2-氨基醇为骨架的生物活性物质合成提供参考。

肾上腺素是一种激素和神经传送体，由肾上腺释放。当人经历某些刺激时会分泌出，使人呼吸加快，心跳与血液流动加速等。同时肾上腺素会使心脏收缩力上升，使心脏、肝、和筋骨的血管扩张和皮肤、粘膜的血管收缩，拯救濒死的人或动物。该物质易被氧化，氧化颜色变化为浅粉色至红棕色，且在水中溶解性极低，其盐酸盐易溶于水。该物质具有一定的应用价值，可用于心脏骤停的抢救和过敏性休克的抢救，挽救患者生命；可用于过敏性疾病(如支气管哮喘、荨麻疹)的治疗；还可与局麻药合用有利局部止血和延长药效等。

同时，肾上腺素作为危重患者的一种抢救药品，具有重要的利用价值，因此需加强对肾上腺素作用机理与合成途径的研究，采取相对安全、高效的合成途径。目前化学合成方法具有收率低、环境污染较重、使用昂贵金属催化剂等问题。生物合成方法中，苯乙醇胺-N-甲基转移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase，PNMT)是关键酶，该酶催化将甲基从 S-腺苷蛋氨酸转移到去甲肾上腺素的氨基端生成肾上腺素。PNMT多数情况下来源于动物，基因复杂度较高；是以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，属于甲基转移酶(MTs)小分子亚家族。利用苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化去甲肾上腺素合成肾上腺素，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成。可解决目前化学合成的收率低、环境污染较重、使用昂贵金属催化剂等问题。

因此，通过酶祖先序列重建技术，挖掘具有较高活力的苯乙醇胺-N-甲基转移酶对催化合成肾上腺素具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。该酶来源于现有人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶(hPNMT)的祖先序列挖掘，该酶最适温度为50℃，最适pH为7.5，在pH5.0-8.5，酶活仍保持50％以上，表明hPNMT54稳定性较高；Ni²⁺离子对hPNMT54活力具有较大的抑制作用，2h内，hPNMT54催化合成0.4g/l肾上腺素，转化率达43％。利用苯乙醇胺-N-甲基转移酶，以去甲肾上腺素和S-腺苷蛋氨酸为底物，生物催化合成肾上腺素，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成。但其酶活较低，催化合成肾上腺素产量较低。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

MDPGRESSIAAVAESYQKFDPRAYLQNNYVPPRADFSREDSVVPWKLRCLAEAFATGEIHGRTLIDIGSGPTIYQL LSACEHFEEIIMTDFLEVNRQELRRWLRGEPGAFDWSPYLQHVCKIEGKGESWQEKERRLRERVKRVLPIDVHQPNPLGSGSLAPEPVDALVSTFCLEAVSPDRASFQRALENITTLLKPGGHFLMIGALEESFYLAGEARLSVVPVSEEEVREALTKSG YEIRDFRTYTMPPSLKVGVDDVRGIFFVWAQKKAAAHHHHHH

上述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

ATGGACCCTGGTCGTGAAAGCAGCATTGCAGCAGTTGCAGAAAGCTATCAGAAATTTGATCCGCGTGCATATCTGC AGAATAACTATGTTCCGCCTCGTGCAGATTTTAGCCGTGAAGATAGCGTTGTTCCGTGGAAACTGCGTTGTCTGGCCGAAGCATTTGCAACCGGTGAAATTCATGGTCGTACCCTGATTGATATTGGTAGCGGTCCGACCATTTATCAGCTGCTGAGCGC ATGTGAACATTTTGAAGAAATTATCATGACCGATTTTCTGGAAGTGAATCGTCAAGAACTGCGTCGTTGGCTGCGTGGTGAACCGGGTGCATTTGATTGGAGCCCGTATCTGCAGCATGTTTGTAAAATTGAAGGTAAAGGTGAAAGCTGGCAAGAAAAA GAACGTCGTCTGCGTGAACGTGTTAAACGTGTTCTGCCGATTGATGTTCATCAGCCGAATCCGTTAGGTAGCGGTAGCCTGGCACCGGAACCGGTTGATGCACTGGTTAGCACCTTTTGTCTGGAAGCAGTTAGTCCGGATCGTGCGAGCTTTCAGCGTG CACTGGAAAACATTACCACACTGCTGAAACCTGGTGGTCATTTTCTGATGATTGGTGCCCTGGAAGAAAGTTTTTATCTGGCAGGCGAAGCACGTCTGAGCGTTGTGCCGGTTAGCGAAGAAGAAGTTCGCGAAGCACTGACCAAAAGCGGTTATGAAAT TCGTGATTTTCGCACCTATACCATGCCTCCGAGCCTGAAAGTTGGTGTTGATGATGTTCGTGGTATCTTTTTTGTTTGGGCACAGAAAAAAGCAGCAGCACATCACCATCATCATCAC

一种实验室现有人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

GGATCCATGAGCGGTGCGGACCGTAGCCCGAACGCGGGTGCGGCGCCGGATAGCGCGCCGGGTCAGGCGGCGGTGG CGAGCGCGTACCAACGTTTCGAACCGCGTGCGTACCTGCGTAACAACTATGCGCCGCCGCGTGGTGACCTGTGCAACCCGAACGGTGTTGGTCCGTGGAAGCTGCGTTGCCTGGCGCAGACCTTTGCGACCGGTGAAGTGAGCGGCCGTACCCTGATCGA TATTGGTAGCGGCCCGACCGTTTACCAACTGCTGAGCGCGTGCAGCCACTTCGAGGACATCACCATGACCGATTTTCTGGAAGTGAACCGTCAGGAGCTGGGCCGTTGGCTGCAAGAGGAACCGGGTGCGTTCAACTGGAGCATGTATAGCCAGCACGCG TGCCTGATCGAAGGCAAGGGCGAGTGCTGGCAGGACAAAGAACGTCAACTGCGTGCGCGTGTGAAACGTGTTCTGCCGATTGATGTGCATCAGCCGCAACCGCTGGGTGCGGGCAGCCCGGCGCCGCTGCCGGCGGATGCGCTGGTTAGCGCGTTTTGCC TGGAGGCGGTTAGCCCGGACCTGGCGAGCTTTCAACGTGCGCTGGATCACATCACCACCCTGCTGCGTCCGGGTGGCCACCTGCTGCTGATTGGTGCGCTGGAGGAAAGCTGGTATCTGGCGGGTGAAGCGCGTCTGACCGTGGTTCCGGTTAGCGAGGA AGAGGTGCGCGAGGCGCTGGTTCGTAGCGGCTACAAAGTGCGTGATCTGCGTACCTATATTATGCCGGCGCACCTGCAGACCGGTGTGGACGATGTTAAGGGCGTGTTCTTTGCGTGGGCGCAGAAAGTTGGTCTGTAAAAGCTT

一种重组质粒，含有编码权利要求1所述的苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54基因的质粒。

一种重组菌株，表达上述的重组质粒的菌株。

上述的重组菌株的克隆表达，步骤如下：

步骤1，构建表达PNMT的基因工程菌pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)

根据酶祖先序列重建技术挖掘出的氨基酸祖先序列进行密码子优化后，全基因合成该序列(序列如SEQ NO.1所示)，亚克隆到载体pET24a上，获得重组质粒pET24a-hPNMT54，将构建好的重组质粒pET24a-hPNMT54用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)；

步骤2，体外诱导表达

将苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)接入5ml含卡纳霉素的LB培养基中离心管中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1％的接种量接种到100ml 含卡纳霉素的LB培养基中，当OD₆₀₀＝0.4-0.8时，加入终浓度0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃， 150-250rpm培养15-20h；

步骤3，苯乙醇胺-N-甲基转移酶的获得

体外诱导表达结束后于4℃，4000-8000rpm离心10-15min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体3次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心10-15min收集上清液，纯化处理，即得苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液。

上述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液在催化合成肾上腺素中的应用。

作为改进的是，所述催化合成的温度为37℃、反应体系的pH 7.0。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用，本发明的酶属于甲基转移酶，并且具有一定的转甲基的作用，从去甲肾上腺素催化合成肾上腺素，其最适温度50℃、最适pH 7.5，在pH5.0-8.5时24h后相对活力保持50％以上，环境友好，反应条件温和，具有工业化潜在价值。

附图说明

图1为本发明苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的SDS-PAGE检测结果，其中，M：蛋白标准分子量，1为hPNMT54蛋白离心后的上清液，2为hPNMT54蛋白离心后的沉淀，3为纯化后的hPNMT54蛋白；

图2为本发明中温度对苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54最适温度实验结果图；

图3为本发明中苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54最适pH(a)及pH稳定性(b)实验结果图；

图4为本发明中金属离子对苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54活性的影响实验结果图；

图5为本发明中苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54合成肾上腺素产物的液相结果图，其中， 1为S-腺苷蛋氨酸；2为去甲肾上腺素；3为肾上腺素。

具体实施方案

下面通过实施例对本发明做进一步描述，但不用于限制本发明的保护范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1构建表达PNMT的基因工程菌pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)

1、菌株培养：

根据酶祖先序列重建技术(具体依据https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr 网站和参照酶祖先序列重建与定向进化的文献)挖掘出的氨基酸祖先序列进行密码子优化后，全基因合成该序列(序列如SEQ NO.1所示)，亚克隆到载体pET24a上，获得重组质粒 pET24a-hPNMT54，将构建好的重组质粒pET24a-hPNMT54用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到苯乙醇胺-N-甲基转移酶表达菌种pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)。

转化操作如下：(1)取冰上冻融的20μl感受态细胞BL21(DE3)，于上述10μl的质粒中，轻轻混合均匀；(2)在冰上静置30min后，42℃热激处理90s，然后迅速放置冰上5min；(3)在超净工作台加LB培养基800μl，37℃摇床培养1h；(4)5000rpm离心培养液，倒掉部分上清，并重悬菌体，涂布于含有卡纳霉素的LB平板上，37℃过夜培养，筛选阳性转化子，然后挑取1-2个单菌落接种到含有卡纳霉素终浓度为0.2％的5ml LB培养基中，37℃过夜培养。

2、主培养：培养12h后按1％接种量转移至100ml LB卡纳培养基中，37℃震荡培养至 OD₆₀₀＝0.4-0.8；

3、诱导表达：加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导菌体细胞，在25℃下200rpm低温诱导20h；

4、收集全细胞：于4℃，6000rpm，离心10-15min收集菌体，并用10-15ml PBS混匀后于超声波破碎处理10min，至液体呈现透明；

5、可溶蛋白酶hPNMT54的提取：将上述菌液于6000-8000rpm，4℃离心10-15min，取上清液即为可溶蛋白，即本发明所述酶hPNMT54。沉淀一般为破碎细胞和少量的本底表达蛋白；

6、hPNMT54粗酶液的纯化：利用超声过的纯水、50mM和500mM的咪唑先后清洗蛋白纯化仪管路及镍柱，去除其中的杂质。将经过离心10-15min，取上清过滤已去除杂质和破碎细胞的粗酶液上镍柱。接着用50mM的咪唑打通管路，目标蛋白具有His标签，因此可吸附在镍柱上，不带His标签的杂蛋白以及其它杂质不能吸附在镍柱上从而被冲洗下来，待目标蛋白都吸附在镍柱上后，换用500mM的咪唑洗脱目标蛋白，此时注意收集目标蛋白，将最后收集得到的目标蛋白取样进行12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图1，获得纯化hPNMT54酶液。

7、SDS-PAGE电泳检测表达的目的蛋白，见附图1所示。

上述实施例中，LB培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠。

实施例2苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的酶活测定

1.标准品配置

标准品去甲肾上腺素、S-腺苷蛋氨酸、肾上腺素均用0.1％盐酸溶液配置成1g/L溶液。

2.高效液相色谱检测条件

流动相A：称取氯化钠23.5g，加入冰乙酸1.0mL，用超纯水稀释到1000mL，混匀，超滤过膜并脱气。

流动相B：100％乙腈

色谱柱：Waters XSelect HSS T3(4.6×250mm，5μm)，柱温：30℃，流速：0.5mL/min，检测波长：UV280 nm，进样体系：10μL

3.取样

反应体系为110μl PBS缓冲液(pH7.0，50mM)，20μl 5mM去甲肾上腺素和20μl 10mMS-腺苷蛋氨酸，添加50μl hPNMT54酶液，在37℃，1000rpm，反应12h，并且在反应0h， 1h，2h，4h，8h，12h各取样200μl，加入200μl 0.5M HCl终止反应，-20℃冷冻保藏。

4.制样

将冷冻保藏的产物解冻后，放入离心机内12000rpm，离心2min。使用一次性注射器、水膜(0.22μm)将产物过膜，减少杂峰的产生。

5.梯度洗脱法检测产量

实施例3苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的酶学性质

对实施例1获得的苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的酶学性质进行测定，包括最适温度、最适pH、pH稳定性、金属离子对酶活的影响，以去甲肾上腺素为底物进行测定。

一、酶活测定

具体见实施例2。

二、温度对苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的影响

1、最适反应温度

在PBS缓冲液(pH 7.0，50mM)的条件下，以终浓度5mM去甲肾上腺素和10mM S-腺苷蛋氨酸为底物，反应体系包含20μl去甲肾上腺素、20μl S-腺苷蛋氨酸、110μl PBS(pH 7.0，50mM)和50μl hPNMT54酶液，在30℃、40℃、50℃、60℃的温度梯度范围内反应4h，反应结束加入200μl 0.5M HCI终止反应，检测产量。检测方法详见实施例2。以测得的最高产量为100％，检测不同温度下酶的相对活力。

结果如图2所示，苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的最适温度为50℃。

三、pH对苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的影响

1、最适pH

在最适反应温度50℃下，以终浓度5mM去甲肾上腺素和10mM S-腺苷蛋氨酸为底物，50 μl hPNMT54酶液分别在pH值为5-8.5的50mmol/L缓冲液(pH 5.0～6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 6.0-8.0磷酸盐缓冲液，pH 8.0-8.5Tris-HCI缓冲液)中与底物反应4h，反应结束加入200μl 0.5M HCI终止反应，检测产量。检测方法详见实施例2。以测得的最高产量为100％，检测不同pH下酶的相对活力，确定酶的最适反应pH值。

结果如图3(a)所示，苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的最适pH是7.5。

2、苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的pH值稳定性

将酶液分别置于50mmol/L不同pH的缓冲液(pH 5.0-6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 6.0-8.0磷酸盐缓冲液，pH 8.0-8.5Tris-HCI缓冲液)中，于4℃下放置24h，然后在最适反应温度50℃下检测残余酶活，并和未处理的酶活进行比较，计算相对活性。检测方法详见实施例2。

结果如图3(b)所示，苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54在pH为5.0-8.5时均具有活性，在pH值5.0-8.5之间活性较高，在pH为7.5时活力最佳。稳定性实验表明苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54在pH值范围为5.0-8.5时，孵育24h后酶活力维持在50％以上。

四、二价金属离子对苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的影响

向实施例2中的反应体系中分别加入终浓度为1mmol/l的ZnCl₂、MgCl₂、CuCl₂、CaCl₂、 MnCl₂、NiCl₂，然后在最适温度、最适pH下催化反应，并和不添加任何金属离子的酶活进行比较，计算酶相对活性。检测方法详见实施例2。

结果如图4所示，金属离子Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺对苯乙醇胺-N-甲基转移酶 hPNMT54均具有抑制作用，其中Ni²⁺的抑制作用较大，其次为Mg²⁺。

实施例4苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54催化合成肾上腺素的产物分析

(1)取样：反应体系为152μl PBS缓冲液(pH 7.0，50mM)，20μl5mM去甲肾上腺素和20μl 15mM S-腺苷蛋氨酸，添加8μl苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液，在37℃， pH 7.0条件下，1000rpm，反应12h，并且在反应0h，1h，2h，4h，8h，12h各取样200μ l，加入200μl0.5M HCl终止反应，-20℃冷冻保藏；

(2)制样：将冷冻保藏的产物解冻后，放入离心机内12000rpm，离心2min，使用一次性注射器、水膜(0.22μm)将产物过膜，减少杂峰的产生；

(3)产物检测分析：酶促产物利用高效液相色谱仪安捷伦1260，色谱柱为WatersXSelect HSS T3进行分析，使用已超声的乙腈和盐相作为流动相；盐相流动相A：氯化钠23.5g，加入冰乙酸1.0ml，用超纯水稀释到1000ml。流动相B：乙腈；检测方法：利用梯度流动相的方法，0min：A:B＝98:2；5min：A:B＝98:2；15min：A:B＝95:5；20min：A:B＝95:5；30min：A:B＝50:50；33min：A:B＝98:2；40min：A:B＝98:2。进样量10μl，运行时间40min，柱温 30℃，紫外检测信号280nm，检测完成后，用乙腈：水＝70:30保护色谱柱。

酶促产物检测结果如图5所示，苯乙醇胺-N-甲基转移酶转甲基的产物为肾上腺素，表明苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54展现出转甲基的活力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 278

<212> PRT

<213> 氨基酸序列( Amino acid sequences)

<400> 1

Met Asp Pro Gly Arg Glu Ser Ser Ile Ala Ala Val Ala Glu Ser Tyr

1 5 10 15

Gln Lys Phe Asp Pro Arg Ala Tyr Leu Gln Asn Asn Tyr Val Pro Pro

20 25 30

Arg Ala Asp Phe Ser Arg Glu Asp Ser Val Val Pro Trp Lys Leu Arg

35 40 45

Cys Leu Ala Glu Ala Phe Ala Thr Gly Glu Ile His Gly Arg Thr Leu

50 55 60

Ile Asp Ile Gly Ser Gly Pro Thr Ile Tyr Gln Leu Leu Ser Ala Cys

65 70 75 80

Glu His Phe Glu Glu Ile Ile Met Thr Asp Phe Leu Glu Val Asn Arg

85 90 95

Gln Glu Leu Arg Arg Trp Leu Arg Gly Glu Pro Gly Ala Phe Asp Trp

100 105 110

Ser Pro Tyr Leu Gln His Val Cys Lys Ile Glu Gly Lys Gly Glu Ser

115 120 125

Trp Gln Glu Lys Glu Arg Arg Leu Arg Glu Arg Val Lys Arg Val Leu

130 135 140

Pro Ile Asp Val His Gln Pro Asn Pro Leu Gly Ser Gly Ser Leu Ala

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Asp Ala Leu Val Ser Thr Phe Cys Leu Glu Ala Val

165 170 175

Ser Pro Asp Arg Ala Ser Phe Gln Arg Ala Leu Glu Asn Ile Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Lys Pro Gly Gly His Phe Leu Met Ile Gly Ala Leu Glu Glu

195 200 205

Ser Phe Tyr Leu Ala Gly Glu Ala Arg Leu Ser Val Val Pro Val Ser

210 215 220

Glu Glu Glu Val Arg Glu Ala Leu Thr Lys Ser Gly Tyr Glu Ile Arg

225 230 235 240

Asp Phe Arg Thr Tyr Thr Met Pro Pro Ser Leu Lys Val Gly Val Asp

245 250 255

Asp Val Arg Gly Ile Phe Phe Val Trp Ala Gln Lys Lys Ala Ala Ala

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 2

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaccctg gtcgtgaaag cagcattgca gcagttgcag aaagctatca gaaatttgat 60

ccgcgtgcat atctgcagaa taactatgtt ccgcctcgtg cagattttag ccgtgaagat 120

agcgttgttc cgtggaaact gcgttgtctg gccgaagcat ttgcaaccgg tgaaattcat 180

ggtcgtaccc tgattgatat tggtagcggt ccgaccattt atcagctgct gagcgcatgt 240

gaacattttg aagaaattat catgaccgat tttctggaag tgaatcgtca agaactgcgt 300

cgttggctgc gtggtgaacc gggtgcattt gattggagcc cgtatctgca gcatgtttgt 360

aaaattgaag gtaaaggtga aagctggcaa gaaaaagaac gtcgtctgcg tgaacgtgtt 420

aaacgtgttc tgccgattga tgttcatcag ccgaatccgt taggtagcgg tagcctggca 480

ccggaaccgg ttgatgcact ggttagcacc ttttgtctgg aagcagttag tccggatcgt 540

gcgagctttc agcgtgcact ggaaaacatt accacactgc tgaaacctgg tggtcatttt 600

ctgatgattg gtgccctgga agaaagtttt tatctggcag gcgaagcacg tctgagcgtt 660

gtgccggtta gcgaagaaga agttcgcgaa gcactgacca aaagcggtta tgaaattcgt 720

gattttcgca cctataccat gcctccgagc ctgaaagttg gtgttgatga tgttcgtggt 780

atcttttttg tttgggcaca gaaaaaagca gcagcacatc accatcatca tcac 834

<210> 3

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatga gcggtgcgga ccgtagcccg aacgcgggtg cggcgccgga tagcgcgccg 60

ggtcaggcgg cggtggcgag cgcgtaccaa cgtttcgaac cgcgtgcgta cctgcgtaac 120

aactatgcgc cgccgcgtgg tgacctgtgc aacccgaacg gtgttggtcc gtggaagctg 180

cgttgcctgg cgcagacctt tgcgaccggt gaagtgagcg gccgtaccct gatcgatatt 240

ggtagcggcc cgaccgttta ccaactgctg agcgcgtgca gccacttcga ggacatcacc 300

atgaccgatt ttctggaagt gaaccgtcag gagctgggcc gttggctgca agaggaaccg 360

ggtgcgttca actggagcat gtatagccag cacgcgtgcc tgatcgaagg caagggcgag 420

tgctggcagg acaaagaacg tcaactgcgt gcgcgtgtga aacgtgttct gccgattgat 480

gtgcatcagc cgcaaccgct gggtgcgggc agcccggcgc cgctgccggc ggatgcgctg 540

gttagcgcgt tttgcctgga ggcggttagc ccggacctgg cgagctttca acgtgcgctg 600

gatcacatca ccaccctgct gcgtccgggt ggccacctgc tgctgattgg tgcgctggag 660

gaaagctggt atctggcggg tgaagcgcgt ctgaccgtgg ttccggttag cgaggaagag 720

gtgcgcgagg cgctggttcg tagcggctac aaagtgcgtg atctgcgtac ctatattatg 780

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Claims

1. 一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54，其特征在于，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组质粒，其特征在于，表达含有编码权利要求1所述的苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的基因。

3.一种重组菌株，含有权利要求2所述的重组质粒。

4. 一种克隆表达权利要求1所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，构建表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的基因工程菌pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）

根据酶祖先序列重建技术挖掘出的祖先酶基因序列进行密码子优化后，全基因合成该基因序列，亚克隆到载体pET24a上，获得重组质粒pET24a-hPNMT54，将构建好的重组质粒pET24a-hPNMT54用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）；

步骤2，体外诱导表达

将苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）接入5ml含卡纳霉素的LB培养基中离心管中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1%的接种量接种到100ml含卡纳霉素的LB培养基中，当OD₆₀₀=0.4-0.8时，加入终浓度0.25 mM-1 mM的IPTG，15-30℃，150-250 rpm培养15-20h；

步骤3，苯乙醇胺-N-甲基转移酶的获得

体外诱导表达结束后于4℃，4000-8000 rpm离心10-15 min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体3次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心10-15 min收集上清液后，纯化处理，即得苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液。

5.权利要求4所得苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液在催化合成肾上腺素中的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化合成的温度为37℃、反应体系的pH 7.0。