CN114958727A

CN114958727A - 一种用于培养气道基底干细胞的组合物及其应用

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Publication number: CN114958727A
Application number: CN202210011084.3A
Authority: CN
Inventors: 李时悦; 曾海康; 叶永顺; 陈迪非; 陈焕杰; 罗钰龙; 刘明; 林丽琴; 宋新宇; 朱易平
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health Guangzhou Institute Of Respiratory Diseases; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health Guangzhou Institute Of Respiratory Diseases; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114958727B

Abstract

本发明涉及一种用于培养气道基底干细胞的组合物及其应用。所述组合物包含Y‑27632、A‑83‑01、CHIR‑99021、DMH‑1和SU5402。所述组合物加入到干细胞培养基，尤其适合用于培养气道基底干细胞，不需要饲养层或培养板包被处理，原代培养成功率高，细胞活性好，稳定性佳；使用本发明的培养基培养的原代气道基底干细胞，增殖速度快，且经传代多次后仍具有良好的增殖能力并保持良好的干细胞分化潜力；而且本发明提供的组合物以及培养基，具有配制方法简单、安全性高的优点，无外源性污染问题，用于培养气道基底干细胞程序简单、成本降低，应用价值高。

Description

一种用于培养气道基底干细胞的组合物及其应用

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于培养气道基底干细胞的组合物及其应用。

背景技术

干细胞可自我复制更新、并在适当条件下定向分化为其他的功能性细胞或组织器官，这种可以自我复制且分化成其他组织器官的能力在再生医学领域显示出巨大的应用潜力，如骨髓移植治疗白血病，就是最典型的干细胞治疗。无论基础研究或是临床应用，干细胞如何获得，如何体外扩增培养都是进行后续研究与应用最先需要解决的问题，因此针对不同类型的干细胞如何实现在体外快速增殖培养是干细胞培养技术研究的关键点。

气道基底干细胞作为一类可分化为多种气道上皮功能细胞的干细胞，在再生医学领域也有着巨大的应用前景，但是目前关于气道基底干细胞的培养技术研究较少，常采用两种方法：(1)常规培育法(Fulcher,M.L.,&Randell,S.H.(2013).Human nasal andtracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.Methods in molecularbiology(Clifton,N.J.),945,109-121；Maestre-Batlle,D.,et al.(2017).Novel flowcytometry approach to identify bronchial epithelial cells from healthy humanairways.Scientific reports,7,42214.)和(2)饲养层培育法(Gentzsch,M.,et al.(2017).Pharmacological Rescue of Conditionally Reprogrammed Cystic FibrosisBronchial Epithelial Cells.American journal of respiratory cell and molecularbiology,56(5),568-574；Ma,Q.,et al.(2018).Regeneration of functional alveoliby adult human SOX9⁺airway basal cell transplantation.Protein&cell,9(3),267-282.)。

常规培育法是使用培养支气管气道上皮细胞的培养基来培养气道基底干细胞，然而培养效果并不太理想：如经刷检方法获取的原代细胞数量不可控，刷头上带有的离体细胞数量较少时，采用上述培养基细胞增殖缓慢，克隆形成率低，导致原代培养失败率高，从而被动的增加了刷检次数；并且气道基底干细胞经传代多次后，细胞会出现增殖减慢乃至增殖停止，以及会出现分化现象，细胞形态发生明显的不良变化，具体表现为不贴壁、胞质异常扩张、异常分化等。由于存在上述不利于培养干细胞的关键问题，目前常规培育法培养气道基底干细胞早期培养失败率高，长期持续培养传代次数不多。

而饲养层培育法是模拟气道基底干细胞在肺内生长的微环境，以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，将气道基底干细胞覆盖在胚胎成纤维细胞上进行共培养。该方法由于使用的小鼠胚胎成纤维细胞存在外源性污染的隐患，故需要进行长时间的消毒灭菌处理，培养流程复杂，大大增加了气道基底干细胞的培养时间及成本。

因此，现有的气道基底干细胞的培养方法都存在较大缺陷，制约了气道基底干细胞的基础研究及临床应用。

发明内容

为解决上述现有气道基底干细胞培养处理繁琐、周期长、失败率高等关键技术问题，本发明提供一种用于培养气道基底干细胞的组合物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于培养气道基底干细胞的组合物。

本发明的第二个目的是提供上述组合物在培养气道基底干细胞方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于培养气道基底干细胞的培养基。

本发明的第四个目的是提供上述培养基在培养气道基底干细胞方面的应用。

本发明的第五个目的是提供一种气道基底干细胞培养基的制备方法。

为实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于培养气道基底干细胞的组合物，包含以下组分：Y-27632、A-83-01、CHIR-99021、DMH-1和SU5402。

优选地，所述Y-27632的工作浓度为3～35μM，A-83-01的工作浓度为0.5～5μM，CHIR-99021的工作浓度为0.5～5μM，DMH-1的工作浓度为0.5～5μM，SU5402的工作浓度为0.5～5μM。

更优选地，所述Y-27632的工作浓度为5～20μM，A-83-01的工作浓度为0.5～2μM，CHIR-99021的工作浓度为0.5～2μM，DMH-1的工作浓度为0.5～2μM，SU5402的工作浓度为0.5～2μM。

更优选地，所述Y-27632的工作浓度为10μM，A-83-01的工作浓度为1μM，CHIR-99021的工作浓度为1μM，DMH-1的工作浓度为1μM，SU5402的工作浓度为1μM。

一种用于培养气道基底干细胞的培养基，包含上述的组合物。

优选地，所述培养基还包含基础培养基，基础培养基包含组分1和组分2，所述组分1为DMEM培养基和Ham’s F12培养基，还包含胎牛血清或血清替代物；所述组分2为氢化可的松、表皮生长因子和胰岛素。

更优选地，所述组分1中DMEM培养基、Ham’s F12培养基和胎牛血清的体积比为(4～7):(2～7):1；DMEM培养基、Ham’s F12培养基和血清替代物的体积比为(4～7):(2～7):1。

更优选地，所述组分1中DMEM培养基、Ham’s F12培养基和胎牛血清的体积比为(4.5～6.4):(2.5～4.4):1；DMEM培养基、Ham’s F12培养基和血清替代物的体积比为(4.5～6.4):(2.5～4.4):1。

更优选地，所述血清替代物为人血小板裂解物。

更优选地，所述组分2中氢化可的松的工作浓度为0.1～2mg/L；所述表皮生长因子的工作浓度为0.1～2μg/L；所述胰岛素的工作浓度为0.1～2mg/L。

更优选地，所述组分2中氢化可的松的工作浓度为1mg/L；所述表皮生长因子的工作浓度为1μg/L；所述胰岛素的工作浓度为1mg/L。

另外，所述组分2还可包含抗生素，如青霉素和链霉素。

优选地，所述青霉素的工作浓度为50～150U/L，链霉素的工作浓度为50～150μg/L。

更优选地，所述青霉素的工作浓度为100U/L，链霉素的工作浓度为100μg/L。

上述组合物和/或上述培养基在培养气道基底干细胞方面的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种制备气道基底干细胞的方法，其特征在于，使用上述培养基重悬气道基底干细胞；置于细胞培养箱培养。

优选地，所述气道基底干细胞为来自人或犬的原代气道基底干细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的组合物以及培养基，具有配制方法简单、安全性高的优点，尤其适合用于培养气道基底干细胞，不需要饲养层或培养板包被处理，原代培养成功率高，细胞活性好，稳定性佳；使用本发明的培养基培养的原代气道基底干细胞，增殖速度快，可避免因刷检获取原代细胞数量少而出现细胞增殖缓慢，克隆形成率低，导致原代培养失败率高等问题。而且，经传代多次后仍具有良好的增殖能力并保持良好的干细胞分化潜力。同时，本发明提供的组合物以及培养基是适用于常规培养方法的，可避免饲养层培育法的外源性污染问题和程序复杂成本高的问题。因此，利用本发明的培养基培养气道基底干细胞，同时避免了现有常规培养法和饲养层培育法的缺陷问题，并同时具备两种方法的优势。

另外，培养基体系中，胎牛血清与人源血清替代物可相互替用，能同时满足气道基底干细胞的科研级与临床级应用。

附图说明

图1为采用配方1～8的培养基培养的P1～P5代气道基底干细胞形态观察结果；A～H分别对应配方1～8，其中A～B为P1代细胞，C～D为P4代细胞，E～F为P3代细胞，G～H为P2代细胞。

图2为采用配方1～8的培养基培养的P10～P30代气道基底干细胞形态观察结果；A～H分别对应配方1～8，其中A～B为P15代细胞，C～D为P30代细胞，E～F为P25代细胞，G～H为P10代细胞。

图3为采用配方9～13、23的培养基及BEpiCM培养基、Ex-Plus培养基培养的P5代气道基底干细胞形态观察结果；A～E分别对应配方9～13，F对应配方23，G对应培养基BEpiCM，H对应培养基Ex-Plus。

图4为采用配方14～22的培养基培养的P5代气道基底干细胞形态观察结果；A～I分别对应配方14～22。

图5为采用配方1～23的培养基及BEpiCM培养基、Ex-Plus培养基培养的气道基底干细胞的汇合度和细胞数量统计结果；A、B对应配方1～8；C、D对应配方9～13，E、F对应配方14～23，G、H对应培养基BEpiCM和Ex-Plus。

图6为采用配方9～13的培养基、BEpiCM培养基、Ex-Plus培养基、配方3的培养基及配方5的培养基培养的的P5代气道基底干细胞克隆形成染色观察结果；A～E分别对应配方9～13；F、G分别对应BEpiCM、Ex-Plus，H对应配方3；I对应配方5。

图7为采用配方9～13的培养基、BEpiCM培养基、Ex-Plus培养基、配方3的培养基及配方5的培养基培养的P15代气道基底干细胞克隆形成染色观察结果；A～E分别对应配方9～13；F、G分别对应BEpiCM、Ex-Plus，H对应配方3；I对应配方5。

图8为采用配方9～13的培养基、BEpiCM培养基、Ex-Plus培养基、配方3的培养基及配方5的培养基培养的气道基底干细胞克隆形成率统计结果；A为P5代细胞；B为P15代细胞。

图9为采用配方1～8的培养基培养的气道基底干细胞的分子标记物免疫荧光分析结果；A～H分对应配方1～8。

图10为采用配方1～8的培养基培养的早代气道基底干细胞，诱导分化的第21天，HE染色检测结果；A～H分别对应配方1～8；A～B为P2代细胞，C为P4代细胞，D为P6代细胞，E～F为P8代细胞，G为P5代细胞；H为P7代细胞；箭头所指的绒毛状结构即为在复层细胞团表层观察到的簇状分布的纤毛。

图11为采用配方1～8的培养基培养的晚代气道基底干细胞，诱导分化的第21天，HE染色检测结果；A～H分别对应配方1～8；A～B为P11代细胞，C为P28代细胞，D为P30代细胞，E为P14代细胞，F为P18代细胞，G为P9代细胞，H为P10代细胞；箭头所指的绒毛状结构即为在复层细胞团表层观察到的簇状分布的纤毛。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明所用的商用培养基为：支气管上皮细胞培养基(BepiCM)(货号：3211)购自赛恩斯瑟尔(ScienCell)；PneumaCult^TM-Ex Plus Medium(货号：05040，以下简写为Ex-Plus)购自STEMCELL。

实施例1气道基底干细胞培养基的配制方法

1、抑制剂组合物及基础培养基的配方如表1～表3所示，血清替代物为人血小板裂解物。

表1不同配比的抑制剂组合物及不同配比的基础培养基

表2四抑制剂组合物配方

表3超浓度范围抑制剂组合物配方

2、配制方法

按照表1～表3的配方进行配制，具体步骤如下：

(1)将化合物Y-27632溶解于水中，得到Y-27632溶液。

(2)将化合物A-83-01、CHIR-99021、DMH-1和SU5402分别溶解于二甲基亚砜后，再分别溶入水中，得到A-83-01溶液、CHIR-99021溶液、DMH-1溶液和SU5402溶液。

(3)将上述溶液经0.22μm无菌过滤器得到5种溶液的初滤液。

(4)再用0.1μm的无菌过滤器分别过滤初滤液，得到5种溶液的母液。

(5)将5种溶液的母液混匀，即得培养气道基底干细胞的抑制剂组合物。

(6)根据表1～表3所示的配方配制基础培养基，将抑制剂组合物加入基础培养基，混匀，即得到不同配方的气道基底干细胞培养基。

实施例2气道基底干细胞的分离、纯化与培养

以人或犬作为采集对象分离气道基底干细胞，具体包括以下步骤：

1、经纤维支气管镜刷检3～5级支气管上皮，使用15mL离心管回收前端毛刷，放入冰盒1小时内运送至实验室。

2、使用培养基充分冲洗毛刷，收集冲洗液离心。

3、用上一步所用培养基将细胞重悬后转移至T25细胞培养瓶，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

4、培养前三日，每日换液，以清除红细胞、未贴壁细胞和其他杂质从而纯化干细胞，细胞持续培养至生长至密度约50％～70％即可进行传代。

实施例3不同配方培养基对气道基底干细胞增殖能力的影响

1、实验方法

(1)气道基底干细胞培养

按照实施例2的步骤，分别用实施例1中的配方1～23的培养基、BEpiCM及Ex-Plus冲洗毛刷、重悬细胞，获取原代气道基底干细胞并进行培养。

于T25培养瓶内，分别用实施例1中的配方1～23的培养基、培养基BEpiCM及Ex-Plus培养气道基底干细胞，不添加饲养层细胞，常规每1～2日换液，待细胞生长至密度约80％～90％(一般为3～5日)即可消化传代，消化后计数，统计细胞数量和细胞活率，最后按适当细胞密度继续传代至T25瓶或接种至细胞培养板进行后续检测实验。

(2)形态观察

于显微镜下观察气道基底干细胞的生长形态与状态。

细胞贴壁情况的评判：细胞紧贴培养瓶底部，漂浮细胞数量极少，即为贴壁良好；细胞贴壁较紧致，漂浮细胞数量较少，即为贴壁一般；贴壁细胞较松弛，漂浮细胞数量较多，即为贴壁差。

细胞贴壁生长状态的评判：细胞生长时胞质清晰，无细胞碎片颗粒沉积，培养基洁净，即为细胞生长状态良好；细胞生长时胞质较清晰，可见少量细胞碎片颗粒沉积，培养基洁净，即为细胞生长状态一般；细胞生长时胞质较模糊，可见多量细胞碎片颗粒沉积，培养基轻微浑浊，即为细胞生长状态差。

细胞一致性的评判：约＞95％的细胞形态、状态相近，即为整体均一性极好；约85％～95％的细胞形态、状态相近，即为整体均一性良好；约75％～85％的细胞形态、生长状态相近，即为整体均一性一般；约＜75％的细胞形态、状态相近，即为整体均一性欠佳。

(3)汇合度与细胞数量检测

向48孔板每孔中加入1.5×10⁴个细胞，每孔使用不同配方的培养基培养，从细胞接板培养的第一天至第四天，每天利用Celigo全视野细胞分析仪扫描记录全孔细胞贴壁状态，导出数据并分析细胞的汇合度，汇合度＝细胞生长面积÷孔板底面积×100％。

于细胞培养的第四天，将上述孔板使用4％多聚甲醛固定并进行DAPI染色，染色完成后再次利用Celigo全视野细胞分析仪扫描全孔细胞，计数全孔细胞DAPI染色阳性数量(即全孔细胞数量)，导出数据并分析结果。

(4)克隆形成实验

向6孔板中加入500个细胞，每孔使用不同配方的培养基培养，每隔2～3日换液，持续培养至第9～12天后终止培养，使用4％多聚甲醛固定后结晶紫染色，利用Celigo全视野细胞分析仪扫描全孔，计数＞90000μm²克隆的数量，分析克隆形成率。

(5)原代细胞增殖能力检测

从获取原代气道基底干细胞(P0)开始，记录P0代传代时间、细胞数量与细胞活率，消化传代时，将P0代细胞全部接种至T75或T175瓶(即P1代)继续培养，并再次记录P1传代时间、细胞数量和细胞活率。

(6)细胞持续增殖能力与传代次数检测

从获取原代气道基底干细胞(P0)开始，利用T25培养瓶进行持续传代培养，每次传代时计算细胞总数与细胞活率，随后接种30～40万个细胞/瓶，统计细胞传代次数、细胞总量、细胞活率等结果。

2、实验结果

(1)对细胞形态的影响

如图1A～H所示，采用配方1～8的培养基培养的P1～P5代原代气道基底干细胞，细胞贴壁良好，生长状态良好；细胞间连接紧密，生长密度高，边缘清晰；细胞形态以近圆形、略不规则形为主，整体均一性极好。

如图2A～H所示，采用配方1～8的培养基持续培养气道基底干细胞36～112天，传代至P10～P30代，细胞贴壁良好，生长状态良好；细胞间连接紧密，生长密度较大，边缘清晰；仅少量细胞形态发生变化，但绝大部分细胞形态仍为近圆形、略不规则形，整体均一性良好。

如图3A～F及图4A～G、4I所示，采用配方9～13的培养基、配方14～20的培养基及配方22的培养基培养气道基底干细胞，细胞贴壁较好，但生长状态一般；细胞间连接较紧密，边缘尚清晰；较多细胞形态发生变异，主要表现出胞质扩张、条索生成、多角形突刺形成等状态，细胞整体均一性一般。

如图3G所示，采用BEpiCM培养基培养的气道基底干细胞，细胞贴壁差，生长状态一般；细胞间连接不紧密，生长密度低，以单个细胞生长为主，边缘尚清晰，细胞形态以略圆形或梭形为主，细胞整体均一性一般。因细胞整体情况欠佳，仅传2～3代即终止。

如图3H所示，采用Ex-Plus培养基培养的气道基底干细胞，细胞贴壁良好，生长状态一般；细胞间连接紧密，边缘尚清晰；细胞形态多以梭形或略不规则形为主，细胞整体均一性一般。因细胞整体情况一般，持续传8～10代即终止。

如图4H所示，采用配方21的培养基培养的气道基底干细胞，细胞贴壁差，生长状态差；细胞间连接欠紧密，生长密度低，边缘不清晰；较多细胞形态发生显著变异，主要表现为胞质扩张、条索生成等状态，还可见较多黑色颗粒沉积，考虑该抑制剂高浓度对细胞有明显的毒副作用。

综上结果表明，采用配方1～8的培养基培养的早代(≤P5代)气道基底干细细胞整体形态和状态均良好，持续传代培养至10～30代后，细胞仍能保持良好的形态和生长状态，整体均一性也较好。

(2)对汇合度及细胞增殖数量的影响

如图5A、B所示，采用配方1～8的培养基培养的气道基底干细胞在第四天时平均汇合度为96.08(91.04％～99.44％)，细胞数量平均为157129个/每孔(135235～173250)。如图5C～F所示，采用配方9～23的培养基培养的气道基底干细胞，在培养第四天时细胞平均汇合度为87.40％(65.52％～98.77％)，细胞平均数量为113591个/每孔(53650～159869)。如图5G所示，采用BEpiCM培养的气道基底干细胞，在培养第四天时细胞平均汇合度为43.53％(39.66～46.30％)，细胞平均数量为15663个/每孔(10954～20125)。如图5H所示，采用Ex-Plus培养的气道基底干细胞，在培养第四天时细胞平均汇合度为80.09％(75.12％～83.59％)，细胞平均数量为100247个/每孔(87250～128678)。

综上结果表明，采用配方1～8的培养基培养的细胞增殖能力强于配方9～23的培养基，配方9～23的培养基强于商用培养基BEpiCM和Ex-Plus。

(3)对克隆形成的影响

采用配方9～13的培养基、配方3的培养基、配方5的培养基及BEpiCM、Ex-Plus培养基培养气道基底干细胞，持续培养至第9～12天。

如图6A～E及图8A所示，配方9～13的培养基培养的P5代细胞平均克隆形成率为12.27％(8.67％～16.67％)，如图6F及图8A所示，培养基BEpiCM培养的P5代细胞平均克隆形成率为2.74％(2.22％～3.33％)。如图6G及图8A所示，培养基Ex-Plus培养的P5代细胞平均克隆形成率为20.74％(18.44％～22.89％)；如图6H～I及图8A所示，配方3的培养基、配方5的培养基培养的P5代细胞平均克隆形成率为23.52％(20.22％～27.33％)。

如图7A～E及图8B所示，配方9～13的培养基培养的P15代细胞平均克隆形成率为1.87％(0.00％～3.33％)，如图7F及图8B所示，培养基BEpiCM培养的P15代细胞平均克隆形成率为0.37％(0.00％～0.67％)。如图7G及图8B所示，培养基Ex-Plus培养的P15代细胞平均克隆形成率为9.19％(8.67％～11.78％)；如图7H～I及图8B所示，配方3的培养基、配方5的培养基培养的P15代细胞平均克隆形成率为12.81％(8.44％～16.67％)。

综上结果表明，与BEpiCM、Ex-Plus培养基和配方9～13的培养基相比，采用配方3的培养基、配方5的培养基培养的气道基底干细胞的克隆形成能力更强，且在晚代细胞中更为显著。

(4)对原代细胞扩增能力的影响

表4配方1～8的培养基、BepiCM培养基和Ex-Plus培养基采集原代细胞(P0～P1)扩增记录

表注：所有数值的平均值均由≥3个重复检测值求平均值获得，括号内数值为最低值与最高值。

如表4所示，采用配方1～8的培养基从获取原代细胞(P0)开始培养气道基底干细胞，P0代细胞平均传代时间为7.50天(4～12天)，平均细胞扩增数量为1.62×10⁶个(1.05×10⁶个～2.89×10⁶个)，平均细胞活率为97.05％(95.10％～98.78％)；细胞传代至P1代时，平均传代时间为4.00天(3～5天)，平均细胞扩增数量为8.03×10⁶(6.39×10⁶个～9.93×10⁶个)，平均细胞活率为95.91％(93.52％～98.46％)。

而采用BEpiCM培养基的P0代平均传代时间为8.33天(7～10天)，平均细胞扩增数量为0.47×10⁶个(0.37×10⁶个～0.65×10⁶个)，平均细胞活率为90.31％(88.23％～93.22％)，细胞传代至P1代时，平均传代时间为4.33天(4～5天)，平均细胞扩增数量为0.85×10⁶(0.64×10⁶个～1.07×10⁶个)，平均细胞活率为90.71％(89.22％～92.67％)。采用Ex-Plus培养的P0代平均传代时间为8.00天(7～9天)，平均细胞扩增数量为1.23×10⁶个(0.89×10⁶个～1.51×10⁶个)，平均细胞活率为95.68％(94.29％～97.26％)；细胞传代至P1代时，平均传代时间为4.33天(4～5天)，平均细胞扩增数量为5.70×10⁶个(4.56×10⁶个～6.75×10⁶个)，平均细胞活率为95.87％(94.56％～97.38％)。

综上结果表明，相对于商用培养基BEpiCM和Ex-Plus，采用配方1～8的培养基进行原代气道基底干细胞分离及扩增培养时，细胞的增殖能力更强，增殖速度更快，获得细胞数量更多，细胞活性更高，从原代细胞分离扩增到1×10⁶个细胞平均时间仅需约7.5天。

(5)对细胞持续增殖能力的影响

表5配方1～8的培养基、BepiCM培养基、Ex-Plus培养基持续培养传代记录表

如表5所示，采用配方1～8的培养基持续培养气道基底干细胞，细胞可持续传代培养至P10～P30代以上，细胞传代间隔时间为3～5天，传代获得的细胞数量平均为2.50×10⁶个(1.29×10⁶个～3.58×10⁶个)，平均细胞增殖倍次为7.03(3.96～11.93)平均细胞活率为94.23％(90.72％～97.72％)。

而采用BEpiCM持续培养气道基底干细胞，仅持续培养3代即终止，无法继续传代，细胞传代间隔时间为4～5天，传代获得的细胞数量平均为0.58×10⁶个(0.32×10⁶个～0.79×10⁶个)，平均细胞增殖倍次为1.76(0.92～2.25)，平均细胞活率为88.81％(85.45％～91.32％)；采用Ex-Plus持续培养气道基底干细胞，细胞持续培养至P10代即终止，无法继续传代，细胞传代间隔时间为3～5天，传代获得的细胞数量平均为1.54×10⁶个(0.67×10⁶个～2.15×10⁶个)，平均细胞活率为93.62％(90.77％～96.25％)。

综上结果表明，采用配方1～8的培养基培养的气道基底干细胞可持续多次传代(≥P30)，且传代多次后，细胞仍能保持良好的增殖能力与细胞活性。

实施例4气道基底干细胞的免疫荧光检测

1、实验方法

(1)气道基底干细胞培养

按照实施例2的步骤，分别用实施例1中的配方1～8的培养基冲洗毛刷、重悬细胞，获取原代气道基底干细胞并进行培养。

于T25培养瓶内，分别使用实施例1所述配方1～8的培养基培养气道基底干细胞，不添加饲养层细胞，常规每1～2日换液，待细胞生长至密度约80％～90％(一般为3～4日)即可消化，消化后计数细胞数量和细胞活率，最后按10⁴个/cm²的细胞密度接种至48孔细胞培养板。

(2)免疫荧光检测

细胞贴壁培养2日后，使用4％多聚甲醛固定，使用如表6所示的分子标记抗体进行免疫荧光检测。

免疫荧光检测的方法：吸除固定液，使用Triton X 100透化30分钟，5％BSA封闭30分钟，随后加入表6中所示的一抗，4℃孵育过夜。第二日吸除一抗，加入二抗37℃孵育30分钟。吸除二抗，加入DAPI染色15分钟，吸除DAPI，加入PBS防干燥。使用Celigo全孔视野分析仪进行全孔荧光扫描，统计每孔荧光标记阳性细胞的数量，分析阳性细胞率。

表6免疫荧光所用分子标记抗体

2、实验结果

如图9A～H所示，采用配方1～8的培养基培养的气道基底干细胞，气道基底干细胞特异性标记TP63、KRT5的阳性细胞率均在93％以上；细胞增殖标记Ki67的阳性细胞率平均为66.93％(49％～85％)。成纤维细胞标记α-SMA及气道基底干细胞分化标记MUC5AC、CC10、AC-TUB、MUC5B、SPC、AQP5、PDPN和HOPX表达弱阳性，且阳性细胞率均低于4％。

综上结果表明，采用配方1～8的培养基分离培养的气道基底干细胞，其细胞纯度可达93％以上，且增殖能力强、分化率低。

实施例5干细胞诱导分化能力检测

1、实验方法

(1)气道基底干细胞培养

于T25培养瓶内，分别使用实施例1所述配方1～8的培养基培养气道基底干细胞，不添加饲养层细胞，常规每1～2日换液，待细胞生长至密度约80％～90％(一般为3～4日)即可消化，消化后计数细胞数量和细胞活率。将气道基底干细胞按3×10⁵个/cm²细胞的密度接种至transwell的上室，使用配方1～8的培养基培养细胞。

(2)气液界面培养法诱导分化

待增殖3～4天后，吸除transwell上室的培养基后保持无液体状态，下室换用分化诱导液(PneumaCult^TM-ALI Medium，Stemcell，05001)；每隔2日下室换液，每隔5日使用PBS清洗上室黏液，保持气液界面培养21天。

(3)HE染色检测

在分化培养的第21天，将transwell上室膜切下后，进行石蜡包埋操作，主要流程包括乙醇梯度脱水，二甲苯梯度透明，石蜡渗透，将标本放置石蜡模具中包埋。

将上述石蜡包埋的样品切片，烤片30分钟至1小时，使用二甲苯脱蜡后乙醇梯度水化，随后依次进行苏木精染色、0.2％氨水返蓝以及伊红染色，最近进行脱水、透明、封固完成染色，染色完成后在普通光学显微镜下拍照记录。

2、实验结果

如图10～11所示，采用配方1～8的培养基培养不同代次的气道基底干细胞，经气液界面培养法能成功诱导分化出气道假复层纤毛柱状上皮体外模型，显微镜下可见簇状分布的纤毛，包括气道功能细胞如杯状细胞、柱状细胞、纤毛细胞等。

综上结果表明，采用配方1～8的培养基培养的不同代次的气道基底干细胞均可分化为良好气道功能上皮细胞，具有良好的分化潜能。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种用于培养气道基底干细胞的组合物，其特征在于，包含以下组分：Y-27632、A-83-01、CHIR-99021、DMH-1和SU5402。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Y-27632的工作浓度为3～35μM，A-83-01的工作浓度为0.5～5μM，CHIR-99021的工作浓度为0.5～5μM，DMH-1的工作浓度为0.5～5μM，SU5402的工作浓度为0.5～5μM。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述Y-27632的工作浓度为5～20μM，A-83-01的工作浓度为0.5～2μM，CHIR-99021的工作浓度为0.5～2μM，DMH-1的工作浓度为0.5～2μM，SU5402的工作浓度为0.5～2μM。

4.权利要求1～3任一所述组合物在培养气道基底干细胞或制备气道基底干细胞培养基方面的应用。

5.一种用于培养气道基底干细胞的培养基，其特征在于，包含如权利要求1～3任一所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含基础培养基，基础培养基包含组分1和组分2，所述组分1为DMEM培养基和Ham’s F12培养基，还包含胎牛血清或血清替代物；所述组分2为氢化可的松、表皮生长因子和胰岛素。

7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述组分1中，DMEM培养基、Ham’s F12培养基和胎牛血清/血清替代物的体积比为(4～7):(2～7):1。

8.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述组分2中氢化可的松的工作浓度为0.1～2mg/L；所述表皮生长因子的工作浓度为0.1～2μg/L；所述胰岛素的工作浓度为0.1～2mg/L。

9.权利要求4～7任一所述的培养基在培养气道基底干细胞方面的应用。

10.一种培养气道基底干细胞的方法，其特征在于，使用权利要求5～8任一所述的培养基培养气道基底干细胞。