CN114949050A - 一种促进血管健康的中药提取物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进血管健康的中药提取物组合物及其制备方法，该组合物按重量百分比计，包括以下成分：山楂叶提取物30％～50％、丹参提取物30％～50％、葛根提取物10％～30％；其中，所述丹参提取物中包括2％～10％的丹参酮提取物。采用现代化提取工艺，与传统工艺相比，更加充分的利用了药材的有效成分。并对提取物的有效成分含量进行严格控制质量，确保产品的稳定性。通过药效实验、分子机制、UPLC‑MS/MS成分鉴定等进一步验证了中药复方对心血管健康的有效性。

Description

一种促进血管健康的中药提取物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及中药组合物技术领域，更具体的说是涉及一种促进血管健康 的中药提取物组合物及其制备方法。
背景技术
高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病， 如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。
高脂血症可分为原发性和继发性两类。原发性与先天性和遗传有关，是 由于单基因缺陷或多基因缺陷，使参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂 蛋白异常所致，或由于环境因素(饮食、营养、药物)和通过未知的机制而 致。继发性多发生于代谢性紊乱疾病(糖尿病、高血压、黏液性水肿、甲状 腺功能低下、肥胖、肝肾疾病、肾上腺皮质功能亢进)，或与其他因素年龄、 性别、季节、饮酒、吸烟、饮食、体力活动、精神紧张、情绪活动等有关。
高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在 血管内皮沉积所引起的动脉硬化。尽管高脂血症可引起黄色瘤，但其发生率 并不很高；而动脉粥样硬化的发生和发展又是一种缓慢渐进的过程。因此在 通常情况下，多数患者并无明显症状和异常体征。不少人是由于其他原因进 行血液生化检验时才发现有血浆脂蛋白水平升高。
治疗方法主要有：
1)控制理想体重
许多流行病学资料显示，肥胖人群的平均血浆胆固醇和三酰甘油水平显 著高于同龄的非肥胖者。除了体重指数(BMI)与血脂水平呈明显正相关外， 身体脂肪的分布也与血浆脂蛋白水平关系密切。一般来说，中心型肥胖者更 容易发生高脂血症。肥胖者的体重减轻后，血脂紊乱亦可恢复正常。
2)运动锻炼
体育运动不但可以增强心肺功能、改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐量，而且 还可减轻体重、降低血浆三酰甘油和胆固醇水平，升高HDL胆固醇水平。
为了达到安全有效的目的，进行运动锻炼时应注意以下事项：
(1)运动强度通常以运动后的心率水平来衡量运动量的大小，适宜的 运动强度一般是运动后的心率控制在个人最大心率的80％左右。运动形式以中 速步行、慢跑、游泳、跳绳、做健身操、骑自行车等有氧活动为宜。
(2)运动持续时间，每次运动开始之前，应先进行5～10min的预备活动， 使心率逐渐达到上述水平，然后维持20～30分钟。运动完后最好再进行5～ 10min的放松活动。每周至少活动3～4次。
(3)运动时应注意安全保护。
3)戒烟
吸烟可升高血浆胆固醇和三酰甘油水平，降低HDL-胆固醇水平。停止吸 烟1年，血浆HDL-胆固醇可上升至不吸烟者的水平，冠心病的危险程度可降低 50％，甚至接近于不吸烟者。
4)饮食治疗
血浆脂质主要来源于食物，通过控制饮食，可使血浆胆固醇水平降低5％～ 10％，同时有助于减肥。并使降脂药物发挥出最佳的效果。多数Ⅲ型高脂蛋白 血症患者通过饮食治疗，同时纠正其他共存的代谢紊乱，常可使血脂水平降 至正常。
饮食治疗时机，主要取决于患者的冠心病危险程度和血浆LDL-胆固醇水 平。一般来讲，冠心病的危险程度越高，则开始进行饮食治疗的血浆LDL-胆 固醇水平就越低。
高脂血症的饮食治疗是通过控制饮食的方法，在保持理想体重的同时， 降低血浆中的LDL-胆固醇水平。
饮食结构可直接影响血脂水平的高低。血浆胆固醇水平易受饮食中胆固 醇摄入量的影响，进食大量的饱和脂肪酸也可增加胆固醇的合成。通常，肉 食、蛋及乳制品等食物(特别是蛋黄和动物内脏)中的胆固醇和饱和脂肪酸 含量较多，应限量进食。食用油应以植物油为主，每人每天用量以25～30g为 宜。家族性高胆固醇血症患者应严格限制食物中的胆固醇和脂肪酸摄入。
5)药物治疗
以降低血清总胆固醇和LDL胆固醇为主的有他汀类和树脂类。以降低血 清三酰甘油为主的药物有贝特类和烟酸类。
胆固醇(Cholesterol)是人体血脂的一种，约有三分之一由饮食摄取而来。 若胆固醇过高，将会增加罹患高血压、脑中风、心脏病、心肌梗塞等心血管 疾病的风险。
药物治疗以降低血清总胆固醇和LDL胆固醇为主的有他汀类和树脂类。 以降低血清三酰甘油为主的药物有贝特类和烟酸类。对于胆固醇过高，又没 有达到服药标准的民众来说，养成清单、少油炸、少肉多菜的饮食习惯、多 运动、选择合适的保健品，都是能有效降低血脂的方法。因此，如何开发一 种具有促进血管健康作用的中药提取物组合物的植物膳食补充剂具有深远的 社会意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种促进血管健康的中药提取物组合物及其制 备方法。采用现代化提取工艺，与传统工艺相比，更加充分的利用了药材的 有效成分。并对提取物的有效成分含量进行严格控制质量，确保产品的稳定 性。通过药效实验、分子机制、UPLC-MS/MS成分鉴定等进一步验证了中药 复方对心血管健康的有效性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进血管健康的中药提取物组合物，按重量百分比计，包括以下成 分：
山楂叶提取物30％～50％、丹参提取物30％～50％、葛根提取物10％～30％；
其中，所述丹参提取物中包括2％～10％的丹参酮提取物。
优选的，上述的一种促进血管健康的中药提取物组合物，按重量百分比 计，包括以下成分：
山楂叶提取物40％、丹参提取物40％、葛根提取物20％；
其中所述丹参提取物中包括2％的丹参酮提取物和38％的丹酚酸提取物。
优选的，上述的一种促进血管健康的中药提取物组合物，按质量百分比 计，所述山楂叶提取物中包括1％～3％的牡荆素鼠李糖苷，所述丹参酮提取物 中包括5～7％的丹参酮ⅡA，所述丹酚酸提取物包括11～14％的丹酚酸，所述 葛根提取物包括12％～15％的葛根素。
上述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，包括以下步 骤：
(1)山楂叶药材粗碎，物料比为12～8倍，加入60％～80％乙醇，，提取 2-3次，每次回流2-3h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，得山楂叶提取物；
(2)丹参药材切块并粉碎，物料比为1：6～10倍，80％～90％乙醇回流提 取2～3h，提取液浓缩到比重1.00～1.10，放凉静置12～24h，分离药渣、沉淀和 清液，
其中，沉淀65℃以下干燥，粉碎包装，得丹参酮提取物；药渣继续提取 2～3次，物料比为1：5～6倍，用70％～80％乙醇回流提取，每次2～3h，提取 液浓缩到比重1.10-1.15，和首次的清液合并，喷雾干燥，粉碎过筛混合包装， 为丹酚酸提取物，取丹参酮提取物和丹酚酸提取物按质量比为1:50～1:10混合 即得丹参提取物；
(3)葛根药材粗碎，物料比为1:4～5，加入50％～80％乙醇，提取2～3次， 每次回流2～3h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得葛根提取物；
(4)将山楂叶提取物、丹参提取物和葛根提取物按上述中药提取物组合 物中各原料比例混合，根据需要制备不同剂型的中药提取物组合物。
优选的，步骤(1)具体为：山楂叶药材粗碎，加入70％乙醇，分别采用 10倍、8倍量共提取2次，每次回流2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即 得山楂叶提取物。
醇提工艺的收率接近，两个提取工艺的提取物中牡荆素鼠李糖苷含量均 合格，70％醇提物含量高于60％醇提物，并且转移率也高。80％醇提考虑成本 和安全性，因此以70％乙醇作为提取溶剂
Figure BDA0003718798690000051
优选的，步骤(2)具体为：丹参药材切块，原料粉碎，第一次用6倍量 90％乙醇回流提取2h，提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清 液，沉淀65℃以下干燥，粉碎包装，为丹参酮提取物(A)；第二三次分别 用5倍、5倍量75％乙醇回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第 一次的清液合并，喷雾干燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物(B)。取 A、B按比例1:19混合即得丹参提取物。
上述优选的有益效果为：充分利用了丹参药材的醇提物，得到了较高含 量的丹参酮ⅡA、和丹酚酸B。
优选的，步骤(3)具体为：葛根药材粗碎，加入70％乙醇，采用6倍、 5倍、4倍量共提取3次，每次回流2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得 葛根提取物。
Figure BDA0003718798690000061
验证了醇提工艺，为提高提取物中葛根素含量尝试了不同醇浓度提取工 艺，结果显示：醇度越高的提取物葛根素含量越高，然而80％乙醇提取物含 量虽然最高，但是转移率低且成本高，因此还是以70％乙醇作为提取溶剂。
优选的，步骤(1)～(3)中所述干燥为减压干燥或喷雾干燥。
上述优选的有益效果为：喷雾干燥可以控制复合物的粒径大小，使样品 均匀度更高。减压干燥物料损失率少，得率升高。
优选的，步骤(4)中所述剂型为散剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.区别于传统工艺的创新工艺，使有效成分充分提取，得到更好的药效；
2.创新配方，配方精简，药效突出，有明显的改善血管健康功效；
3.质量可控，各个标志性成分含量稳定，重现性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中样品2耐受性考察曲线；
图2为本发明实施例中代表性节间血管图片；
图3为本发明实施例中代表性肠下静脉血管图片；
图4为本发明实施例中样品3耐受性考察曲线
图5为本发明实施例中样品4耐受性考察曲线
图6为本发明实施例中样品对PTK787造成的血管损伤的逆转作用；A代 表性节间血管图片，B节间血管总长度；
图7为本发明实施例中样品对肠下主静脉的促进作用；A代表性肠下静 脉血管图片，B肠下静脉长度统计；
图8为本发明实施例中复方样品质谱图；A正离子模式，B为负离子模式；
图9为本发明实施例中复方活性成分作用靶点与冠心病相关靶点的韦恩 (venn)分析；
图10为本发明实施例中复方治疗冠心病靶点的相互作用网络图；
图11为本发明实施例中复方治疗冠心病靶点的GO与KEGG通路分析；
图12为本发明实施例中原料样品2对NO释放量的影响；
图13为本发明实施例中原料样品2对VEGF释放量和VEGFR2的影响；
图14为本发明实施例中原料样品2对Erk1/2的影响；
图15为本发明实施例中原料样品2对Akt的影响；
图16为本发明实施例中原料样品2对eNOS的影响；
图17为本发明实施例中丹参提取工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
山楂叶300g，粗碎，加入70％乙醇，10倍、8倍量提取2次，每次回流 2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得山楂叶提取物。牡荆素鼠李糖苷含 量为3.4％。
实施例2
丹参药材300g切块，原料粉碎，第一次用6倍量90％乙醇回流提取2hr， 提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清液，沉淀65℃以下干 燥，粉碎包装，为丹参酮提取物(A)；第二三次分别用5、5倍量75％乙醇 回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第一次的清液合并，喷雾干 燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物(B)。取A、B按比例1:19混合即 得丹参提取物。丹参酮提取物的主要成分为丹参酮ⅡA含量为0.44％，丹酚酸 提取物的主要成分为丹酚酸B含量为12.19％。
实施例3
葛根300g药材粗碎，加入70％乙醇，6倍、5倍、4倍量提取3次，每次 回流2h，过滤合并提取液，浓缩，50℃真空干燥箱干燥，即得。葛根提取物 的主要成分为葛根素含量为12.59％。
实施例4
一种具有促进血管健康作用的中药提取物组合物制备方法，具体制备步 骤如下：
山楂叶、葛根、丹参(丹参酮提取物+丹酚酸提取物)
山楂叶300g，粗碎，加入70％乙醇，10倍、8倍量提取2次，每次回流 2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得山楂叶提取物。牡荆素鼠李糖苷含 量为3.4％。
丹参药材300g切块，原料粉碎，第一次用6倍量90％乙醇回流提取2hr， 提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清液，沉淀65℃以下干 燥，粉碎包装，为丹参酮提取物(A)；第二三次分别用5、5倍量75％乙醇 回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第一次的清液合并，喷雾干 燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物(B)。取A、B按比例1:19混合即 得丹参提取物。丹参酮提取物的主要成分为丹参酮ⅡA含量为0.44％，丹酚酸 提取物的主要成分为丹酚酸B含量为12.19％。
葛根300g药材粗碎，加入70％乙醇，6倍、5倍、4倍量提取3次，每次 回流2h，过滤合并提取液，浓缩，50℃真空干燥箱干燥，即得。葛根提取物 的主要成分为葛根素含量为12.59％。
取上述三种浸膏粉，按山楂叶提取物40％、丹参提取物40％、葛根提取 物20％复配即得。
实施例5
胶囊制备
山楂叶、葛根、丹参(丹参酮提取物+丹酚酸提取物)
山楂叶300g，粗碎，加入70％乙醇，10倍、8倍量提取2次，每次回流 2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得山楂叶提取物。牡荆素鼠李糖苷含 量为3.4％。
丹参药材300g切块，原料粉碎，第一次用6倍量90％乙醇回流提取2hr， 提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清液，沉淀65℃以下干 燥，粉碎包装，为丹参酮提取物(A)；第二三次分别用5、5倍量75％乙醇 回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第一次的清液合并，喷雾干 燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物(B)。取A、B按比例1:19混合即 得丹参提取物。丹参酮提取物的主要成分为丹参酮ⅡA含量为0.44％，丹酚酸 提取物的主要成分为丹酚酸B含量为12.19％。
葛根300g药材粗碎，加入70％乙醇，6倍、5倍、4倍量提取3次，每次 回流2h，过滤合并提取液，浓缩，50℃真空干燥箱干燥，即得。葛根提取物 的主要成分为葛根素含量为12.59％。
取上述三种浸膏粉，按山楂叶提取物40％、丹参提取物40％、葛根提取 物20％复配混合均匀，药粉过40目筛后，加入预胶化淀粉，滑石粉硬脂酸镁 混合均匀，装入胶囊，制成胶囊剂。
实施例6
片剂制备
山楂叶、葛根、丹参(丹参酮提取物+丹酚酸提取物)
山楂叶300g，粗碎，加入70％乙醇，10倍、8倍量提取2次，每次回流 2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得山楂叶提取物。牡荆素鼠李糖苷含 量为3.4％。
丹参药材300g切块，原料粉碎，第一次用6倍量90％乙醇回流提取2hr， 提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清液，沉淀65℃以下干 燥，粉碎包装，为丹参酮提取物(A)；第二三次分别用5、5倍量75％乙醇 回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第一次的清液合并，喷雾干 燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物(B)。取A、B按比例1:19混合即 得丹参提取物。丹参酮提取物的主要成分为丹参酮ⅡA含量为0.44％，丹酚酸 提取物的主要成分为丹酚酸B含量为12.19％。
葛根300g药材粗碎，加入70％乙醇，6倍、5倍、4倍量提取3次，每次 回流2h，过滤合并提取液，浓缩，50℃真空干燥箱干燥，即得。葛根提取物 的主要成分为葛根素含量为12.59％。
取上述三种浸膏粉，按山楂叶提取物40％、丹参提取物40％、葛根提取 物20％复配混合均匀，药粉过40目筛后，加入淀粉、硬脂酸镁混合均匀，压 制成片，包薄膜衣，制成片剂。
对比例1
按比例称取山楂叶30g、丹参30g、葛根30g。药材剪碎加900ml水熬煮 2h，取出水提液，药渣加720ml水煎煮1.5h，合并两次滤液，浓缩后减压干 燥得干燥物，粉碎过60目筛即得。
效用实验
一、对血管生成的促进作用
测试样品信息：
样品1对比例1制备物
样品2实施例4制备物
试剂
脱模剂，PTK787血管抑制剂。脱模剂(Pronase)为纯水配置成的1mg/mL 的溶液；PTK787为DMSO配置成的100μg/mL的母液。
实验动物
24hpf的WT斑马鱼，24hpf的血管绿色荧光转基因斑马鱼CZ55 (Tg(fli1a:EGFP))，来自山东第一医科大学实验室。
雌雄斑马鱼在照明14h/黑暗10h、28℃标准条件下分开饲养。在实验前 1d取健康性成熟的雌雄斑马鱼，按雌雄1∶1或者1∶2的比例放入产卵缸， 隔板分开。次日雌雄斑马鱼交配产卵，2h后获得受精卵。对受精卵进行消毒 和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mmol/L NaCl、0.17mmol/L KCl、 0.4mmol/L CaCl2、0.16mmol/L MgSO4)中，28℃下控光培养。
仪器
SCILOGEX迷你离心机(美国赛洛捷克)，minivertex涡旋仪(北京东陵 昌盛生物科技有限公司)，Olympμs倒置荧光显微镜(奥林巴斯日本有限公 司)，细胞培养板(24孔)，超声清洗仪，体式显微镜(重庆光电)，斑马 鱼养殖系统(上海海圣生物有限公司)。
方法
斑马鱼耐受性实验
取发育至24hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置空白对照、不同浓度药物组，提前加好养鱼水和药物(2mL 的体系采用先加1ml的养鱼水，再加药物，最后再补足剩余养鱼水，利用补 足的养鱼水达到混匀药物的目的)，将脱去卵膜的斑马鱼按照每孔10条滴入 孔中(每个浓度三个孔)，尽量控制残余水分的滴入，在28℃的恒温室中给 药后24h统计斑马鱼的发育及死亡情况。
样品对PTK787造成的节间血管损伤的逆转作用
取发育至24hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置空白对照、PTK787血管抑制剂的模型组(0.2μg/mL)、样品 1药物组(10μg/mL),提前加好养鱼水和药物(2mL的体系采用先加1ml的 养鱼水，再加药物，最后再补足剩余养鱼水，利用补足的养鱼水达到混匀药 物的目的)，将脱去卵膜的斑马鱼按照每孔10条滴入孔中，尽量控制残余水 分的滴入，在28℃的恒温室中给药后24h统计斑马鱼的发育及死亡情况，并 随机挑选8条斑马鱼在Olympμs IX83倒置荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血 管生长情况并拍照，使用Image Pro Plμs6.0进行各浓度组斑马鱼ISV(斑马鱼 体节间血管)长度和出芽数量(节间血管数量)进行定量统计，结果采用 GraphPad Prism9进行统计。血管相对生成率用下列公式计算：
血管相对生成率％＝(药物治疗组均值-造模组均值)/空白对照组均值) *100％
样品对正常血管(肠下主静脉)生长促进作用
取发育至72hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置药物空白对照组，样品1药物组(10μg/mL)，不同浓度的 样品2给药组，具体浓度设置见结果。将斑马鱼幼鱼按照每孔10条，尽量控 制残余水分的滴入，在28℃的恒温室中给药孵育24h，然后随机挑选8条斑 马鱼在Olympμs IX83倒置荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血管生长情况并拍 照，使用Image Pro Plμs 6.0进行各浓度组斑马鱼肠下主静脉(MSIVs)长度、 直径(直径测量采用肠下主静脉上5个不同点血管直径的平均值)和肠下静 脉丛(SIVs)面积定量统计，结果采用GraphPad Prism9进行分析。
数据统计
用GraphPad Prism9软件分析数据，方差分析和Dμnnett’s T-检验进行统 计学分析，统计结果用
Figure BDA0003718798690000131
表示，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表 示具有极显著性差异。
实验结果
斑马鱼耐受性实验结果
设置样品2给药浓度为为10、100、500、1000、1500、2000μg/mL，当 样品2的浓度在100μg/mL以上时，从显微镜下可以看到斑马鱼开始出现部分 发育畸形或死亡，见图1。因此后续样品2的药效评价的剂量设置在100μg/mL 以下。
样品对斑马鱼模型受损的血管生长的保护活性
使用PTK787造模显著造成斑马鱼的血管总长度和出芽数量的减小，与空 白组相比具有及显著性差异(P<0.0001)。
10μg/mL的样品1组显著促进了斑马鱼节间血管的生长长度和出芽数量。 样品2的高、中、低3个浓度均能显著促进斑马鱼节间血管的生长和数量。 以血管长度计，样品1组对斑马鱼血管的生长促进率为17.01％，样品2高中 低三个浓度对斑马鱼节间血管的生长促进率分别为32.25％、26.38％、23.53％。
表1不同浓度样品2对斑马鱼节间血管的影响
Figure BDA0003718798690000141
Figure BDA0003718798690000142
注：与对照组相比，####P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，*** P＜0.001。
样品2对斑马鱼模型正常血管生长的促进活性
结果如图3所示，样品1和样品2显著增加了肠下主静脉的长度和直径， 以斑马鱼肠下主静脉长度计，样品1对于正常斑马鱼血管的促进率为119.6％， 样品2高中低3个浓度正常血管促进率分别为121.3％、122.5％、119.7％。
表2不同浓度样品2对斑马鱼正常血管生长促进的影响
Figure BDA0003718798690000143
Figure BDA0003718798690000144
注：与对照组相比，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
结论
在本实验条件下，复方样品对斑马鱼损伤节间血管具有生长促进作用， 且能促进正常肠下静脉血管的生长。并且经过制备工艺改造后的复方样品， 在相同剂量下对斑马鱼模型受损的血管生长的保护活性的生长率、对于正常 斑马鱼血管的促进率均显著提高。
二、利用斑马鱼评价原料样品对血管生成的促进作用
测试样品信息：
对照1辅酶Q10
样品2实施例4制备物
样品3实施例1制备物
样品4实施例2制备物
分别用DMSO配置成相应浓度的母液，备用。
试剂
脱模剂，PTK787血管抑制剂。脱模剂(Pronase)为纯水配置成的1mg/mL 的溶液；PTK787为DMSO配置成的100μg/mL的母液。
实验动物
24hpf的WT斑马鱼，24hpf的血管绿色荧光转基因斑马鱼CZ55 (Tg(fli1a:EGFP))，来自山东第一医科大学实验室。
雌雄斑马鱼在照明14h/黑暗10h、28℃标准条件下分开饲养。在实验前 1d取健康性成熟的雌雄斑马鱼，按雌雄1∶1或者1∶2的比例放入产卵缸， 隔板分开。次日雌雄斑马鱼交配产卵，2h后获得受精卵。对受精卵进行消毒 和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mmol/L NaCl、0.17mmol/L KCl、 0.4mmol/L CaCl2、0.16mmol/L MgSO4)中，28℃下控光培养。
仪器
SCILOGEX迷你离心机(美国赛洛捷克)，minivertex涡旋仪(北京东陵 昌盛生物科技有限公司)，Olympμs倒置荧光显微镜(奥林巴斯日本有限公 司)，细胞培养板(24孔)，超声清洗仪，体式显微镜(重庆光电)，斑马 鱼养殖系统(上海海圣生物有限公司)。
方法
样品3、4的耐受性考察
取发育至24hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置空白对照、不同浓度药物组，提前加好养鱼水和药物(2mL 的体系采用先加1ml的养鱼水，再加药物，最后再补足剩余养鱼水，利用补 足的养鱼水达到混匀药物的目的)，将脱去卵膜的斑马鱼按照每孔10条滴入 孔中(每个浓度三个孔)，尽量控制残余水分的滴入，在28℃的恒温室中给 药后24h统计斑马鱼的发育及死亡情况。
样品2、3、4对PTK787造成的节间血管损伤的逆转作用
取发育至24hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置空白对照、PTK787血管抑制剂的模型组(0.2μg/mL)、CoQ10 组(10μg/mL),提前加好养鱼水和药物(2mL的体系采用先加1ml的养鱼水， 再加药物，最后再补足剩余养鱼水，利用补足的养鱼水达到混匀药物的目的)， 将脱去卵膜的斑马鱼按照每孔10条滴入孔中，尽量控制残余水分的滴入，在 28℃的恒温室中给药后24h统计斑马鱼的发育及死亡情况，并随机挑选8条 斑马鱼在Olympμs IX83倒置荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血管生长情况并 拍照，使用Image Pro Plμs6.0进行各浓度组斑马鱼ISV(斑马鱼体节间血管) 长度和出芽数量(节间血管数量)进行定量统计，结果采用GraphPad Prism9 进行统计。血管相对生成率用下列公式计算：
血管相对生成率％＝(药物治疗组-造模组均值)/空白对照组均值)*100％、
样品2、3、4对正常血管(肠下主静脉)生长促进作用
取发育至72hpf的CZ55(Tg(fli1a:EGFP))斑马鱼用1mg/mL的脱模剂 脱去卵膜，设置药物空白对照组，CoQ10的组(10μg/mL)，不同待试给药 组，将斑马鱼幼鱼按照每孔10条，尽量控制残余水分的滴入，在28℃的恒 温室中给药孵育24h，然后随机挑选8条斑马鱼在Olympμs IX83倒置荧光显 微镜下观察斑马鱼体节间血管生长情况并拍照，使用Image ProPlμs 6.0进行 各浓度组斑马鱼肠下主静脉(MSIVs)长度、直径(直径测量采用肠下主静脉上5个不同点血管直径的平均值)和肠下静脉丛(SIVs)面积定量统计，结果采 用GraphPadPrism9进行分析。
数据统计
用GraphPadPrism9软件分析数据，方差分析和Dμnnett’s T-检验进行统 计学分析，统计结果用
Figure BDA0003718798690000171
表示，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表 示具有极显著性差异。
实验结果
耐受性考察结果
设置样品3给药浓度为10、100、500、1000、1500、2000μg/mL，当样 品3的浓度在100μg/mL以上时，从显微镜下可以看到斑马鱼开始出现部分发 育畸形或死亡，见图4。因此后续样品3的药效评价的剂量设置在100μg/mL 以下。
设置样品4给药浓度同样品3，当样品4的浓度在100μg/mL以上时，从 显微镜下可以看到斑马鱼开始出现部分发育畸形或死亡，见图5。因此后续样 品4的药效评价的剂量设置在100μg/mL以下。
样品2、3、4对斑马鱼模型受损的血管生长的保护活性
结果如图6所示，使用PTK787造模显著造成斑马鱼的血管总长度和出芽 数量的减小，与空白组相比具有及显著性差异(P<0.0001)。
注：与对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，***P＜0.001，****P ＜0.0001
10μg/mL的CoQ10组显著促进了斑马鱼节间血管的生长。样品2、3、4 均能显著促进斑马鱼节间血管生长。样品2能显著促进斑马鱼节间血管长度 的生长。
样品2、3、4对斑马鱼模型正常血管生长的促进活性
结果如图7所示，CoQ10显著增加了肠下主静脉的长度，样品2、3均能 显著促进斑马鱼肠下主静脉的长度。样品4并未表现出对肠下主静脉长度的 促进。
注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001。
结论
3个品2、3、4均能显著促进损伤节间血管的生长，且能够促进正常肠下静 脉的生长。其中2号样品各指标均显著。
三、样品2化学检测分析、网络药理学分析及其作用机制研究
研究目的
通过UPLC-Q/TOF进行组学分析，对优选的原料样品初步定性，利用网络 药理学对优选的原料样品成分筛选并研究优选的原料样品对NO生成途径的 作用机制。
2.1测试样品
样品2葛根、山楂叶、丹参
用DMSO配置成相应浓度的母液，备用。
实验模型
原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自购自青旗(上海)生物技术发展 有限公司，经鉴定为原代细胞。
试剂
HUVECs细胞(p6，购自青旗(上海)生物技术发展有限公司)，胰酶 消化液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：1051101011200)， HUVECs细胞完全培养基(添加15％胎牛血清)，0.5％FBS培养基，DMEM 培养基(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：10611010150)，样品 2(青岛琛蓝)，D-PBS(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：20201103)， 一氧化氮测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，双蒸水。BCA蛋白质定 量试剂盒(碧云天，批号：070721210930)、上样缓冲液(碧云天，批号： 070121211008)，凝胶配置试剂盒(碧云天，批号：101821211026)，牛血 清白蛋白，脱脂奶粉批号：CAH4859)，1×TBST缓冲液，NC膜(批号： R1DB82932)，显影液，Erk1/2一抗(CST，#4348S)，Akt一抗(CST，#9272S)， VEGFR2一抗(CST，#4626S)，eNOS一抗(CST，#32027S)，p-Erk1/2 一抗(CST，#8544S)，p-Akt一抗(CST，#4060S)，p-eNOS一抗(CST， #9575S)，二抗(山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721))，Hμman VEGFA ELISA 测定试剂盒(ab119566)。
仪器
DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，BY-400C型医 用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)，HR1200-ⅡA2-E生物安全柜(青岛 海尔生物医疗股份有限公司)，XDS-1B倒置生物显微镜(重庆重光实业有限 公司)，371型二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，Eppendorf Research plμs移液枪(美国Eppendorf公司)，IX83+DP8荧光倒置显微镜(日 本OLYMPΜS公司)，ΜV2600紫外分光光度计(日本Shimadzμ公司)。涡 旋仪、脱色摇床(TS-300S，杭州米欧)、蛋白电泳仪(北京六一DYY-5D)、 DYY-5D蛋白转膜仪(北京六一)、超纯水过滤机(Milli-Q Advantage A10)、 制冰机、Azμre 400荧光成像系统，低温高速冷冻离心机(湘仪)，细胞刮、 制冰机(FMB-25)、DKT200-2金属浴(杭州米欧)、96孔板、SpectraMax iD5- 多功能酶标仪。
方法
基于UPLC-MS/MS的网络药理学分析
基于UPLC-MS/MS的样品2成分分析
仪器为SCIEXX500R UPLC-Q-TOF/MS，色谱柱为Shim-pack GIST(2μm, 3.0×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量：5μL，A相位0.1％甲酸 水，B相为甲醇，离子源温度：550℃，扫描范围：50-2000Da。
表3流动相比例
Figure BDA0003718798690000201
网络互作和富集分析
将基于UPLC-MS/MS的样品2成分分析鉴定得到的化合物导入String数 据库得到潜在化合物的靶点，构建靶点库；利用GeneCards数据库构建冠心 病的靶点库，最后获取两个靶点库的交集用于PPI互作分析，GO和KEGG 通路分析。
样品2的作用机制探究
样品2对HUVECs细胞NO释放的影响
细胞分组和干预
将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)置于15％完全培养液中于37℃、5％ CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期的HUVEC用0.25％胰酶消 化并收集细胞。以完全培养液(含15％FBS)制成细胞悬液进行细胞计数， 调整细胞密度为1×105个/ml接种于24孔板中。待细胞生长到80％左右，进 行饥饿处理24h，再用药物处理24h。实验分为Ctrl组和4、8、16μg/mL 3个 含样品2药物血清组，以上各组均设6个重复。用倒置相差显微镜观察各组 HΜVECs的生长情况及形态变化。药物处理24h后收集培养上清液 10000r/min离心1min，然后置于-20℃保存待测。
细胞培养上清液生化检测
用比色法检测培养液中NO的含量，操作步骤参照试剂盒说明进行在分光 光度计和酶标仪上检测并进行数据处理。
酶联免疫吸附实验(ELISA)
实验使用完全培养基生长期为指数分化期的细胞稀释成1×105个/mL细 胞悬液，以每孔2mL加入到6孔板中，然后转移至37℃、5％CO2培养箱中 生长。待细胞铺满6孔板底部约70％时，更换为无血清完全培养基，饥饿处 理12h；然后使用0.5％FBS完全培养基和样品2三个处理组(4、8、16μg/mL) 处理，对照组的DMSO含量与高浓度组剂量一致，然后加盖标记，转移至37℃、 5％CO2培养箱中继续生长。在24h收集细胞培养基，在4℃低温环境下以1200 rpm/min离心10分钟，将上清液保存至-20℃备用。利用ELISA检测VEGF 因子释放水平①按照说明书提示准备所有试剂、工作标准品和样品。②在 预先添加抗体的ELISA孔板中加入标准品和待测样品，用提供的胶带覆盖培 养板，并在室温下培2h。③弃原液并清洗，重复两次，共清洗三次。最后一 次清洗后，将清除液完全取出，并把板子倒过来，用干净的纸巾吸干。④向 每个孔中添加200μL人血管内皮生长因子结合物。用新的胶带盖住。室温下孵育2h。⑤重复步骤3中的清洗。⑥向每个孔中添加200μL基质溶液。避光 培养20分钟。⑦每孔添加50μL停止液。⑧处理好的样品应该在半小时内使 用酶标仪检测每个孔中样品的OD值，检测波长为450nm。⑨绘制标准曲线， 以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，根据标准曲线的公式计算VEGF的含量。
Western Blot蛋白检测
细胞干预
待细胞紧紧的附着在培养板底部后使用不含血清的培养基饥饿处理12h。 然后使用0.5％FBS完全培养基和样品2的9个处理组(Ctrl、4、8、16、LY294002 +16、Μ0126+16、LMNNA+16、PTK787+16、DHI)共同处理，对照组的 DMSO含量与高浓度组剂量一致，然后加盖标记，转移至37℃、5％CO2培养 箱中继续生长。
蛋白提取与电泳
将给药后24h的细胞从CO2培养箱中拿出，吸除培养液，用4℃遇冷的PBS 清洗2次，清洗完成后加如1mL的4℃预冷的PBS，用细胞刮将细胞刮下， 将细胞转移至1.5mL的ep管中，4℃下10000rpm离心10min，离心后弃去上 清，加入已配置好的细胞裂解液，每管细胞200μL，在冰上裂解30min，期间 上下反复颠倒ep管，使裂解充分。裂解完成后4℃下10000rpm离心25min， 吸出150μL的液体到新的遇冷的离心管中，然后测定蛋白浓度。
取1.2mL蛋白标准配置液加入到一管标准蛋白中，形成25μg/μL的蛋白 标准溶液，-20℃可长期保存；取适量25mg/mL的蛋白标准溶液配置成0.5μg/μL 的蛋白标准溶液，使用溶剂为PBS。BCA工作液配制，将BAC是试剂盒中的 A液和B液按照50：1的比例配置成工作液。按照试剂盒的要求配制蛋白标 准品梯度浓度(0、1、2、4、8、12、16、20μL，用PBS补足到20μL体系)， 形成浓度梯度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL的标准品浓度 梯度。待测试的每管样品的蛋白吸取8μL后用PBS补足到20μL，然后每孔加 入200μL配制好的BCA工作液，37℃孵育30min后用酶标仪测量吸光度。
取适量120μL的上清蛋白样品加入40μL的上样缓冲液混匀。用金属浴煮 沸10min缓慢恢复至室温放置-20℃保存。
电泳
将胶板放置于电泳槽内，分别向电泳内外槽中倒入1×电泳液，内槽电泳 液务必要高于胶的上边缘，竖直拔掉梳子，在第一个孔中加入6μL marker， 待测样品按照浓度顺序从第二个孔中依次加入，剩余各孔使用杂蛋白进行配 平，防止条带在电泳过程中偏移。电泳以60V电压将溴酚蓝跑出浓缩胶，待 marker出现后改用100V电压继续电泳，终止时间一般在溴酚蓝到达玻璃板 边缘时即可。准备一个磁盘，向里面倒入转膜液，将转膜时所用的转膜夹和 海绵、滤纸一起放置在转膜液中，充分润湿，按照白色转膜板-海绵-滤纸-NC膜-分离胶-滤纸-海绵-黑色转膜板的顺序整理好转膜夹装置，每一层都要对齐， 并赶走气泡；取出玻璃板，轻轻撬开，在玻璃板上面剥离开上端的浓缩胶， 然后小心取下分离胶，平铺在NC膜的上面(靠近白色转膜板)，分离胶与 NC膜之间不允许存在气泡，否则蛋白无法转移到膜的表面；将转膜夹放置于 转膜槽中，加满转膜液，放置于盛放碎冰的保温箱内，转膜电流以220mA恒 流进行，转膜时间根据目的蛋白分子量大小决定。使用双蒸水清洗一遍，根据marker标记的位置将目的蛋白区域的膜裁剪，放置于孵育盒中，再次使用 双蒸水清洗三遍。将配置好的5％脱脂奶粉或者5％BSA倒入上述孵育盒中， 并在在摇床上封闭1h。倒掉封闭液，将NC膜在1x TBST中清洗三次，每次 10分钟。将NC膜正面朝上，按照抗体供应商提供的稀释比例，使用5％BSA 稀释一抗并倒入孵育盒内，4℃冰箱过夜处理。取出经一抗孵育过夜的NC膜， 五次TBST洗涤，每次约5分钟，随后按照1：10000的比例使用5％脱脂奶 粉稀释的二抗溶液，加入到孵育盒内，室温孵育2h。取出二抗孵育后的NC 膜，三次TBST洗涤，每次约10分钟，将洗膜液沥干，平放于显影盘中，取 化学发光显影A液和B液各1mL混合，滴加在膜的表面孵育1分钟，然后 沥干后放置于显影仪中，保存扫膜结果使用Image-J软件进行灰度值计算。
数据分析方法
实验获得的所有数据均在GraphPad Prism 9中进行统计分析，统计的数 据用mean±SD表示，统计方法依据One-Way ANOVA进行，p＜0.05为显 著性差异，p＜0.01为极显著性差异。
结果
UPLC-MS/MS成分鉴定
总共37个化合物被鉴定出，具体结果见图8和表4。
表4复方成分鉴定
Figure BDA0003718798690000241
Figure BDA0003718798690000251
Figure BDA0003718798690000261
Figure BDA0003718798690000271
Figure BDA0003718798690000281
复方活性成分—心衰疾病靶点网络构建
在Genecards数据库初步筛选出7682个候选基因，取Relevance score值 较高(大于等于30)的结果，共得到393个疾病靶点，将得到的疾病靶点与 复方靶点导入venny2.1.0取交集，得到56个共同靶点，即为复方治疗冠心病 的潜在作用靶点，并绘制韦恩图(图9)。
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建
为了进一步探讨复方对冠心病的治疗机制，基于PPI的关联，将56个复 方参与冠心病相关的靶点导入STRING数据库以获得蛋白质相互作用信息， 然后在Cytoscape 3.9.0软件上构建复方与治疗心衰相关靶点的PPI网络(图 10)。复方疾病靶点的PPI网络包含56个节点和668条交互关系。节点颜 色的深浅与大小代表该节点的Degree值的大小，颜色越深，节点越大代表 Degree值越大。利用Cytoscape软件分析了复方PPI网络拓扑学的特征，其 中涉及的关键靶点包括ALB、VEGFA、TNF、IL6、KDR、MMP9、CASP3 等。
富集分析结果
将复方-冠心病-基因数据导入Metascape数据库进行GO及KEGG分析。 共得出392个GO条目与146条KEGG通路。在GO功能富集的392个生物 学功能条目中主要涉及蛋白质磷酸化的正向调控、正向调节细胞迁移、激素 反应、血液循环肽酶的活动、内质网腔、外部封装结构、复杂受体等功能。 在146条KEGG通路富集中，涉及PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、 流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等经典 通路。将GO三个部分及KEGG主要富集进行气泡图展示(图11)。
表5GO条目注释
Figure BDA0003718798690000291
样品2对HUVECs细胞NO释放水平的影响
给予4、8、16μg/mL样品2处理HUVECs细胞，与空白对照组比较16 μg/mL有显著性差异(P<0.01)，而4、8μg/mL则无显著性变化，见图12。
注：与对照组相比，*P<0.05
表6样品2对NO释放量的影响
Figure BDA0003718798690000292
Figure BDA0003718798690000301
样品2对VEGFR2蛋白和VEGF分泌水平的影响
VEGF因子就像是血管生成过程中的一个开关，检测该生长因子是否受到 样品2的影响。采用酶联免疫吸附方法测定经样品2处理后培养基中VEGF 蛋白的分泌水平。如图13-A所示，随着样品2浓度的提高，细胞中的VEGF 生长因子的释放量逐渐增加。
样品2对VEGFR2蛋白的影响结果如图13-B所示，使用不同浓度的样品 2处理HUVECs细胞24h，各组间蛋白的表达量发生了改变，在8、16μg/mL 时，与对照组相比两组蛋白表达量出现显著性上调，且具有统计学显著性差 异；而4μg/mL的低浓度并未表现出统计学差异。
为了进一步证明VEGF通路与样品2诱导体外促血管生成过程相关，使用 了VEGFR2蛋白抑制剂PTK787，以观察样品2在VEGF信号通路中发挥的 作用。VEGFR2蛋白表达情况如图13-C所示，HΜVEC细胞在经过PTK787 抑制剂处理0.5h，再同时给予16μg/mL的样品2处理24h后，VEGFR2蛋 白表达量发生了改变。与空白对照组相比，16μg/mL的样品2能够显著上调VEGFR2的表达量，但用PTK787和16μg/mL样品2共同处理,VEGFR2的蛋 白表达量有所下降，一定程度上说明了PTK787可以阻断样品2诱导VEGFR2 蛋白的表达量。实验结果表明，样品2诱导的体外血管生成的过程中VEGF 信号通路可能发挥了一定的作用。
表7样品2对VEGF分泌量的影响
Figure BDA0003718798690000302
Figure BDA0003718798690000311
样品2对Erk1/2蛋白的影响
样品2对Erk1/2蛋白磷酸化的影响结果如图14-A所示，使用不同浓度的 样品2处理HΜVECs细胞24h，各组间蛋白的表达量发生了改变，在4、8、 16μg/mL时，与对照组相比三组蛋白磷酸化水平出现显著性上调，且具有统 计学显著性差异。
为了进一步证明Erk通路与样品2诱导体外促血管生成过程相关，使用了 Erk1/2蛋白抑制剂Μ0126，以观察样品2在Erk信号通路中发挥的作用。Erk1/2 蛋白磷酸化情况如图14-B所示，HΜVEC细胞在经过Μ0126抑制剂处理0.5h， 再同时给予16μg/mL的样品2处理24h后，p-Erk1/2蛋白表达量发生了改变。 与空白对照组相比，16μg/mL的样品2能够显著上调p-Erk1/2的表达量，但 用Μ0126和16μg/mL样品2共同处理，p-Erk1/2的蛋白表达量有所下降，与 只用16μg/mL样品2处理组相比具有统计学差异，说明了Μ0126可以阻断样 品2诱导Erk1/2蛋白的磷酸化。实验结果表明，样品2诱导的体外血管生成 的过程中Erk信号通路可能发挥了一定的作用。
注：与对照组相比，**P<0.01，与样品216μg/mL组相比，##P<0.01。
样品2对Akt蛋白的影响
样品2对Akt蛋白磷酸化的影响结果如图15-A所示，使用不同浓度的样 品2处理HUVECs细胞24h，各组间蛋白的表达量发生了改变，在4、8、16 μg/mL时，与对照组相比16μg/mL组蛋白磷酸化水平出现显著性上调，且具 有统计学显著性差异。
为了进一步证明Akt通路与样品2诱导体外促血管生成过程相关，使用 了Akt蛋白抑制剂LY294002，以观察样品2在Akt信号通路中发挥的作用。 Akt蛋白磷酸化情况如图15-B所示，HΜVEC细胞在经过LY294002抑制剂 处理0.5h，再同时给予16μg/mL的样品2处理24h后，p-Akt蛋白表达量发 生了改变。与空白对照组相比，16μg/mL的样品2能够显著上调p-Akt的表达 量，但用LY294002和16μg/mL样品2共同处理，p-Akt的蛋白表达量有所下 降，一定程度上说明了LY294002可以阻断样品2诱导Akt蛋白的磷酸化。实 验结果表明，样品2诱导的体外血管生成的过程中Akt信号通路可能发挥了 一定的作用。
样品2对eNOS蛋白的影响
样品2对eNOS蛋白磷酸化的影响结果如图16-A所示，使用不同浓度的 样品2处理HΜVECs细胞24h，各组间蛋白的表达量发生了改变，在4、8、 16μg/mL时，与对照组相比三组蛋白磷酸化水平出现显著性上调，且具有统 计学显著性差异。
为了进一步证明eNOS通路与样品2诱导体外促血管生成过程相关，使用 了eNOS蛋白抑制剂L-MNNA，以观察样品2在eNOS信号通路中发挥的作 用。eNOS蛋白磷酸化情况如图16-B所示，HUVEC细胞在经过L-MNNA抑 制剂处理0.5h，再同时给予16μg/mL的样品2处理24h后，p-eNOS蛋白表 达量发生了改变。与空白对照组相比，16μg/mL的样品2能够显著上调p-eNOS 的表达量，但用L-MNNA和16μg/mL样品2共同处理，p-eNOS的蛋白表达 量有所下降，与只用16μg/mL样品2处理组相比具有统计学差异，说明了 L-MNNA可以阻断样品2诱导eNOS蛋白的磷酸化。实验结果表明，样品2 诱导的体外血管生成的过程中eNOS信号通路可能发挥了一定的作用。
结论
原料样品2显著促进NO和VEGF的释放水平，能显著上调VEGFR2蛋白表 达，且能促进Erk1/2、Akt和eNOS的磷酸化水平。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。 对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述 的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种促进血管健康的中药提取物组合物，其特征在于，按重量百分比计，包括以下成分：
山楂叶提取物30％～50％、丹参提取物30％～50％、葛根提取物10％～30％；
其中，所述丹参提取物中包括2％～10％的丹参酮提取物。
2.根据权利要求1所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物，其特征在于，按重量百分比计，包括以下成分：
山楂叶提取物40％、丹参提取物40％、葛根提取物20％；
其中所述丹参提取物中包括2％的丹参酮提取物和38％的丹酚酸提取物。
3.根据权利要求2所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物，其特征在于，按质量百分比计，所述山楂叶提取物中包括1％～3％的牡荆素鼠李糖苷，所述丹参酮提取物中包括5～7％的丹参酮ⅡA，所述丹酚酸提取物包括11～14％的丹酚酸B；所述葛根提取物包括12％～15％的葛根素。
4.如权利要求3所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)山楂叶药材粗碎，物料比为1：8～12倍，加入60％～80％乙醇，提取2-3次，每次回流2-3h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，得山楂叶提取物；
(2)丹参药材切块并粉碎，物料比为1：6～10倍，80％～90％乙醇回流提取2～3h，提取液浓缩到比重1.00～1.10，放凉静置12～24h，分离药渣、沉淀和清液，
其中，沉淀65℃以下干燥，粉碎包装，得丹参酮提取物；药渣继续提取2～3次，物料比为1：5～6倍，用70％～80％乙醇回流提取，每次2～3h，提取液浓缩到比重1.10-1.15，和首次的清液合并，喷雾干燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物，取丹参酮提取物和丹酚酸提取物按质量比为1:50～1:10混合即得丹参提取物；
(3)葛根药材粗碎，物料比为1:4～5，加入50％～80％乙醇，提取2～3次，每次回流2～3h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得葛根提取物；
(4)将山楂叶提取物、丹参提取物和葛根提取物按权利要求3中所述中药提取物组合物中各原料比例混合，根据需要制备不同剂型的中药提取物组合物。
5.根据权利要求4所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：山楂叶药材粗碎，加入70％乙醇，分别采用10倍、8倍量共提取2次，每次回流2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得山楂叶提取物。
6.根据权利要求4所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为：丹参药材切块，原料粉碎，第一次用6倍量90％乙醇回流提取2h，提取液浓缩到比重1.05，放凉静置12h，分离沉淀和清液，沉淀65℃以下干燥，粉碎包装，为丹参酮提取物；第二三次分别用5倍、5倍量75％乙醇回流提取，每次2h，提取液浓缩到比重1.10，和第一次的清液合并，喷雾干燥，粉碎过筛混合包装，为丹酚酸提取物。取丹参酮提取物和丹酚酸提取物按质量比1:19混合即得丹参提取物。
7.根据权利要求4所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：葛根药材粗碎，加入70％乙醇，采用6倍、5倍、4倍量共提取3次，每次回流2h，过滤合并提取液，浓缩，干燥，即得葛根提取物。
8.根据权利要求4所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中所述干燥为减压干燥或喷雾干燥。
9.根据权利要求4所述的一种促进血管健康的中药提取物组合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述剂型为散剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
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