CN114945812A - 基于激光的从微毛细管阵列回收单细胞的设备和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了从微毛细管阵列回收样品内容物的系统和方法。所述微毛细管阵列包括多个微毛细管孔。定位激光以靶向多个微毛细管孔中的第一微毛细管孔。激光在所述第一微毛细管孔处脉冲至少一次。提取来自所述第一微毛细管孔的所述内容物，回收所述第一微毛细管孔的所述内容物。
Description
发明背景
生物样品的分析(包括蛋白质、核酸、碳水化合物和其他重要生物分子的鉴定、表征和重新工程化)极大地受益于样品数量的扩大和样品大小的缩小。例如，生物材料的二维微阵列(如DNA微阵列)已经使涉及处理样品和检测结果的多路复用方法的高通量筛选方法的发展成为可能。
虽然此类技术提供关于特定样品的分析信息，例如溶液中特定生物分子的存在和潜在的量或特定核酸或多肽的序列，但它们通常不允许在未失活或以其他方式损坏目的样品的情况下回收通过测定鉴定的生物样品。此外，允许回收的方法通常基于使用荧光或其他标签。
已经在微阵列测定技术的背景下采用的荧光和其他方法具有它们的局限性。细胞和/或分子必须发出荧光，以便它们能够使用此类荧光方法进行检测。因此，这些方法需要标记，为测定设置和开发增加了额外的时间和精力。在高通量技术的背景下，此类额外的时间和精力可能非常显著，尤其是在处理数十万甚至数百万个样品时。
因此，持续需要开发具有高通量能力的改进的微尺度筛选和分析方法、系统和装置，且特别是能够分析和回收样品而不需要预先贴标签或预先标记分析的样品的方法和系统。此类方法可用于许多应用，包括酶工程化、ELISA测定、稳定性测定和细胞生长测量。
虽然不同团队已经尝试了用于样品回收的其他方法，但仍然需要更有效和更好的方法(参见，例如，美国专利公开第2017/0028376号、美国专利公开第2015/0072897号、美国专利公开第2017/0028376号和美国专利第8,105,554号，所有这些都通过引用整体并入本文中)。
微毛细管阵列最近已被用于对大量生物样品进行高通量分析和蛋白质工程化的方法中，例如在被称为“微毛细管单细胞分析和激光提取”或“μSCALE”的方法中。参见Chen等人，(2016)Nature Chem.Biol.12:76–8。这种方法依赖于微毛细管阵列内单个细胞的空间分离，并因此能够对微毛细管阵列的每个微毛细管内的单独样品进行重复成像、细胞生长和蛋白质表达。因此，该技术能够对微毛细管阵列内的数百万或几百万个样品进行大规模平行、定量生物化学和生物物理学测量，例如，在分析从在整个阵列中分布的酵母、细菌或其他合适的细胞表达的数百万或几百万种蛋白质变体中。有利地，该方法允许对多路复用样品进行同步时间分辨动力学分析，以及基于靶向的表型特征对那些细胞进行分选。
在美国专利申请公开第2016/0244749 A1号中也报道了用于对生物变体群体进行定量生物化学和生物物理学分析的μSCALE方法和设备的开发，该专利申请公开通过引用整体并入本文中。然而，根据μSCALE方法提取所期望微毛细管的内容物需要在每个样品中包括辐射吸收物质，并将来自脉冲激光的电磁辐射引导到该物质中，从而增加了提取方法的复杂性。另外，在微腔阵列中筛选生物变体的早期方法依赖于将微粒添加到阵列样品中，以部分或完全抑制电磁辐射传输到样品中或样品外，以使从缺乏所期望结合活性的微腔发射的信号最小化。参见美国专利申请公开第2014/0011690 A1号。
此外，虽然此类电磁辐射传输方法通常允许回收由测定鉴定的生物样品而不会失活或以其他方式损坏所鉴定的样品，但是此类方法要求细胞在回收后是活的。一旦从微毛细管中重新取出活细胞，就将活细胞培养较长时间(例如，几天)，然后进行测序，这进一步消耗了大量的时间和精力。因此，这些方法需要在潮湿环境(例如，容纳裂解混合物的孔)中回收活细胞以防止细胞腐烂。
本背景部分中所公开的信息仅用于增强对本发明的一般背景的理解，且不应被视为对该信息构成本领域技术人员已知的现有技术的承认或任何形式的启示。
发明概述
有利地，本公开中详细描述的系统和方法解决了上文详细描述的本领域的缺点。提供了基于激光的从微毛细管阵列回收单细胞内容物的系统和方法。定位激光以靶向所述微毛细管阵列的多个微毛细管孔中的第一微毛细管孔。所述激光朝向所述第一微毛细管孔脉冲至少一次。提取来自所述第一微毛细管孔的内容物，其回收或允许回收所述第一微毛细管孔的所述内容物。
在一方面，本公开提供了从包括多个微毛细管孔的微毛细管阵列回收样品内容物的方法，其中所述方法包括：(A)定位激光以靶向所述多个微毛细管孔中的第一微毛细管孔；(B)使所述激光朝向所述第一微毛细管孔脉冲至少一次；和(C)从所述第一微毛细管孔提取内容物，从而回收所述第一微毛细管孔的内容物。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(A)定位所述激光之前，鉴定所述第一微毛细管孔。在一些实施方案中，(B)使所述激光脉冲还包括使所述激光朝向所述第一微毛细管孔的一个或多个子部分进行脉冲。在一些实施方案中，(B)使所述激光脉冲还包括使所述激光脉冲超过一次，并使所述激光在所述第一微毛细管孔的多于一个的子部分中进行脉冲。
在一些实施方案中，所述内容物包含一个或多个完整细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个完整细胞包括哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个完整的细胞不再能够进行细胞生长。
在一些实施方案中，(C)提取和回收还包括在回收所述内容物期间对所述内容物成像。
在一些实施方案中，使用激光导引系统进行(A)定位所述激光。在一些实施方案中，所述激光导引系统包括激光、激光扫描组件、扫描透镜系统和镜筒透镜。在一些实施方案中，所述激光导引系统是检流计系统。在一些实施方案中，所述激光导引系统是ScannerMAX Compact-506RE系统。在一些实施方案中，所述激光扫描组件是检流计镜。
在一些实施方案中，从所述激光发射的光的波长范围为213纳米(nm)至1380nm。在一些实施方案中，从所述激光发射的光的波长为355nm、514nm、532nm或1064nm。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列与样品台连接。在一些实施方案中，在(A)定位所述激光期间，所述样品台以比所述激光导引系统更慢的速率移动。
在一些实施方案中，所述激光脉冲范围为100次脉冲/秒至1000次脉冲/秒，包括例如20,000Hz至120,000Hz和总共10-1000次脉冲。在一些实施方案中，所述激光脉冲为20,000Hz至120,000Hz和总共10-1000次脉冲。在一些实施方案中，所述激光脉冲为500次脉冲/秒。
在一些实施方案中，(A)定位所述激光还包括使用激光导引系统对所述第一微毛细管孔的内容物成像。
在一些实施方案中，所述激光对2个子部分至10个子部分范围内的所述第一微毛细管孔的多个子部分进行脉冲。在一些实施方案中，所述激光对所述第一微毛细管孔的5个子部分进行脉冲。在一些实施方案中，所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行5次脉冲至15次脉冲范围内的脉冲。在一些实施方案中，所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行10次脉冲的脉冲。在一些实施方案中，每个激光脉冲具有5纳秒(ns)至20ns范围内的持续时间。在一些实施方案中，每次激光脉冲的持续时间未15ns。在一些实施方案中，所述激光对所述第一微毛细管孔的5个子部分进行脉冲，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行10次脉冲的脉冲，并且其中每次激光脉冲的持续时间为15ns。
在一些实施方案中，所述激光导引系统还包括一个或多个空间光调制器，以改变从所述激光发射的光束的形状。在一些实施方案中，所述激光导引系统还包括数字微镜器件(DMD)，以改变从所述激光发射的光束的形状。在一些实施方案中，(C)提取和回收的内容物被置于收集载玻片上。
在一些实施方案中，所述收集载玻片包括含有裂解缓冲液的一个或多个收集载玻片，其中在(C)回收所述内容物之前将所述裂解缓冲液加入至一个或多个收集孔中。在一些实施方案中，所述收集载玻片包括不含有裂解缓冲液的一个或多个收集孔，其中在(C)回收所述内容物之前未将所述裂解缓冲液加入至一个或多个收集孔中。在一些实施方案中，方法还包括在(C)提取和回收之后，将所述内容物置于收集载玻片上并冷冻所述收集载玻片。在一些实施方案中，所述收集载玻片随后被解冻。在一些实施方案中，对解冻的收集载玻片进行处理，以使所述细胞中的RNA变性。在一些实施方案中，对包含变性RNA的所述解冻的收集载玻片进行RT-PCR扩增。在一些实施方案中，对RT-PCR扩增产物进行定量。在一些实施方案中，对所述RT-PCR扩增产物进行测序。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(C)提取和回收之后，将所述内容物置于收集载玻片上，并将所述收集载玻片的内容物转移至PCR板，并冷冻所述PCR板。在一些实施方案中，所述PCR板随后被解冻。在一些实施方案中，对解冻的PCR板进行处理，以使所述RNA变性。在一些实施方案中，对包含所述变性RNA的所述解冻的PCR板进行RT-PCR扩增。
在一些实施方案中，所述内容物包含遗传物质，并且其中所述样品包含具有所期望表型的一个或多个完整的细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞是B细胞。在一些实施方案中，所述遗传物质包括抗体序列。在一些实施方案中，所述抗体序列包括重链和轻链。在一些实施方案中，所述遗传物质包括mRNA。
在一些实施方案中，对所述mRNA进行逆转录。在一些实施方案中，所述重链和轻链的RT-PCR扩增在单独的反应中进行。在一些实施方案中，所述重链和轻链的RT-PCR扩增在单个反应容器中进行。
在一些实施方案中，所述内容物包含遗传物质，并且其中所述样品包含具有所期望表型的一个或多个完整的细胞，并且其中采用单细胞NGS测序来确定遗传表型。在一些实施方案中，所述RT-PCR扩增还包括一个或多个单细胞特异性的DNA水平条形码。在一些实施方案中，所述RT-PCR扩增还包括一个或多个单细胞特异性的DNA水平条形码，其中向正在扩增的抗体序列的重链和轻链中加入相同的条形码。
本公开的方法和设备具有其他特征和优点，这些特征和优点将从并入本文中的附图和以下详细描述中显而易见或更详细地阐述，它们一起用于解释本发明的某些原理。
附图简述
图1示出了根据本公开的示例性实施方案的用于从微毛细管阵列回收样品内容物的示例性系统拓扑结构。
图2提供了根据本公开的示例性实施方案的用于回收样品内容物的系统的过程和特征的流程图。
图3示出了根据本公开的示例性实施方案的系统的各种坐标部件相对于时间的图；
图4示出了根据本公开的示例性实施方案的微毛细管阵列以及激光相对于时间朝向微毛细管阵列进行定位和脉冲的第一视图；
图5示出了根据本公开的示例性实施方案的微毛细管阵列以及激光相对于时间朝向微毛细管阵列进行定位和脉冲的第二视图。
图6A-6B。图6A示出了根据本公开的示例性实施方案的朝向微毛细管孔的子集中每个微毛细管孔的内部部分的激光的定位和脉冲视图。图6B是图6A的局部放大视图。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I、7J、7K和7L共同示出了根据本公开的示例性实施方案的朝向微毛细管的内部部分的激光的多种定位配置。
图8A-8B。图8A示出了根据本公开的示例性实施方案的朝向微毛细管孔的子集中每个微毛细管孔的边界部分的激光的定位和脉冲视图。图8B是图8A的局部放大视图。
图9A-9B。图9A示出了根据本公开的示例性实施方案的激光的一系列渐进式定位和脉冲配置以及靶标的边界部分。图9B是图9A的局部放大视图。
图10示出了根据本公开的示例性实施方案的从样品中回收的内容物的量相对于朝向样品的激光脉冲的数量的图。
图11A-11B分别示出了根据本公开的示例性实施方案的激光光束的第一横截面和第二横截面。
图12提供了根据本公开的示例性实施方案的对样品进行测序的工作流的流程图。
图13A-13C示出了将一个或多个样品从收集载玻片转移至PCR板。
图14显示了如实施例2中所讨论的经由激光回收具有所期望功能活性的细胞的方法。
图15显示了用于下一代测序(NGS)的逆转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)准备。
图16显示了如实施例2中所讨论的xPloration B测定的结合分析。
图17提供了如实施例2中所讨论的xPloration B细胞测定的定量和分选步骤的结果。
图18提供了在实施例2中所讨论的在xPloration B细胞测定中所测量的连接HCDR3-LCDR3的每个细胞之间的成对距离的热图。
图19显示了如实施例2中所讨论的xPloration B细胞测定的克隆型聚类结果。
图20显示了如实施例2中所讨论的颗粒蛋白前体的不同亚结构域，其具有广泛覆盖的靶亚结构域(A、B、G、P)。
图21显示了CDR3的稀释性曲线。
图22显示了H3、L3、VH和VK的稀释性曲线。
应当理解，附图不一定是按比例绘制的，其呈现了说明本发明基本原理的各种特征的稍微简化的表示。如本文所公开的本发明的特定设计特征(包括例如特定尺寸、定向、位置和形状)将部分地由特定的预期应用和使用环境来确定。
在附图中，参考数字在附图的全部几幅图中指代本发明的相同或等效部分。
发明详述
本公开的系统和方法提供了基于激光的从微毛细管阵列回收单细胞，以用于高通量分析。本公开通过提供基于激光的从微毛细管阵列回收单细胞的系统和方法来满足未满足的需求。本公开的系统和方法提供了允许从微毛细管阵列快速回收大量样品的定位激光。定位激光朝向样品或样品边界以及微毛细管阵列脉冲多次，以提取样品来确保样品的最佳回收。此外，定位激光在照射样品之前通过物镜传输，允许同时成像和回收样品。另外，本公开的系统和方法通过允许回收完整的细胞来改善细胞的回收，并因此用于在干燥环境中对死细胞进行回收和测序，而不是要求细胞维持细胞生长以进行延长培养。在本发明的一些方面，筛选方法不依赖于活细胞的回收，并因此不依赖于在潮湿环境中的回收，从而显著减少了所消耗的时间并提高了筛选技术的效率。
现在将详细参考本公开的各种实施方案，其实例在附图中示出并在下文描述。虽然将结合示例性实施方案来描述本公开，但是应当理解，本描述并非旨在将本发明限制于那些示例性实施方案。相反，本发明旨在不仅涵盖示例性实施方案，还涵盖各种替代、修改、等效物和其他实施方案，它们可以包括在如所附权利要求定义的本发明的精神和范围内。
还应当理解，尽管在本文中可以使用术语第一、第二等来描述各种元件，但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅被用于区分一个元件与另一个元件。例如，第一微毛细管孔可以被称为第二微毛细管孔，并且类似地，第二微毛细管孔可以被称为第一微毛细管孔，而不脱离本公开的范围。第一微毛细管孔和第二微毛细管孔都是微毛细管孔，但它们不是同一微毛细管孔。
本公开中所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。如在本发明的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。还将理解，如本文所用的术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合。将进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”指定了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或它们的组。
如本文所用的，取决于上下文，术语“如果”可以解释为意指“当”或“一经”或“响应于确定”或“响应于检测”。类似地，取决于上下文，短语“如果确定”或“如果检测到[所述条件或事件]”可以解释为意指“一经确定”或“响应于确定”或“一经检测到[所述条件或事件]”或“响应于检测到[所述条件或事件]”。
此外，当参考数字被赋予“第i”表示时，该参考数字是指通用部件、组或实施方案。例如，被称为“微毛细管孔i”的微毛细管孔是指多个微毛细管孔中的第i微毛细管孔(例如，多个微毛细管孔500中的微毛细管孔500-i)。
在一些实施方案中，微毛细管孔是长的通孔，其直径足够小，使得表面张力将液体保持在适当位置。在一些实施方案中，微毛细管孔具有从顶部加载液体的一个入口。在一些实施方案中，微毛细管孔中的液体经由无底表面张力保持。在一些实施方案中，通孔的相对端是从中回收样品的地方。
前述描述包括体现说明性实施方式的示例性系统、方法、技术、指令序列和计算机程序产品。出于解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对本发明主题的各种实施方式的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明主题的实现。通常，众所周知的指令例子、方案、结构和技术并未详细显示。
为了解释的目的，以上描述已经参照具体实施方式进行了描述。然而，下面的说明性讨论并不旨在穷举或将实施方式限制为所公开的精确形式。鉴于上述教导，许多修改和变化都是可能的。选择和描述实施方式是为了最好地解释原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够最好地利用实施方式和具有适合于预期的特定用途的各种修改的各种实施方式。
为了清楚起见，并未示出和描述本文所描述的实施方式的所有常规特征。应当理解，在任何此类实际实施方式的开发中，为了实现设计者的特定目标(如遵守用例和业务相关的约束)，做出许多特定于实施方式的决策，并且这些特定目标将从一种实施方式到另一种实施方式，以及从一名设计者到另一名设计者发生变化。此外，应当理解，此类设计工作可能是复杂和耗时的，但是对于受益于本公开的本领域技术人员来说仍然是工程化的常规工作。
除非另有说明，否则权利要求和说明书中所用的术语定义如下。在与母临时专利申请中所用的术语直接冲突的情况下，以本说明书中所用的术语为准。“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(the IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的它们通常已知的三字母符号或单字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。
“氨基酸取代”是指用第二个不同的“替换”氨基酸残基替换预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个另外的氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。虽然插入将通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但可以进行本发明更大的“肽插入”，例如，插入约三个至约五个或甚至多达约十个、十五个或二十个氨基酸残基。如上文所公开的，插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用的，术语“蛋白质”是指全长蛋白质或多肽序列及它们的片段。此类片段可以包括保留功能活性(诸如例如结合活性)的片段。术语“蛋白质”和“多肽”在整个公开内容中可互换使用，并且包括通过肽键共价连接的氨基酸链，其中多肽中的每个氨基酸可以称为“氨基酸残基”。术语“蛋白质”或“多肽”的使用不应被认为限于任何特定长度的多肽，例如任何特定数量的氨基酸残基。主题蛋白质可以包括具有非肽修饰(如翻译后修饰，包括糖基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化等)或其他化学修饰(如烷基化、乙酰化、酯化、聚乙二醇化等)的蛋白质。另外的修饰(如在多肽序列中包含非天然氨基酸或氨基酸残基之间的非肽键)也应考虑在术语“蛋白质”或“多肽”的定义范围内。
在一些实施方案中，变体蛋白质群是具有微小变异的蛋白质群，例如其中每种蛋白质具有略微不同的氨基酸序列或不同的翻译后修饰的蛋白质群。在一些实施方案中，变体蛋白可以相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，变体相差至少1个氨基酸。因此，筛选测定可以鉴定具有所期望特性的变体蛋白质序列。因为可以在微观尺度上进行如此大量的筛选，所以可以在相对短的时间内测定大量的变体蛋白质。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，NucleicAcid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人，Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Cassol等人，1992；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。对于精氨酸和亮氨酸，第二个碱基处的修饰也可以是保守性的。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。本文所用的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由以下组成：单链和双链DNA、作为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA，以及作为单链和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。多核苷酸还可以包含一个或多个经修饰的碱基或为了稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化(tritylated)碱基和不常见的碱基(如肌苷)。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。
如本文所用的术语“条形码”是用于识别目的的标记或标签。在一些实施方案中，条形码可以是核苷酸序列。在一些实施方案中，条形码可以是单细胞特异性的DNA水平条形码。在一些实施方案中，一个或多个单细胞特异性的DNA水平条形码可以被用于鉴定抗体序列的重链和/或轻链。在一些实施方案中，向扩增的抗体序列的重链和轻链加入相同的细胞特异性的DNA水平条形码。
“微腔”及其变体是指包含多个微腔的微腔阵列，每个微腔包含样品组分，其包括但不限于蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞。术语微腔包括微毛细管和/或微孔。
另外，除非另有明确说明，否则术语“光导引系统”、“激光导引系统”和“成像导引系统”在本文中可互换使用。此外，除非另有明确说明，否则术语“光”和“光束”在本文中可互换使用。
如本文所用的，术语“透镜”包括单个透镜或透镜组件，除非另有明确说明。
此外，如本文所用的，术语“靶标”意指由光源的光束多次脉冲的特征。相应的靶标可能经受单次脉冲或多次脉冲。
本公开的一方面涉及提供从微毛细管阵列回收样品内容物的服务。提供了从微毛细管阵列回收样品内容物的系统和方法。微毛细管阵列包括多个微毛细管孔，其以紧凑的顺序形成。多个微毛细管孔的子集中的每个微毛细管孔容纳包括内容物的相应样品，用于选择性回收。定位激光以靶向多个微毛细管孔的第一微毛细管孔。激光朝向第一微毛细管孔脉冲至少一次，照射第一微毛细管孔的一部分。提取来自第一微毛细管孔的内容物，回收第一微毛细管孔的内容物。
图1示出了用于回收样品内容物的系统10的示例性拓扑结构。系统10包括光导引系统100(例如，激光导引系统)，其包括一个或多个光源(例如，第一光源102和第二光源116)。每个光源朝向指定靶标发射电磁辐射(例如光)。指定靶标的照射根据相应的光源提供指定靶标的成像和/或指定靶标的内容物的回收。因此，导引系统100将从来自光源发射的光导向指定靶标，并控制光源102的一项或多项操作。
在一些实施方案中，指定的靶标包括包含多个微腔的微腔阵列132。微腔阵列132中的每个微腔容纳对应的样品。因此，激光导引系统100照射微腔阵列132中的微腔，以从对应的微腔中回收相应的样品。在一些实施方案中，微腔阵列132是样品台130的部件，样品台130还包括收集载玻片134，用于在提取后接收样品的内容物。
通常，微腔阵列132包括多个腔室的阵列(例如，图5的微毛细管500)。每个腔室容纳具有各种内容物的相应样品。此外，微腔阵列132的每个腔室允许光通过腔室传输。这种光的传输可以是腔室的形状和/或腔室的材料，这将在下文更详细地描述。
在一些实施方案中，微腔阵列132包括具有多个微毛细管孔(例如，第一微毛细管孔500-1、第二微毛细管孔500-2、…、第i微毛细管孔500-i等)的微毛细管孔阵列。此外，每个微毛细管孔500容纳相应的样品(例如，第一微毛细管孔500-1容纳第一样品600-1，第二微毛细管孔500-2容纳第二样品600-2等)。在一些实施方案中，微毛细管阵列132包括多个纵向融合的毛细管500，例如融合的二氧化硅毛细管。然而，在一些实施方案种，微毛细管阵列132使用了另一合适的材料。参见，例如，2016年12月12日递交的美国申请第62/433,210号；2016年12月12日递交的美国申请第15/376,588号；PCT国际专利公开第WO 2012/007537号和第WO 2014/008056号中所描述的阵列，其每一项均在此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，例如通过包括捆绑数百万或数十亿个二氧化硅毛细管并通过热处理将它们熔合在一起的方法来制造微毛细管阵列132。然而，如上文所述，在一些实施方案中，另一合适的材料被用于微毛细管阵列132。在一些实施方案中，熔合过程包括例如加热在张力下被拉伸成单包层光纤的毛细管单拉制玻璃。通过将单拉伸玻璃捆绑、加热和拉伸形成毛细管多次拉伸单毛细管。因此，通过另外的捆绑、加热和拉伸多次拉伸单毛细管形成多次拉伸多毛细管。通过将多次拉伸多毛细管堆叠在压块中进一步形成拉伸玻璃的块组件。通过对来自块组件的压块进行加热和压力处理而形成块压制块。然后通过以预定长度(例如，1毫米(mm))切割块压制块来形成块形成块。
在一些实施方案中，制造方法还包括剪切(例如，切割)二氧化硅毛细管。这种剪切形成了每单位面积具有相对高密度的微毛细管的玻璃微毛细管阵列132。在一些实施方案中，微毛细管阵列132被剪切成大约1mm的高度。在一些实施方案中，微毛细管阵列132包括多个微毛细管孔500，每个微毛细管孔500具有的高度范围为1微米(μm)至25mm、、5μm至20mm、5μm至15mm、10μm至15mm或10μm至10mm。然而，本公开不限于此。例如，在一些实施方案中，预期多个微毛细管孔500的高度短于或长于上述高度。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500具有均一的高度。微毛细管阵列132的这种均一高度允许每个相应的微毛细管孔500的表面(例如，上表面和/或下表面)与多个微毛细管孔500共面，或基本上共面(例如，在本领域技术人员已知的可接受公差内共面)。
此类过程形成适用于本公开的高密度微毛细管阵列132。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500形成为具有内径的圆柱形或大致圆柱形(例如，半圆柱形、具有均一长度的n边的多边形形状，例如六边形等)。在此类实施方案中，包括非圆形形式的水力直径的等效特征尺寸被用于确定基本上圆柱形的微毛细管孔500的内径。在一些实施方案中，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500的内径范围为0.5μm至500μm、1μm至500μm、1μm至300μm、25μm至250μm、50μm至250μm、50μm至200μm、75μm至150μm、75μm至125μm、75μm至110μm、80μm至110μm、1μm至100μm、1μm至75μm、1μm至50μm、5μm至50μm或1μm至10μm。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500的内径为80μm、90μm、100μm、110μm或以上的组合。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500的内径为1μm、5μm、10μm或以上的组合。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500的内径是恒定的。例如，在一些实施方案中，微毛细管阵列中每个相应的微毛细管孔500的内径为5μm、10μm或100μm。此外，在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500的内径是恒定的。在一些实施方案中，内径从相应微毛细管孔500的第一末端部分处的第一直径转变为第二末端部分处的第二直径。在一些实施方案中，微毛细管孔500的内径包括恒定部分和非恒定部分。
在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括代表微毛细管孔500的内腔的开放区。在一些实施方案中，开放的毛细管阵列132中一个或多个微毛细管孔500的比例范围为微毛细管孔500的40％至95％、45％至95％、50％至90％、50％至85％、55％至80％、60％至75％、65％至70％、或66％至68％。在一些实施方案中，开放的毛细管阵列132中一个或多个微毛细管孔500的比例为微毛细管孔500的67％。在一些实施方案中，微毛细管阵列132中一个或多个微毛细管孔500的比例是如通过商购可获得的微毛细管阵列132(如Hamamatsu Photonics K.K.(日本))提供的比例。
在一些实施方案中，包括微毛细管阵列132中每个微毛细管孔500的每个开放区的总体开放区域包括微毛细管阵列132的90％的开放区，使得如果每个微毛细管孔500的内径变化范围为1μm至500μm，则微毛细管阵列132的每平方厘米(cm2)的微毛细管孔500的数量类似地在460个微毛细管孔500至1.1·106个微毛细管孔500或更多的范围内变化。在一些实施方案中，微毛细管阵列132的总开放面积包括大约67％的开放面积，使得如果孔径(例如，开放面积)在1μm至500μm变化，则每cm2微毛细管阵列132的微毛细管孔500的数量在从大约340至超过800,000个微毛细管孔500的范围内变化。在一些实施方案中，每cm2微毛细管阵列132的微毛细管孔500的数量在500个微毛细管孔500至1·107个微毛细管孔500的范围内。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132包括10厘米(cm)×10cm的表面积(例如，微毛细管阵列132的上表面和/或下表面的表面积)。此外，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500具有5μm的内径和66％的开放区域。因此，微毛细管阵列132包括大约3.3·108个微毛细管孔500(例如，第一微毛细管孔500-1、第二微毛细管孔500-2、…、第(3.3·108)微毛细管孔500-(3.3·108)等)。在一些微毛细管阵列中，阵列的开放区包括开放区域(OA)的多达90％，使得当孔径在1μm至500μm间变化时，每cm阵列的微毛细管数量在约460至超过1100万之间变化。在一些微毛细管阵列中，阵列的开放区包括开放区的大约67％，使得当孔径在1μm至500μm变化时，每平方厘米阵列的微毛细管数量在大约340个至超过800,000个变化。在一些实施方案中，孔径为1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、250μm、350或500μm。在一些实施方案中，孔径为5μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为10μm至450μm。在一些实施方案中，孔径为50μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为100μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为250μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为350μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为100μm至450μm。在一些实施方案中，孔径为250μm至450μm。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管数量为大约400；500；1000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；20,000；50,000,100,000；200,000；300,000；400,000；500,000；600,000；700,000；或800,000个。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约500至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约1000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约2000至600,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约10,000至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约10,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约50,000至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约50,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至600,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至500,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约500,000至800,000个变化。
在一些实施方案中，通过在通过热制造工艺将二氧化硅毛细管熔合在一起之前结合多个二氧化硅毛细管(例如，1·109个毛细管)来制造微毛细管阵列132。将熔合的二氧化硅毛细管剪切成大约大于或等于0.5mm的高度，形成具有相对高纵横比(例如，大于或等于10、大于或等于25、……、大于或等于10,000等)的玻璃微毛细管阵列132。微毛细管阵列132的纵横比是高度相对于微毛细管阵列500的微毛细管孔500的内径的比率。在一些实施方案中，微毛细管阵列132的纵横比范围为0.002(例如，具有1μm高度和500μm内径的微毛细管孔500)至50,000(例如，具有25mm高度和0.5μm内径的微毛细管孔500)、2至50,000、5至50,000、5至25,000、10至25,000、10至15,000、20至15,000，或25至10,000。在一些实施方案中，微毛细管阵列132是商购可获得的微毛细管阵列，如可从Hamamatsu Photonics K.K.(日本)；Incom,Inc.(马萨诸塞州)；Photonis Technologies,S.A.S.(法国)Inc.等获得的微毛细管阵列。
本公开的微毛细管阵列132不限于特定数量的微毛细管孔500。在一些实施方案中，按照待筛选的变体蛋白质文库的大小来确定微毛细管阵列132的微毛细管孔500的数量。例如，在一些实施方案中，系统10的样品台130可以容纳许多不同的微毛细管阵列132。在一些实施方案中，微毛细管阵列132包括1·104个微毛细管孔500至5·108个微毛细管孔500或更大范围的许多孔。然而，本公开不限于此。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132的厚度范围为100μm至3,000μm、150μm至2,500μm、200μm至2,000μm、500μm至2,500μm、500μm至2,000μm、750μm至1,750μm，或1,000μm至1,500μm。在一些实施方案中，微毛细管阵列132的厚度对应于微毛细管孔500的高度。例如，如果微毛细管孔500的高度为1mm，则微毛细管阵列132相应的厚度为大约1mm(例如，微毛细管阵列132的厚度为1mm，排除通过样品台130的安装机构(如托架)提供的额外厚度)。
在一些实施方案中，微腔阵列132的厚度为1.5mm，并且每个相应的微毛细管孔500的内径为150μm。在一些实施方案中，微腔阵列132的厚度为2mm，并且每个微毛细管孔500的内径为200μm。在一些实施方案中，微腔阵列132的厚度为1mm，并且每个微毛细管孔500的内径为100μm。在一些实施方案中，微腔阵列132的厚度为1mm，并且每个微毛细管孔500的内径为10μm。
在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500提供的体积(例如，每个相应的微毛细管孔500的样品的体积)为纳升(nL)范围(例如，1nL至1,000nL)、皮升(pL)范围(例如，1pL至1,000pL)，或飞升范围(fL)(例如，1fL至1,000fL)。在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品体积范围为1纳升(nL)至600nL、5nL至500nL、5nL至450nL、5nL至400nL、5nL至350nL、5nL至300nL、5nL至250nL、5nL至200nL、5nL至150nL、5nL至100nL、5nL至90nL、5nL至80nL、5nL至70nL、5nL至60nL、5nL至50nL、5nL至40nL、5nL至30nL、5nL至20nL、5nL至10nL、5nL至8nL，或7nL至8nL。在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品体积为7.8nL。此外，在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品体积范围为50pL至150pL、65pL至110pL、70pL至100pL、70pL至90pL，或70pL至80pL。在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品的体积为78.5nL。另外，在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品体积范围为100fL至1000fL、150fL至1000fL、200fL至1000fL、250fL至1000fL、300fL至1000fL、350fL至1000fL、350fL至950fL、350fL至900fL、400fL至900fL、450fL至900fL、500fL至950fL、500fL至800fL、100fL至250fL、150fL至250fL、150fL至200fL、或125fL至175fL。在一些实施方案中，通过每个相应的微毛细管孔500容纳的样品体积为157fL。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500还包括置于相应微毛细管孔500内的一种或多种试剂。如果细胞表达测定与本公开的系统和方法一起使用，则一种或多种试剂改善细胞表达系统的存活力。在一些实施方案中，一种或多种试剂防止在回收微毛细管孔500的内容物时发生细胞损伤。例如，在一些实施方案中，回收内容物包括从激光(例如，图1的激光102)发射光脉冲，并且一种或多种试剂防止样品(例如，图6B的样品602-i)被激光102损伤。
在一些实施方案中，试剂是甲基纤维素(例如在0.001wt％至10wt％的范围内)、右旋糖酐(例如在0.5wt％至10wt％的范围内)、普朗尼克F-68(例如在0.01wt％至10wt％的范围内)、聚乙二醇(“PEG”)(例如在0.01wt％至10wt％的范围内)、聚乙烯醇(“PVA”)(例如在0.01wt％至10wt％的范围内)等。
可选地或另外，在一些实施方案中，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500还包括生长添加剂，诸如例如50％条件生长培养基、25％标准生长培养基或25％血清。在一些实施方案中，条件生长培养基被条件化大约24小时。在一些实施方案中，添加的试剂包括胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、胰岛素样生长因子或以上的组合，或任何上述试剂。
还应该理解，微毛细管孔500内的筛选测定的每种组分的浓度可以在测定中根据需要进行调节，以实现最佳结果。特别地，可能需要调节蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞的浓度，以实现这些组分之间的所期望水平的缔合。缔合水平还将取决于这些组分之间的特定亲和力，其中对于给定浓度的组分，更高的亲和力导致更高水平的缔合，并且对于给定浓度，更低的亲和力导致组分的更低水平的缔合。如本领域普通技术人员将理解的，同样可以调节各种成分的浓度，以实现最佳水平的信号输出。
在一些实施方案中，每个微毛细管孔500在微毛细管孔500的第一末端部分和第二末端部分处包括开放平面。此外，在一些实施方案中，微毛细管阵列的每个相应的开放平面与相应的开放平面共面。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500包括微毛细管孔500的从第一平面至第二平面的通孔。然而，本公开不限于此。在一些实施方案中，微毛细管阵列132包括连接微毛细管阵列132的末端部分(例如，表面或表面的一部分)的固体基底，其形成了微毛细管阵列132的一个或多个微毛细管孔500的关闭末端部分。
在一些实施方案中，相应的样品(例如，图6B的样品602-i)通过表面张力被容纳在微毛细管孔500中。例如，在一些实施方案中，微毛细管孔500包括微毛细管孔500的第一末端部分和第二末端部分处的开放表面，使得样品602仅通过表面张力被容纳在具有暴露第一和第二末端部分的微毛细管500中。在一些实施方案中，表面张力是相应微毛细管孔500中保持样品的唯一力。因此，在此类实施方案中，激光光束(例如，图1的激光102的光束104)朝向样品602的脉冲破坏了相应微毛细管孔500的表面张力，并提取样品602。
可以根据本公开筛选的文库包括任何文库，其包括多个分子以及其混合物和/或组合。在一些实施方案中，文库包括样品，其包括生物物质。在一些实施方案中，文库包括样品，其包括多个一个或多个分子和/或细胞以及其混合物和/或组合。在一些实施方案中，文库包括样品，其包括多个一种或多种蛋白质、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，小分子包括任何分子。在一些实施方案中，分子包括蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或染料，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，文库包括样品，其包括生物物质，包括多肽、核酸、小分子和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，文库包括多个样品。在一些实施方案中，样品包括生物物质，其包括多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，样品含有待筛选的至少一个分子和/或细胞。在一些实施方案中，样品含有待筛选的至少1至10个分子和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，样品含有待筛选的多个分子和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，待筛选的分子被称为靶分子。在一些实施方案中，待筛选的细胞被称为靶细胞。
本文所提供的微毛细管阵列132允许筛选文库，其包括蛋白质、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，待筛选的靶分子是蛋白质、多肽、核酸、小分子、染料、碳水化合物、脂质或它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质和/或多肽选自酶、配体和受体。例如，在一些实施方案中，靶分子包括脂质修饰的或糖基化的蛋白质。在一些实施方案中，靶分子包括天然蛋白质。
如上文所述，在实施方案中，通过本公开所提供的微毛细管阵列132的每个微毛细管孔500容纳具有与微毛细管阵列132中的另一微毛细管孔500的样品内容物不同的内容物的相应样品(例如，第一微毛细管孔500-1容纳第一样品600-1，第二微毛细管孔500-2容纳第二样品600-2，第三微毛细管孔500-3容纳第三样品600-3等)。类似地，在实施方案中，通过本公开所提供的微毛细管阵列132中的一个或多个微毛细管孔500容纳具有与微毛细管阵列132中的另一微毛细管孔500的样品内容物不同的内容物的相应样品(例如，第一微毛细管孔500-1容纳第一样品600-1，第二微毛细管孔500-2容纳第二样品600-2，第三微毛细管孔500-3容纳第一样品600-1等)。在一些实施方案中，样品的内容物包括蛋白质、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞(即，靶分子和/或靶细胞)，以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，用于筛选的文库包括表现出区别特征的变体蛋白质、变体多肽、变体核酸、变体小分子、变体染料和/或一种或多种变体细胞。在一些实施方案中，变体蛋白质、变体多肽、变体核酸、变体小分子、变体染料和/或一种或多种变体细胞表现出区别特征。这些表现出的区别特征允许每个微毛细管孔500包括相应的样品，该样品包括与由微毛细管阵列132内的每个其他微毛细管孔500容纳的相应样品不同的靶分子和/或靶细胞。在一些实施方案中，微毛细管阵列132内的一个或多个微毛细管孔500包括相应的样品，其包括与由微毛细管阵列132内的至少一个其他微毛细管孔130容纳的另一样品相同的靶分子和/或靶细胞(例如，相应的样品至少被复制以用于比较)。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132中待筛选文库中的蛋白质和/或多肽包括一种或多种变体蛋白质和/或多肽。变体蛋白质包括基于至少一种特性或特征而彼此可区分的蛋白质和多肽。在一些实施方案中，变体蛋白质和/或多肽表现出不同的氨基酸序列、表现出不同的氨基酸序列长度、通过不同的方法产生/生成、表现出不同的活性、表现出不同的化学修饰、表现出不同的翻译后修饰，或以上的组合。在一些实施方案中，变体蛋白质包括变体蛋白质和/或多肽群，其正在利用本公开的微毛细管阵列132进行筛选和分析。在一些实施方案中，变体蛋白质和/或多肽群包括可适当分布在微毛细管阵列132内的任何蛋白质群。
在一些实施方案中，微腔阵列中待筛选文库中的核酸包括一种或多种变体核酸。变体核酸包括基于至少一种特性或特征而彼此可区分的核酸。在一些实施方案中，变体核酸包括不同的核苷酸序列、不同的核苷酸序列长度、不同的甲基化模式、不同的化学修饰、通过不同的方法产生/生成、表现出其他区别性修饰，或以上的组合。在一些实施方案中，核酸属于变体核酸群，其正在利用本公开的微毛细管阵列132进行筛选和分析。在一些实施方案中，变体核酸群包括可适当分布在微毛细管阵列132内的任何核酸群。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132中待筛选文库中的小分子包括变体和/或不同的小分子。变体小分子包括基于至少一种特性或特征彼此可区分的小分子。在一些实施方案中，变体小分子包括不同的结构、已经通过不同的方法产生/生成、具有不同的化学修饰、表现出其他可区分的不同特征，或以上的组合。在一些实施方案中，小分子是彼此的衍生物。在一些实施方案中，小分子是利用本公开的微毛细管阵列132进行筛选和分析的小分子群。在一些实施方案中，小分子群包括可适当分布在微毛细管阵列132内的任何小分子群。
在一些实施方案中，微腔阵列中待筛选文库中的细胞包括变体细胞和/或不同类型的细胞。变体细胞包括基于至少一种特性或特征而彼此可区分的细胞。在一些实施方案中，细胞来源于不同的样品、来源于不同的患者、来源于不同的疾病、具有不同的化学修饰、已被遗传修饰，或以上的组合。在一些实施方案中，细胞包括真核和/或原核细胞。在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞(例如，人类细胞、啮齿动物细胞(如小鼠细胞和大鼠细胞)、禽类细胞(如鸡细胞)等)、细菌细胞、包括酵母细胞的真菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞包括血细胞、淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、骨髓细胞或它们的组合。在一些实施方案中，细胞是利用本公开的微毛细管阵列132进行筛选和分析的细胞群。在一些实施方案中，细胞群包括可适当分布在微毛细管阵列132内的任何细胞群。
在一些实施方案中，蛋白质、多肽、核酸和/或细胞群分布在微毛细管阵列132中，允许每个微毛细管孔500容纳少量不同的变体蛋白质、变体多肽、变体核酸和/或细胞。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括单个不同的变体蛋白质、变体多肽、变体核酸和/或细胞。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括单个不同的变体蛋白质。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括单个不同的变体多肽。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括每个微腔的单个不同变体核酸。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括每个微腔的单个不同细胞。变体蛋白质、变体多肽、变体核酸和/或细胞的群体与样品中的其他组分组合选择。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132中的每个微毛细管孔500包括不同的变体蛋白质、变体多肽、变体核酸和/或来自变体蛋白质群的细胞，范围从0个不同变体到10个不同变体、从0个不同的变体到7个不同的变体、从0个不同的变体到5个不同的变体、从0个不同的变体到4个不同的变体、从0个不同的变体到3个不同的变体、从0个不同的变体到2个不同的变体，或从0个不同的变体到1个不同的变体。
因此，在一些实施方案中，变体蛋白包括可溶性蛋白，例如，由细胞表达系统分泌的可溶性蛋白。示例性的可溶性变体蛋白包括抗体和抗体片段、可替代蛋白支架(如二硫键结合的肽支架)、细胞表面受体蛋白的胞外结构域、受体配体(如G蛋白偶联受体配体)、其他肽激素、凝集素等。在一些实施方案中，使用本公开的系统和方法筛选的变体蛋白不需要共价附接至表达相应变体蛋白的细胞或病毒，以便在筛选测定后被鉴定。回收相应微毛细管孔500的内容物，随后增殖负责表达所期望变体蛋白的细胞或病毒克隆，使得能够识别和表征相应的变体蛋白。与其中通过将蛋白质与细胞或病毒颗粒表面上的分子融合来展示变体蛋白的筛选测定不同，本公开中所鉴定的变体蛋白在其鉴定之前或之后不需要以任何方式改变。因此，在筛选中观察到的变体蛋白的活性更有可能代表那些蛋白质在其后续应用中的实际活性。在筛选之前不需要改变变体蛋白或多肽也允许更有效的筛选，节省文库制备的成本和时间。
在一些实施方案中，待筛选的变体蛋白包括膜相关蛋白，例如，通常与表达系统中的细胞或病毒颗粒表面相关的蛋白。在一些实施方案中，如果变体蛋白及其靶分子介导生物组织内两个细胞之间的相互作用，则期望筛选细胞相关变体蛋白。在一些实施方案中，筛选与细胞相关的变体蛋白的能力在筛选与传统上“不可成药”的蛋白质靶标，诸如例如G-蛋白偶联受体或离子通道的相互作用中是合乎需要的。同样，在筛选之前不需要改变变体蛋白质或多肽也允许进行更有效的筛选，从而在文库制备过程中节省资源。
在一些实施方案中，待筛选的变体核酸包括任何核酸或多核苷酸，包括与蛋白质结合或相互作用的核酸或多核苷酸。同样，在筛选之前不需要改变核酸或多核苷酸也允许更有效的筛选，节省文库制备的成本和时间。
在一些实施方案中，待筛选的蛋白质是抗体、抗体片段(如Fc)或抗体融合物(包括例如Fc融合物)。在一些实施方案中，可以标记抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，该方法采用抗体来结合待筛选的靶分子。在一些实施方案中，抗体是用于结合靶分子的标记的第一抗体或标记的第二抗体。第一抗体通常被认为是直接与目的抗原结合的抗体，而第二抗体通常被认为是为了标记第一抗体的目的而与第一抗体上的恒定区结合的抗体。因此，第二抗体经常用荧光团或其他可检测标记进行标记，或者用能够产生可检测信号的酶进行标记。第二抗体通常对来自不同物种的第一抗体具有特异性。例如，在一些实施方案中，如本领域普通技术人员所理解的，山羊或其他动物物种被用于产生针对小鼠、鸡、兔的第二抗体，或几乎除来自该动物物种的抗体之外的任何第一抗体。在一些实施方案中，标记的抗体是第一抗体或第二抗体。在一些实施方案中，标记的抗体是荧光抗体或酶联抗体。
如本领域普通技术人员将理解的，例如，如果在本公开的系统和方法中使用荧光抗体，则相应的微毛细管孔500内由在溶液中保持游离的任何过量报告元件发出的信号(即不与变体蛋白质结合或与不与靶分子结合的变体蛋白质结合)不应该太高，以至于它经由变体蛋白质压过与靶分子相关联的报告元件的信号(参见，例如，不相关的荧光抗体)。然而，可以通过限制微毛细管溶液中标记抗体或其他报告元件的浓度来最小化此类背景信号。另外，在一些实施方案中，如果使用荧光显微镜测量来自筛选方法的信号，则显微镜被配置为对包围靶分子位置的相对窄的景深进行成像(例如，如果靶细胞已经通过重力沉降在下端部分处沉降，则为微毛细管孔500的下端部分)，以最小化来自与靶分子不相关的报告元件的背景信号。
在一些实施方案中，微毛细管阵列132内的微毛细管孔500的数量是根据要筛选的文库的大小来确定的。在一些实施方案中，文库的大小在1·104至5·108个蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞，以及它们的混合物和/或组合的范围内。然而，本公开不限于此。
本领域技术人员将理解，每个相应的微毛细管孔500将通常包括相同蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞的多个拷贝，这取决于特定蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合的来源和表达水平。在一些实施方案中，每个相应的微毛细管孔500包括在5·102至1·1010个范围内的特定蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞的许多分子，这取决于蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合如何被递送至相应的微毛细管孔500或在其内表达。在一些实施方案中，由相应的微毛细管孔500容纳的样品中的蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞的多种类型的范围为1种至10种、1种至5种，或1种至4种。
蛋白质、多肽、核酸和/或小分子以及它们的混合物和/或组合的群体通常使用生物表达系统中的遗传文库生成，例如，在体外(例如，无细胞的)表达系统中或在体内或细胞表达系统中。在一些实施方案中，蛋白质、多肽、核酸和/或小分子以及它们的混合物和/或组合的群体经由任何已知的合成方法生成。示例性的细胞表达系统包括例如动物系统(例如哺乳动物系统)、真菌系统(例如酵母系统)、细菌系统、昆虫系统或植物系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物系统或酵母系统。表达系统，无论是细胞的还是无细胞的，通常包括编码变体蛋白群的遗传物质文库。细胞表达系统提供的优点是具有所期望表型的细胞(例如，表达特定目的变体蛋白(如能够以高亲和力与固定的靶分子缔合的变体蛋白质)的细胞)可以生长和增殖，因此促进和简化细胞所表达的目的蛋白的鉴定和表征。
编码蛋白质、多肽、核酸和/或小分子以及它们的混合物和/或组合的大群体的遗传文库在生物工程领域是众所周知的。此类文库通常被用于依赖定向进化过程的系统中，以识别具有有利性质的蛋白质，如与靶分子的高亲和力结合、稳定性、高表达或特定光谱(例如荧光)或酶活性。文库通常包括与来自宿主表达系统的序列的基因融合，例如，指导亚细胞定位的蛋白质片段，其中所表达的变异融合蛋白群被靶向片段引导至细胞或病毒颗粒的特定位置，以用于变体蛋白群的活性筛选的目的。大量的变体蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或细胞(例如，106个变体、108个变体、1010个变体、1012个变体或甚至更多个变体)，以及它们的混合物和/或组合，可以如本领域公知的，使用常规生物工程技术生成。在一些实施方案中，文库是从商业来源购买的。
然而，本公开不限于此。在一些实施方案中，样品包括无机材料或有机和无机材料的组合，如环境来源(例如，土壤、水、植物等)。在一些实施方案中，显微镜台架安装允许用激光回收所述微毛细管阵列内容物。在一些实施方案中，回收的内容物包含细胞。在一些实施方案中，回收的内容物包括活细胞和/或死亡(例如，死)细胞。在一些实施方案中，进一步分析回收的细胞中一种或多种核酸的存在。在一些实施方案中，进一步分析回收的细胞中一种或多种氨基酸的存在。
现在已经公开了微毛细管阵列132和微毛细管孔500的细节，公开了关于根据本公开的实施方案的采样系统10的光导引系统100的细节。
参考图1，系统10包括促进微毛细管阵列132的内容物的回收和/或成像的光导引系统100。系统10还包括采样台130，其容纳微毛细管阵列132，并且在一些实施方案中，有助于促进微毛细管阵列132的内容物的回收和/或成像。
在一些实施方案中，系统10包括一台或多台具有存储器和处理器的计算机(例如，计算机系统)。存储器存储一个或多个程序以供一个或多个处理器执行。一个或多个程序单独或共同包括用于利用光导引系统100和/或采样台130的指令。在一些实施方案中，一个或多个指令包括用于光导引系统100的光源的定位指令(例如，用于将部件定位在光导引系统100的光学组件上的定位指令等)、光源的操作指令(例如，激活和去激活指令、强度指令、脉冲参数指令等)和关于样品台130的类似指令(例如，定位指令)。
导引系统100包括将电磁辐射朝向靶标引导的一个或多个光源，以照射靶标的一部分(例如，微毛细管阵列132)。在一些实施方案中，一个或多个光源的第一子集促进从微毛细管孔500的样品提取和回收内容物(例如，图6B的500-i的细胞604-1)，而一个或多个光源的第二子集促进样品的成像。在一些实施方案中，光源的第一和第二子集协同运行，允许在样品回收期间对微毛细管阵列132进行实时成像。在一些实施方案中，光导引系统100包括系统10的一个或多个光依赖部件的相应的导引系统。例如，在一些实施方案中，导引系统100包括至少用于操作激光102和定位激光102的光束104的激光导引系统100。在一些实施方案中，导引系统100包括至少用于操作一个或多个照相机120的成像导引系统。
由于每个微毛细管孔500的直径大小相对小(例如，直径小于1cm)，在回收微毛细管阵列132的内容物期间，光导引系统100利用光104的聚焦光束来准确且精确地靶向微毛细管阵列132中相应的微毛细管孔500。因此，在一些实施方案中，光源包括发射电磁辐射的相干光束104的激光102。在一些实施方案中，激光102是激光二极管。在一些实施方案中，激光102是连续波激光，或优选地，脉冲激光。
激光102包括限定脉冲频率的脉冲周期(例如，1个脉冲/秒产生1赫兹(Hz)等)。在一些实施方案中，激光的脉冲周期范围为1Hz至60,000Hz(例如，60千赫兹(kHz))、100Hz至60kHz、500Hz至60kHz、500Hz至50kHz、500Hz至40kHz、1kHz至40kHz、1kHz至30kHz、1kHz至27.5kHz、1kHz至25kHz、1.5kHz至25kHz、2kHz至25kHz、1kHz至20kHz、2kHz至20kHz、2.5kHz至20kHz、5kHz至25kHz、5kHz至20kHz、10kHz至40kHz或15kHz至25kHz。在一些实施方案中，激光102的脉冲周期为20kHz。
在一些实施方案中，激光102发射紫外光谱(例如，UV激光)或可见光谱(例如，可见光谱激光)中的光104。在一些实施方案中，从激光102发射的光束104范围为213纳米(nm)至1380nm。在一些实施方案中，从激光102发射的光束104选自：355nm、375nm、404nm、405nm、406nm、450nm、462nm、473nm、488nm、514nm、520nm、532nm、633nm、635nm、637nm、638nm、639nm、640nm、642nm、650nm、658nm、660nm、670nm、685nm、690nm和1064nm。在一些实施方案中，根据激光102的靶标选择光束104的波长。
在一些实施方案中，激光102是商购可获得的激光。在一些实施方案中，商业激光102包括例如，可从Thorlabs(参见例如，万维网Thorlabs.com/newgrouppage9.cfm？objectgroup_id＝7上列出的那些)；Spectra-Physics(参见例如，万维网spectra-physics.com/products/q-switched-lasers/explorer-one上列出的那些)；和/或Integrated Optics(参见例如，integratedoptics.com/products/nanosecond-lasers上列出的那些)获得的那些激光。
在一些实施方案中，系统10的导引系统100包括拦截来自一个或多个光源的光束(例如，激光102的光束104、荧光光源116的光束118等)的物镜112，和/或一个或多个照相机120的视场。例如，如图1中所示的，在一些实施方案种，物镜112介于样品台130和一个或多个光源之间，允许物镜112收集来自一个或多个光源中的每一个的光。在一些实施方案中，物镜112基于改进的显微镜。在一些实施方案中，显微镜提供具有高光收集效率的前端图像收集和光学变焦。在一些实施方案中，物镜10提供在1至100光学放大率、2至100光学放大率、4至100光学放大率、4至80光学放大率或4至40光学放大率范围内的光学放大率。在一些实施方案中，物镜112的光学放大倍数为10。
在一些实施方案中，物镜112是固定的，使得样品台130相对于物镜112定位。在一些实施方案中，物镜112与允许定位物镜112的马达114连接。在一些实施方案中，马达114向物镜112提供一个自由度。在一些实施方案中，马达114提供的一个自由度不同于检流计系统106提供的自由度(例如，检流计系统106在X轴和Y轴上提供两个平移自由度，并且马达114在Z轴上提供一个平移自由度，用于重新定向光束104)。因此，在一些实施方案中，物镜112被固定在平行于样品台130的相应平面的平面上，使得光束104在穿过物镜112之后被引导朝向微毛细管阵列132，其中入射角0度(°)，或大约为0°。这种有限的入射角允许物镜112提供微毛细管阵列132的单一视场。在此类实施方案中，单一视场允许激光102从第一靶标定位到第二靶标，而不必重新聚焦光束104或以其他方式调整激光102。因此，在一些实施方案中，导引系统100和样品台130相对于彼此横穿，使得样品台130的移动为物镜提供新的视场。此外，具有有限入射角的这种配置允许在从微毛细管孔500中提取内容物的过程中(例如，同时)对微毛细管阵列进行成像。
在一些实施方案中，一个或多个光源包括发射光的相应光束118的荧光光源116。在一些实施方案中，荧光光源116发射UV波长谱中的光的光束118(例如，范围为10nm至400nm)。
在一些实施方案中，一个或多个光源包括明场光源126。相对于荧光光源116，明场光源126被设置在微毛细管阵列132的相对端部处，使得微毛细管阵列132介于荧光光源116的光束118和明场光源126之间。在一些实施方案中，来自一个或多个光源的发射光从指定的微毛细管孔500的样品被引导至检测单元(例如，明场光源126)。
在一些实施方案中，激光导引系统100和微毛细管阵列132中的每个被置于固定位置处，使得至(例如，激光扫描组件)促进朝向指定靶标(例如，第一微毛细管孔500-1、第一微毛细管孔500-1的一部分等)来导引激光的光束104。例如，在一些实施方案中，采样台130将微毛细管132容纳在固定位置，防止微毛细管阵列132在内容物的回收和/或成像期间移动位置以及对微毛细管阵列132的内容物的物理破坏。
在一些实施方案中，采样台130为微毛细管阵列132提供了多个自由度，从而使微毛细管阵列132能够相应地定位(例如，横穿和/或旋转)。例如，在一些实施方案中，微毛细管阵列132以六个自由度定位，允许微毛细管阵列132围绕三个正交轴横穿和/或旋转(例如，围绕三维笛卡尔坐标系横穿并以可变倾斜度旋转、滚动和摇动(yaw))。在一些实施方案中，微毛细管阵列132仅以一个或多个平移自由度定位。因此，在其中微毛细管阵列130的内容物是流体的实施方案中，内容物保持在基本水平的自由表面(例如，在可接受的公差内，不包括弯月面等)。这包括基本上包含流体内容物(例如，包括固体和流体物质的非均质混合物)等的实施方案。
参考图3，在一些实施方案中，激光导引系统100和微毛细管阵列132可相对于彼此移动(例如，激光导引系统100和微毛细管阵列132中的两个或一个是可移动的)，允许激光102的光束104根据系统10的相对移动被导引。在一些实施方案中，光束104的导引由至少一个检流计106提供。在一些实施方案中，系统10的两个或更多个部件的定位是顺序进行的，使得系统10的第一部件定位于从第一位置到第二位置。一旦第一部件定位到第二位置，系统10就将该部分的第二部件从第三位置定位到第四位置。例如，在一些实施方案中，系统10进行采样台130的第一定位，并且一经完成第一定位，进行光束104的第二定位(例如，经由检流计106)。此外，在一些实施方案中，系统10在完成光束104的第二定位后对激光102进行脉冲。在一些实施方案中，在定位光束104之前进行样品台的定位允许在样品台130的定位完成和激光102的脉冲之间经过更大的时间段，进一步允许微毛细管阵列132的内容物从在样品台130的定位期间发生的瞬态扰动中沉降下来。
在一些实施方案中，系统10进行光束104定位的多个实例，并且一经完成光束104的定位，在重新定位样品台130之前将激光102朝向指定靶标进行脉冲。在一些实施方案中，朝向指定靶标的定位和脉冲的多个实例范围为1个实例至100个实例、1个实例至50个实例、1个实例至25个实例、1个实例至15个实例、2个实例至15个实例、1个实例至12个实例、2个实例至12个实例、1个实例至10个实例、2个实例至10个实例，或4个实例至10个实例。在一些实施方案中，朝向指定靶标的定位和脉冲的多个实例是5个实例。
此外，在一些实施方案中，为了回收指定靶标的内容物，需要将光束104多于一次地朝向指定靶标(例如，第一微毛细管孔500-1)进行脉冲。因此，一经完成样品台130的定位，系统10进行朝向指定靶标的光束104的定位和激光器102的脉冲的两个或更多个实例。例如，图3中描绘了样品台130的定位、检流计106的定位和激光器102的脉冲的坐标。在图3的坐标中，系统10对样品台130进行从各自的初始位置到第一位置的第一定位，这发生在大约100毫秒(ms)的时间段内。一经完成样品台132的第一定位，系统10通过检流计106从各自的初始位置朝向第一位置进行光束104的第一定位。光束104的该第一定位，并且取决于各个位置之间的距离、光束104的定位的每个相应实例，在大约300微秒(μs)的时间段内发生。因此，在完成光束104的第一定位后，系统10朝向第一位置对激光102进行第一脉冲。对激光102进行脉冲的每个相应实例发生在大约20纳秒(ns)的时间段内(例如，20ns的脉冲持续时间)。在一些实施方案中，脉冲持续时间范围为.001ns至100ns、.01ns至100ns、.1ns至100ns、少于1ns至50ns、1ns至50ns、0.1ns至30ns、0.1ns至25ns、0.1ns至20ns或5ns至20ns。一经完成激光102朝向第一位置的第一脉冲，系统10从第一位置到第二位置进行光束104的第二定位。一经完成光束104的第二定位，系统10进行激光102朝向第二位置的第二脉冲。对于样品台130的一个或多个定位，将该系列对光束104进行定位和对激光102进行脉冲重复预定数量的实例。在图3的坐标中，对于样品台130的第一位置，将对光束104进行定位和对激光102进行脉冲重复7次。然而，本公开不限于此。在一些实施方案中，在激光102的脉冲的每个瞬间完成之前，系统10至少部分地静止(例如，不主动地从微毛细管阵列132回收内容物)一段时间。在一些实施方案中，该部分静止时间段被用于进行微毛细管阵列132的成像。
在一些实施方案中，以以下范围内的速率进行样品台130的定位：0.1毫米/秒(mm/s)至20mm/s、0.1mm/s至10mm/s、0.5mm/s至20mm/s、0.5mm/s至15mm/s、1mm/s至15mm/s、1mm/s至10mm/s、5mm/s至15mm/s、5mm/s至10mm/s、7.5mm/s至15mm/s、或7.5mm/s至12.5mm/s、或9mm/s至11mm/s。在一些实施方案中，以小于10mm/s的速率或以小于或等于10mm/s的速率进行样品台130的定位。此外，在一些实施方案中，以以下范围内的速率进行光束104的定位(例如，通过导引系统100)：10mm/s至1,500mm/s、50mm/s至1,500mm/s、50mm/s至1,250mm/s、100mm/s至1,250mm/s、或100mm/s至1,000mm/s。此外，在一些实施方案中，以慢于光束104的速率，并因此以慢于导引系统100的速率进行定位样品台130的速率。例如，在一些实施方案中，经由导引系统100定位样品台130的速率与定位光束104的速率的比率范围为1:5至1:1,500、1:5至1:1,250、1:10至1:1,500、1:10至1,250、或1:10至1:1,000。在一些实施方案中，上述定位速率是瞬时速度或在定位时间段内取得的平均速度。
在一些实施方案中，激光导引系统100包括光学组，也被称为光学组件。光学组包括一个或多个光操纵仪器的布置，包括一个或多个透镜(例如，图1的物镜112)、一个或多个滤光片、一个或多个反射镜(例如，图1的反射镜124-1)，或它们的组合，用作成像系统的一部分，以至少引导从激光102发射的光束104。在一些实施方案中，调整每个透镜和/或反射镜124的位置和/或角度，以引导光源的光束(例如，激光104的光束104)朝向指定靶标，并且此类调整将在本领域技术人员的技术水平内，以根据成像系统的需要进行调整。
在一些实施方案中，用于仪器的光学组基于改进的显微镜。在一些实施方案中，显微镜提供具有高光收集效率的前端图像收集和光学变焦。在一些实施方案中，成像系统包括彩色照相机。在一些实施方案中，成像系统包括黑白照相机。在一些实施方案中，成像系统包括彩色照相机和黑白照相机。在一些实施方案中，光学组与针对特定波长、荧光团和/或比率染料优化的一个或多个发射滤光片(例如，图1的反射镜124-1、反射镜124-2和反射镜124-3)连接。
在一些实施方案中，激光导引系统100的光学组包括激光扫描组件，其朝向指定靶标(如第一微毛细管孔500-1)进一步引导从激光102发射的光束104。在一些实施方案中，激光扫描组件包括一个或多个反射镜124，其重新导向激光102的光束104的光程。例如，在一些实施方案中，一个或多个反射镜124包括第一反射镜124-1、第二反射镜124-2和第三反射镜124-3。在一些实施方案中，反射镜124中的一个或多个是滤光片。此外，在一些实施方案中，反射镜124中的一个或多个是二色性的。例如，在一些实施方案中，反射镜124中的一个或多个包括诸如二色性的反射镜或二色性的滤光片的物质。在一些实施方案中，第一反射镜124-1是被配置为操作一个或多个照相机120的视场并朝向一个或多个照相机120导向光(例如，光束122)的反射性反射镜。在一些实施方案中，第二反射镜124-2包括与从光源116发射的电磁辐射118相互作用的二色性物质。例如，在一些实施方案中，第二反射镜124-2是辐射荧光二色性反射镜。因此，在一些实施方案中，第二反射镜124-2允许传输由一个或多个照相机120捕获的第一光谱(例如，可见光)的(例如，光束122)，以通过第二反射镜124-2，同时反映从荧光光源116发射的第二光谱(例如，UV光)的传输(例如，光束118)。此外，在一些实施方案中，第三反射镜124-3是激光二色性反射镜。因此，在一些实施方案中，第三反射镜124-3允许第四光谱的传输(例如，光束104)，同时反映第三光谱(例如，光束104的波长)的传输(例如，光束104)。在一些实施方案中，第四光谱包括第一和第二光谱。
在一些实施方案中，光导引系统100的光组件包括检流计系统106。检流计系统106包括多个反射镜和控制检流计系统106的多个反射镜中的每个反射镜定位的检流计。朝向检流计系统106导向激光102的光束104，并根据多个反射镜的定位，朝向微毛细管阵列132或导引系统100的光学组件的其他不部件(例如，扫描透镜108、镜筒透镜110、二色性反射镜124-3、物镜112或它们的组合)导向光束1004。在一些实施方案中，检流计系统106允许一个或多个轴，如两个轴(例如，笛卡尔系的X轴和Y轴)中光束104的定位。在一些实施方案中，检流计系统106包括商业检流计系统，如Thorlabs Galvo反射镜组件(GVSM002)或ScannerMAXCompact-506RE。如上文所述，在一些实施方案中，检流计系统106以显著大于样品台130的定位速率(例如，10倍、100倍、1000倍等)的速率定位，允许激光102以高水平的准确度和精确度快速连续地朝向不同靶标发射光束104的脉冲。
参考图4，在一些实施方案中，检流计系统106将从激光102发射的光束104高速导向一个或多个定义的坐标。例如，在一些实施方案中，微毛细管阵列132的表面(例如，面向物镜112的表面)被映射到坐标系。因此，在一些实施方案中，系统10的计算机系统向检流计系统106提供指令，以将光束104导向预定的一系列定义坐标。在一些实施方案中，激光102在系列中的每个定义的坐标处对光束104脉冲相同数量的脉冲。如图4所示，激光102的光束104用激光的每个脉冲与物体表面相互作用。在图4所示的实施方案中，光束104首先靶向第一坐标，并且在一段时间内以线性方式行进通过一系列定义的坐标，这以每秒大约500个光束脉冲104的速率发生。然而，本公开不限于此。在一些实施方案中，并非以坐标行或列行进，检流计系统106朝向一簇靶标中的靶标导向从激光102发射的光束104。在一些实施方案中，激光脉冲范围为100次脉冲/秒至1000次脉冲/秒。在一些实施方案中，激光脉冲为约100次脉冲/秒、约200次脉冲/秒、约300次脉冲/秒、约400次脉冲/秒、约500次脉冲/秒、约600次脉冲/秒、约700次脉冲/秒、约800次脉冲/秒、约900次脉冲/秒或约1000次脉冲/秒。在一些实施方案中，激光脉冲为500次脉冲/秒。
参考图5，在一些实施方案中，检流计系统106将从激光102发射的光束104高速导向一个或多个微毛细管孔500(例如，识别的靶标)。例如，在一些实施方案中，每个分别定义的坐标代表微毛细管阵列132中对应的微毛细管孔500的位置。因此，检流计系统106将光束104导向第一微毛细管孔500-1的第一定义坐标，并且对激光102进行脉冲以从第一微毛细管孔500-1中提取内容物。检流计系统106还将光束104导向第二微毛细管孔500-2的第二定义坐标，并且对激光102进行脉冲以从第二微毛细管孔500-1中提取内容物。在图5中，颜色相对较深的微毛细管孔500描绘了先前靶向的微毛细管孔50。
在一些实施方案中，检流计系统106将从激光102发射的光束104导向每个微毛细管孔500的多个特定部分以提高样品回收率。例如，参考图6A和图6B，在一些实施方案中，检流计系统106将从激光102发射的光束104导向微毛细管孔500的多个内部部分。在图中，靶标600(例如，图6B的靶标600-1、图7E的靶标600-5等)表示激光102朝向通过激光102脉冲的指定靶标的多次脉冲(例如，靶标600-1到靶标600-5中的每一个表示激光102的大约10至20次单独的脉冲，速率为20kHz/靶标600)。
在一些实施方案中，微毛细管孔500的样品(例如，包括图6B的细胞604-1的样品602-i)包括一个或多个不透明珠或类似的吸收材料。因此，在一些实施方案中，希望用激光102的光束104照射一个或多个不透明珠，以从微毛细管孔500回收内容物。在此类实施方案中，光束104照射一个或多个不透明珠中的每一个的可见表面区域的一部分，以使到吸收材料的能量传递最大化。在一些实施方案中，激光102的光束104被导向多个靶标，这些靶标共同消耗微毛细管孔500的表面区域的大量部分(例如，在30％到100％的范围内的部分)。例如，图6A示出了多个微毛细管500-1至500-i，其中每个包括多个形成为十字形(例如“+”)形状的靶标600。
参考图7A-图7L，在一些实施方案中，在单个微毛细管孔500内由激光102脉冲的多个靶标600的形状是根据光束104的横截面和微毛细管孔的形状来确定的。在本实施方案中，光束104的横截面和微毛细管孔500的形状都假定为圆形(例如，如图11A所示的圆形光束靶标600-1)。然而，本公开不限于此。在一些实施方案中，光束104的横截面是非圆形形状(例如，如图11B所示的新月形或刀片状的形状靶标600-1)。在一些实施方案中，光束104作为点激光导向靶标(例如，由于激光的相干性质，基本上不改变光束的横截面)，并且靶标以相应的圆形被照射。通过以上形状和形式的充填效率来描述用多个均匀的内部整体(例如，非同心圆)圆(例如，光束104的横截面)填充更大的外圆(例如，微毛细管孔500)的数学最优解决方案。该填充效率是较大圆的面积相对于多个均匀较小的共同消耗的面积的比率。参见，Kravitz,S.,1967,“Packing Cylinders into Cylindrical Containers,”Math.Mag.,40,第65页；Friedman,E.,“Circles in Circles,”Stetson University，印刷，其中每一项均在此通过引用整体并入。在图7A-图7L中，“r”表示最小已知外圆(例如，微毛细管孔500)的半径，其内部单位圆的数量逐渐增加。
参考图8A-图10，在一些实施方案中，样品不含吸收材料。因此，从微毛细管阵列132中提取内容物包括将激光102的光束104导向(例如，使用检流计系统106)样品内容物和微毛细管孔500之间的界面(例如，微毛细管孔500的内壁)。在一些实施方案中，将激光102的光束104导向界面包括朝向多个靶标对激光进行脉冲。在一些实施方案中，朝向界面的脉冲的多个靶标600形成为圆形，其中每个相应的靶标围绕该圆处于相等的间隔。例如，参考图9A，描绘了用于1至14个靶标范围内的多个靶标的多个靶标的内部间距。虽然本公开不限于多个靶标中的特定数量的靶标，但是图10示出了相对于靶标数量的回收效率。如图10所示的，在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量被确定为大于或等于5。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量被确定为大于或等于6。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量被确定为大于或等于8。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于80％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于85％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于90％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于95％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于96％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于97％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于98％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于或大于99％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量通过回收百分比确定，其中回收百分比等于100％。在一些实施方案中，每个微毛细管孔500的靶标的最佳数量被确定为大于或等于10。然而，本公开不限于此，因为最佳数量可以取决于多种因素。参考图9B，针对三个总靶标示出了射击多个靶标600的顺序。在所示的实施方案中，激光102的光束104被导向第一靶标600-1，然后定位以将光束104导向第二靶标600-1，并最后导向第三靶标600-3。虽然图9B以顺时针的顺序描绘了定位和导向，但本公开不限于此。例如，在一些实施方案中，确定脉冲多个靶标600的顺序，以使在各个靶标之间的转移期间通过光束104共同横穿的距离最小化。
在一些实施方案中，检流计系统106包括检流计谐振扫描器。利用检流计谐振扫描器提供了导引系统100的改进的定位能力。例如，检流计谐振扫描器提高了将激光器102从第一微毛细管孔500-1定位到第二微毛细管孔500-2的速率等，并因此改善了从微毛细管阵列132提取和回收内容物的经过时间。例如，在一些实施方案中，检流计谐振扫描器增加了从微毛细管回收内容物的速度，范围从8倍到12倍(例如，对于给定数量的提取和回收，回收通量从1小时到6分钟增加了10倍)。在一些实施方案中，检流计谐振扫描器是商购可获得的检流计谐振扫描器，如Thorlabs LSK-GR08。
参考图11A和图11B，在一些实施方案中，系统10的导引系统100包括一个或多个空间光调制器，其扭曲光束102的形状(例如，横截面)，从而允许光束104用非圆形形状对靶标进行脉冲。一个或多个空间光调制器利用置于第一透明薄膜晶体管(TFT)和硅半导体之间的硅上液晶(LCoS)装置。一个或多个空间光调制器产生具有单独可寻址像素的高分辨率、高速反射式相位调制，允许每个可寻址像素独立地导向光束102的一部分，并因此操纵光束104的横截面。此外，在其中系统包括一个或多个空间光调制器的此类实施方案中，可以用激光102的单个脉冲对多于一个靶标进行脉冲，或者类似地，可以在单个视场内通过激光102对更大尺寸的靶标进行脉冲，进一步减少了从微毛细管阵列中提取和回收样品的经过时间。例如，图11A示出了光束104在第一靶标600-1处的横截面，其通常与点激光相关联。另一方面，由于一个或多个空间光调制器的添加单独可寻址的像素产生高分辨率，图11B的第二靶标600-2具有形成为新月形或刀片状形状的横截面。本领域的技术人员将知道光束104的其他合理的横截面，这些横截面在本文中没有明确考虑。在一些实施方案中，一个或多个空间光调制器包括商业空间光调制器，如Holoeye Pluto-2或Thor Exulus-HD1。
在一些实施方案中，系统10利用数字微镜器件将激光102的光束104导向具有可配置横截面的靶标(例如，如上文所述)。在一些实施方案中，利用数字微镜器件代替空间光调制器。数字微镜器件包括置于器件表面上的多个反射镜。在一些实施方案中，多个反射镜范围为1·103个反射镜至1·106个反射镜、1·104个反射镜至1·106个反射镜、1·104个反射镜至9·105个反射镜、1·104个反射镜至7·105个反射镜、或5·104个反射镜至5·105个反射镜。在一些实施方案中，数字微镜器件是商业数字微镜器件，如Mirrorcle集成的MEMS反射镜(A5M24.1-2400AL)。
在一些实施方案中，激光导引系统100的光学组包括扫描透镜108。扫描透镜108提供平面图像平面，其具有穿过平面的最小的光学像差，并且在一些实施方案中，具有相对较大的视场。在一些实施方案中，大的视场对于本公开的物镜112的单视场特别有用。在一些实施方案中，扫描透镜108是商业扫描透镜，如Thorlabs大视场扫描透镜或Thorlabs扫描透镜(LSM03-VIS)。
在一些实施方案中，光学组包括镜筒透镜110。在一些实施方案中，镜筒透镜110包括远心镜筒透镜。在一些实施方案中，镜筒透镜110是商购可获得的镜筒透镜，如Thorlabs标准镜筒透镜(TTL-200)或Thorlabs激光扫描镜筒透镜(TL200-CLS2)。
在一些实施方案中，激光导引系统100包括一个或多个高分辨率照相机120。在一些实施方案中，一个或多个照相机120包括黑白照相机。在一些实施方案中，一个或多个照相机120包括彩色照相机。在一些实施方案中，激光导引系统100包括一个实时高分辨率照相机和一个彩色照相机。在一些实施方案中，成像系统由一个彩色照相机和一个单色照相机组成，以便扩增检测范围。然而，本公开不限于此。例如，在一些实施方案中，一个或多个照相机120包括帮助回收微毛细管阵列的内容物的热成像照相机(例如，红外照相机)。
在一些实施方案中，虽然两个照相机看到完全相同的视场，但它们捕获不同的信息。例如，彩色照相机捕获RGB光，而单色(例如黑白)照相机捕获同一场中的透射光。在一些实施方案中，为了捕获两种不同的图像，可以采用与图像捕捉过程同步的高速脉冲光源。在一些实施方案中，为了捕捉两种不同的图像，可以结合两个照相机采用高速脉冲光源(例如，激光102)。
在一些实施方案中，导引系统100包括成像导引系统，用于使用一个或多个照相机120对微毛细管阵列132进行成像。在一些实施方案中，成像导引系统促进控制或照相机120的控制，如捕获序列、图像捕获设置等的控制。在一些实施方案中，成像导引系统包括一个或多个反射镜124-1，其为一个或多个照相机提供新的视场。在一些实施方案中，一个或多个反射镜124-1包括一个或多个反射镜中的每个照相机120的相应反射镜子集，允许每个照相机具有单独可配置的视场。此外，在一些实施方案中，成像系统的一个或多个反射镜124-1或者是固定的或者提供一个或多个自由度。
在一些实施方案中，光学组与针对特定波长、荧光团和/或比率染料优化的一个或多个发射滤光片连接。
现在已经公开了用于从微毛细管阵列132回收样品内容物的系统10的细节，根据本公开的实施方案，参考图2-图11B所公开的关于用于实施系统10的方法200的过程和特征的流程图的细节。
框202。参考图2的框202，提供了用于回收样品(例如，图6B的样品602-1)内容物的系统(例如，图1的系统10)。系统10包括微毛细管阵列132，其还包括多个微毛细管孔500。在一些实施方案中，每个分别的微毛细管孔500容纳不同微毛细管孔500的独特的样品或样品的复制品。因此，每个微毛细管孔500被配置为容纳生物物质的分别的样品602。如上文所述，在一些实施方案中，生物物质包括一个或多个细胞。这些一个或多个细胞包括哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或以上的组合。在一些实施方案中，一个或多个细胞是不完整的并且不再能够进行细胞生长。
在一些实施方案中，微毛细管阵列与样品台(例如，图1的样品台130)连接，其有助于促进样品回收。在一些实施方案中，样品台130包括接收提取样品602的收集载玻片134。
框204。参考框204，该方法还包括定位激光102，以靶向微毛细管阵列132的多个微毛细管孔500中的第一微毛细管孔500-1。
在一些实施方案中，定位激光102利用导引系统(例如，图1的激光导引系统100)，其允许激光102保持固定，而系统10的其他部件(例如，图1的物镜112、图1的样品台130、图1的检流计系统106等)相对于激光102移动。在一些实施方案中，激光导引系统100包括激光102、激光扫描组件(例如，检流计系统和/或反射镜)、检流计谐振扫描器等)、扫描透镜(例如，图1的扫描透镜108)系统和镜筒透镜(例如，图1的镜筒透镜106)。在一些实施方案中，激光导引系统是商业扫描系统，如ScannerMAX Compact-506RE系统。此外，在一些实施方案中，样品台130的定位速率小于激光导引系统100的定位速率。在一些实施方案中，激光扫描组件包括改变来自激光102的光束形状的装置。在一些实施方案中，装置包括检流计系统和/或反射镜106、数字微镜器件、一个或多个空间光调制器，或以上的组合。
在一些实施方案中，激光102以213nm至1380范围内的离散波长发射光束(例如，图1的光束104)。例如，在一些实施方案中，来自激光102的光束104的波长为355nm、514nm、532nm或1064nm。
在一些实施方案中，从多个微毛细管孔500中鉴定第一微毛细管孔500-1。例如，在一些实施方案中，在定位激光102期间，一个或多个照相机(例如，图1的一个或多个照相机120)和/或荧光光源116对一些或整个微毛细管阵列132进行成像。在一些实施方案中，在从微毛细管阵列提取内容物期间，一个或多个照相机120对一些或整个微毛细管阵列132进行成像。在一些实施方案中，通过从容纳在微毛细管孔500中的细胞表达抗体来鉴定用于回收的毛细管孔500。
框206。参考框206，该方法包括朝向第一微毛细管孔500-1将对激光102进行脉冲。脉冲破坏了微毛细管孔中样品的表面张力，从而允许提取样品。在一些实施方案中，激光102脉冲第一微毛细管孔500-1的多个子部分(例如，靶标600)。在一些实施方案中，多个子部分被置于微毛细管孔500的内部部分中(例如，图6B的靶标600-5)、置于微毛细管孔500的内表面与微毛细管孔500的内容物(例如，图8B的靶标600-2)之间的界面处，或以上的组合。在一些实施方案中，激光102脉冲范围为2个子部分至20个子部分、2个子部分至14个子部分、2个子部分至14个子部分，或2至10个子部分。在一些实施方案中，激光102在每个分别的子部分处脉冲多次。例如，在一些实施方案中，激光102脉冲范围为在子部分处1次至30次、在子部分处1次至25次、在子部分处1次至20次，或在子部分处大于或等于5次。此外，在一些实施方案中，激光102脉冲频率范围为1kHz至60kHz、1kHz至40kHz、5kHz至40kHz、15kHz至25kHz或5kHz至10kHz(例如，5,000至10,000个激光脉冲/秒)。因此，在一些实施方案中，激光102的每次脉冲具有的持续时间范围为0.05ns至100ns、0.1ns至50ns、0.1ns至40ns、0.1ns至25ns、0.1ns至20ns或5ns至20ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为5纳秒(ns)至20ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为5纳秒(ns)至15ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为8纳秒(ns)至18ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为10纳秒(ns)至18ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为10纳秒(ns)至15ns。在一些实施方案中，激光102的每次脉冲的持续时间范围为15ns。在一些实施方案中，脉冲持续时间为大约15ns。例如，在一些实施方案中，激光102脉冲每个相应微毛细管孔500的5个子部分(例如，靶标600)。每个相应微毛细管孔500的相应子部分的每个脉冲发射10次激光脉冲。此外，10次激光脉冲中的每次的持续时间为15ns。
框208。参考框208，该方法包括从第一微毛细管孔500-1提取样品内容物以回收内容物。在一些实施方案中，将来自微毛细管阵列的内容物回收在收集载玻片(例如，图1的收集载玻片134)中，使得从相应微毛细管孔500回收的每个样品被接收到收集载玻片的相应孔中。在一些实施方案中，在回收样品后干燥收集载玻片的孔(例如，孔不包括流体)。在一些实施方案中，在从微毛细管阵列130回收样品后将裂解缓冲液加入收集载玻片的孔中。
现在已经公开了用于从微毛细管阵列132回收样品内容物的方法200的细节，根据本公开的实施方案，参照图12公开了关于用于实施系统10的方法200的工作流的细节。
现在已经公开了用于从微毛细管阵列132回收样品内容物的工作流1200的细节，根据本公开的实施方案，公开了关于提取、回收和合成内容物的实例的细节。
在工作流1200的一些实施方案中，从第一微毛细管孔提取内容物，从而回收第一微毛细管孔的内容物的步骤(C)。在工作流1200的一些实施方案中，将提取和回收提取(例如，细胞提取1210)的内容物置于收集载玻片上。在一些实施方案中，收集载玻片包括含有裂解缓冲液的一个或多个收集孔，其中在回收内容物之前将所述裂解缓冲液加入一个或多个收集孔中。在一些实施方案中，收集载玻片包括不含有裂解缓冲液的一个或多个收集孔，其中在(C)回收内容物之前未将所述裂解缓冲液加入一个或多个收集孔中。在一些实施方案中，该方法还包括在(C)提取和回收之后，将内容物置于收集载玻片上并冷冻收集载玻片。在一些实施方案中，收集载玻片随后被解冻。在一些实施方案中，对解冻的收集载玻片进行处理以使RNA变性。在一些实施方案中，对解冻的包括变性RNA的收集载玻片进行RT-PCR扩增。在一些实施方案中，对RT-PCR扩增产物进行定量。在一些实施方案中，对RT-PCR扩增产物进行测序。在一些实施方案中，该方法还包括在(C)提取和回收之后，将内容物置于收集载玻片上，并将收集载玻片的内容物转移到PCR板上，并冷冻PCR板。在一些实施方案中，PCR板随后被解冻。在一些实施方案中，对解冻的PCR板进行处理以使RNA变性。在一些实施方案中，对解冻的包括变性RNA的PCR板进行RT-PCR扩增。
在一些实施方案中，被回收的样品包括变体蛋白群和/或编码变体蛋白的核酸群，其在一些实施方案中可以使用生物表达系统中的遗传文库产生，例如在体外(即无细胞)表达系统或在体内或细胞表达系统中。示例性的细胞表达系统包括例如动物系统(例如哺乳动物系统)、真菌系统(例如酵母系统)、细菌系统、昆虫系统或植物系统。在具体实施方案中，表达系统是哺乳动物系统或酵母系统。在具体实施方案中，表达系统是禽类系统(例如，鸡系统)。表达系统，无论是细胞的还是无细胞的，通常包括编码变体蛋白群的遗传物质文库。细胞表达系统提供的优点是具有所期望表型的细胞，例如表达特定目的变体蛋白的细胞(如能够以高亲和力与固定的靶分子缔合的变体蛋白)可以生长和繁殖，从而促进并简化由细胞表达的目的蛋白质的鉴定和表征。在一些实施方案中，生物表达系统包含哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系选自CHO-K1、CHO-S、HEK293T和/或这些细胞类型的任何衍生物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是CHO-K1。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是CHO-S。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是HEK293T。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系选自人、小鼠和/或大鼠杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是人杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是小鼠杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是大鼠杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是B细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞包括B细胞。编码较大变体蛋白质群的遗传文库在生物工程领域是众所周知的。此类文库通常被用于依赖定向进化过程的系统中，以鉴定具有有利性质的蛋白质，如与靶分子的高亲和力结合、稳定性、高表达或特定光谱(例如荧光)或酶促活性。文库通常包括与来自宿主表达系统的序列的基因融合，例如导向亚细胞定位的蛋白质片段，其中表达的变体融合蛋白群由靶向片段导向至细胞或病毒颗粒的特定位置，以用于变体蛋白群的活性筛选的目的。如本领域所熟知的，可以使用常规生物工程技术产生大量变体蛋白(例如，106个变体、108个变体、1010个变体、1012个变体或甚至更多变体)。此类文库可包括本文所述的任何变体蛋白质，包括抗体、抗体片段、单链可变片段或天然蛋白质配体。在一些实施方案中，本发明的系统允许VH/VL(可变重链和可变轻链)的准确配对。
在一些实施方案中，变体蛋白(或由核酸编码的变体蛋白质)是可溶性蛋白，例如，由细胞表达系统分泌的可溶性蛋白。示例性的可溶性变体蛋白包括抗体和抗体片段、可替代蛋白支架(如二硫键键合的肽支架)、细胞表面受体蛋白的胞外结构域、受体配体(诸如例如G蛋白偶联受体配体)、其他肽激素、凝集素等。然而，在其他实施方案中，可能期望变体蛋白是膜结合蛋白，例如，在表达系统中保持与细胞或病毒颗粒表面结合的蛋白。根据工作流1200分离所期望微毛细管的内容物从而能识别别和表征内容物。
在一些实施方案中，微毛细管孔中的内容物包括遗传物质。在一些实施方案中，样品包括具有所期望表型的一个或多个完整细胞的遗传物质。在一些实施方案中，一个或多个完整细胞的表型识别B细胞。在一些实施方案中，一个或多个完整细胞的表型识别B细胞的亚组。在一些实施方案中，遗传物质包括抗体序列。在其他实施方案中，抗体序列包括重链和轻链。在一些实施方案中，遗传物质包括mRNA。在其他实施方案中，对mRNA进行逆转录。在其他实施方案中，在单独的反应中进行重链和轻链的扩增。
实施例1：细胞提取&裂解
参考图12，提供了用于从微毛细管阵列132回收样品内容物的工作流1200的框架。
步骤1210。在微毛细管阵列132内，靶标样品被识别，如目的靶抗体，用于回收和测序。因此，激光(例如，图1的激光102)从表达目的抗体的微毛细管阵列132(例如图2的方法200)中提取一个或多个细胞。在提取后，在收集载玻片(例如，图1的收集载玻片134)的相应孔中回收来自微毛细管孔500(例如，图6B的微毛细管孔500-3)的每个相应的细胞(例如，图6B的细胞604-1)。如上文所述，本公开的一方面涉及提供不要求细胞在提取后能够进行细胞生长，而是要求细胞是完整的回收方法。因此，本公开的系统和方法允许将细胞提取和回收到干燥环境(例如，空的孔)中。
步骤1220。制备裂解缓冲液。裂解缓冲液包括水、重组RNA酶抑制剂、triton(例如，triton 100-X)、多种RT引物和dNTP混合物。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含水、重组RNA酶抑制剂、triton、RT引物和dNTP组合。此外，在一些实施方案中，RT引物是基因特异性的或非基因特异性的。在一些实施方案中，步骤1220的裂解缓冲液的制备在工作流1200的提取(步骤1210)之前进行，以考虑时间。
提供裂解缓冲液至收集载玻片134(例如，图1的收集载玻片134)的每个孔中。在一些实施方案中，收集载玻片134的每个孔包括至少8μl的裂解缓冲液。在一些实施方案中，收集载玻片134的每个孔包括浸没孔的下端部所需的最少体积的裂解缓冲液。在一些实施方案中，收集载玻片134包括18孔载玻片。在一些实施方案中，工作流1200同时利用多个收集载玻片。在一些实施方案中，提供裂解缓冲液至收集载玻片134的孔的子集中。在一些实施方案中，裂解缓冲液的制备和供应在提取(步骤1210)之前进行，允许将细胞回收到潮湿环境中。在一些实施方案中，在将裂解缓冲液供应到收集载玻片134的每个孔后，对收集载玻片134施加搅动以确保每个细胞被裂解缓冲液包被或浸没。
将收集载玻片134的样品转移到PCR板(例如，图13的PCR板1302)，以用于RNA变性和进一步分析。如图13A-图13B所示，收集载玻片134容纳在托盘1300中，该托盘1300包括可拆卸地连接的第一部分和第二部分。在转移样品时，每个收集载玻片134具有一个面向上的开口，该开口暴露于周围环境(例如，收集载玻片134的每个孔没有加盖)并容纳在托盘1300的第一部分中，同时一个或多个PCR条盖1304被容纳在托盘1300的第二部分中。在一些实施方案中，一个或多个PCR条盖1304的数量对应于收集载玻片134的孔的数量和/或PCR板1302的孔的数量。如图13A所示，PCR板1302被倒置，使得每个孔的开口面向收集载玻片的开口。将包括PCR条盖1304的托盘1300的第二部分连接到托盘1300的第一部分。在一些实施方案中，直到托盘1300的第二部分与第一部分连接，托盘1300的包括收集载玻片134的第一部分才被重新定向(例如，托盘1300的第一部分的下端部分在图13A和图13B所示的上述转移部分中保持静止并面向下)。在一些实施方案中，一旦托盘1300被连接，并且收集载玻片134、PCR板1302和PCR盖条1304被固定在托盘1300内，托盘1300被重新定向，使得托盘1300的第一部分的下端部分现在朝上，如图13C所示。在一些实施方案中，包括收集载玻片134、PCR板1302和PCR盖条1304的连接托盘1300由离心机容纳，迫使细胞裂解物从收集载玻片134的孔进入PCR板132的孔的下端部分中，在收集载玻片134的孔中几乎没有或没有残留液体，同时还压实细胞裂解物。在一些实施方案中，托盘1300的离心进行0至180s、30s至90s、45s至75s范围内的一段时间。在一些实施方案中，对托盘1300进行离心大约约60秒的一段时间。在一些实施方案中，以2,000G至3,500G、2,250G至3,500G、2,500G至3,500G、或2,750G至3,250G范围内的相对离心力(例如，G力)进行对托盘1300的离心。在一些实施方案中，以大约约3,000G的相对离心力对托盘1300进行离心。
在一些实施方案中，从收集载玻片134中回收初始体积的细胞裂解物。因此，初始体积被提供给PCR板孔的第一孔和第二孔，允许来自一个细胞的细胞裂解物被供应到多于一个孔中。在一些实施方案中，初始体积为8微升(μL)，允许来自相同细胞的每个相应PCR板的每孔4μL细胞裂解物的均等分布。例如，在一些实施方案中，第一孔被用于轻链测序，且第二孔被用于重链测序。
一旦一个或多个细胞被提取、回收并转移到PCR板，PCR板就暴露于快速的负温差(例如快速冷冻)，以冷却细胞并固化收集载玻片134的内容物。细胞的这种冷却完成了细胞的裂解，并保留了细胞的基因组内容物。在一些实施方案中，通过将细胞暴露于-90℃至-70℃、-88℃至-72℃、-86℃至-74℃、-84℃至-76℃、或-82℃至-78℃范围内的温度，来进行细胞的快速冷却。在一些实施方案中是通过将细胞暴露于大约约-80℃的温度来进行细胞的快速冷却。在一些实施方案中，通过将细胞容纳并由此将细胞暴露于固体二氧化碳(也称为干冰)来进行细胞的快速冷却。在一些实施方案中，细胞的快速冷却进行一段时间，时间范围为2.5分钟至7.5分钟、3分钟至7分钟、3.5分钟至6.5分钟、4分钟至6分钟，或从4.5分钟到5.5分钟。在一些实施方案中，细胞的快速冷却进行大约约5分钟的时间段。因此，收集的载玻片134被解冻，使内容物变成流体相。在一些实施方案中，通过将细胞暴露于0℃至10℃、0℃至8℃、或2℃至6℃范围内的温度来进行解冻。在一些实施方案中，通过将细胞暴露于大约约4℃的温度来进行解冻。在一些实施方案中，解冻在冰床上进行。在一些实施方案中，当将细胞裂解物容纳在收集载玻片134内时进行冷冻和解冻，使得在收集载玻片134内解冻之后将细胞裂解物转移到PCR板1302。
步骤1230。在一些实施方案中，如其中在收集载玻片134被冷冻和解冻的实施方案中，PCR板1302高速旋转，迫使细胞裂解物到达相应孔的下端部分。在一些实施方案中，如上文关于离心托盘1300所述旋转PCR板1302。一旦暴露于高旋转速度，PCR板1302被容纳在热循环仪中，在第一预定温度下进行第一预定时间段。在一些实施方案中，热循环仪的第一温度范围为78℃至66℃、76℃至68℃或74℃至70℃。在一些实施方案中，热循环仪的第一温度为大约约72℃。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第一预定时间段范围为2分钟至5分钟、2分钟至4分钟、或2.5分钟至3.5分钟。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第一预定时间段为大约约3分钟。此外，在一些实施方案中，在高速旋转PCR板1302和将PCR板1302容纳在热循环仪内的步骤之间，PCR板1304保持在预定温度下。在一些实施方案中，预定温度范围为0℃至10℃、0℃至8℃、或2℃至6℃。在一些实施方案中，预定温度大约约为4℃。在一些实施方案中，保持在预定温度是在冰床上进行的。因此，对收集载玻片134进行使RNA变性的处理。
步骤1240。制备逆转录(RT)制剂。在一些实施方案中，逆转录制剂在每次使用之前制备(例如，工作流1200的每个实例)。逆转录制剂包括10x RT缓冲液、水、重组RNA酶抑制剂和逆转录酶。向PCR板1302的每个孔中提供一定体积的RT制剂，其中包括细胞裂解物。在一些实施方案中，RT制剂的体积范围为2μL至10μL或4μL至8μL。在一些实施方案中，RT制剂的体积大约约为6μL。因此，包括细胞裂解物和RT制剂的PCR板1302在第二预定温度下容纳在热循环仪中，持续第二预定时间段。在一些实施方案中，热循环仪的第二温度范围为48℃至36℃、46℃至38℃或44℃至40℃。在一些实施方案中，热循环仪的第二温度为大约约32℃。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第二预定时间段范围为80分钟至100分钟、82分钟至98分钟、84分钟至96分钟、86分钟至94分钟，或88分钟至92分钟。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第二预定时间段为大约约90分钟。热循环仪中的该第二容纳提供逆转录。
一旦完成逆转录，PCR板1302还被容纳在第三预定温度下的热循环仪中，持续第三预定时间段。在一些实施方案中，热循环仪的第三温度范围为78℃至62℃、76℃至64℃、74℃至66℃、或72℃至68℃。在一些实施方案中，热循环仪的第三温度为大约约70℃。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第三预定时间段范围为10分钟至20分钟、12分钟至18分钟、或14分钟至16分钟。在一些实施方案中，暴露于热循环仪的第三预定时间段为大约约15分钟。热循环仪中中的该第三容纳提供了逆转录酶。此外，在一些实施方案中，PCR板1304在工作流程2100的上述逆转录的步骤子集中的每个步骤之间保持在预定温度。在一些实施方案中，预定温度范围为0℃至10℃、0℃至8℃、或2℃至6℃。在一些实施方案中，预定温度大约约为4℃。在一些实施方案中，保持在预定温度是在冰床上进行的。
步骤1250。制备PCR制剂，包括PCR主制剂、水和基因特异性正向和/或反向引物。将一定体积的PCR制剂供应到PCR板1304的每个反应孔。在一些实施方案中，PCR制剂的体积范围为10μL至20μL、12μL至18μL、或14μL至16μL。在一些实施方案中，PCR制剂的体积为大约约15μL。在供应PCR制剂之后，PCR板1304被容纳在热循环仪中，以进行热循环。在一些实施方案中，热循环包括将PCR板1304暴露于第四预定温度，持续第四预定时间段，将PCR板1304暴露于第五预定温度，持续第五预定时间段，以及将PCR板1304暴露于热循环的其他子热循环。在一些实施方案中，第四预定温度为大约约37℃，并且第四预定时间段为大约约30分钟。在一些实施方案中，第五预定温度为大约约95℃，并且第五预定时间段为大约约3分钟。在一些实施方案中，热循环的子热循环包括将PCR板1304暴露于第六预定温度达第六预定时间段的第一条件、将PCR板1304暴露于第七预定温度达第七预定时间段的第二条件，以及将PCR板1304暴露于第八预定温度达第八预定时间段的条件。在一些实施方案中，第六预定温度为大约约98℃，并且第六预定时间段为大约约20s。在一些实施方案中，第七预定温度为大约约65℃，并且第七预定时间段为大约约15s。在一些实施方案中，第八预定温度为大约约72℃，并且第八预定时间段为大约约1分钟。在一些实施方案中，在进行工作流1200之前，将热循环的子热循环重复多次重复。在一些实施方案中，子热循环的重复次数范围为40次重复至50次重复、42次重复至48次重复、或44次重复至46次重复。在一些实施方案中，子热循环的重复次数为45次重复。在一些实施方案中，将子热循环的最后重复的第三条件维持额外的时间段(例如，最后重复6分钟而不是每次后续重复的1分钟)。在一些实施方案中，额外的时间段范围为1分钟至10分钟、或1分钟至9分钟、3分钟至7分钟、或4分钟至6分钟。在一些实施方案中，额外的时间段是5分钟。保持在4℃(或冰上)。此外，在一些实施方案中，PCR板1304在工作流2100的上述逆转录步骤的子集中的每个步骤之间保持在预定温度。在一些实施方案中，预定温度范围为0℃至10℃、0℃至8℃或2℃至6℃。在一些实施方案中，预定温度为大约约4℃。在一些实施方案中，保持在预定温度是在冰床上进行的。因此，PCR板1302进行RT-PCR扩增。在一些实施方案中，时间段
步骤1260。进行测序以回收RT-PCR扩增产物的基因组。在一些实施方案中，对RT-PCR扩增产物进行定量。
因此，本公开提供了用于从微毛细管阵列中提取和回收单个细胞的改进系统和方法。细胞的提取以高水平的精度和准确度进行，允许激光靶向微毛细管阵列的一个或多个部分，以优化提取和回收。此外，本公开的系统和方法产生高通量(例如，大于或等于大约约1·106次提取/小时。高通量与高水平的精确度和准确度的靶向组合极大地提高了回收的提取质量和效率。此外，本公开的系统和方法不需要包括额外的样品组分或操作(如辐射吸收材料)，从而简化和提高筛选技术的效率。此外，本公开的系统和方法允许回收不需要能够进行细胞生长(例如，活的)的完整细胞。与维持细胞需要潮湿环境相比，完整但未生长的细胞的这种回收允许将细胞回收到干燥环境中。另外，根据本公开的系统和方法回收完整的但未生长的细胞允许本公开的设计者省略在几天内培养细胞，从而大大减少从开始提取细胞到开始对细胞测序的经过的时间段。
实施例2：XPLORATION NGS工作流
在另一实例中，本公开还包括在微毛细管中从具有所期望表型的细胞中回收所期望遗传物质的方法。下面以及图14和图15中呈现了高水平概述：
步骤1：在该步骤中，基于本公开中所包含的方法经由激光回收具有所期望功能活性的细胞。
步骤2：接下来，细胞基于本公开中所包含的方法进行用于NGS的RT和PCR制备。这些步骤包括裂解、逆转录、单细胞条形码化、全板条形码化，并产生NGS就绪序列。
xPloration B细胞测定：首先，将mAb分泌物(OmniChicken脾细胞(～1个细胞/μPore))和靶珠(链霉亲和素珠上的颗粒蛋白前体-生物素(2.8μm))组合。接下来，利用检测抗体(山羊抗鸡IgY(H+L)–Alexa Fluor488)将细胞加载到阵列中，创建均质测定。将细胞孵育三小时，然后对它们进行成像并量化数据。结合分析如图16所示，且定量和分选如图17所示。
扩增的NGS组：筛选后，在96孔板中分离细胞。进行单细胞逆转录，然后分别扩增可变重链和可变轻链。回收的具有成对重链和轻链的细胞总数为569个(75％)。独特的H3/L3克隆型总数为280个。独特序列的总数为485个。每个细胞连接的HCDR3-LCDR3之间的成对距离如图18所示。
结果：实验结果表明，更深层次的表征鉴定了新的克隆型家族(参见图19)。xPloration筛选鉴定了通过凝胶封装微环境(GEM)测定鉴定的大多数克隆型(如Izquierdo等人，High-efficiency antibody discovery achieved with multiplexed microscopy,Microscopy,2016,65(4):341-352中所述，通过引用并入本文中，用于测定程序)，并且还用xPloration鉴定了多种新的克隆型。NGS测序增加了对新集群的支持，并揭示了甚至更多的多样性。抗原特异性克隆被证明具有高亲和力和广泛的表位覆盖。配体将发现的克隆子集表达为sc-Fv。经由carterra LSA进行表征(亲和力和表位分级数据)。簇映射到颗粒蛋白前体的不同子结构域，广泛覆盖靶标子结构域(A、B、G、P)(参见图20)。更深入的表征还允许估计抗体多样性(参见图21)。使用方程式S＝nS最大值/(n+B)，其中S是独特序列的数量，n是序列的总数，S最大值是独特序列的最大数量，且B是拟合常数，使用自举采样将稀释性曲线拟合到数据。H3的估算的总多样性(NGS集捕获的％)为201(62％)，L3为95(65％)，VH为700(32％)，VK为1450(22％)，如图22所示。
虽然本发明的实施方案和应用已经通过说明和实例的方式进行了一些详细的描述，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本文所包含的发明概念的情况下，许多另外的修改是可能的。本文引用的所有参考文献均在此整体并入本文中。
Claims (54)
1.从包括多个微毛细管孔的微毛细管阵列中回收样品内容物的方法，其中所述方法包括：
(A)定位激光以靶向所述多个微毛细管孔中的第一微毛细管孔；
(B)使所述激光朝向所述第一微毛细管孔脉冲至少一次；和
(C)从所述第一微毛细管孔提取所述内容物，从而回收所述第一微毛细管孔的所述内容物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在(A)定位所述激光之前，鉴定所述第一微毛细管孔。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中(B)使所述激光脉冲还包括使所述激光朝向所述第一微毛细管孔的一个或多个子部分进行脉冲。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中(B)使所述激光脉冲还包括使所述激光脉冲超过一次，并使所述激光在所述第一微毛细管孔的多于一个的子部分中进行脉冲。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述内容物包含一个或多个完整细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个完整细胞包括哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述一个或多个完整细胞不再能够进行细胞生长。
8.如权利要求1所述的方法，其中(C)提取和回收还包括在回收所述内容物期间对所述内容物成像。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用激光导引系统进行(A)定位所述激光。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述激光导引系统包括激光、激光扫描组件、扫描透镜系统和镜筒透镜。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述激光导引系统是检流计系统。
12.如权利要求9-10中任一项所述的方法，其中所述激光导引系统是ScannerMAXCompact-506RE系统。
13.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述激光扫描组件是检流计镜。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中从所述激光发射的光的波长范围为213纳米(nm)至1380nm。
15.如权利要求14所述的方法，其中从所述激光发射的光的波长为355nm、514nm、532nm或1064nm。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述微毛细管阵列与样品台连接。
17.如权利要求16所述的方法，其中在(A)定位所述激光期间，所述样品台以比所述激光导引系统更慢的速率移动。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述激光脉冲范围为100次脉冲/秒至1000次脉冲/秒，包括例如20,000Hz至120,000Hz和总共10-1000次脉冲。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述激光脉冲为20,000Hz至120,000Hz和总共10-1000次脉冲。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述激光脉冲为500次脉冲/秒。
21.如权利要求11所述的方法，其中(A)定位所述激光还包括使用激光导引系统对所述第一微毛细管孔的内容物成像。
22.如权利要求4-21中任一项所述的方法，其中所述激光对2个子部分至10个子部分范围内的所述第一微毛细管孔的多个子部分进行脉冲。
23.如权利要求4-22中任一项所述的方法，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的5个子部分进行脉冲。
24.如权利要求4-23中任一项所述的方法，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行5次脉冲至15次脉冲范围内的脉冲。
25.如权利要求4-24中任一项所述的方法，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行10次脉冲的脉冲。
26.如权利要求4-25中任一项所述的方法，其中每次激光脉冲具有5纳秒(ns)至20ns范围内的持续时间。
27.如权利要求4-26中任一项所述的方法，其中每次激光脉冲的持续时间为15ns。
28.如权利要求4-27中任一项所述的方法，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的5个子部分进行脉冲，其中所述激光对所述第一微毛细管孔的每个子部分进行10次脉冲的脉冲，并且其中每个激光脉冲的持续时间为15ns。
29.如权利要求9-28中任一项所述的方法，其中所述激光导引系统还包括一个或多个空间光调制器，以改变从所述激光发射的光束形状。
30.如权利要求9-29中任一项所述的方法，其中所述激光导引系统还包括数字微镜器件(DMD)，以改变从所述激光发射的光束形状。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中(C)提取和回收的内容物被置于收集载玻片上。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述收集载玻片包括含有裂解缓冲液的一个或多个收集载玻片，其中在(C)回收所述内容物之前将所述裂解缓冲液加入至一个或多个收集孔。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述收集载玻片包括不包含裂解缓冲液的一个或多个收集孔，其中在(C)回收所述内容物之前未将所述裂解缓冲液加入至一个或多个收集孔。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在(C)提取和回收之后，将所述内容物置于收集载玻片上并冷冻所述收集载玻片。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述收集载玻片随后被解冻。
36.如权利要求35所述的方法，其中对解冻的收集载玻片进行处理，以使所述细胞中的RNA变性。
37.如权利要求36所述的方法，其中对包含变性RNA的所述解冻的收集载玻片进行RT-PCR扩增。
38.如权利要求37所述的方法，其中对RT-PCR扩增产物进行定量。
39.如权利要求38所述的方法，其中对所述RT-PCR扩增产物进行测序。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在(C)提取和回收之后，将所述内容物置于收集载玻片上，并将所述收集载玻片的内容物转移至PCR板，并冷冻所述PCR板。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述PCR板随后被解冻。
42.如权利要求41所述的方法，其中对解冻的PCR板进行处理以使所述RNA变性。
43.如权利要求42所述的方法，其中对包含所述变性RNA的所述解冻的PCR板进行RT-PCR扩增。
44.如权利要求1所述的方法，其中所述内容物包含遗传物质，并且其中所述样品包含具有所期望表型的一个或多个完整的细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个细胞是B细胞。
46.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述遗传物质包括抗体序列。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗体序列包括重链和轻链。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述遗传物质包括mRNA。
49.如权利要求48所述的方法，其中对所述mRNA进行逆转录。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述重链和轻链的RT-PCR扩增在单独的反应中进行。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述重链和轻链的RT-PCR扩增在单个反应容器中进行。
52.如权利要求1所述的方法，其中所述内容物包含遗传物质，并且其中所述样品包含具有所期望表型的一个或多个完整的细胞，并且其中采用单细胞NGS测序来确定遗传表型。
53.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其中所述RT-PCR扩增还包括一个或多个单细胞特异性DNA水平条形码。
54.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其中所述RT-PCR扩增还包括一个或多个单细胞特异性DNA水平条形码，其中向正在扩增的抗体序列的重链和轻链中加入相同的条形码。
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