JPH1078434A - 少なくとも一つの与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関する分子のスクリーニングのための方法及び装置 - Google Patents
少なくとも一つの与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関する分子のスクリーニングのための方法及び装置Info
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- JPH1078434A JPH1078434A JP9203966A JP20396697A JPH1078434A JP H1078434 A JPH1078434 A JP H1078434A JP 9203966 A JP9203966 A JP 9203966A JP 20396697 A JP20396697 A JP 20396697A JP H1078434 A JPH1078434 A JP H1078434A
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/808—Optical sensing apparatus
Abstract
(57)【要約】
【課題】 少なくとも一つの与えられたリガンドに対す
る個々の結合特性に関する分子ライブラリーからの分子
のスクリーニングのための方法。 【解決手段】 この目的のために、蛍光色素で標識され
たリガンドが、懸濁液の形態にある分子ライブラリーと
混合される。過剰の結合しないリガンドが洗浄された後
に、この混合物が２次元の基層（２）上に広げられる。
次に、基層上の局所的な蛍光強度が、蛍光顕微鏡（５）
において電気光学的に同定され、そして与えられた選別
規準に従って電子工学的に識別される。このようにして
選択され、位置を定められた物体は、次に、基層（２）
及び分離作動装置（２０、２１）間の、座標が画像計算
機により制御される変位により順次正確に配置され、そ
して分離作動装置（２０、２１）により基層（２）から
空間的に分離される。
る個々の結合特性に関する分子ライブラリーからの分子
のスクリーニングのための方法。 【解決手段】 この目的のために、蛍光色素で標識され
たリガンドが、懸濁液の形態にある分子ライブラリーと
混合される。過剰の結合しないリガンドが洗浄された後
に、この混合物が２次元の基層（２）上に広げられる。
次に、基層上の局所的な蛍光強度が、蛍光顕微鏡（５）
において電気光学的に同定され、そして与えられた選別
規準に従って電子工学的に識別される。このようにして
選択され、位置を定められた物体は、次に、基層（２）
及び分離作動装置（２０、２１）間の、座標が画像計算
機により制御される変位により順次正確に配置され、そ
して分離作動装置（２０、２１）により基層（２）から
空間的に分離される。
Description
【０００１】本発明は、初めて、非常に多種多様な分子
を調べることができ、個々の結合事象に関する情報を提
供し、そして選択される分子の穏やかな（ｓｐａｒｉｎ
ｇ）選択を可能にする、一つまたはそれより多い与えら
れた標的分子に対する結合特性に関する、分子ライブラ
リーからの分子の最適化した選別のための方法及び装置
に関する。
を調べることができ、個々の結合事象に関する情報を提
供し、そして選択される分子の穏やかな（ｓｐａｒｉｎ
ｇ）選択を可能にする、一つまたはそれより多い与えら
れた標的分子に対する結合特性に関する、分子ライブラ
リーからの分子の最適化した選別のための方法及び装置
に関する。
【０００２】本発明の選別方法のための基礎を成す分子
ライブラリーは、化学的方法（組み合わせ（ｃｏｍｂｉ
ｎａｔｏｒｉａｌ）化学）により、または応用分子進化
（ＡＭＥ）の分野内の生物工学的方法により作製され
る。これに関して、組み合わせ化学は、分子ライブラリ
ーの構築のために化学反応の全ての方法を利用し、一
方、ＡＭＥは、突然変異法により多集団の異なる生体高
分子を生じる。特定の標的に結合する分子または生体高
分子の効率良い選択は、新しい製薬学的活性成分（試験
的な構造）の発見における本質的な要素であり、従っ
て、非常に重要である。
ライブラリーは、化学的方法（組み合わせ（ｃｏｍｂｉ
ｎａｔｏｒｉａｌ）化学）により、または応用分子進化
（ＡＭＥ）の分野内の生物工学的方法により作製され
る。これに関して、組み合わせ化学は、分子ライブラリ
ーの構築のために化学反応の全ての方法を利用し、一
方、ＡＭＥは、突然変異法により多集団の異なる生体高
分子を生じる。特定の標的に結合する分子または生体高
分子の効率良い選択は、新しい製薬学的活性成分（試験
的な構造）の発見における本質的な要素であり、従っ
て、非常に重要である。
【０００３】原則として、タンパク質デザインのための
ＡＭＥの分野内の方法は既知であり、確立されている。
進化の方法は、例えば、ペプチドリガンドの発見におい
て（Ｏ’Ｎｅｌｌ等、Ｐｒｏｔ．１４、５０９（１９９
２））、そして特別に作製した高い親和性の抗体の開発
において（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ １０４、
１４７（１９９１）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５２、６２４（１９９１）、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１（１９９１）、Ｐｅ
ｒｓｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８、２４３２（１９９１））応用された。抗
体工学は、特に、応用進化生物工学の前途有望な概念で
ある。抗体は、それらの非常に選択的な結合特性のため
に、研究、診断、及び治療における重要な試薬である
（Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３
３７、１３（１９９０）、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、５４５（１９９１）、Ｌ
ｉｔｔｌｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．第１２巻、５
３９（１９９４））。ＡＭＥによる分子ライブラリーの
形成の他に、主として組み合わせ化学の用途が、最近、
確立されてきている。これは、例えば、ポリマービーズ
のような固体の支持体上のライブラリーの合成のため
に、様々な化学反応を利用する（Ｄ．Ｊ．Ｅｃｋｅｒ、
Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
１９９５、１３、３５１；Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｓｋａｍ
ｐ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９４、１０６、６
６１；Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ、Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｔｅｒ、Ａ．
Ｂａｓｈｉｒ−Ｈａｓｈｅｍｉ、Ｊ．Ｒｅｂｅｋ、Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９４、１０６、２１５９；
Ｊ．Ｗ．Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｋ．−Ｈ．Ｗｉｅｓｍｕｅｌ
ｌｅｒ、Ｖ．Ｇｎａｕ、Ｊ．Ｂｒｕｅｎｊｅｓ、Ｇ．Ｊ
ｕｎｇ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９３、１０
５、９０１）。ここで述べることのできる例は、Ｈｏｂ
ｂｓ、Ｄｅ Ｗｉｔｔ等によるベンゾジアゼピンの固相
合成（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳ
Ａ、１９９３、６０、６９０９）である。
ＡＭＥの分野内の方法は既知であり、確立されている。
進化の方法は、例えば、ペプチドリガンドの発見におい
て（Ｏ’Ｎｅｌｌ等、Ｐｒｏｔ．１４、５０９（１９９
２））、そして特別に作製した高い親和性の抗体の開発
において（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ １０４、
１４７（１９９１）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５２、６２４（１９９１）、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１（１９９１）、Ｐｅ
ｒｓｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８、２４３２（１９９１））応用された。抗
体工学は、特に、応用進化生物工学の前途有望な概念で
ある。抗体は、それらの非常に選択的な結合特性のため
に、研究、診断、及び治療における重要な試薬である
（Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３
３７、１３（１９９０）、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、５４５（１９９１）、Ｌ
ｉｔｔｌｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．第１２巻、５
３９（１９９４））。ＡＭＥによる分子ライブラリーの
形成の他に、主として組み合わせ化学の用途が、最近、
確立されてきている。これは、例えば、ポリマービーズ
のような固体の支持体上のライブラリーの合成のため
に、様々な化学反応を利用する（Ｄ．Ｊ．Ｅｃｋｅｒ、
Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
１９９５、１３、３５１；Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｓｋａｍ
ｐ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９４、１０６、６
６１；Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ、Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｔｅｒ、Ａ．
Ｂａｓｈｉｒ−Ｈａｓｈｅｍｉ、Ｊ．Ｒｅｂｅｋ、Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９４、１０６、２１５９；
Ｊ．Ｗ．Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｋ．−Ｈ．Ｗｉｅｓｍｕｅｌ
ｌｅｒ、Ｖ．Ｇｎａｕ、Ｊ．Ｂｒｕｅｎｊｅｓ、Ｇ．Ｊ
ｕｎｇ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ、１９９３、１０
５、９０１）。ここで述べることのできる例は、Ｈｏｂ
ｂｓ、Ｄｅ Ｗｉｔｔ等によるベンゾジアゼピンの固相
合成（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳ
Ａ、１９９３、６０、６９０９）である。
【０００４】本発明の方法の条件は、分子ライブラリー
が支持体に基づかなければならないことである。それに
より、多数の類似した分子の測定が可能になり、そし
て、このようにして個々の結合特性が適切に特徴づけら
れることができる。適当な支持体に基づく系の例は、Ａ
ＭＥの分野内のバクテリア、または組み合わせ化学の分
野内のポリマービーズである。
が支持体に基づかなければならないことである。それに
より、多数の類似した分子の測定が可能になり、そし
て、このようにして個々の結合特性が適切に特徴づけら
れることができる。適当な支持体に基づく系の例は、Ａ
ＭＥの分野内のバクテリア、または組み合わせ化学の分
野内のポリマービーズである。
【０００５】大腸菌バクテリアのタンパク質ライブラリ
ーの作製のための方法は、文献（Ｈｏｆｎｕｎｇ、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３４、７７（１９９１）、Ｋ
ｌａｕｓｅｒ等、ＥＭＢＯ Ｊ．、９、１９９１（１９
９０）、Ｆｕｃｈｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９、１３６９（１９９１）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、
２７１３（１９９２）、Ｐｕｇｓｌｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１２０５８
（１９９２））において既知である。加えて、ファージ
表面上での発現が記述されており（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏ
ｍ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０、
４１（１９９２））、これはファージの大きさ（＜＜１
μｍ）のために本発明の方法に関係しない。
ーの作製のための方法は、文献（Ｈｏｆｎｕｎｇ、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３４、７７（１９９１）、Ｋ
ｌａｕｓｅｒ等、ＥＭＢＯ Ｊ．、９、１９９１（１９
９０）、Ｆｕｃｈｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９、１３６９（１９９１）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、
２７１３（１９９２）、Ｐｕｇｓｌｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１２０５８
（１９９２））において既知である。加えて、ファージ
表面上での発現が記述されており（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏ
ｍ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０、
４１（１９９２））、これはファージの大きさ（＜＜１
μｍ）のために本発明の方法に関係しない。
【０００６】細胞を多数（＞１０6）から分類するため
の選別方法に対する技術的な解決法は、ＦＡＣＳ（蛍光
活性化セルソーター）及びＭＡＣＳ（磁気活性化セルソ
ーター）において市販されている。
の選別方法に対する技術的な解決法は、ＦＡＣＳ（蛍光
活性化セルソーター）及びＭＡＣＳ（磁気活性化セルソ
ーター）において市販されている。
【０００７】蛍光活性化細胞分類は、空間的な分類のた
めに静電的な原理を用いる。市販のＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌ
ｕｓ）は、一日当たり約１０8細胞を順次処理すること
ができる。しかし、ここで、有効な分類率が著しく１０
０％を下回ることを考慮に入れなければならない。しか
しながら、細胞集団における非常に稀な場合において、
約１０9の大きい処理量が所望される。
めに静電的な原理を用いる。市販のＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌ
ｕｓ）は、一日当たり約１０8細胞を順次処理すること
ができる。しかし、ここで、有効な分類率が著しく１０
０％を下回ることを考慮に入れなければならない。しか
しながら、細胞集団における非常に稀な場合において、
約１０9の大きい処理量が所望される。
【０００８】本発明の方法に比較して、ＦＡＣＳの場合
さらに、分類工程が測定工程の後に直接行われ、その結
果、親和性の閾値に対する次の補正の際に、全分類工程
が繰り返されなければならない。このことにより、分子
支持体またはバクテリアへのさらなる機械的ストレスが
伴う。
さらに、分類工程が測定工程の後に直接行われ、その結
果、親和性の閾値に対する次の補正の際に、全分類工程
が繰り返されなければならない。このことにより、分子
支持体またはバクテリアへのさらなる機械的ストレスが
伴う。
【０００９】ＭＡＣＳ分類方法は、磁気ビーズへの関係
のある細胞の結合を利用する。分類工程において、この
ように標識された細胞は、均質でない磁場によりＭＡＣ
Ｓカラム中に保持され、一方、非標識の細胞は妨げられ
ずにカラムを素通りする。しかしながら、この方法によ
り、磁気を帯びた細胞及び磁気を帯びていない細胞の間
を区別することだけが可能である。従って、ＭＡＣＳ
は、多数の集団の迅速な処理が可能であるが、個々の結
合事象に関する何の情報も得られることができない。
のある細胞の結合を利用する。分類工程において、この
ように標識された細胞は、均質でない磁場によりＭＡＣ
Ｓカラム中に保持され、一方、非標識の細胞は妨げられ
ずにカラムを素通りする。しかしながら、この方法によ
り、磁気を帯びた細胞及び磁気を帯びていない細胞の間
を区別することだけが可能である。従って、ＭＡＣＳ
は、多数の集団の迅速な処理が可能であるが、個々の結
合事象に関する何の情報も得られることができない。
【００１０】組み合わせ化学におけるビーズの分類は、
通例、手動式の方法により行われる。
通例、手動式の方法により行われる。
【００１１】本発明は、分子ライブラリーからの多数
（１０9）の分子から、２４時間以内に、一つまたはそ
れより多い与えられたリガンドに対する特定の結合親和
性により同定される個々の物体を検出し、分離すること
が可能である方法を開発するという目的に基づく。バク
テリア集団の生命力は、ＡＭＥの分野内の次のバクテリ
アの増殖（増幅）のために保持されなければならない。
（１０9）の分子から、２４時間以内に、一つまたはそ
れより多い与えられたリガンドに対する特定の結合親和
性により同定される個々の物体を検出し、分離すること
が可能である方法を開発するという目的に基づく。バク
テリア集団の生命力は、ＡＭＥの分野内の次のバクテリ
アの増殖（増幅）のために保持されなければならない。
【００１２】この目的は、以下の工程を含んでなる方法
により、本発明により果たされる。 ａ）結合するリガンドが蛍光色素で標識され、そして懸
濁液の形態にある分子ライブラリーと混合される。
により、本発明により果たされる。 ａ）結合するリガンドが蛍光色素で標識され、そして懸
濁液の形態にある分子ライブラリーと混合される。
【００１３】ｂ）次に、分子ライブラリー中の分子に結
合しない過剰のリガンドが洗浄され、除かれる。
合しない過剰のリガンドが洗浄され、除かれる。
【００１４】ｃ）この混合物が２次元の基層（ｓｕｂｓ
ｔｒａｔｅ）上に広げられる。ｄ）このように被覆され
た基層が蛍光顕微鏡の下に置かれる。次に、基層上に観
察される局所的な蛍光強度が電気光学的に同定され、全
画像の形態において、または部分的画像の形態において
順次、ＣＣＤカメラによりデジタルで同定され、閾値の
形態の与えられた選別規準に従って電子工学的に識別さ
れ、そして分子ライブラリーの分子に対するリガンドの
高い結合親和性により特徴づけられ、それにより選別規
準を満たす、基層上に位置している物体が同定され、画
像計算機中の保管により位置が突き止められる。
ｔｒａｔｅ）上に広げられる。ｄ）このように被覆され
た基層が蛍光顕微鏡の下に置かれる。次に、基層上に観
察される局所的な蛍光強度が電気光学的に同定され、全
画像の形態において、または部分的画像の形態において
順次、ＣＣＤカメラによりデジタルで同定され、閾値の
形態の与えられた選別規準に従って電子工学的に識別さ
れ、そして分子ライブラリーの分子に対するリガンドの
高い結合親和性により特徴づけられ、それにより選別規
準を満たす、基層上に位置している物体が同定され、画
像計算機中の保管により位置が突き止められる。
【００１５】ｅ）次に、このように選別された物体が、
基層及び分離作動装置間の−座標が画像計算機により制
御される−相対的な変位により分離作動装置の作動地点
で順次位置を定められ、基層から取り除かれ、そして個
々に局所的に置かれる。
基層及び分離作動装置間の−座標が画像計算機により制
御される−相対的な変位により分離作動装置の作動地点
で順次位置を定められ、基層から取り除かれ、そして個
々に局所的に置かれる。
【００１６】上の方法による生体分子のライブラリーか
らの分子の同定及び分離は、これらの分子が適当な生物
学的細胞の表面上に十分な数で存在すると考える。この
目的のために、生体分子に関する遺伝情報が多集団の微
生物に集められ、それにより、生体分子を合成する。生
化学的合成のためのこの微生物の制御を含む方法は、集
合的に発現系と呼ばれる。ライブラリーの多様性は、集
められた情報の突然変異体の多様性として生じる。ここ
で、＞１０9の複雑なものが作製されることができる。
らの分子の同定及び分離は、これらの分子が適当な生物
学的細胞の表面上に十分な数で存在すると考える。この
目的のために、生体分子に関する遺伝情報が多集団の微
生物に集められ、それにより、生体分子を合成する。生
化学的合成のためのこの微生物の制御を含む方法は、集
合的に発現系と呼ばれる。ライブラリーの多様性は、集
められた情報の突然変異体の多様性として生じる。ここ
で、＞１０9の複雑なものが作製されることができる。
【００１７】基層上の局所的な蛍光強度の電気光学的同
定は、全画像の形態において、または部分的画像の形態
において順次、ＣＣＤカメラにより都合よく行われる。
次に、場合によってはデータの要約整理の後に、これら
の全画像または部分的画像は、保管のために、そして与
えられた選別規準に従った画像分析及び評価によるさら
なる処理のために、画像計算機へ送られる。
定は、全画像の形態において、または部分的画像の形態
において順次、ＣＣＤカメラにより都合よく行われる。
次に、場合によってはデータの要約整理の後に、これら
の全画像または部分的画像は、保管のために、そして与
えられた選別規準に従った画像分析及び評価によるさら
なる処理のために、画像計算機へ送られる。
【００１８】代わりに、基層上の局所的な蛍光強度の電
気光学的同定は、レーザースキャナーによっても行われ
ることができ、その出力シグナルは、与えられた選別規
準に従って電子工学的に評価され、そして関係する局所
的な座標と組み合わせて画像計算機へ送られる。
気光学的同定は、レーザースキャナーによっても行われ
ることができ、その出力シグナルは、与えられた選別規
準に従って電子工学的に評価され、そして関係する局所
的な座標と組み合わせて画像計算機へ送られる。
【００１９】好ましくは、大腸菌バクテリアが、生体分
子ライブラリーの作製におけるバクテリアの発現系とし
て用いられる。
子ライブラリーの作製におけるバクテリアの発現系とし
て用いられる。
【００２０】ペプチドライブラリー及び／またはタンパ
ク質ライブラリーの作製のために特に好ましく用いられ
る特定のバクテリア発現系は、遺伝子操作によりＬａｍ
Ｂ膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質の
変種を発現する大腸菌バクテリアを含んでなる。
ク質ライブラリーの作製のために特に好ましく用いられ
る特定のバクテリア発現系は、遺伝子操作によりＬａｍ
Ｂ膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質の
変種を発現する大腸菌バクテリアを含んでなる。
【００２１】微生物から形成された分子ライブラリーか
らの分子の最適化した選別及び分離に加えて、本方法
は、化学的方法により作製された分子ライブラリーから
の分子の選別及び分離にも関する。組み合わせ化学にお
いて、分子ライブラリーは、化学的方法（反応）により
固相上で作製される。ライブラリーの多様性は、様々な
反応及び試薬を用いることの結果として生じる。これら
の分子ライブラリーは、ポリマービーズ上で都合よく作
製される。好ましくは、５０μｍから２００μｍまでの
直径を有するプラスチックのポリスチレンまたはポリア
クリルアミドビーズが、ポリマー支持体として用いられ
る。
らの分子の最適化した選別及び分離に加えて、本方法
は、化学的方法により作製された分子ライブラリーから
の分子の選別及び分離にも関する。組み合わせ化学にお
いて、分子ライブラリーは、化学的方法（反応）により
固相上で作製される。ライブラリーの多様性は、様々な
反応及び試薬を用いることの結果として生じる。これら
の分子ライブラリーは、ポリマービーズ上で都合よく作
製される。好ましくは、５０μｍから２００μｍまでの
直径を有するプラスチックのポリスチレンまたはポリア
クリルアミドビーズが、ポリマー支持体として用いられ
る。
【００２２】いくつかのリガンドを同時に調べることを
可能にするために、異なるリガンドが異なる蛍光色素で
有効に標識される。異なるリガンドに対する選別規準
は、異なる色の蛍光強度に対する閾値の表の形態におい
て与えられる。
可能にするために、異なるリガンドが異なる蛍光色素で
有効に標識される。異なるリガンドに対する選別規準
は、異なる色の蛍光強度に対する閾値の表の形態におい
て与えられる。
【００２３】本発明の方法のさらなる発展は、さらなる
蛍光色素で標識された、バクテリア上の分子ライブラリ
ーを支持しているタンパク質またはポリマービーズ上の
組み合わせ化学から得られた化合物、及び画像分析にお
けるさらなる選別規準として考慮に入れられる結合部位
の蛍光強度にある。 この場合、結合部位に特徴的な蛍
光強度に対するリガンドに特徴的な蛍光強度の比率が、
結合親和性に対する明確な選別規準として画像分析にお
いて用いられることができる。
蛍光色素で標識された、バクテリア上の分子ライブラリ
ーを支持しているタンパク質またはポリマービーズ上の
組み合わせ化学から得られた化合物、及び画像分析にお
けるさらなる選別規準として考慮に入れられる結合部位
の蛍光強度にある。 この場合、結合部位に特徴的な蛍
光強度に対するリガンドに特徴的な蛍光強度の比率が、
結合親和性に対する明確な選別規準として画像分析にお
いて用いられることができる。
【００２４】本発明の方法を行うための装置は、倒立蛍
光顕微鏡、及び懸濁液中に広がった物体と共に支持体を
保持する移動台、並びに蛍光を励起するための少なくと
も一つの光源を含んでなり、そして本発明により、 ａ）基層上に広げられたバクテリアの懸濁液の局所的な
蛍光強度の同定のためのＣＣＤカメラまたはレーザース
キャナーからなる電気光学的走査装置で、その装置が、
蛍光画像情報のさらなる処理及び保管のために画像計算
機に連結され、 ｂ）選別された物体の移動のための分離作動装置が、移
動台上に配置され、 ｃ）そして、画像計算機が、分離作動装置に対する移動
台の配置を制御する、ことを特徴とする。
光顕微鏡、及び懸濁液中に広がった物体と共に支持体を
保持する移動台、並びに蛍光を励起するための少なくと
も一つの光源を含んでなり、そして本発明により、 ａ）基層上に広げられたバクテリアの懸濁液の局所的な
蛍光強度の同定のためのＣＣＤカメラまたはレーザース
キャナーからなる電気光学的走査装置で、その装置が、
蛍光画像情報のさらなる処理及び保管のために画像計算
機に連結され、 ｂ）選別された物体の移動のための分離作動装置が、移
動台上に配置され、 ｃ）そして、画像計算機が、分離作動装置に対する移動
台の配置を制御する、ことを特徴とする。
【００２５】分離作動装置は、顕微操作装置中に取り付
けられた下げることのできる微細毛細管を都合よく含ん
でなる。
けられた下げることのできる微細毛細管を都合よく含ん
でなる。
【００２６】好ましい態様において、蛍光を励起する光
は、顕微鏡からの光線の進路から離れた少なくとも一つ
の光学導波管を通って基層へ送られる。この目的のため
に、同じ光学導波管中に封入されることのできる、異な
る波長を有する２つの異なるレーザーが、蛍光を励起す
るために提供される。
は、顕微鏡からの光線の進路から離れた少なくとも一つ
の光学導波管を通って基層へ送られる。この目的のため
に、同じ光学導波管中に封入されることのできる、異な
る波長を有する２つの異なるレーザーが、蛍光を励起す
るために提供される。
【００２７】間違いの結果を防ぐために、照明装置及び
微細毛細管を含む蛍光顕微鏡は、水蒸気で飽和した空気
の流れにより１℃及び１０℃の間の温度に冷却される気
候室（ｃｌｉｍａｔｉｃ ｃｈａｍｂｅｒ）に取り付け
られる。これらの間違いの結果は、例えば、バクテリア
の増殖、アガロース基層の収縮、及び温度変化であり得
る。
微細毛細管を含む蛍光顕微鏡は、水蒸気で飽和した空気
の流れにより１℃及び１０℃の間の温度に冷却される気
候室（ｃｌｉｍａｔｉｃ ｃｈａｍｂｅｒ）に取り付け
られる。これらの間違いの結果は、例えば、バクテリア
の増殖、アガロース基層の収縮、及び温度変化であり得
る。
【００２８】記述される方法の主な利点は、分析される
結合事象の大きい処理量が伴う、結合複合体の個々の定
量及び個々の選別である。このことは、時間及び費用に
おいてかなりの減少をもたらす。さらに、生物学的な物
体の場合、選別される細胞の生命力が保証される。
結合事象の大きい処理量が伴う、結合複合体の個々の定
量及び個々の選別である。このことは、時間及び費用に
おいてかなりの減少をもたらす。さらに、生物学的な物
体の場合、選別される細胞の生命力が保証される。
【００２９】分子ライブラリーを特徴づけるための方法
は、基礎的な科学的調査の枠組み内において用いられる
ことができる。可能な工業的用途は、新しい製薬のため
の試験的な構造の探索である。本発明の方法により、抗
体の適当なライブラリーの樹立と共に、個々の患者に対
してあつらえられた医薬品が一日で見つけられ、単離さ
れ、そして増やされることができる、薬理学的な個々の
治療が可能である。
は、基礎的な科学的調査の枠組み内において用いられる
ことができる。可能な工業的用途は、新しい製薬のため
の試験的な構造の探索である。本発明の方法により、抗
体の適当なライブラリーの樹立と共に、個々の患者に対
してあつらえられた医薬品が一日で見つけられ、単離さ
れ、そして増やされることができる、薬理学的な個々の
治療が可能である。
【００３０】本発明は、図面及び実施例に従い、以下に
より詳細に説明される。
より詳細に説明される。
【００３１】図１は、広げられたバクテリア懸濁液を有
する二次元の基層を示す。
する二次元の基層を示す。
【００３２】図２は、ＣＣＤカメラに基づく選別装置の
図を示す。
図を示す。
【００３３】図３は、レーザースキャナーに基づく選別
装置の図を示す。
装置の図を示す。
【００３４】図４は、選別された特有の物体の移動（分
離）のための分離作動装置を示す。標的分子に対する高
い結合親和性を有する分子の選別及び分離のために本発
明の選別及び分離の方法を行うことは、適当な分子ライ
ブラリー及び以下にリガンドと呼ばれる標的分子を用意
することが必要である。このことは、以下に、ペプチド
ライブラリーの例を用いて記述される。ここでは、この
生体分子ライブラリーの提示のために、遺伝子操作によ
りＬａｍＢ膜貫通タンパク質の変種を発現する大腸菌バ
クテリアが用いられる。選択されたリガンドは、アセチ
ルコリンレセプターである。一般に用いられるファージ
法と異なり、バクテリア系は、バクテリアの表面上の類
似した結合事象の多様性のために、ペプチドを維持して
いる細胞及びレセプターの間の相互作用の単一の検査が
行われることができるという利点を与える。ファージを
用いた類似した方法は、ファージ粒子の小さい大きさの
ために除外される。
離）のための分離作動装置を示す。標的分子に対する高
い結合親和性を有する分子の選別及び分離のために本発
明の選別及び分離の方法を行うことは、適当な分子ライ
ブラリー及び以下にリガンドと呼ばれる標的分子を用意
することが必要である。このことは、以下に、ペプチド
ライブラリーの例を用いて記述される。ここでは、この
生体分子ライブラリーの提示のために、遺伝子操作によ
りＬａｍＢ膜貫通タンパク質の変種を発現する大腸菌バ
クテリアが用いられる。選択されたリガンドは、アセチ
ルコリンレセプターである。一般に用いられるファージ
法と異なり、バクテリア系は、バクテリアの表面上の類
似した結合事象の多様性のために、ペプチドを維持して
いる細胞及びレセプターの間の相互作用の単一の検査が
行われることができるという利点を与える。ファージを
用いた類似した方法は、ファージ粒子の小さい大きさの
ために除外される。
【００３５】蛍光色素で標識されたリガンドは、ペプチ
ドを維持しているバクテリアと混合される。この目的の
ために、例えば、６５０ｎｍで励起され、そして６７０
ｎｍで発光する、色素RＣｙ５（商標）（企業Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｔｅｍの製
品）が用いられる。この蛍光シグナルは、長波の励起の
ために、おおむね自己蛍光なしに検出されることができ
る。バクテリアの表面上のペプチドの数は一定でないの
で、全てのバクテリア上の全てのペプチドに対して同じ
である分子の部分が、その蛍光シグナルから結合部位の
数の分量を得るために、さらなる色素で特に標識され
る。複合体の結合親和性の程度は、２つの蛍光強度の比
率から得られることができる。用いられる２番目の蛍光
色素 は、４９０ｎｍで励起され、そして５２０ｎｍで
発光する、RＦＩＴＣ（商標）（企業Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓの製品）である。これらのスペクトル
特性と共に、２つの蛍光シグナルは互いの相互作用なし
に測定される。
ドを維持しているバクテリアと混合される。この目的の
ために、例えば、６５０ｎｍで励起され、そして６７０
ｎｍで発光する、色素RＣｙ５（商標）（企業Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｔｅｍの製
品）が用いられる。この蛍光シグナルは、長波の励起の
ために、おおむね自己蛍光なしに検出されることができ
る。バクテリアの表面上のペプチドの数は一定でないの
で、全てのバクテリア上の全てのペプチドに対して同じ
である分子の部分が、その蛍光シグナルから結合部位の
数の分量を得るために、さらなる色素で特に標識され
る。複合体の結合親和性の程度は、２つの蛍光強度の比
率から得られることができる。用いられる２番目の蛍光
色素 は、４９０ｎｍで励起され、そして５２０ｎｍで
発光する、RＦＩＴＣ（商標）（企業Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓの製品）である。これらのスペクトル
特性と共に、２つの蛍光シグナルは互いの相互作用なし
に測定される。
【００３６】色素で標識されたリガンドがバクテリアの
懸濁液と混合された（インキュベーション）後、バクテ
リアは、遠心分離され、続いて純粋なバッファー溶液中
に分散されることにより洗浄される。その結果、バクテ
リアの表面上のみに位置している蛍光色素だけがバクテ
リアの分散物中で後に残る。
懸濁液と混合された（インキュベーション）後、バクテ
リアは、遠心分離され、続いて純粋なバッファー溶液中
に分散されることにより洗浄される。その結果、バクテ
リアの表面上のみに位置している蛍光色素だけがバクテ
リアの分散物中で後に残る。
【００３７】バクテリア１のこの分散物は、次に、二次
元の基層２上に位置しているアガロース表面上にスパー
テルで広げられる（図１参照）。アガロース表面は、後
に分離されたバクテリアが置かれるようになる分離区画
３が各端の領域にあるように分割される。基層と異なり
栄養物を含むこれらのアガロース表面３は、はがすこと
により基層２から分離されることができる。次に基層上
の単一の平面に置かれたバクテリアの蛍光強度の効率よ
い測定を達成するために、１０％の表面被覆密度が目標
とされる。１０9種類の集団に対して、得られる全面積
は２５０ｃｍ2である。
元の基層２上に位置しているアガロース表面上にスパー
テルで広げられる（図１参照）。アガロース表面は、後
に分離されたバクテリアが置かれるようになる分離区画
３が各端の領域にあるように分割される。基層と異なり
栄養物を含むこれらのアガロース表面３は、はがすこと
により基層２から分離されることができる。次に基層上
の単一の平面に置かれたバクテリアの蛍光強度の効率よ
い測定を達成するために、１０％の表面被覆密度が目標
とされる。１０9種類の集団に対して、得られる全面積
は２５０ｃｍ2である。
【００３８】図２は、全選別装置の構造の図を示す。技
術的な作業は、蛍光の記録を取り、そして続いてバクテ
リアを分離することを含み、これらは、前以て決められ
た特定の結合特性により識別される。例えば、バクテリ
アの増殖のような間違いの結果は、測定工程の間に除か
れなければならない。このことは、水蒸気で飽和された
４℃の空気の流れにより冷却される気候室４によりもた
らされる。装置の中心部は、倒立顕微鏡５からなる。画
像対物レンズ６、照明集光器７、及び基層２が保持され
る移動台８は、顕微鏡の部品である。蛍光分光学のため
に用いられる光源は、２つのレーザー、及び２００μｍ
のコア直径を有する光学導波管１０において交互に替わ
る電子シャッターを経て２つのレーザー光線を封入する
光学配置からなるレーザーモジュール９である。５００
ｍＷの出力で６４７ｎｍの波長で作動されるＫｒイオン
ガスレーザーが、リガンドの蛍光発光部分（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）の励起のために用いられる。バクテリア
上の結合部位での二番目の蛍光発光部分の励起のための
二番目の光源は、４８８ｎｍでの発光及び匹敵する出力
に調整されたＡｒイオンガスレーザーである。サンプル
上に直径１．５ｍｍの照らされた点（ｌｕｍｉｎｏｕｓ
ｓｐｏｔ）を生じる微小レンズ１１が、光ファイバー
の末端に付けられる。外部からのレーザー励起は、画像
対物レンズ６における散乱光及びバックグラウンドの蛍
光を防ぐ。高いレーザー強度は、露光当たり０．１ない
し１秒の範囲の露光時間を可能にする。基層２から発光
する蛍光は、冷却されたＣＣＤカメラ１２により検出さ
れる。この蛍光画像の画素の数は１０００＊１０１８で
あり、その結果、１．２μｍの分解能で１０倍の顕微鏡
倍率で計算がなされることができる。この値は、この範
囲内に位置するバクテリアの大きさと適合する。カメラ
１２の前には、２つの蛍光発光部分に適合した発光フィ
ルターがある。対物レンズ６の焦点を合わせる位置は、
モーターで作動する装置（図には示されない）により調
整される。表面の後方反射により作動する、この焦点調
整のための装置は、例えば、Ｇ．Ｂｏｕｗｈｕｉｓ等、
ｐ７５ｆｆ、Ａ．Ｈｉｌｇｅｒ Ｌｔｄ（ＵＫ／ＵＳ
Ａ）、１９８５において記述されている。
術的な作業は、蛍光の記録を取り、そして続いてバクテ
リアを分離することを含み、これらは、前以て決められ
た特定の結合特性により識別される。例えば、バクテリ
アの増殖のような間違いの結果は、測定工程の間に除か
れなければならない。このことは、水蒸気で飽和された
４℃の空気の流れにより冷却される気候室４によりもた
らされる。装置の中心部は、倒立顕微鏡５からなる。画
像対物レンズ６、照明集光器７、及び基層２が保持され
る移動台８は、顕微鏡の部品である。蛍光分光学のため
に用いられる光源は、２つのレーザー、及び２００μｍ
のコア直径を有する光学導波管１０において交互に替わ
る電子シャッターを経て２つのレーザー光線を封入する
光学配置からなるレーザーモジュール９である。５００
ｍＷの出力で６４７ｎｍの波長で作動されるＫｒイオン
ガスレーザーが、リガンドの蛍光発光部分（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）の励起のために用いられる。バクテリア
上の結合部位での二番目の蛍光発光部分の励起のための
二番目の光源は、４８８ｎｍでの発光及び匹敵する出力
に調整されたＡｒイオンガスレーザーである。サンプル
上に直径１．５ｍｍの照らされた点（ｌｕｍｉｎｏｕｓ
ｓｐｏｔ）を生じる微小レンズ１１が、光ファイバー
の末端に付けられる。外部からのレーザー励起は、画像
対物レンズ６における散乱光及びバックグラウンドの蛍
光を防ぐ。高いレーザー強度は、露光当たり０．１ない
し１秒の範囲の露光時間を可能にする。基層２から発光
する蛍光は、冷却されたＣＣＤカメラ１２により検出さ
れる。この蛍光画像の画素の数は１０００＊１０１８で
あり、その結果、１．２μｍの分解能で１０倍の顕微鏡
倍率で計算がなされることができる。この値は、この範
囲内に位置するバクテリアの大きさと適合する。カメラ
１２の前には、２つの蛍光発光部分に適合した発光フィ
ルターがある。対物レンズ６の焦点を合わせる位置は、
モーターで作動する装置（図には示されない）により調
整される。表面の後方反射により作動する、この焦点調
整のための装置は、例えば、Ｇ．Ｂｏｕｗｈｕｉｓ等、
ｐ７５ｆｆ、Ａ．Ｈｉｌｇｅｒ Ｌｔｄ（ＵＫ／ＵＳ
Ａ）、１９８５において記述されている。
【００３９】効率良い画像分析のために、ＣＣＤカメラ
のｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｂｏａｒｄの面におい
てデータの要約整理が行われる。この場合のソフトウェ
アは、稀であると予想される結合事象の検出のために考
案される。Ｌｏｏｋ−ＵｐＴａｂｌｅｓ（索引表）（Ｌ
ＵＴ）に従い、まず第一に、標識されたリガンドの蛍光
記録上に選択された閾値Ｓ1以上の蛍光シグナルがある
かどうかが調べられる。検査が陽性である場合、結合部
位の蛍光発光部分の２番目の蛍光記録が取られる。２つ
のシグナルの商が計算された後、これらの商が選択され
た閾値Ｓ2以上である場合に対してのみ、その商と共に
画素座標が画像計算機に保存される。この目的のため
に、かなりの画素を含む線がｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅ
ｒ ｂｏａｒｄ上に確認される。第二の工程において、
これらの線は画像計算機へ伝えられ、そしてそこでかな
りの画素に対して検索が行われる。代わりに、リガンド
画像の全画像分析が、与えられた選別規準、すなわち、
基層２上に位置し、そして分子ライブラリーの分子に対
するリガンドの高い結合親和性により特徴づけられる物
体の検出及び配置、に従って画像計算機においてのみ行
われることができる。「高い結合親和性」により、これ
らの物体の蛍光強度が上記の閾値Ｓ2に関する選別規準
を満たすことを意味する。
のｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｂｏａｒｄの面におい
てデータの要約整理が行われる。この場合のソフトウェ
アは、稀であると予想される結合事象の検出のために考
案される。Ｌｏｏｋ−ＵｐＴａｂｌｅｓ（索引表）（Ｌ
ＵＴ）に従い、まず第一に、標識されたリガンドの蛍光
記録上に選択された閾値Ｓ1以上の蛍光シグナルがある
かどうかが調べられる。検査が陽性である場合、結合部
位の蛍光発光部分の２番目の蛍光記録が取られる。２つ
のシグナルの商が計算された後、これらの商が選択され
た閾値Ｓ2以上である場合に対してのみ、その商と共に
画素座標が画像計算機に保存される。この目的のため
に、かなりの画素を含む線がｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅ
ｒ ｂｏａｒｄ上に確認される。第二の工程において、
これらの線は画像計算機へ伝えられ、そしてそこでかな
りの画素に対して検索が行われる。代わりに、リガンド
画像の全画像分析が、与えられた選別規準、すなわち、
基層２上に位置し、そして分子ライブラリーの分子に対
するリガンドの高い結合親和性により特徴づけられる物
体の検出及び配置、に従って画像計算機においてのみ行
われることができる。「高い結合親和性」により、これ
らの物体の蛍光強度が上記の閾値Ｓ2に関する選別規準
を満たすことを意味する。
【００４０】蛍光記録の全工程は、以下の時間の考察に
基づく。１０倍の倍率で、ＣＣＤカメラは、１．２＊
１．２ｍｍの画像の開きを検出する。２．５＊１０4ｍ
ｍ2の全てのバクテリアの表面の要求に対して、１７４
００フレームが記録されなければならない。２重蛍光の
分析のために、４．１秒のサイクル時間がフレーム当た
り概算され、これは各場合における１秒の露光時間を含
む。ここで、移動台の移動のための時間が考慮される。
このことは、全部の露光工程に対して２０時間の全時
間、または一日あたり１０9の処理量をもたらし、従っ
て、規準に合う。
基づく。１０倍の倍率で、ＣＣＤカメラは、１．２＊
１．２ｍｍの画像の開きを検出する。２．５＊１０4ｍ
ｍ2の全てのバクテリアの表面の要求に対して、１７４
００フレームが記録されなければならない。２重蛍光の
分析のために、４．１秒のサイクル時間がフレーム当た
り概算され、これは各場合における１秒の露光時間を含
む。ここで、移動台の移動のための時間が考慮される。
このことは、全部の露光工程に対して２０時間の全時
間、または一日あたり１０9の処理量をもたらし、従っ
て、規準に合う。
【００４１】顕微鏡の全視野の同時の蛍光励起による蛍
光発光物体の検出、及びＣＣＤカメラでの蛍光画像の並
列検出の代わりとして、レーザー走査装置を用いた部分
走査蛍光励起が選択されることができる。この型の構造
が、図３において概略的に示される。２０ｍＷの出力を
有するＡｒ−Ｋｒレーザー１３から生じるレーザー光線
１４は、光学モジュール１６中のモノモード光ファイバ
ー１５により封入される。このモジュール１６におい
て、励起レーザー光線は、二色の光線スプリッター（ｓ
ｐｌｉｔｔｅｒ）１７を経てｘ−ｙ反射鏡１８へ送られ
る。コンピューターが制御する反射鏡１８は、対物レン
ズ６を通ってある点に焦点を合わせられたレーザー光線
がｘ−ｙ方向にサンプルの面を走査するようにレーザー
光線を偏光させる。蛍光発光物体の局所的座標は、偏光
反射鏡の制御している変数によりここで保存される。こ
れらの変数は、サンプル表面上のレーザー光線のｘ−ｙ
位置と明白に関係する。この対等関係は、市販されてい
るスキャナー（例えば、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ４Ｄ Ｓｃ
ａｎｎｅｒ、Ｌｅｉｃａ ＬａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋＧ
ｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にお
いて利用される。サンプルからの蛍光は、対物レンズ６
及び偏光反射鏡１８を経て光線スプリッター１７に達
し、そしてそこで励起光線に対して反対の方向に伝えら
れる。この蛍光は、検出モジュール１９中の光線スプリ
ッター１７の後ろで検出される。このモジュールは、焦
点の面の外の蛍光を抑えることのできるごく小さな穴、
ＦＩＴＣ及びＣｙ５の２つの蛍光発光のための２つの光
電子増倍管、及び対応する色フィルターを含んでなる。
走査工程の間、標識したリガンド及び結合部位の蛍光発
光部分の蛍光強度は同時に測定され、そして一つがもう
一つで割られ、その結果、別の２回目の蛍光記録は必要
ない。従って、この商は、閾値Ｓ2からオンラインで識
別され、そして走査の完了時に、設定した閾値Ｓ2以上
の強度を有する画素の座標及び強度だけが、制御及び分
析しているコンピューターの作動メモリーに存在する。
しかしながら、この代わりとして、場合によっては異な
る閾値を用いて後に識別するために、走査工程の完了時
に、分析しているコンピューター上で全画像が処理され
ることができる。
光発光物体の検出、及びＣＣＤカメラでの蛍光画像の並
列検出の代わりとして、レーザー走査装置を用いた部分
走査蛍光励起が選択されることができる。この型の構造
が、図３において概略的に示される。２０ｍＷの出力を
有するＡｒ−Ｋｒレーザー１３から生じるレーザー光線
１４は、光学モジュール１６中のモノモード光ファイバ
ー１５により封入される。このモジュール１６におい
て、励起レーザー光線は、二色の光線スプリッター（ｓ
ｐｌｉｔｔｅｒ）１７を経てｘ−ｙ反射鏡１８へ送られ
る。コンピューターが制御する反射鏡１８は、対物レン
ズ６を通ってある点に焦点を合わせられたレーザー光線
がｘ−ｙ方向にサンプルの面を走査するようにレーザー
光線を偏光させる。蛍光発光物体の局所的座標は、偏光
反射鏡の制御している変数によりここで保存される。こ
れらの変数は、サンプル表面上のレーザー光線のｘ−ｙ
位置と明白に関係する。この対等関係は、市販されてい
るスキャナー（例えば、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ４Ｄ Ｓｃ
ａｎｎｅｒ、Ｌｅｉｃａ ＬａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋＧ
ｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にお
いて利用される。サンプルからの蛍光は、対物レンズ６
及び偏光反射鏡１８を経て光線スプリッター１７に達
し、そしてそこで励起光線に対して反対の方向に伝えら
れる。この蛍光は、検出モジュール１９中の光線スプリ
ッター１７の後ろで検出される。このモジュールは、焦
点の面の外の蛍光を抑えることのできるごく小さな穴、
ＦＩＴＣ及びＣｙ５の２つの蛍光発光のための２つの光
電子増倍管、及び対応する色フィルターを含んでなる。
走査工程の間、標識したリガンド及び結合部位の蛍光発
光部分の蛍光強度は同時に測定され、そして一つがもう
一つで割られ、その結果、別の２回目の蛍光記録は必要
ない。従って、この商は、閾値Ｓ2からオンラインで識
別され、そして走査の完了時に、設定した閾値Ｓ2以上
の強度を有する画素の座標及び強度だけが、制御及び分
析しているコンピューターの作動メモリーに存在する。
しかしながら、この代わりとして、場合によっては異な
る閾値を用いて後に識別するために、走査工程の完了時
に、分析しているコンピューター上で全画像が処理され
ることができる。
【００４２】２．５＊１０4ｍｍ2の走査面、１ｍｍ2の
大きさの視野、及び視野当たり１．１秒の走査時間（Ｚ
ｅｉｓｓ−ＬＳＭ）の場合、サンプルを保持している台
の移動を考慮して、全蛍光分析のためにかかる全時間は
１１時間である。
大きさの視野、及び視野当たり１．１秒の走査時間（Ｚ
ｅｉｓｓ−ＬＳＭ）の場合、サンプルを保持している台
の移動を考慮して、全蛍光分析のためにかかる全時間は
１１時間である。
【００４３】ＣＣＤカメラによる、またはレーザースキ
ャナーによる全走査工程の後に、画像計算機のメモリー
は、特定の結合特性を有するバクテリアの局所的座標の
表を含み、これを用いてバクテリアの分離が行われる。
分離されるバクテリアの数は、場合によってはこの表を
基にして制限されることができる。
ャナーによる全走査工程の後に、画像計算機のメモリー
は、特定の結合特性を有するバクテリアの局所的座標の
表を含み、これを用いてバクテリアの分離が行われる。
分離されるバクテリアの数は、場合によってはこの表を
基にして制限されることができる。
【００４４】走査が終了され、分離されるバクテリアの
局所的座標がわかった後、後者は、適当な分離作動装置
により基層から取り除かれ、そして標的基層上に置かれ
なければならない。微細毛細管２０に基づく分離作動装
置がこの目的のために用いられる。この種の分離作動装
置は、原則として、パッチクランプ（ｐａｔｃｈ ｃｌ
ａｍｐ）技術から既知である。
局所的座標がわかった後、後者は、適当な分離作動装置
により基層から取り除かれ、そして標的基層上に置かれ
なければならない。微細毛細管２０に基づく分離作動装
置がこの目的のために用いられる。この種の分離作動装
置は、原則として、パッチクランプ（ｐａｔｃｈ ｃｌ
ａｍｐ）技術から既知である。
【００４５】移動工程のための装置は、図４に略図的に
示される。微細毛細管２０は、顕微操作装置２１により
動かされることができ、画像計算機中の座標の表に従っ
て、選択されるバクテリアへ順に動かされ、そしてそれ
らの上に正確に位置される。従って、画像計算機は、顕
微操作装置２１が、選択されるバクテリアの部位で微細
毛細管２０を捜し出し、そしてその位置を定めるための
制御計算機として機能する。選択されたバクテリアは、
次に、微細毛細管２０により基層の表面から吸引され、
そして再び標的基層の上に置かれる。ここで、寒天面ま
たはアガロース面を用いて調製される、基層２上の端の
区画３は、標的基層として働く。目的は個々のバクテリ
アを高い被覆密度で操作することであるので、微細毛細
管の直径は物体の大きさに適合し、従って、２及び２０
μｍの間である。 好ましくは、引き伸ばす工程により
融解した状態において製造された、特別なガラスで作ら
れた微細毛細管が、バクテリアの移動のために用いられ
る。１．６ｍｍの最初の直径を有するホウケイ酸ガラス
管（企業Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、Ｍａｌｓｆｅｌｄ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）が、記述される実験のために用いられ
る。市販されているピペット引き伸ばし装置（ＤＭＺ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｕｌｌｅｒ、企業Ｚｅｉｔｚ−Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を用いる３段階の引き伸ばし工程において、毛細管
は、融解した末端で開口部で約６μｍの直径を有する円
柱のピペットの形（すなわち、先端まで引き伸ばされな
い）に製造される。もう一方の側で、最初の直径は変わ
らないままである。このピペットの形は、移動工程、特
にすすぎ工程の再現性のために有用であることがわかっ
ている。
示される。微細毛細管２０は、顕微操作装置２１により
動かされることができ、画像計算機中の座標の表に従っ
て、選択されるバクテリアへ順に動かされ、そしてそれ
らの上に正確に位置される。従って、画像計算機は、顕
微操作装置２１が、選択されるバクテリアの部位で微細
毛細管２０を捜し出し、そしてその位置を定めるための
制御計算機として機能する。選択されたバクテリアは、
次に、微細毛細管２０により基層の表面から吸引され、
そして再び標的基層の上に置かれる。ここで、寒天面ま
たはアガロース面を用いて調製される、基層２上の端の
区画３は、標的基層として働く。目的は個々のバクテリ
アを高い被覆密度で操作することであるので、微細毛細
管の直径は物体の大きさに適合し、従って、２及び２０
μｍの間である。 好ましくは、引き伸ばす工程により
融解した状態において製造された、特別なガラスで作ら
れた微細毛細管が、バクテリアの移動のために用いられ
る。１．６ｍｍの最初の直径を有するホウケイ酸ガラス
管（企業Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、Ｍａｌｓｆｅｌｄ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）が、記述される実験のために用いられ
る。市販されているピペット引き伸ばし装置（ＤＭＺ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｕｌｌｅｒ、企業Ｚｅｉｔｚ−Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を用いる３段階の引き伸ばし工程において、毛細管
は、融解した末端で開口部で約６μｍの直径を有する円
柱のピペットの形（すなわち、先端まで引き伸ばされな
い）に製造される。もう一方の側で、最初の直径は変わ
らないままである。このピペットの形は、移動工程、特
にすすぎ工程の再現性のために有用であることがわかっ
ている。
【００４６】図４から見ることができるように、微細毛
細管２０は、顕微操作装置２１に取り付けられた締め具
装置２２に保持され、これは、μｍの範囲で３次元的に
位置されることができ、そしてその動きは画像計算機に
より制御される。この型の顕微操作装置は市販されてい
る。微細毛細管は、管２３を経て注射器２４に連結さ
れ、これにより毛細管の内圧が調整される。この圧力
は、三つ又栓２５を経て圧力計２６により測定される。
顕微操作装置２１及び注射器２４の両方は、パルスモー
ター（ここには示されない）を用いて遠隔操作により作
動され、そして画像計算機により誘導される。
細管２０は、顕微操作装置２１に取り付けられた締め具
装置２２に保持され、これは、μｍの範囲で３次元的に
位置されることができ、そしてその動きは画像計算機に
より制御される。この型の顕微操作装置は市販されてい
る。微細毛細管は、管２３を経て注射器２４に連結さ
れ、これにより毛細管の内圧が調整される。この圧力
は、三つ又栓２５を経て圧力計２６により測定される。
顕微操作装置２１及び注射器２４の両方は、パルスモー
ター（ここには示されない）を用いて遠隔操作により作
動され、そして画像計算機により誘導される。
【００４７】相互に作用する工程としての分離方法は、
以下に記述される。しかしながら、それは、コンピュー
ターの制御下で完全に自動的に処理されることもでき
る。
以下に記述される。しかしながら、それは、コンピュー
ターの制御下で完全に自動的に処理されることもでき
る。
【００４８】バクテリアの吸引及び分離の全工程（選抜
工程）は、位相差における４０倍の倍率での観察により
可能とされる視覚制御に基づく。ここで示される顕微鏡
の唯一の部品は、対物レンズ６及び照明集光器である。
集光器７から目的物までの約２２ｍｍの必要な操作距離
を考慮して、微細毛細管２０は、ほとんど９０°の角度
を形成し、それ故、集光器の下に小さくまとまって位置
されることができるように、軟化点以上に加熱され、曲
げられる。このようにして、移動工程の観察が、妨げら
れずに行われることができる。ピペットの直径（ここで
は、６μｍ）の大きさの範囲内の移動工程の高い空間分
解能のために、ピペットが選抜される物体と垂直の接触
をしなければならないことが極めて重要である。その結
果として、移動工程の間に周囲の物体に影響し得る水の
被膜が、毛細管壁及び寒天基層の間に形成されない。選
抜のための準備において、低圧により保存瓶から毛細管
２０の中にバッファー溶液が吸引される。ここで、毛細
管の先細になった部分のみがバッファー溶液で満たされ
ることで十分である。
工程）は、位相差における４０倍の倍率での観察により
可能とされる視覚制御に基づく。ここで示される顕微鏡
の唯一の部品は、対物レンズ６及び照明集光器である。
集光器７から目的物までの約２２ｍｍの必要な操作距離
を考慮して、微細毛細管２０は、ほとんど９０°の角度
を形成し、それ故、集光器の下に小さくまとまって位置
されることができるように、軟化点以上に加熱され、曲
げられる。このようにして、移動工程の観察が、妨げら
れずに行われることができる。ピペットの直径（ここで
は、６μｍ）の大きさの範囲内の移動工程の高い空間分
解能のために、ピペットが選抜される物体と垂直の接触
をしなければならないことが極めて重要である。その結
果として、移動工程の間に周囲の物体に影響し得る水の
被膜が、毛細管壁及び寒天基層の間に形成されない。選
抜のための準備において、低圧により保存瓶から毛細管
２０の中にバッファー溶液が吸引される。ここで、毛細
管の先細になった部分のみがバッファー溶液で満たされ
ることで十分である。
【００４９】次に、選抜される物体または基層２から分
離されるバクテリア２７が、顕微鏡の移動台８の移動に
より毛細管２０の下に位置され、この移動の座標は、画
像計算機により制御される。ここで、毛細管の内圧は、
周囲の圧力に対して−３００ｍｂａｒに調整される。顕
微鏡により同時に観察されながら、毛細管２０が、選抜
されるバクテリア２７上のアガロース基層２の上へ直接
置かれる。次に、微細毛細管２０が、顕微操作装置上の
高さ調整により持ち上げられ、その結果、空の基層表面
が顕微鏡画像において後に残る。バクテリア２７をすす
ぐために、微細毛細管２０または移動台８のいずれか
が、標的基層上の適当な位置へ動かされる。ここで、内
圧が＋１００ｍｂａｒに増加される。毛細管が標的基層
（この場合、基層２上の端の区画３）上に置かれている
間に、すすぎ工程が行われる。毛細管２０が標的基層３
から再び持ち上げられた後、すすがれたバクテリアが顕
微鏡の位相差画像においてもう一度見える。
離されるバクテリア２７が、顕微鏡の移動台８の移動に
より毛細管２０の下に位置され、この移動の座標は、画
像計算機により制御される。ここで、毛細管の内圧は、
周囲の圧力に対して−３００ｍｂａｒに調整される。顕
微鏡により同時に観察されながら、毛細管２０が、選抜
されるバクテリア２７上のアガロース基層２の上へ直接
置かれる。次に、微細毛細管２０が、顕微操作装置上の
高さ調整により持ち上げられ、その結果、空の基層表面
が顕微鏡画像において後に残る。バクテリア２７をすす
ぐために、微細毛細管２０または移動台８のいずれか
が、標的基層上の適当な位置へ動かされる。ここで、内
圧が＋１００ｍｂａｒに増加される。毛細管が標的基層
（この場合、基層２上の端の区画３）上に置かれている
間に、すすぎ工程が行われる。毛細管２０が標的基層３
から再び持ち上げられた後、すすがれたバクテリアが顕
微鏡の位相差画像においてもう一度見える。
【００５０】４つの実施例の各々において、１０個のバ
クテリアが本生育培地から栄養物を含んだ標的基層へ移
された。数日の生育期間の後に、これらの場合の５０な
いし６０％において個々のバクテリアからコロニーが形
成した。親集団の活力度の試験において、６０％の値が
測定され、従って、このことに基づき、移動工程は非常
に穏やか（ｓｐａｒｉｎｇ）であると見なされることが
できる。代わりに、バクテリアは、液体、例えば、ＰＢ
Ｓバッファー中に置かれることができる。この液体は、
市販されている９６または３８４マイクロタイタープレ
ートの窪み（ウェル）に置かれることができる。
クテリアが本生育培地から栄養物を含んだ標的基層へ移
された。数日の生育期間の後に、これらの場合の５０な
いし６０％において個々のバクテリアからコロニーが形
成した。親集団の活力度の試験において、６０％の値が
測定され、従って、このことに基づき、移動工程は非常
に穏やか（ｓｐａｒｉｎｇ）であると見なされることが
できる。代わりに、バクテリアは、液体、例えば、ＰＢ
Ｓバッファー中に置かれることができる。この液体は、
市販されている９６または３８４マイクロタイタープレ
ートの窪み（ウェル）に置かれることができる。
【００５１】迅速に連続して行われる選抜及びすすぎ工
程に加えて、いくつかのバクテリアが次々に選抜され、
そして対応して次々にすすがれることもできる。この方
法は、選抜される物体間の進路が最適化されることがで
き、そしてさらに毛細管中の圧力の調整が各場合におい
て一回だけなされることが必要であるので、比較的時間
を節約する。バクテリアの使用の利点は、通常の生育に
よる単純な増幅である。さらに、個々の選抜されたバク
テリアから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりこ
れらのバクテリアの特定の性質を担う遺伝子配列を増幅
することが可能である。
程に加えて、いくつかのバクテリアが次々に選抜され、
そして対応して次々にすすがれることもできる。この方
法は、選抜される物体間の進路が最適化されることがで
き、そしてさらに毛細管中の圧力の調整が各場合におい
て一回だけなされることが必要であるので、比較的時間
を節約する。バクテリアの使用の利点は、通常の生育に
よる単純な増幅である。さらに、個々の選抜されたバク
テリアから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりこ
れらのバクテリアの特定の性質を担う遺伝子配列を増幅
することが可能である。
【００５２】選別及び分離の全工程は、以下に要約して
もう一度記述される。第一段階は、サンプルの調製にあ
る。蛍光標識したリガンドは、バクテリアの分散物と混
合される。このインキュベーション工程の後に、バッフ
ァー溶液で遠心分離されることにより、バクテリアは洗
浄される。このバクテリアの分散物は、次に、二次元の
アガロース基層２上に置かれる。基層２は、倒立顕微鏡
５の移動台８上に置かれる。次に、選別工程の第二段階
は、蛍光記録を行うことにある。最初に、移動台８は、
走査されるサンプルの領域の上左隅が顕微鏡の画像領域
中に置かれるようになるように位置される。次の台の移
動は、全サンプル表面を含む蛇行経路をたどる。蛍光記
録のために、レーザー光線が、リガンドの蛍光を励起す
るためにシャッターを経て放たれ、そしてサンプルに照
射するために光ファイバー１０中に封入される。次に、
ＣＣＤカメラ１２の記録モードが開始される。露光時間
の最後に、レーザーモジュール９のシャッターが閉じら
れる。ＣＣＤカメラ１２のｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ
ｂｏａｒｄ上で、蛍光画像が、選択された閾値Ｓ1以
上の画素に対して走査される。何も画素が見つからない
場合、台は次の位置へ移動され、そして画像の記録工程
が記述されたように繰り返される。分析の間に閾値以上
の画素が検出される場合、次に、結合部位の蛍光発光部
分のもう一つの蛍光記録が、同じ位置の台で行われる。
この目的のために、レーザーモジュール９のシャッター
が、第二のレーザーに対して開かれ、そしてＣＣＤカメ
ラ１２による画像記録が開始される。画像記録の終了時
に、シャッターが再び閉じられる。リガンドの蛍光の画
像及び結合部位の蛍光の画像の商が、ｆｒａｍｅ ｇｒ
ａｂｂｅｒ ｂｏａｒｄの面において再び得られる。こ
の商の画像から、次に、閾値Ｓ2以上である画素が検出
される。画素の座標及び関係する商の値は、この情報を
データファイルに保存する画像計算機において測定され
る。このソフトウェア分析の終了時に、台は次の位置へ
動かされ、そして全サンプルが蛍光分光学により特徴づ
けられるまで、走査工程が周期的に繰り返される。
もう一度記述される。第一段階は、サンプルの調製にあ
る。蛍光標識したリガンドは、バクテリアの分散物と混
合される。このインキュベーション工程の後に、バッフ
ァー溶液で遠心分離されることにより、バクテリアは洗
浄される。このバクテリアの分散物は、次に、二次元の
アガロース基層２上に置かれる。基層２は、倒立顕微鏡
５の移動台８上に置かれる。次に、選別工程の第二段階
は、蛍光記録を行うことにある。最初に、移動台８は、
走査されるサンプルの領域の上左隅が顕微鏡の画像領域
中に置かれるようになるように位置される。次の台の移
動は、全サンプル表面を含む蛇行経路をたどる。蛍光記
録のために、レーザー光線が、リガンドの蛍光を励起す
るためにシャッターを経て放たれ、そしてサンプルに照
射するために光ファイバー１０中に封入される。次に、
ＣＣＤカメラ１２の記録モードが開始される。露光時間
の最後に、レーザーモジュール９のシャッターが閉じら
れる。ＣＣＤカメラ１２のｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ
ｂｏａｒｄ上で、蛍光画像が、選択された閾値Ｓ1以
上の画素に対して走査される。何も画素が見つからない
場合、台は次の位置へ移動され、そして画像の記録工程
が記述されたように繰り返される。分析の間に閾値以上
の画素が検出される場合、次に、結合部位の蛍光発光部
分のもう一つの蛍光記録が、同じ位置の台で行われる。
この目的のために、レーザーモジュール９のシャッター
が、第二のレーザーに対して開かれ、そしてＣＣＤカメ
ラ１２による画像記録が開始される。画像記録の終了時
に、シャッターが再び閉じられる。リガンドの蛍光の画
像及び結合部位の蛍光の画像の商が、ｆｒａｍｅ ｇｒ
ａｂｂｅｒ ｂｏａｒｄの面において再び得られる。こ
の商の画像から、次に、閾値Ｓ2以上である画素が検出
される。画素の座標及び関係する商の値は、この情報を
データファイルに保存する画像計算機において測定され
る。このソフトウェア分析の終了時に、台は次の位置へ
動かされ、そして全サンプルが蛍光分光学により特徴づ
けられるまで、走査工程が周期的に繰り返される。
【００５３】走査工程が終了された時、バクテリアの分
離が第三段階において行われる。この目的のために、画
像計算機に保存された選抜表に従って、移動台は、分離
されることになるバクテリアへ徐々に移動される。次
に、微細毛細管２０が選別されたバクテリア２７上へ下
げられ、そして低圧により吸引される。毛細管２０が基
層２から再び持ち上げられた後、移動台８は、独立した
標的基層表面３へ移動し、そこにバクテリア２７が置か
れる。この目的のために、毛細管２０は、基層３上へ下
げられ、そしてバクテリア２７は、毛細管２０中に設定
された過剰の圧力によりすすがれる。この工程は、全選
抜表が処理されるまで繰り返される。調べられたバクテ
リアの位置は、後の配置を保証するために、画像計算機
中に記録される。バクテリアの移動の終了時に、分離さ
れたバクテリアと共に標的基層３は、移動台８から取り
除かれ、そしてバクテリアの培養のためにインキュベー
ター中に置かれる。
離が第三段階において行われる。この目的のために、画
像計算機に保存された選抜表に従って、移動台は、分離
されることになるバクテリアへ徐々に移動される。次
に、微細毛細管２０が選別されたバクテリア２７上へ下
げられ、そして低圧により吸引される。毛細管２０が基
層２から再び持ち上げられた後、移動台８は、独立した
標的基層表面３へ移動し、そこにバクテリア２７が置か
れる。この目的のために、毛細管２０は、基層３上へ下
げられ、そしてバクテリア２７は、毛細管２０中に設定
された過剰の圧力によりすすがれる。この工程は、全選
抜表が処理されるまで繰り返される。調べられたバクテ
リアの位置は、後の配置を保証するために、画像計算機
中に記録される。バクテリアの移動の終了時に、分離さ
れたバクテリアと共に標的基層３は、移動台８から取り
除かれ、そしてバクテリアの培養のためにインキュベー
ター中に置かれる。
【００５４】分子進化の分野からの上記の実施例と同様
に、ポリマービーズ上に支持される、組み合わせ化学に
より得られたライブラリーからの結合事象の分離を行う
ことが可能である。ポリマービーズは、分子ライブラリ
ーを生じる多段階の化学合成を受ける。これは、同じ種
類の分子の多様性が、個々のビーズ表面上に存在するこ
とを特徴とし、一方、異なるビーズ上の分子の型は、２
つ一組になって異なる。バクテリアの懸濁液のように、
ビーズの懸濁液は、色素で標識されたリガンドと混合さ
れ、続いて洗浄される。ここで、ビーズのバックグラウ
ンドの蛍光を減少するために、例えばＣｙ５のような長
い波長を有する色素が色素での標識のために都合よく用
いられる。次に、これらのビーズは、アガロース表面上
に置かれ、そして上記のように蛍光分光学により分析さ
れる。個々のビーズを分離する工程のために、用いられ
る分離作動装置は、同様にガラスの毛細管であるが、し
かしながら、その開口部は、約１００μｍの直径のビー
ズの大きさに適合する直径を有する。分離工程は、個々
のビーズの吸引及び次の空間的に分離された基層上での
すすぎにより、同様に行われる。
に、ポリマービーズ上に支持される、組み合わせ化学に
より得られたライブラリーからの結合事象の分離を行う
ことが可能である。ポリマービーズは、分子ライブラリ
ーを生じる多段階の化学合成を受ける。これは、同じ種
類の分子の多様性が、個々のビーズ表面上に存在するこ
とを特徴とし、一方、異なるビーズ上の分子の型は、２
つ一組になって異なる。バクテリアの懸濁液のように、
ビーズの懸濁液は、色素で標識されたリガンドと混合さ
れ、続いて洗浄される。ここで、ビーズのバックグラウ
ンドの蛍光を減少するために、例えばＣｙ５のような長
い波長を有する色素が色素での標識のために都合よく用
いられる。次に、これらのビーズは、アガロース表面上
に置かれ、そして上記のように蛍光分光学により分析さ
れる。個々のビーズを分離する工程のために、用いられ
る分離作動装置は、同様にガラスの毛細管であるが、し
かしながら、その開口部は、約１００μｍの直径のビー
ズの大きさに適合する直径を有する。分離工程は、個々
のビーズの吸引及び次の空間的に分離された基層上での
すすぎにより、同様に行われる。
【００５５】本発明及び態様を示せば以下のとおりであ
る。
る。
【００５６】１．ａ）結合するリガンドが蛍光色素で標
識され、そして懸濁液の形態にある分子ライブラリーと
混合され、 ｂ）次に、分子ライブラリー中の分子に結合しない過剰
のリガンドが洗浄され、そして除かれ、 ｃ）この混合物が２次元の基層（２）上に広げられ、 ｄ）被覆された基層（２）が蛍光顕微鏡（５）の下に置
かれ、基層（２）上の局所的な蛍光強度が電気光学的に
同定され、閾値の形態の与えられた選別規準に従って電
子工学的に識別され、そして分子ライブラリーの分子に
対するリガンドの高い結合親和性により特徴づけられ、
それにより選別基準を満たす、基層（２）上に位置して
いる物体が同定され、画像計算機中の保管により位置を
突き止められ、 ｅ）次に、これらの物体が、基層（２）及び分離作動装
置（２０、２１）の間の−座標が画像計算機により制御
される−相対的な変位により分離作動装置（２０、２
１）の作動地点で位置を定められ、分離作動装置（２
０、２１）により基層から取り除かれ、そして個々に局
所的に置かれる、ことを特徴とする、少なくとも一つの
与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関して分
子ライブラリーから分子をスクリーニングし、そして高
い親和性の種類を個々に選別するための方法。
識され、そして懸濁液の形態にある分子ライブラリーと
混合され、 ｂ）次に、分子ライブラリー中の分子に結合しない過剰
のリガンドが洗浄され、そして除かれ、 ｃ）この混合物が２次元の基層（２）上に広げられ、 ｄ）被覆された基層（２）が蛍光顕微鏡（５）の下に置
かれ、基層（２）上の局所的な蛍光強度が電気光学的に
同定され、閾値の形態の与えられた選別規準に従って電
子工学的に識別され、そして分子ライブラリーの分子に
対するリガンドの高い結合親和性により特徴づけられ、
それにより選別基準を満たす、基層（２）上に位置して
いる物体が同定され、画像計算機中の保管により位置を
突き止められ、 ｅ）次に、これらの物体が、基層（２）及び分離作動装
置（２０、２１）の間の−座標が画像計算機により制御
される−相対的な変位により分離作動装置（２０、２
１）の作動地点で位置を定められ、分離作動装置（２
０、２１）により基層から取り除かれ、そして個々に局
所的に置かれる、ことを特徴とする、少なくとも一つの
与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関して分
子ライブラリーから分子をスクリーニングし、そして高
い親和性の種類を個々に選別するための方法。
【００５７】２．基層（２）上の局所的な蛍光強度の電
子光学的な同定が、ＣＣＤカメラ（１２）により、全画
像の形態おいてまたは部分的な画像の形態において順次
行われ、そして場合によってはデータの要約整理後に、
保管のために、そして画像分析によるさらなる処理及び
与えられた選別規準に従った評価のために、全画像また
は部分的画像が画像計算機へ送られることを特徴とす
る、上記１に記載の方法。 ３．基層（２）上の局所的な蛍光強度の電子光学的な同
定が、レーザースキャナー（１３、１５、１６）により
行われ、その出力シグナルが、与えられた選別規準に従
って電子工学的に評価され、そして関係する局所的座標
と組み合わせて画像計算機へ送られることを特徴とす
る、上記１に記載の方法。
子光学的な同定が、ＣＣＤカメラ（１２）により、全画
像の形態おいてまたは部分的な画像の形態において順次
行われ、そして場合によってはデータの要約整理後に、
保管のために、そして画像分析によるさらなる処理及び
与えられた選別規準に従った評価のために、全画像また
は部分的画像が画像計算機へ送られることを特徴とす
る、上記１に記載の方法。 ３．基層（２）上の局所的な蛍光強度の電子光学的な同
定が、レーザースキャナー（１３、１５、１６）により
行われ、その出力シグナルが、与えられた選別規準に従
って電子工学的に評価され、そして関係する局所的座標
と組み合わせて画像計算機へ送られることを特徴とす
る、上記１に記載の方法。
【００５８】４．大腸菌バクテリアが、分子ライブラリ
ーの作製におけるバクテリアの発現系として用いられる
ことを特徴とする、上記１ないし３に記載の方法。
ーの作製におけるバクテリアの発現系として用いられる
ことを特徴とする、上記１ないし３に記載の方法。
【００５９】５．ペプチドライブラリー及び／またはタ
ンパク質ライブラリーの作製のために、用いられる特定
のバクテリアの発現系が、遺伝子操作によりＬａｍＢ膜
貫通タンパク質の変種を発現する大腸菌バクテリアを含
んでなることを特徴とする、上記４に記載の方法。
ンパク質ライブラリーの作製のために、用いられる特定
のバクテリアの発現系が、遺伝子操作によりＬａｍＢ膜
貫通タンパク質の変種を発現する大腸菌バクテリアを含
んでなることを特徴とする、上記４に記載の方法。
【００６０】６．組み合わせ化学の方法が、分子ライブ
ラリーの作製のために用いられ、従って、分子ライブラ
リーがポリマービーズ上に作製されることを特徴とす
る、上記１ないし３に記載の方法。
ラリーの作製のために用いられ、従って、分子ライブラ
リーがポリマービーズ上に作製されることを特徴とす
る、上記１ないし３に記載の方法。
【００６１】７．異なるリガンドが異なる蛍光色素で標
識されることを特徴とする、上記１ないし６に記載の方
法。
識されることを特徴とする、上記１ないし６に記載の方
法。
【００６２】８．蛍光強度に対する閾値の表が、異なる
リガンドに対する選別規準として与えられることを特徴
とする、上記７に記載の方法。
リガンドに対する選別規準として与えられることを特徴
とする、上記７に記載の方法。
【００６３】９．バクテリア上の分子ライブラリーを支
持しているタンパク質及びポリマービーズ上の組み合わ
せ化学から得られた化合物が、さらなる蛍光色素で標識
され、そしてこの結合部位の蛍光強度が、画像分析にお
けるさらなる選別規準として考慮されることを特徴とす
る、上記１ないし６に記載の方法。
持しているタンパク質及びポリマービーズ上の組み合わ
せ化学から得られた化合物が、さらなる蛍光色素で標識
され、そしてこの結合部位の蛍光強度が、画像分析にお
けるさらなる選別規準として考慮されることを特徴とす
る、上記１ないし６に記載の方法。
【００６４】１０．結合部位に特徴的な蛍光強度に対す
るリガンドに特徴的な蛍光強度の比率が、画像分析にお
いて、結合親和性に対する明確な選別規準であると考え
られることを特徴とする、上記９に記載の方法。
るリガンドに特徴的な蛍光強度の比率が、画像分析にお
いて、結合親和性に対する明確な選別規準であると考え
られることを特徴とする、上記９に記載の方法。
【００６５】１１．ａ）バクテリアの広げられた懸濁液
の局所的蛍光強度の同定のためのＣＣＤカメラ（１２）
またはレーザースキャナー（１３、１５、１６）からな
る電気光学的走査装置が提供され、この装置が、蛍光画
像情報のさらなる処理及び保管のために画像計算機に連
結され、 ｂ）選別された物体の移動のための分離作動装置（２
０、２１）が、移動台（８）上に配置され、 ｃ）そして、画像計算機が、分離作動装置（２０、２
１）に対する移動台（８）の配置を制御する、ことを特
徴とする、倒立蛍光顕微鏡（５）、及び懸濁液中の広げ
られた物体と共に支持体（２）を保持するための移動台
（８）、並びに蛍光を励起するための少なくとも一つの
光源（９）からなる、上記１ないし８に記載の方法を行
うための装置。
の局所的蛍光強度の同定のためのＣＣＤカメラ（１２）
またはレーザースキャナー（１３、１５、１６）からな
る電気光学的走査装置が提供され、この装置が、蛍光画
像情報のさらなる処理及び保管のために画像計算機に連
結され、 ｂ）選別された物体の移動のための分離作動装置（２
０、２１）が、移動台（８）上に配置され、 ｃ）そして、画像計算機が、分離作動装置（２０、２
１）に対する移動台（８）の配置を制御する、ことを特
徴とする、倒立蛍光顕微鏡（５）、及び懸濁液中の広げ
られた物体と共に支持体（２）を保持するための移動台
（８）、並びに蛍光を励起するための少なくとも一つの
光源（９）からなる、上記１ないし８に記載の方法を行
うための装置。
【００６６】１２．分離作動装置（２０、２１）が、顕
微操作装置に連結した下げることのできる微細毛細管
（２０）を含んでなることを特徴とする、上記１１に記
載の装置。
微操作装置に連結した下げることのできる微細毛細管
（２０）を含んでなることを特徴とする、上記１１に記
載の装置。
【００６７】１３．蛍光を励起する光が、顕微鏡からの
光線の進路から離れた少なくとも一つの光学導波管（１
０）を通って基層（２）へ送られることを特徴とする、
上記１１及び１２に記載の装置。
光線の進路から離れた少なくとも一つの光学導波管（１
０）を通って基層（２）へ送られることを特徴とする、
上記１１及び１２に記載の装置。
【００６８】１４．同じ光学導波管（１０）中に封入さ
れることのできる、異なる波長を有する２つの異なるレ
ーザーが、蛍光を励起するために提供されることを特徴
とする、上記１３に記載の装置。
れることのできる、異なる波長を有する２つの異なるレ
ーザーが、蛍光を励起するために提供されることを特徴
とする、上記１３に記載の装置。
【００６９】１５．照明装置（７）及び微細毛細管（１
３）を含んでいる蛍光顕微鏡が、水蒸気で飽和された空
気の流れにより１℃及び１０℃の間の温度に冷却される
気候室（４）に取り付けられることを特徴とする、上記
１１ないし１４に記載の装置。
３）を含んでいる蛍光顕微鏡が、水蒸気で飽和された空
気の流れにより１℃及び１０℃の間の温度に冷却される
気候室（４）に取り付けられることを特徴とする、上記
１１ないし１４に記載の装置。
【図１】広げられたバクテリア懸濁液を有する二次元の
基層を示す。
基層を示す。
【図２】ＣＣＤカメラに基づく選別装置の図を示す。
【図３】レーザースキャナーに基づく選別装置の図を示
す。
す。
【図４】選別された特有の物体の移動（分離）のための
分離作動装置を示す。
分離作動装置を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ビンフリート・コシユ ドイツ65203ビースバーデン・アムギユル デンプラン11 (72)発明者 バルター・バイヘル ドイツ51519オーデンタール・デユナーア ウエ15
Claims (3)
- 【請求項１】 ａ）結合するリガンドが蛍光色素で標識
され、そして懸濁液の形態にある分子ライブラリーと混
合され、 ｂ）次に、分子ライブラリー中の分子に結合しない過剰
のリガンドが洗浄され、そして除かれ、 ｃ）この混合物が２次元の基層（２）上に広げられ、 ｄ）被覆された基層（２）が蛍光顕微鏡（５）の下に置
かれ、基層（２）上の局所的な蛍光強度が電気光学的に
同定され、閾値の形態の与えられた選別規準に従って電
子工学的に識別され、そして分子ライブラリーの分子に
対するリガンドの高い結合親和性により特徴づけられ、
それにより選別基準を満たす、基層（２）上に位置して
いる物体が同定され、画像計算機中の保管により位置を
突き止められ、 ｅ）次に、これらの物体が、基層（２）及び分離作動装
置（２０、２１）の間の−座標が画像計算機により制御
される−相対的な変位により分離作動装置（２０、２
１）の作動地点で位置を定められ、分離作動装置（２
０、２１）により基層から取り除かれ、そして個々に局
所的に置かれる、ことを特徴とする、少なくとも一つの
与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関して分
子ライブラリーから分子をスクリーニングし、そして高
い親和性の種類を個々に選別するための方法。 - 【請求項２】 基層（２）上の局所的な蛍光強度の電子
光学的な同定が、ＣＣＤカメラ（１２）により、全画像
の形態おいてまたは部分的な画像の形態において順次行
われ、そして場合によってはデータの要約整理後に、保
管のために、そして画像分析によるさらなる処理及び与
えられた選別規準に従った評価のために、全画像または
部分的画像が画像計算機へ送られることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ａ）バクテリアの広げられた懸濁液の局
所的蛍光強度の同定のためのＣＣＤカメラ（１２）また
はレーザースキャナー（１３、１５、１６）からなる電
気光学的走査装置が提供され、この装置が、蛍光画像情
報のさらなる処理及び保管のために画像計算機に連結さ
れ、 ｂ）選別された物体の移動のための分離作動装置（２
０、２１）が、移動台（８）上に配置され、 ｃ）そして、画像計算機が、分離作動装置（２０、２
１）に対する移動台（８）の配置を制御する、ことを特
徴とする、倒立蛍光顕微鏡（５）、及び懸濁液中の広げ
られた物体と共に支持体（２）を保持するための移動台
（８）、並びに蛍光を励起するための少なくとも一つの
光源（９）からなる、請求項１ないし２に記載の方法を
行うための装置。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19629141.0 | 1996-07-19 | ||
| DE19629141A DE19629141A1 (de) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
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| JPH1078434A true JPH1078434A (ja) | 1998-03-24 |
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| EP (1) | EP0819930A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1078434A (ja) |
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