CN114940949A - 用于栽培北苍术菌根化苗的菌剂制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备用于栽培北苍术的菌剂的方法，以及以所制备的菌剂制备菌根化北苍术苗的方法。实验证明，接种本发明的用于栽培北苍术的菌剂后，北苍术根系菌根侵染率达到100％，且显著提高了北苍术生物量，当年和一年生北苍术对菌根依赖性分别达到36％和52％，全株干重分别提高56.2％和108.4％，均达显著水平。同时，接种用于栽培北苍术的菌剂的次年生北苍术根长、根表面积均显著高于不接种处理。表明本发明的用于栽培北苍术的菌剂更适合北苍术幼苗，形成的菌根化幼苗具有较好的生长势和发育良好的根系。

Description

用于栽培北苍术菌根化苗的菌剂制备方法及应用

技术领域

本发明专利属于栽培技术领域，具体涉及一种用于栽培北苍术菌根化苗的菌剂的制备方法与应用。

背景技术

北苍术(Atractylodes Chinensis(DC.)Koidz)为菊科苍术属多年生草本药用植物，以干燥的根茎入药，是中医药大宗药材之一。近年来，野生北苍术被过度采挖导致资源日益枯竭，为满足市场需求，人工栽培规模逐年增多，但由于种植不规范，突显出许多问题：①种苗繁育不规范、市场缺口大、价格波动大，影响质量和效益。②中药材野生性强，仿野生技术不规范，常规农业栽培措施难以达到抗逆、耐密、高产的目标，且土传病害严重。③中药材生产技术侧重于重产量轻质量，滥用化肥、农药、生长调节剂现象较为普遍，导致中药材品质下降，影响药材的质量和疗效。

丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)真菌是陆地土壤中一类重要有益真菌，广泛存在于各类生态系统中，如高原、平原、农田、沙漠、湿地、重金属污染区、盐碱地等。但不同生态系统中AM真菌优势群落组合存在差异，这些组合差异是宿主植物和生境环境共同作用的结果，也是其帮助植物适应不同生态系统的前提，如改善植物营养状况，增强宿主植物的抗旱性、抗盐渍性、抗病性等。这些不同生境中AM真菌优势群落组合差异，正是AM真菌具有生态专性共生特性的表现，也决定着不同植物对不同AM真菌的菌根依赖程度高低。

目前关于药用植物根区土壤中AM真菌物种多样性研究发现药用植物AM真菌种质资源丰富，其中曹敏^[1]等人采用高通量测序技术分析发现重庆地区茅苍术根际土壤AM有球囊菌门3纲4目8科9属，其中球囊霉属相对丰度最高，达到67％。随着菌根研究的快速发展，将丛枝菌根真菌应用到药用植物栽培中也是目前研究的热点，研究报道AM真菌对药用植物栽培具有显著的促进生长、提高抗逆性和药用成分的作用。因为AM真菌的生态专性共生特性使得药用植物与AM真菌建立共生关系时具有一定的选择性，且研究表明土壤中土著优势AM真菌对植物的促进作用最为显著^[2]。因此对药用植物根区土壤AM真菌多样性进行分析并诱导培养获得优势土著AM菌，运用到药用植物栽培及保种引种繁育中，对保护药用植物种质资源、改善药用植物生长状况和提高有效成分含量，促进中医药事业的可持续发展具有重要意义。

[1]曹敏,胡开治,刘燕琴,等.高通量测序分析重庆地区茅苍术根际丛枝菌根真菌多样性.微生物学通报,2020,9:2877-2886.

[2]薛英龙,李春越,王苁蓉,等.丛枝菌根真菌促进植物摄取土壤磷的作用机制.水土保持学报,2019,33(6):10-20.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何繁育菌根化北苍术苗。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备用于栽培北苍术的菌剂的方法，包括如下步骤：取含有丛枝菌根真菌的野生北苍术根系周围带细根系的根区土壤得到根土混合物；将所述根土混合物与灭菌基质混合后栽种宿主植物，待宿主植物的丛枝菌根真菌侵染率达到75％以上，且丛枝菌根真菌孢子成熟时，将宿主植物的根系粉碎后作为菌剂的成分，得到用于栽培北苍术的菌剂。

上述方法中，所述菌剂含有丛枝菌根真菌。

上述方法中，所述野生北苍术与北苍术的待栽培地位于同一地区。

上述方法中，所述野生北苍术可为三年生以上的野生北苍术。

上述方法中，所述灭菌基质为将沸石与河沙按体积比1：1混合并灭菌得到。

上述方法中，所述根土混合物与灭菌基质混合，为按体积比1：1混合。

上述方法中，所述宿主植物可为三叶草和葱，两者混合播种。

上述方法中，所述干燥为干燥至无自由水分。

本发明还保护上述方法制备的用于栽培北苍术的菌剂。

所述菌剂还可包括培养基质。所述基质为固体。所述固体基质为矿物材料、植物材料；所述矿物材料为沸石、河砂中的至少一种；所述植物材料为植物根系。

本发明还提供所述的用于栽培北苍术的菌剂在栽培菌根化北苍术苗中的应用。

本发明还提供一种制备菌根化北苍术苗的方法，包括如下步骤：所述的用于栽培北苍术的菌剂接种于基质得到育苗基质，在所述育苗基质中进行北苍术育苗，得到菌根化北苍术苗。

上述方法中，所述基质为草炭：蛭石：珍珠岩体积比为6：3：1的混合基质。

所述丛枝菌根真菌可侵染北苍术根系，促进北苍术幼苗的生长，提高幼苗的适应性及成活率，增强栽培模式下北苍术的野生性。

实验证明，接种本发明的用于栽培北苍术的菌剂后，北苍术根系菌根侵染率达到100％，且显著提高了北苍术生物量，当年和一年生北苍术对菌根依赖性分别达到36％和52％，全株干重分别提高56.2％和108.4％，均达显著水平。同时，接种用于栽培北苍术的菌剂的次年生北苍术根长、根表面积均显著高于不接种处理。表明本发明的用于栽培北苍术的菌剂更适合北苍术幼苗，形成的菌根化幼苗具有较好的生长势和发育良好的根系。

附图说明

图1为本发明实施例1中OM处理(图片中间白线左侧)和GI处理图片中间白线右侧)北苍术幼苗的照片。

图2为本发明实施例1中不接种对照处理北苍术幼苗的照片。

图3为本发明实施例1中不接种对照CK处理北苍术幼苗根系无侵染的显微镜照片，放大倍数为200倍。

图4为本发明实施例1中GI处理北苍术幼苗根系侵染的显微镜照片，放大倍数为200倍。

图5为本发明实施例1中OM处理北苍术幼苗根系侵染显微镜照片，放大倍数为200倍。

具体实施方式

实施例1

本专利发明人针对河北省承德地区野生北苍术根围土壤中AM真菌物种多样性研究，运用高通量测序技术在上海美吉生物制药科技有限公司完成的多样性分析，分析发现，该地区北苍术根系中菌根侵染率达到100％，AM真菌物种有球囊菌门1纲(球囊菌纲Glomeromycetes)3目(球囊霉目Glomerales、类球囊霉目Paraglomerales、多样孢囊霉目Diversisporales)3科(球囊霉科Glomeraceae、类球囊霉科Paraglomeraceae、巨孢囊霉科Gigasporaceae)3属(球囊霉属Glomus、巨孢囊霉属Gigaspora、类球囊霉属Paraglomus)，其中球囊霉属Glomus相对丰度最高，达77.20％，为优势种属。

1.材料

(1)供试菌剂：1)北苍术专性AM真菌菌群菌剂，试验标号为OM；2)Rhizophagusintraradices(BGC编号HEB07D，参见非专利文献“王幼珊等，中国丛枝菌根真菌的保藏、共享服务与研究利用，菌物学报，22November 2019,38(11):1760-1807MycosystemaISSN1672-6472 CN11-5180/Q”)，试验标号为GI(AM真菌菌剂)，该菌种由北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所提供。

北苍术专性AM真菌菌群菌剂(试验标号OM)的培养方式如下：

1)在河北省承德市隆化县中关镇生长三年以上的野生北苍术根系周围，挖取带细根系的北苍术根区土壤，将细根系剪碎成小段与土壤混匀，得到根土混合物。

2)将沸石与河沙按体积比1：1混合并灭菌，得到灭菌的沸石与河沙培养基质；将上述根土混合物和灭菌的沸石与河沙培养基质按体积比1：1混合，得到混合基质①。

3)将混合基质①装入容积为1升的培养塑料盆中，先浇足水分，等水渗入混合基质①后，播种三叶草和葱，每种植物播种10-15粒/盆，播种后用灭菌的沸石与河沙培养基质覆盖。

4)将培养塑料盆放在日光温室培养(温室温度15-30℃，自然光照)至6个月。

5)用打孔取样法，从培养盆中取部分三叶草和葱的根系和培养基质，检查根系的菌根侵染率和菌根孢子。

6)对根系侵染率达到75％以上且繁殖体孢子成熟、数量多的培养盆移至温度恒定(室温20-25℃)且通风的房间中，干燥培养基质，至无自由水分。

7)如果侵染率低，孢子不成熟，数量太少，培养盆将不收获，继续培养至达到步骤6)的要求。

8)将干燥好的培养基质转移到牛皮纸上，剪碎根系，混匀基质，转移入封口袋中，即获得含有AM真菌菌群繁殖体孢子、菌丝、侵染根段，具有高度侵染能力的北苍术AM真菌菌群菌剂，试验标号OM。

通过测定，所得的AM真菌菌群菌剂中孢子数量为20-50个/ml菌剂。高通量测序技术在上海美吉生物制药科技有限公司完成的多样性分析，分析发现，该菌剂中AM真菌物种有球囊菌门1纲(球囊菌纲Glomeromycetes，)3目(球囊霉目Glomerales)、类球囊霉目(Paraglomerales)、多样孢囊霉目Diversisporales)3科(球囊霉科Glomeraceae、类球囊霉科Paraglomeraceae、巨孢囊霉科Gigasporaceae)3属(球囊霉属Glomus、巨孢囊霉属Gigaspora、类球囊霉属Paraglomus)，球囊霉属Glomus相对丰度最高，达77.20％，为优势种属。

(2)供试北苍术种子：采收自河北省承德野生北苍术产区。

(3)育苗容器：采用黑色12孔育苗穴盘，穴盘在使用前用84消毒液(稀释50倍)浸泡30min，晾干后备用。

(4)接种量：每穴接种菌剂10g。

(5)育苗基质：为草炭：蛭石：珍珠岩体积比为6：3：1的混合基质②。

2.试验处理

采用穴盘育苗，在北京市农林科学院智能温室内进行。本试验有3个处理方式：

CK处理：不接种对照处理CK。

OM处理：接种北苍术专性AM真菌菌群菌剂，试验标号为OM。

GI处理：接种Rhizophagus intraradices处理，试验标号为GI。

每个处理重复4个穴盘。

3.试验实施

(1)接种操作

将混合基质②装入穴盘中每个穴孔的2/3处，每穴接种10g菌剂，并用玻璃棒插入基质1cm左右，将菌种与基质混匀，再放入约2厘米厚的混合基质②铺平。不接种处理直接装满混合基质②。浇足水等待播种。

(2)播种

选取颗粒饱满、外表颜色正常、无机械损伤的北苍术种子，用清水冲洗干净，并控干种子表面多余的水分，用1％的次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，用清水反复冲洗种子，并浸泡4h后播种。

每穴播种8-10粒北苍术种子后覆盖1-2cm厚混合基质②，放于温室内。用双层黑色遮阳网覆盖穴盘，以保持水分和温度。

(3)育苗日常管理

日常期间，要注意补充水分，保持育苗基质湿润即可。在出苗后，每间隔一个月喷施磷含量为10-20mg/kg的霍格兰营养液(购自北京酷来搏科技有限公司)，直至成苗。

(3)北苍术育苗取样

分别在北苍术幼苗生长8个月和12个月进行取样和测定，并分别记录为当年生苗和一年生苗。OM处理和GI处理北苍术幼苗的照片见图1，对照处理北苍术幼苗的照片见图2。用剪刀剪去北苍术地上部分并装入信封袋中做好标记，再用大量的清水冲洗北苍术穴盘，将培养基质冲洗干净，从而得到完整的北苍术根系，然后把根系放入封口袋中带回实验室。

(4)试验指标测定方法与结果

1)AM真菌菌根侵染率

AM真菌菌根侵染率：采用墨水醋染色方法染色根段(参考文献：Vierheilig H,Coughlan AP,Wyss U,et al.Ink and vinegar,a simple staining technique forarbuscular-mycorrhizal fungi[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64(12):5004-5007.)，按照如下公式计算菌根侵染率：菌根侵染率(％)＝侵染根段/测定总根段数×100。

不接种对照CK处理北苍术幼苗根系无侵染的图片见图3。GI处理北苍术幼苗根系侵染的图片见图4。OM处理北苍术幼苗根系侵染的图片见图5。表明进入细胞内的AM真菌菌丝经过连续的双叉分枝成为灌木状结构，即为丛枝，得到了丛枝菌根。

不同接种处理下北苍术根系侵染率结果见表1，表明接种处理的当年生和一年生北苍术幼苗根系均可观测到AM真菌的侵染，但当年生幼苗中接种北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM的处理菌根侵染比接种GI侵染更高，且差异显著，说明菌剂OM更快侵染北苍术幼苗根系，到达高侵染率。不同生长时间的北苍术幼苗根系侵染率均显著高于未接种对照处理。随着生长时间延续，AM真菌对北苍术的侵染效应指标均有所提高。

表1北苍术幼苗根系菌根侵染率

注：同一列数据后不同小写字母表示在P＜0.05水平上差异著。

2)北苍术生物量

北苍术生物量：采用天平称重。

其中菌根依赖性采用如下公式计算：菌根依赖性(％)＝(接种处理干重-不接种处理干重)/接种处理干重×100。

AM真菌对北苍术生物量的影响见表2，与不接种对照相比，接种AM真菌OM处理的当年生北苍术幼苗的地下部和全株生物量显著高于对照CK和接种GI处理，其中全株干重比对照提高56.2％；接种AM真菌两个处理OM、GI的一年生北苍术幼苗地上部、地下部、全株生物量均显著高于对照处理，其中全株生物量比对照分别提高108.4％、46.2％；菌根依赖性是反应植物和菌根真菌亲和关系的指标，依赖性越高，说明该菌与其宿主植物的亲和力越强，促生效应会越好。不同生长时期的北苍术幼苗对AM真菌OM和GI的菌根依赖性不同，且北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM与北苍术幼苗亲和较好，菌根依赖性分别为36％和52％，而且北苍术随着生长年限的增加，对AM真菌的依赖性更强。

表2AM真菌对北苍术生物量的影响

注：同一列数据后不同小写字母表示在P＜0.05水平上差异显著。

3)根系形态指标测量

根系形态指标测量：将清洗干净的北苍术根系用EPSON PERFECTION V800Photo扫描仪扫描根系形态，并使用Win RHIZO PRO 2012b根系分析软件进行根系结构分析，获得北苍术根系的根长、根表面积等数据。

AM真菌对北苍术根系的影响见表3，各处理中，当年生北苍术幼苗根长及根表面积均无显著差异。但一年生北苍术幼苗中，接种AM真菌均显著促进了幼苗根系的生长，与对照相比，接种GI处理的幼苗根长和根表面积增加35.3％和44.1％，而接种OM处理的幼苗根长和根表面积增加43.9％和58.0％，可见接种OM明显促进了幼苗根系的生长，且与接种GI处理相比，幼苗根表面积达到了显著差异。植物所获得的水分和养分大部分是通过根系的吸收获得的，因此根系的生长发育越好，根系越长表面积越大根系扩展范围也越大，其吸收养分和水分的范围越大，更能为植物获取养分，从而促进植物生长。

表3接种AM真菌对北苍术根系的影响

注：同一列数据后不同小写字母表示在P＜0.05水平上差异显著。

上述实验结果表明：接种专性AM真菌后，北苍术根系菌根侵染率达到100％，且显著提高了北苍术生物量，当年和一年生北苍术对菌根依赖性分别达到36％和52％，全株干重分别提高56.2％和108.4％，均达显著水平。同时，接种专性AM真菌的次年生北苍术根长、根表面积均显著高于不接种处理。说明专性AM真菌是合适的用于栽培北苍术的菌剂。

优良种苗繁育是中药材标准化生产的核心环节，更是获得中药材优异品质的基础，因此优质种苗的选育与供应就成为了药材标准化生产建设的制约因素之一。因此本发明基于药材道地性构成因素之一的生物因素，诱导培养北苍术道地产区土壤中关键微生物AM真菌，并获得其优势AM真菌菌群作为道地专性特色AM真菌菌群，在北苍术育苗期间接种其专性AM真菌菌群，模拟道地产区土壤中关键微生物AM真菌菌群，在优越的根际环境使北苍术幼苗形成丛枝菌根，获得菌根化北苍术苗木。菌根化苗木携带成熟的丛枝菌根，当移栽进入大田时，具有成熟的丛枝菌根和更强的适应性，提高幼苗成活率，增强北苍术的道地性，促进有效成分积累，为道地中药材的种质资源保护、人工引种繁育、优质高产生态栽培提供优良种苗栽培技术方法。接种AM真菌均显著提高了北苍术幼苗生物量，但接种北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM处理的生物量显著高于接种GI菌种处理，说明北苍术幼苗能够与北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM建立良好的共生关系且亲和更好，菌根依赖性更高。同时，接种北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM处理显著促进了幼苗根系的生长发育。表明北苍术专性AM真菌菌群菌剂OM更适合北苍术幼苗，形成的菌根化幼苗具有较好的生长势和发育良好的根系。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (8)

1.制备用于栽培北苍术的菌剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：取含有丛枝菌根真菌的野生北苍术根系周围带细根系的根区土壤得到根土混合物；将所述根土混合物与灭菌基质混合后栽种宿主植物，待宿主植物的丛枝菌根真菌侵染率达到75％以上，且丛枝菌根真菌孢子成熟时，将宿主植物的根系粉碎后作为菌剂的成分，得到用于栽培北苍术的菌剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述野生北苍术为三年生以上的野生北苍术。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述灭菌基质为将沸石与河沙按体积比1：1混合并灭菌得到。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述根土混合物与灭菌基质混合，为按体积比1：1混合。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述宿主植物为三叶草和葱。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：以权利要求1-5任一所述方法制备的用于栽培北苍术的菌剂。

7.权利要求6所述的用于栽培北苍术的菌剂在栽培北苍术中的应用。

8.一种制备菌根化北苍术苗的方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求6所述的用于栽培北苍术的菌剂接种于基质得到育苗基质，在所述育苗基质中进行北苍术育苗，得到菌根化北苍术苗。

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