CN114921423B - 一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体及其制备方法和应用。该噬菌体名称为沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage)MDASK，保藏号为GDMCC NO：62376‑B1，于2022年4月12日保存于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。该噬菌体可以以多重耐药肯塔基沙门菌(Salmonella sp.Kentucky)10A20为宿主菌分离得到，其具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，效价高，潜伏期较短，且具有强裂解效用，可作为抗菌剂用于降低畜禽生产链中肯塔基沙门菌污染。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体及其制备方法和应用。
背景技术
沙门菌属于肠道致病菌，其感染人和动物后可引起伤寒、急性胃肠炎以及败血症等疾病，是全球范围内引起食物中毒的常见病原菌之一；也是导致人类死亡的第三大致病菌。近年来，肯塔基沙门菌(Salmonella Kentucky)已成为引起食源性疾病常见的沙门菌血清型之一。预防和治疗沙门菌感染的主要手段仍是抗生素，但由于抗生素长期和不合理的使用，使得沙门菌产生了广泛的耐药性。据报道，沙门菌属的多重耐药率已从20世纪90年代的20％增加到了本世纪初的70％，且耐药性可通过食物链或环境在人与食品、人与人或人畜之间传递。这对食品性动物生产和公共卫生安全造成极大的危害，同时，也对全球的食品安全和人类健康产生了巨大的威胁。
在导致沙门菌中毒的食品中，畜禽产品(如肉、蛋、奶)占90％。鸡肉是世界范围内主要的动物性食品之一，且肉鸡在养殖、屠宰，以及鸡肉贮藏、加工和销售过程中极易受到沙门菌的污染。有研究对鸡屠宰场主要加工环节中沙门菌的污染情况进行了监测，结果表明在屠宰的四个环节(浸烫、预冷、分割和运输)中，沙门菌的检出率呈现先下降后升高的趋势。
为了降低畜禽生产链中沙门菌的污染，人们常采取冲淋、伽马辐射、使用噬菌体制剂、控制啮齿动物和昆虫、控制人员和设备的移动和使用有机酸制剂、微生态制剂、专用消毒剂等一系列的措施。其中，噬菌体制剂是近些年人们较为关注的话题。噬菌体是感染细菌、真菌等微生物的病毒，发现之初便用于治疗细菌感染。与传统抗生素相比，噬菌体具有分布广、易筛选、高度的宿主专一性、增殖能力强、安全性高、研发成本低等优势。随着多重耐药菌的广泛流行，噬菌体治疗细菌感染重新引起了人们的重视，且因其高效特异识别并裂解宿主菌的特性被认为是最具潜力的抗生素替代品之一。
Mahmoud等人(Mahmoud M,Askora A,Barakat AB,et al.Isolation andcharacterization of polyvalent bacteriophages infecting multi drug resistantSalmonella serovars isolated from broilers in Egypt[J].International Journalof Food Microbiology,2018,266:8-13.)分离出了三株多价噬菌体，并命名为Salmacey1、Salmacey2和Salmacey3，它们都能裂解4种不同血清型的沙门菌，同时还能裂解柠檬酸杆菌。其中Salmacey1和Salmacey2属于长尾噬菌体科，潜伏期分别为35min和40min，爆发期分别为85min和100min，裂解量分别为80PFU/cell和90PFU/cell。而Salmacey3属于肌尾噬菌体科，潜伏期为60min，爆发期为80min，裂解量为110PFU/cell。还有一株肯塔基沙门噬菌体(未命名)属于长尾噬菌体科，潜伏期为10min，爆发期为15min，裂解量为100PFU/cell。这些肯塔基沙门噬菌体均存在潜伏期长、裂解量低且感染复数较大的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体。
本发明的另一目的在于提供一株用于制备所述噬菌体的多重耐药肯塔基沙门菌。
本发明的再一目的在于提供所述多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体，名称为沙门氏菌噬菌体(Salmonellaphage)MDASK，保藏号为GDMCC NO：62376-B1，该噬菌体于2022年4月12日保存于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
一株用于制备所述噬菌体的多重耐药肯塔基沙门菌，名称为肯塔基沙门菌(Salmonella sp.Kentucky)10A20，保藏号为GDMCC NO：62376，该菌株于2022年4月12日保存于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
一种制备所述多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体的方法，将所述多重耐药肯塔基沙门菌接种于液体培养基中，培养至对数生长期，然后接入多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体进行噬菌体培养。
所述的液体培养基优选为LB肉汤培养基。
所述的多重耐药肯塔基沙门菌的培养条件为：37℃，150～200rmp振荡培养4～6h。
所述的多重耐药肯塔基沙门菌与噬菌体按感染复数(MOI)为0.0001～1000配比计算；优选为按感染复数(MOI)为0.0001配比计算。
所述的噬菌体的培养温度为37～80℃；优选为37～50℃。
所述的噬菌体的培养pH范围为4～11。
所述的噬菌体的培养时间为1～4h；优选为3.5h。
所述的多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体在制备杀菌剂中的应用。
所述的多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体以及所述的多重耐药肯塔基沙门菌在制备杀菌剂中的应用。
所述的杀菌剂中的菌包括沙门菌；优选为肯塔基沙门菌，包括畜禽生产链中肯塔基沙门菌；优选为肯塔基沙门菌(Salmonella sp.Kentucky)10A20。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以一株多重耐药肯塔基沙门菌为宿主菌分离得到了一株噬菌体，该噬菌体对多株多重耐药的肯塔基沙门菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体以降低畜禽生产链中沙门菌污染提供了噬菌体来源。
(2)本发明提供的沙门菌噬菌体，当沙门氏菌培养物中加入噬菌体后，1小时内有明显的裂解效果，具有较强的裂解活性，表现出良好的应用前景。
(3)本发明提供的沙门菌噬菌体，在70℃的条件下作用30min，效价维持在103PFU/mL，依然具有生物活性；在pH＝11时，效价可达到108PFU/mL，在pH＝2时，仍有噬菌体存活；表现出了较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，效价较高，安全有效。
(4)本发明提供的噬菌体最佳MOI较小，潜伏期较短且裂解量较高，可为降低畜禽生产链中肯塔基沙门菌污染的噬菌体制剂奠定基础。
附图说明
图1是本发明中的多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定结果图；其中，A为噬菌体形成的噬菌斑；B为噬菌体(MDASK)的形态。
图2是本发明中的噬菌体的最佳感染复数的测定结果图。
图3是本发明中的噬菌体的一步生长曲线图。
图4是本发明中的噬菌体的热稳定性测定结果图。
图5是本发明中的噬菌体的pH稳定性测定结果图。
图6是本发明中的噬菌体的测序结果图(图中，每一圈代表的含义(由外到内)：(1)基因组基因功能注释，标注出了主要蛋白质，用黑色表示；(2)GC偏移值，偏移值大于0为绿色，小于0为棕色；(3)GC含量，用蓝色表示)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
1、噬菌体与肯塔基沙门菌的分离、纯化、鉴定和保藏
(1)噬菌体的分离纯化
①将40份于广东某养鸡场采集的池塘水样品、土壤样品和鸡粪样品分装于无菌离心管中。加2mL池塘水样品于离心管中，土壤样品和粪便样品加生理盐水振荡混匀后取2mL加入离心管。10000g离心5min。
②用一次性注射器吸取离心后的上清液，再用高压灭菌过的0.22μm除菌滤头过滤上清，得到噬菌体滤液。用SM Buffer(称取0.8g MgSO4·7H2O、2.32g NaCl和0.04g明胶混合后加入到20mL 1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液中，用超纯水稀释并定容至400mL，高压灭菌备用)稀释滤液，稀释至10-6。每次稀释前都要用涡旋仪涡旋10s以上。噬菌体稀释液于4℃冰箱保存备用。
(2)肯塔基沙门菌10A20的分离、纯化、鉴定和保藏
①先准备好高压灭菌的BPW培养液和无菌10mL离心管等必需材料。取前端沾有粪便样品的棉签置入含有3mL BPW培养液(购自广州环凯微生物科技有限公司)的离心管中，放入摇床。摇床设置为37℃，180r/min，过夜培养增菌。
②次日，取100μL增菌液，加入含3mL TTB液体培养基(购自广州环凯微生物科技有限公司)的10mL离心管中，置于42℃摇床，180r/min培养18～2h。用1μL接种环蘸取适量菌液，划线于XLT-4琼脂培养基(购自广州环凯微生物科技有限公司)，置于37℃恒温培养箱培养，至出现明显黑色菌落。
③挑取单菌落，划线于沙门显色培养基(购自广州环凯微生物科技有限公司)，培养过夜。挑显色板上的紫色单菌落，对其编号为10A20，并置于LB肉汤增菌，37℃，180r/min增菌培养3～4h。以菌液为模板PCR扩增InvA基因(SEQ ID NO.1)，先根据基因序列设计引物序列InvA-F：GGTGATGGTCTTGTCGCC，InvA-R：GCTCGCCTTTGCTGGTT，扩增得到的产物片段大小约为280bp。其中PCR反应程序为：(94℃，5min)+{(94℃，30s)+(53℃，30s)+(72℃，20s)}×30+(72℃，5min)，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。鉴定为InvA阳性菌株，及10A20为沙门菌。
④将10A20的菌液均匀涂布于LB琼脂培养基，置于37℃恒温培养箱培养16h。用10μL接种环刮去菌苔至于装有1mL含30％(v/v)甘油的LB肉汤的2mL离心管，涡旋混匀后缠上封口膜，-20℃或-80℃保存备用。
⑤采用Ⅰllumina MiSeq测序平台进行10A20进行全基因组测序。利用网站Centerfor Genomic Epidemiology(CGE，https://cge.cbs.dtu.dk/)确定10A20的血清型和耐药基因携带情况。结果显示10A20为肯塔基沙门菌，其同时携带四环素类抗生素耐药基因、氨基糖苷类抗生素耐药基因、喹诺酮类抗生素耐药基因、磺胺类抗生素耐药基因、大环内酯类抗生素耐药基因以及β-内酰胺类抗生素耐药基因。
⑥根据10A20菌株的菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将10A20菌株命名为肯塔基沙门菌(Salmonella sp.Kentucky)10A20。该菌株已于2022年4月12日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：62376，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
(3)双层平板法分离噬菌体
①挑选10A20这一多重耐药肯塔基沙门菌原菌接种于XLD培养基(购自广州环凯微生物科技有限公司)上，置于37℃培养箱内培养至出现黑色菌落。挑一黑色单菌落至含有LB肉汤培养基的试管中，置于37℃摇床，180rpm，培养至菌液OD595＝0.3～0.5。
②利用双层平板法分离噬菌体。取100μL步骤(3)中获得的菌液和100μL不同梯度的噬菌体稀释液(噬菌体稀释液用之前需要涡旋混匀)加于10mL离心管中。室温静置10min后，每支离心管加约3mL半固体琼脂，上下颠倒混匀，倒于薄的LB琼脂板上。待琼脂凝固后，倒置放入37℃培养箱培养过夜。第二天，观察噬菌斑。大小不一视为不同的噬菌体。
③用高压灭菌后的枪头戳单个噬菌斑至SM Buffer中，涡旋混匀，室温静置30min，再用灭菌后的0.22μm除菌滤头过滤。重复利用双层平板法纯化噬菌体，直至噬菌斑大小一样。最后重复该步骤制备噬菌体原液。
(4)噬菌体的鉴定和保藏
①本实施例以10A20菌株为宿主菌，从40份样品中分离纯化得到一株噬菌斑透亮，边缘清晰，无晕圈的沙门菌烈性噬菌体。该噬菌体形成的噬菌斑直径约为3～4mm，见图1A。根据国际病毒分类学委员会(ICTV)的噬菌体命名规则将其命名为Salmonella phageMDASK，后文统一简称为MDASK。MDASK的分类根据ICTV的指南进行。MDASK具有一正多面体的头部，直径约60nm，有一条长约15nm的短尾巴，见图1B。根据噬菌体形态对噬菌体分类，该噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)。噬菌体的全基因组序列如SEQ ID NO.2所示。
②根据噬菌体的形态特征和鉴定结果，将MDASK命名为噬菌体MDASK(Salmonellaphage MDASK)。该噬菌体已于2022年4月12日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：62376-B1，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2、噬菌体及宿主菌复活
(1)取甘油中保存的宿主菌10A20用三线法接种于XLD琼脂平板，37℃恒温培养16h。挑取黑色单菌落接种于2mL LB肉汤培养基中，37℃，180rmp振荡培养4～6h(约108CFU/mL)。
(2)取100μL菌液和4mL半固体琼脂混合，做双层板。将上述步骤1(3)中保存的噬菌体原液划线接种于双层板上，37℃恒温培养至出现透亮的，直径3mm左右的噬菌斑。
(3)挑取单个噬菌斑加入1mL SM Buffer(配制方法同上述步骤1(1))中，室温静置1h。混合液用0.22μm无菌滤头过滤，滤液分装，4℃保存备用。
(4)将噬菌体滤液稀释到合适的浓度(10-6)，然后取100μL稀释过的噬菌体滤液与100μL培养至对数期的宿主菌菌液混合做双层板。37℃恒温培养至出现噬菌斑，测定噬菌体滤液的效价(即噬菌体的浓度)，三次重复。
3、最佳感染复数测定
(1)分别按照感染复数(MOI)1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001将噬菌体与培养至对数期的宿主菌10A20的菌液混合，并添加LB肉汤培养基至3mL，37℃，180rmp振荡培养3.5h。
(2)培养液11000rmp离心10min，取上清液，用0.22μm无菌滤头过滤之后做噬菌体效价测定，噬菌体效价的测定方法同上述步骤2(4)。实验重复3次，每次设3个平行。
结果如图2所示：当MOI＝0.0001时，MDASK感染宿主后产生的子代噬菌体效价为3.17×109PFU/mL，是所测8个感染复数中效价最高的，因此确定为最佳感染复数。
4、噬菌体一步生长曲线测定
(1)将噬菌体与宿主菌10A20按照上述最佳感染复数混合，添加LB肉汤培养基至2mL，37℃静置20min后11000rmp离心12min，弃上清。
(2)用LB肉汤培养基洗涤沉淀，再取提前预热至37℃的LB肉汤培养基6mL重悬沉淀。
(3)迅速将混合液置于37℃的150rmp的摇床内，每隔10min取样，11000rmp离心2min，取上清液进行噬菌体效价测定(测定方法同上述步骤2(4))。实验重复3次，每次3个平行。
结果如图3所示：如图可知MDASK潜伏期小于10min，爆发期约为60min，效价稳定在1011PFU/mL，爆发量为394PFU/cell。
5、噬菌体宿主谱测定
除肯塔基沙门菌10A20外，本发明还测试了上述噬菌体MDASK对其他的宿主菌是否同样具有裂解活性，具体步骤为：
从不同地区(湖南、广东、广西)的不同来源(粪便，土壤，人)共筛选得到92株沙门菌，经研究，这些沙门菌均为多重耐药肯塔基沙门菌，且这些多重耐药沙门菌对氨苄西林、环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻肟、阿米卡星、替米考星、多西环素产生了不同程度的耐药性。然后将噬菌体MDASK和这些待测宿主菌混合制作双层板，37℃恒温培养3～4h，之后观察是否有透亮的噬菌斑产生。
结果发现：MDASK还可裂解这92株多重耐药肯塔基沙门菌，说明MDASK是一株宿主特异性很强的噬菌体。
6、噬菌体热稳定性测定
将100μL上述步骤1(3)中保存的噬菌体原液置于高压灭菌后的1.5mL EP管中，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中，分别作用15min、30min、45min、60min，处理时间结束后，迅速取出样品置于4℃冰箱，冷却后测效价(测定方法同上述步骤2(4))。实验重复3次，每次3个平行。
结果如图4所示：噬菌体在40℃、50℃温育1h效价基本维持稳定状态且仍然保持原有的活性。在温度60℃下作用1h内，效价持续下降但未完全失活。在70℃作用45min之后，噬菌体完全失活。在80℃，15min后，噬菌体已经完全失活。说明高温处理会严重影响噬菌体的活性。
7、噬菌体pH稳定性测定
将100μL上述步骤1(3)中保存的噬菌体原液置于高压灭菌后的1.5mL EP管中，分别加入900μL不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的SM缓冲液中，于40℃水浴2h，处理时间结束后测定噬菌体效价(测定方法同上述步骤2(4))。实验重复3次，每次3个平行。
采用磷钨酸染色法，轻取铜网，浸于噬菌体原液中10min，之后用滤纸吸去多余的液体。再将铜网置于2％(w/v)磷钨酸染料中染色3min，吸去多余液体，自然晾干至完全干燥。在透射电镜下观察噬菌体形态。
pH稳定性结果如图5所示：噬菌体在pH在4～11之间时，效价较稳定，基本能保持原活性。当pH低于4时，噬菌体效价下降。以上说明过酸会导致噬菌体的活性降低。
8、噬菌体全基因组测序和分析
采用Ⅰllumina MiSeq测序平台进行噬菌体全基因组测序。应用软件SPA对原始测序数据进行从头拼装。利用在线注释网站Rapid Annotation using SubsystemTechnology(RAST)进行全基因组的基因预测，从而得到基因序列的开放阅读框。将开放阅读框翻译成氨基酸序列后利用NCBI的BLAST，通过Blastp程序搜索NR数据库，与已经确定功能的蛋白进行相似性搜索，完成功能注释。
测序结果如图6所示：结果显示MDASK基因组全长39966bp，平均GC含量50％，通过RAST注释后得出其有45个开放阅读框(OFR)，表1中仅标注出了较为重要的功能蛋白。由比对结果得出，该噬菌体不携带任何耐药基因、毒力基因和溶原相关基因。
表1 MDASK基因组OFR信息
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<120> 一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2058
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> InvA基因
<400> 1
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gatcttgtcc tccttacgtc tgtcgatgtc cgtcgattta ttaagaaaat gattgaaggt 1980
cgttttccgg atctggaggt tttatctttc ggtgagatag cagatagcaa gtcagtgaat 2040
gttataaaaa caatataa 2058
<210> 2
<211> 39966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 噬菌体序列
<400> 2
ggtcatccta cttattggtc tatcctagtg tcgcctgacc tacggtcctt gacctacagt 60
ggctgaggcc tacagtagtg acgatgagtt ttggaccaaa agtttgagac cacatctcac 120
agttcaagag cctcaagtct ccccataggg tcacttccag tcagaccaaa ggccctaccc 180
tagaccttcg gtctaaactt caggtcattg actcaaggtc tacccgaagt catgacgata 240
ggtcaaggct atggcttagg gaaggacggt aggtagggac tatgggttgt ctctgagtct 300
ctatctgtat agtgttatag tataacatta cgtcctacaa cctacagtct aacaacctac 360
agtctaacaa cctacagtct aacaacctac agtcacaacc ataagacact cacagcctac 420
agtcatagac ctacagttaa tagacacgaa gctatagact taaggtctaa gacatgttag 480
tcaaagacta tatcatctta gtcactatgg ggccgacgat agcttaatca atattatttc 540
aaattaccta ttgactatag gtccagacta tggcttaata gcttccgtca acgcgacacg 600
gcaacaaccg gatagtgaag acgccgggtc atccctgaag gccctgactg atagtcacta 660
acaattgaga ggatataact atggaacgta acgctaacgc atactatgac cttcagtctc 720
acgcttttga actgcttaaa gagcggattg cttacgaaga tattcaagat gcaagcgacg 780
cgggtgatgc aattcacgag gttgcaggtg atgtaacgcc gcattactat catgaaatct 840
ttacagtgat ggcggctgac ggcatcgata tcgatttcga ggacagcggc cttatccctg 900
aaacgaagga tgttagccgt atctgccaag ctcgcattta tgaacagctc accattgaca 960
tgtggaataa cgttgaccaa atcgttgatg aatatttaga gactcttgag gacaccagcg 1020
atagcgtagt gttcgaccat gcggctgctg aggattgcga gtgatggtaa cttatggtct 1080
ctgtcaacac catgtcaaca acgcccggct tatggtcgag accgggaagt tacaccatga 1140
tgcgactatg cgtcacctga aagaggtcta tgagggccgc aagcgcatac acgacagctt 1200
acactctgag gataaataaa catgtaccag ataacttata gcagtgaaca ggcgttctat 1260
gatggatgct acgagatgat gaagcgcggg gcctgctaca cggctaacca ccatgctctg 1320
accataacac tgacaggcgg gtactgagtg ccagactaca ggtcatccat gcgggtggcc 1380
tgactgattg tcacttaacc acaagaagga aacacacgta atgaacgaac acgataaagt 1440
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tgaggactct agcgctggca tagctggtca acctcgctgg ggagcctttg agatactggc 1560
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ggacctgccg ggatatgcaa tcaaggtagg ctttaagaag gatgactcag gcgctgcata 1680
tgcggccttc tgccgagaga atgagggtct ggctgggctt ccggtcatcc atctggtcaa 1740
gcgctttagc agggcataca tggtcgctat ggataagtac cgctcactga atgccatcgg 1800
cggtgactac tgccgggatg gtgagaccta cgagcagcga gtcttaaacg tgtcgtggcg 1860
tgtggtcaac gagataatag accatttcga gcaaccgtct gaggccctga gctggtggct 1920
ggaccaagac gcacgggctg agtttgcaca cgtagaggct cagtatatca aggaccttgc 1980
gcagactgct aagaagatta acagtttctt ctacgggctg gcatcattcg acacgcaccg 2040
cgctaatgtg atggttgata acaacgggcg cctgataatc acagacccgg tgtcttggac 2100
tcaggcagac catcaagacg agctgcaagg caagctgaac gcaatagctg agtgatagac 2160
gagaggccac tacatctagt ggtctcaaag attatttctc acaacatata ggcaggtgaa 2220
caatgggctg ggcacttctg gtcatcggct acgggttaat actcgcagtc ctgacgaaag 2280
acatcatgaa ggcacgtaaa gtctaccgct tccagtatgt acgactgggc cgctggactg 2340
taagacaacc gaacggacga ttcatgcgca acctcgcaaa cgtctgggac atcgcaacgt 2400
tagggagcaa actgtaatga gtaaatctta tgacatcaac ttggtccatg aacttgacgc 2460
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cgcacgtcaa cagcaggagc gtgaccgtgt actacaagca agactccggg ccgaggacca 2580
taaggcggag ctaatgtgtc tgccgtatgg cacacgacca atcaccgacg acggcaaact 2640
tctggtctca ggctggaagg cgatagacca gcggtcaacc atcaagcaca cgaccaacgg 2700
tgacttcagt catcttcacg ctaacccact gatatgcaag taattctgac ttaactatca 2760
ctataggact caaggtctaa gactccaagt gaaagaccaa agagacttta agtgaaagac 2820
taataacaag gactttaagt atgagcgtca tctcaattga caagcacgac ttctctgatg 2880
tgtcgaatgc aatcgaaccc ttcaacgtac tggcggacca ctacggtcag gacctcgcag 2940
tcaagcagct acaacttgag cacgaggcat acactgaagg agagcgacgt ttcatcaaga 3000
accttgagcg ccagactgag cgcggggaac tggcagacaa tcaggttgct aagccactga 3060
tgcaaacgct ggtcccgacc atcgctaagg ctgtgcgtga gtggcatgaa ggcccggacg 3120
gtaagtcctc gacctctcgc ccaagcgtag cgtttaccat gctgagcact gacgagaagg 3180
ctgtcaaaga ccgctctctg cgcatctcct ccgagtccgc tgcggtcatc atactgaagg 3240
tcatcctcag caagctagtc aagcctgagg gcatcccgat aactcctatg gcgtccgcga 3300
taggtcgcac actggaagat gaaatccgct ttggtcgaat ccgtgagcag gagcaggagc 3360
atttcaagaa gaccatagcg gagaacctga agaaacgcgc tggcgcaagc tacaagaaag 3420
cctacatgca ggcagtcgag gcgtctatgc ttgagcaggg acaactggct gacgcgtggg 3480
ggacttggag tccgaccgag gcggtacacg ttggcatcaa gatgcttgag attgtcatac 3540
agtctacaca actggtcgag cttaagcgtt atggtgctgg caatgcagcg gctgatgttg 3600
agatggtcca actgtcagac ttctgggtca agaagatggc acaacgtgga ttcagccttg 3660
cgggtattgc gccagtctat caaccttgcg tcgttccacc taagccgtgg acgggtgtcg 3720
taggcggtgg ttactgggct aaaggtcgca gaccgttacc gttgattcga ttagggtcta 3780
agtctgcggt agcacgttac gaagacgtgt acatgcctga agtctatgac gctgtgaaca 3840
tcatccagaa tacaccttgg aaagttaaca agaaggttct ggacgtggtg aacatggtcg 3900
agaagctaaa caacacgcct attgatgaca tccctcagat ggaaccactg aagcctgagg 3960
actatgcggg tgagaccgag gaggaactaa aggcatggaa gaaagctgct gctggtatct 4020
atcgccgcga gaaggcccga cagtcacgca gattgtcgct gagttttatc gtcaaccaag 4080
cgaacaagtt ctctcagttc aaggccatat gggtcccgta caacatggac tggcgaggtc 4140
gagtctacgc tgtgccgatg ttcaaccctc agggtaacga catgcagaag ggcctcctga 4200
ctctggcagt cggcaagcct attggtgctg acggtttcaa atggctaaag gtacacggtg 4260
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accacgataa catcatggct gctgctaaag caccgatgga tagcattgag tggtggggca 4380
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acggattgtc ttactcttgt tcgctaccga tagctttcga tgggtcatgc tctgggattc 4500
aacactttag cgcgatgctt cgtgatcaca tcggtggaca tgcagtaaac ctgacgccat 4560
ccggtaaggt ccaagacatc taccgcatcg tatccgaccg catcgaggag gaactcaaag 4620
tcctgctggt taacggtacg gacaacgaga tggtaactca cgaggacaag aaaactggtg 4680
agattaccga gcgtctcaag ctggggactc gagagctggc ccgtcagtgg ctgacttacg 4740
gtatgtcacg caaggtcact aagcgttcgg tcatgactct ggcctacggg tcgaaagagt 4800
acggcttcgc ggaccaagtg tacgaagata tagtgatgcc agcgattgac tcagggtctg 4860
gcgctatgtt cactgagcca agccaagcat ctcgcttcat ggctaagatg atttgggaag 4920
ctgtgagtgt gaccgtagtt gctgcggttg acgcgatgaa gtggcttcaa ggtgctgcca 4980
agctgctggc tgctgaggtg aaggacaaga agactggaga aatcctgaag ccgtgccttc 5040
cggtacactg ggtcacacct gatggtttcc cggtctggca ggaataccgc aagaaggata 5100
ccactcgtct gaacctgatg ttcttagggt cattcaacct tcagcctacg gtcaacaaag 5160
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actcacaaga tggtagccac ctccgcaaga ctgtagtcca cacgcaccgc aagtatggcg 5280
tgatgtcatt cgcagtgatt cacgatagct tcgggaccat cccggctgac gctgagtatc 5340
tgttccgtgg cgtccgtgag acgatggtcg agacctaccg cgacaacgat gtgctgcttg 5400
acttctacga gcagtttaaa taccagcttc acgagagcca gcgcgacaag ttgcctgagc 5460
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caagatgtca aaacagctta acgtcccgtt caagtggctg gttaagaagg tggagcagac 5700
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tggcttggag cactcgcagt attcacttta atccaacgca gaagaggtta acctaaacta 5820
tcactatagg attagactaa aggtcatgac tcaaagtcgt ggcctccatg attaaccatt 5880
actactaacg taaactactg gagatttaac cacatgtatc agaacactat caacttcgag 5940
cgcatccgtg aacgtcagaa gactgaaggt tacattccga agggccgtaa cgctcatgac 6000
tccgaggcaa ctaaaggtcg caagttgaat aaagtaagga gggatcgcag tgagaagcgt 6060
catttctgtc agtgatagat tctggaataa agtggacaag tctggagaat gttgggaatg 6120
gactgcctca agatttacta atggatacgg gcagtttacg ataaacggaa gaccaatagg 6180
gtctcataga ttcgcctaca tggacaccta cgggcctata cctaaaggct tattggtaag 6240
gcatacttgc gacaacagac tttgttgtaa tccttcacat ttattgttgg gtacaccaca 6300
agataatatg aacgataagg tcgaacgtgg tagacagtac agacctgaga ggaagtatgc 6360
tgaggctatg atggtgggcc tcaagtataa ggaggcaaaa gaactgttcg gaataagcga 6420
gacacatttc tataggttga aaggaggata acgctatggg ccgactttac agtggcaacc 6480
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ctggtaacat cttcgcgctt aagaccttcg cacaccgcga tgaaaacgta ctgtacaaca 6660
ctgcaacagg attccttaac tgtctcgcta accaactcga cacatggaga taacacaatg 6720
acaactatta aaactaaccc acaccgcgct gtagattact ctgagtctgg cattaagaag 6780
gcactggaag cagcagggtc gcttgaagct gaagtgaagt acgatggtgt acggttgaac 6840
cttctggtgc tgcgagaggg ggagacttat tggttaagcc gtgagtcgaa acctctgcct 6900
gccttggagt ggatgaactc tgagctaggc aatgcgtgga cccaagctga ctggcgatgg 6960
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aacgaggagt tcgctgaatg ttatccgggc cgtggcaaga aggtcccgtt ctgggtcgaa 7140
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aaagccgaag gtcctatcca tagtgtcact cgcctgaagg ccgaagctat cgtccctcta 7260
ctccagaaat acttccctga aatagactgg gttctgtctg agtcacacac ggtctatgac 7320
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tgtggtctga ctgaagaaca gaaggacgag ttcacagcta aggtctttga aaactgcaag 7620
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ggctcccttc gtcaccctaa cttcaagtgc tggcgtggaa ccgaagacaa cccaaccgtt 7800
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ttcgacctaa ggagacgcta tgtctaagaa cttaatgttc aatcgttata ccagtacatt 7980
ccacctgtct cacaacccat tcgcttgcat taagcgcaac gagaagctgg gctacttcgg 8040
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ctggagctaa agatgatgga ctctatgatg cagagaaagt tgagttcttc ggtgctcgct 8460
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ttccggtgta cgcaaagtct cttgaagagg ctaccctgaa gtcccaagag tatgaggacg 8700
ctgggtttgt ggtcggacgg attcgtcctg agacctaaac tatcactgta ggacagacgt 8760
ccagttcgta actttaaatt aggagattta cacagatggc taaagagcaa ctgaaaactt 8820
tcaccactcc ggtcgctggt atcgttgagc cttacgcatg gctgaacaaa gcagacacca 8880
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attacgactt ctaatggccc aatggtctgc aaaacggggg cactctgtgg gtgcctaccg 9540
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cgaaagccat tatatcaact atgtgattcc ggcttccgac cacaagtaca caccagattt 9660
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cggctataag tatgccgata agttcatccc ggttgagtgg ctgagagagg cgactgtacg 9900
tctgccttct ggtatactca ttcccaagaa gaaaggagtt aagtgatgac tcagaaatat 9960
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ctaaactatc accttagggg tgggacaatt agtcctgtcc ctttgttcgc atttgtgatt 11160
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ggacgatatg tcccactacc agcccgtagt ctcagcatgg agatatgcaa gaagtacagc 11460
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accgagggtg agatagacgc gctgtctgtg gctcaggtgc aggacggtaa gtatccggtt 11700
gtctctcttc cgttaggcgc caagtctgcg aagaaagcta tggctgcgaa ccttgagtat 11760
ctcgaccagt tcgaagagat aatcttgatg ttcgacatgg atgaaccggg tcgtcaggcc 11820
attgaggatg cagctccagt cttaccagca ggtcgggtta aggttgcatt catcaacggg 11880
tacaaagacg ccaacgctgc acttcaggtc aaggacttca aggccattac cgatgctata 11940
tggaacgcta aacctttcat ccctgctgga gtggtatcag cggcaagtct gaaggaccgc 12000
acacgagagg caatgcttaa ggcagagact gaaggtctca tgttctcgtc atgcacaaca 12060
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ggcatgggta agtctacatt cgtccgtcag ctcctcttag agtggggccg gggcggtaag 12180
cgtgttggta tggctatgct tgaagaggct gtagaggaaa cagttcaaga ccttatgggt 12240
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catgaagaag gacgtcctgt tagtatcact gatttgcgtg gaagtggtgc tctgcgtcag 12660
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catctccgtt tgcttaagtg ccgctttact ggtgacactg gagtggcggg acaccttgag 12780
tacaacaaga cgaccgggtg gcttgaaccg attagcttca ctggcagcag cggagaagag 12840
gatagcggct cgtgggaaga caccgacttc taaggaggag tacattgcta agaaaactta 12900
aagctcgcta ccatcggttc atgtacaaat ggtggagcga tgaagcaacc tgcctgtcaa 12960
acattctagg agaccaaagg ttcgactcta aggcatggaa gaaagctaac cggaagttta 13020
tgtatcactt cttgcgtaca gacttctagg tctagactca aggccattca catcgagtgg 13080
cctttatgat tagactaaac ggaggattaa ccatgtttga ttgcattgag tggaccgggt 13140
gtcgagatag tttcggctat ggtatgcgaa aggtcaacgg gaaggtccgt agactacatc 13200
tgatagcctt cgaggaggag aatggtccga taccagaggg aatggtcgtg aggcacaaat 13260
gcgacaaccc tgcgtgctac aatccagaac acttggagct ggggacaagg gctgagaaca 13320
atcacgatag agacgtcaga ggtcgaaccg ctaaaggcgt gcgacatggc agctctaagc 13380
ttacacctga gataatacaa gaggccaagg tgctctacgc aggaggtgga tggactcacc 13440
gctccctagg tgagaagtat ggagtgggac accgcacgat agctagagca attggaggag 13500
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tggaaaggtt agagggctgc tatgtaccaa ctgcaatcaa gctataggca agctgaagga 27300
tgacgctcag ttacttagaa acgctatcaa ctatctggag gtgaaccgtg tgtgaaccag 27360
tatccatcgg tctaggagtc atgtctgtag ccggggccac gatgtccgca tcccaacagg 27420
ccaaggctga aggcgctgct attgatgctc agaaccgaca ggctcaggag atgattaagc 27480
agatgaacta ctctgactcc aacctgagga tgcaggagag agacctgaag gagcagcaga 27540
tggttgaact gacagagacc acgctcaacg gtatccgcaa tcagggtatg gtccgagctg 27600
cggtggctga gtctggtctg gaaggaaatt ctatggacag gattgaacgt caggtcgcag 27660
gagatacagt caaggagcga gtagggatta ccgaaagcta caaccgtgac tattcggcta 27720
tcttcgggaa ccgtatcgcc aacattgaga acaccaagtc tgctatccgt ggtcaaggta 27780
aaatcatcaa gaccagccca ctggctcatg cacttaatgt tgctacctca gggatgcaag 27840
ggtacgctgc tggtaaatct atcgccggac cttcaagctc tggcggtgct gcaccgatta 27900
gtgctgctaa aggtacacct acaggtcata gctaagagga ggactaatgg ctagtaatat 27960
tgaatcagct ctggctaatc ggactatggg tcgtggcaga gcgccgggta aaactatcgc 28020
cgtcaactat caagcagcca gcgttcaggc tccaactggc gactccggtc tggctcgtgc 28080
gtttactaac ttcgttgagg cgggaacagg gttatacaag cagttcagtg atgaacagaa 28140
gacaagagca gacgagcggt ccaacgagat tatccgtaag ttgacacctc agcagagacg 28200
tgaggctatc cagaacggca cattgctgta tcaggacgac ccttacgcta tggaagcact 28260
tcgagtaaag actggtcgta acgctgcctt tgcggtggat gacgagatta acgttaagat 28320
tcagaacggt gagttccgta cacgtcagga catggaagag tatcgccacc agcgacttca 28380
ggatgccgct aagtcatatg ctgaagaggc gggcattaat cctaccgacg agttcttcca 28440
gcgaggattc aacgataaca tcacggaccg aaacatcgct atctacgggt ccttcaataa 28500
gtatttcagc aagcagtctg aagagacagc aatgttgaac actcgtattg agatgaactc 28560
gttccttaac gatggggacc tgatgcgttc gcctgagtct ggaaagacct tcatggccta 28620
ccttcgggat ggattgacga ctgctgctat cccttcggac cagagagcac gagaggtcat 28680
cacccagacg gtacgtgacg caatccagaa gtcaggaggc tcaaacttcc tacagcaagt 28740
ccgtggcgag cgtatcaccc ttaatggtgt tgacgctacc atcgaagaga ttgtaggacc 28800
tgacgtcttc aatgctgcta gggttgaggc ccaaggtact gagtataaac tggtggctaa 28860
gtatcaggaa gacttagcgt taggcgttca gtctgcgatt cttcaggatg acccgaccat 28920
cggtctggcc cagattcaaa aactcaagga gcagaacaac cagcttcaac ccggtgaaga 28980
actcactcct cagcgtcaga tgcttattaa cgccgaagcc acgctactgg aagcggtaaa 29040
gcgtaagtct gctgaacagg cgaaggagaa cacgaagtta atccagaccc agaacaagca 29100
actagtcata gaccaagtgt atcagcgacg tctggctggg gacaacgtgt caaccaacta 29160
tgaggacctt ccggtctcag atgctacagg agagttcaag cgttcagaca tgaacaacta 29220
tgcgtctgcc aagctacagc agattgacca gatggacatc cctgaggctg ctaaggacgc 29280
tcagaaggtg gcattgttga gggctgacac taacaatggt cctttccgta atgccttcca 29340
gacgctgact caggatgctg ctggtgagtg gcaagctgcg gtcatccgtg gacagtacga 29400
cccagacaaa atgaaacgct tcgagtctct tcgccgtgcc tacactcagg acccttcaag 29460
tttcgctgct ctgtatcctg accaagctca gttgttctct acgttcgacc agatggacaa 29520
gatgggtctg gaccctcaga cgatgattga agctgataag caagctgcaa gtcaaagccg 29580
tgagatgcgc atggagtcag acaaggcgtg gcaggagttg aagaacgact ccaagaacac 29640
ccagttgtct cgtctcccaa cgtctcttga ctcaagtgct cgtaaggtat gggactcatg 29700
gtactatcgt acaggtaacg ctgatgctgc aactcagcag actcaacgct ggctgaacga 29760
gaacaccgta acgttccagt ctgaaggttc tgacgggaag tccatcggca tggtgtccaa 29820
gcaccagctt atggtcgggg ataacccaga gtcatggcag gtaggtcgag acattatcga 29880
caccgcccgt aagcagctca ttaaggccaa cccttgggta gtgaactctc agttgtccgt 29940
tgttgaacag aacggctcta tcttcctcca agacgctaca gggactattc gtattcgtta 30000
cgataaagaa cttgtaggta aactctaccg cgaacaacag cagaaggcac aagatgctgc 30060
atacgctcag gcagaacgtg acgctaacaa gcgagcgcgt atcgtcggga ctaaagctgc 30120
tggggataaa cgacgagctg accgagaggc caacatcgag aagcgcggtg ggatgtacaa 30180
tgacgtctca ctggagggta tcgcaaacac cttaattggt aaggagtaaa catgaagaac 30240
gggacagcca gtgagagact ggcagaattg tcagtagctg aagagtctgg ctgtatccga 30300
ttcacaggcc acttagacgg agaaggatac ggaaggataa tggtggctag ggttaagtat 30360
atggcacatc gtctctccta ctccctaaat aaggggccaa taccagatgg ttatgttgtt 30420
aggcataaat gtgataatcc atcatgcata aatcctgaac accttgaaat aggaacgcag 30480
gctgacaaca ttgcagataa ggtttcaaga ggccgacagg caagaggtag tggagcaggc 30540
agagctatac tgacagagga atctgttagg gaaatacgct ccagtccatt aaaagtatct 30600
gagctttcca ccttatacgg ggtaagcgtc gtttccatac gaaatatatt gaggagaaag 30660
acatggcaac acgtggtgta aggaacgcaa atccgggcaa tatccgtaag tctaaggacc 30720
aatgggaagg agctactggc gatgatgggg agtttgtagt atttgatagc ccagagtctg 30780
gtgtgcgggc cttgggtaag aacttattaa gttacggtcg ccaaggttat gactccatcg 30840
agaagattat caacagatgg gcacctccta acgaaaacga cactcaggct tatattgact 30900
cagtggtgtc tgcgactggt attcctgcaa ctcaaagtct cgacctatct gaccctgaca 30960
ccctgtcttc tctggctcaa gctatcagct tccatgagac aggctccagg tacgaccctg 31020
aagtctacca gaagggggtc gcaagagcac tcaacggtat cagcccaaag acgccaccag 31080
taagcgctaa cgtatttgac gcactcacag aaggactcaa ggctaaacct aaagtagctc 31140
tgggtgagaa ccttccgacc gctgctggtc tgaatattga gggtcaagca cctgaagctc 31200
ccaacgaatc gttcggtgag atgttctata aggctactgg agagaccatg caggaacgag 31260
aggaccgctc tacgtggttc ggttttggct ctgctacaga agctgaagtg aagaactcta 31320
tggtcggcgt ggctatccga gctggcaaga ctgaggactc actggatgta attggcgatg 31380
tgttcaaccc aaccagatgg aacaaccata agtggactcg agaagagctt gaccagattc 31440
gtaacgctgg ggttctgcct cagtattacg gagtcattac tggtggctct cctcagaacc 31500
ttacagagct tatcaacttg gcgcttgaga accagaagtt ggaccaagag aaggctaagg 31560
ccgggactgg tgctcagtta gctgctggtg tgattggtgc tggtgtagac cctctgacct 31620
acgttcctat cgctggaccg gttggtaaag gcggtaagct ggtcaataag atgttcaccg 31680
tggctgctca atctggagca ctggctggtg tgtccgagat ggcccgtacc tcagtggctg 31740
gtggtgatgc tcatgtggcg gaagctatcc ttggtggtgc tctcttcggt ggtggtatga 31800
ctgctatcgc tgatgggtta ggcagagcct taggtcgcaa cactaatgag tttgctggcc 31860
cagctacacg tctggaagct cgtgagaccg ctcgtaacgt tgatggtcag gacctgtctc 31920
gtctccctat tcaggaaggt gagcagacct tcagctatca aggcgttaag ttcgctgacg 31980
ttcctaacga gccgggtagt gtacgactgg aagatggttc aatcctgatt ggtgagaacc 32040
ctctgaaccc taagacacgt caagtctttg acgaagtgat tgagccagaa cgtgccgctg 32100
ctggtgtgaa ccttggtgga cttaccgaga ttggcctgaa gctgcttcgg tctgagaacc 32160
ctgagattcg tggagtagct gctgacttag tgcgctcacc gactggtatg cagtctgggg 32220
cctcaggtaa aatcgggaca actgcgtcag acgtgttcga gagacttcgt gctgtggacc 32280
atcggttcta caacgacatc gacgatgcgg ttactgaggc actaaaagac ccgtacttcc 32340
agacagcatt ctggcgagac tctggcgcat tccgtcagga catctaccag cgtgtgtcta 32400
tggctatcga agatggtagc ggaaacctga aggctgaact gactacggga gagctgaaag 32460
tctatgacct actgaagaac cagtttgacg ccaagcgtga gatgatggag aatccagcta 32520
tgtttggtcg gccagacgct cagtctatct ttccgggtag ccgcttcaag ggaacctacg 32580
tccctcatgt gtatagcaaa cagatgaagg agctgtacat caaggagctt gggagtccag 32640
aggcgttgca ggaggccatc aaaaagtcat ggttgaccag ctatgcgtca agacctgaag 32700
tcaagaaacg cgtggacgag gcactcttag aggctgaccc tacgttgact ccagagggac 32760
ttgctgctgc ggtcgataag tacgccaacg ataaggctta cggtatctct cacaccgagc 32820
agttcgaacg ttcatccgta atggaagaga acatcaacgg tctggttggt ctggagaaca 32880
acagcttcct tgaggctcgt aacctgttcg atagcgatat gtcaatcgtc ctacctaacg 32940
gtcagacctt cagtgtcaac aacctgcgtg agtgggacat ggacaagatt gtcccggcct 33000
acaaccgtcg agttaatggc gatattgcta tcatggctgg tacaggtaaa accacgaagg 33060
acatgaagga cttggttgag accatgatga acaaggctgg ggatgacggt aagttgaaag 33120
gtgaagtatc caccttacgt gacaccttga aggttctaac tggtcgtgct cgacgtgatg 33180
gtgctgacga tgcagccttc aataccgtta tgcgcacaat gacagaccta tcgttcttcg 33240
ctaagaatgc ctacatgggt gttcagaact taacggagat tggtggtatg ctggctcgtg 33300
gtaacgttcg tgcaatgctt catggggtcc cgatgttccg tgacctagcc ttccgtaaca 33360
agaaggtaag tggctcagag attaaggacc tgcataatgt cctcttcggt aaggaactgg 33420
atgactcaat ccgcccgtct aaacaggatg tcattgaccg tctgcgctcc tatagcgacc 33480
taggtcgtgg ggcagctaca gctctgggga ctgccaagta ttacactggc gaacttgcag 33540
tacgctctcc gttaactaaa gtcctcaacg gtacgaccaa ctacctgtta gatgctggac 33600
ggcagggatt cctgtctgac atcgtggaac atagtctgac tggcagtaag cgtaagttcg 33660
atgaccgctg gctgaagacc gctggtatat ctgacgagca gtggaagggc attaagtccc 33720
taatccgtga gtcagtgact cgtggtccag acgggaagta caccatcaag gacaagaagg 33780
cgttcagtca ggacccaagg gctatggacc tgtggcgtat gggtgacacc atcgctgatg 33840
aaacgttact acgacctcat aagctgtcta acatggatgc caaggcttat ggtcctctag 33900
ctaagactgt ccttcagttt aagaacttcg tcatcaagtc tatcaatggg cgaaccatgc 33960
gaaccttcta taacgccacg aagaacaacc gagcgatgga cgctgcattg tctactgtga 34020
tgtctatggg tctggctggt atctactaca tggctcaggc gcacgtcaag gcttacgcta 34080
tgcaggacgg tcgagaccga gattatctca agcaagctct ggacccaacg atgattggct 34140
atgctgctct gtcccgtagt tcacatctag gtggtccact tggggtagct aacattctgg 34200
gtggcatcgc tgggtatgag gacactaaga tgctccgttc gtctatccta ccccgttcgc 34260
ctacagagaa gcctgaacgt gctattacct atggagctgc gaagagtgac ccggtgatga 34320
atgtggttgg aaacttcctt gagcaggttc cggctttcgg atacgccgct aacgtggggg 34380
cttcggccta caacttggct ggatacctga aagctgacac acgtgtgaac gaacgtgact 34440
acatgacagg gatgtacaat accttccgtg agctggtccc gaacgaccca atcacacaga 34500
ggcttctgct cggaaccttt gaggaacaag gtattcacat caaggactaa actatcacta 34560
taggaaacgg gcgctcccac aggccctaaa cacaacttaa ggagactata tgtccggaac 34620
tcttactaaa ttcccaactg gaagcacgaa atataagatt aacttcgact acttatcccg 34680
taagtttgtt aaagttactt taagcaactc tcttgatgct accttaaata aagagctagt 34740
ggttggtaac gattaccgct tccttagtgc aaccacatta gaaatactag ccagtcaatc 34800
tgggttcgac gtcatacaga tttatcgcca aacgtcttca gagcttatgg ttgatttcag 34860
agatggctca gtattgaccg catccgacct cacaacggcg gagcttcagg ccatccatat 34920
cgccgaggag ggtagagacc agacggttga acaggccgta cagtttgcgg aagctgctga 34980
gaaatctgcc gaggacgctg ccgcatcact tagcgggatt aaggacataa tcgctaacaa 35040
caatatcgat tcaacaatcc gttcagacct gtccaagtcg gatgggtaca caatgattgg 35100
cggactgtct gaacgattca gtctacccta caagtgggtg gtagtggata acgctcctta 35160
taatggcgac cttgagaagg ccgtatccga aagttcagac ggtacgggat tcctattagg 35220
tagagggaaa tcctacgact tccttacatt ccgcagcgct cgtaacacta agaagaacct 35280
aacgttcgtt ggtggagggg tcccggagct gtctgccgat acacggagcc ttgttgctgg 35340
tactggaacg ataatcagag gaccaatgaa gactgaggct ggtgggttcc agttagtgaa 35400
cctaggtgtt gactgtggtg gtgtgatgtc agacgaactt ctaggcggtc aatgggacga 35460
ccctatccaa tgctatggta ttggtaaaga ggcaaatgtt tttatagata acgttaaaac 35520
cttgagtcat acgaacctca ctggtccaaa ctacccagga actcacagct tgcttcttga 35580
gattcttgac ggagcttatg ttggaaaggt agaactgatt ggtggctacc acggtctgac 35640
ccttaagggg actaacttag atgtgatgga cgcccactgt tatggacaaa gaggtgatgc 35700
gtttatcatt aagtctgact ctgctgcaac ggctgctgat atctacatcg gaagacttaa 35760
ggtagggctt cgtgataact ctaagtttac agatgttact atgggcggca tctacgacgc 35820
tcacgatggg gttaacatcg ataacgtgga gataggctct cttcaggtct acaacgcatc 35880
atgggggctc attccctcaa atgaaaatac tggttatatc agcaacttgc gtattgggaa 35940
ctacgtggct atgaacgtat atggtaacta ctattcgcta gtgattgatg gtcgctgcgt 36000
tggtgttaac atcggggagc accagtgttc taacacatct ggcggaatca gcgtagaccc 36060
ttcctctgtt aacgtgtcac tgggtaacgg attctcaaag ggtgccacaa agtctggtta 36120
caagctgggg ggtaactctc tggttcacgg gaacctgata gccgatgaga atggtgagta 36180
cggtgttgag tatgctggcg gcctagggtt cgatgcgtca aaagttctag ggtatagtaa 36240
cccattcggt ctggtgtcgg ctgaggttag cgcccttggg tcaactactg gacctaagaa 36300
tggctgggga gacactgggg acttttcatg ggtaatgcat ggtaagatgt cgatagtaaa 36360
cggagccctt attaagggat atggggcggt cccatacaca tctctaccaa taacggctcc 36420
tcgcaggaaa acgcgcatcg ctgcatgggg tgtgcaaggg tcgagcatga ttccagtcga 36480
gtgctatgtg gaagcgaatg gggaccttaa cgtcgttggc tgggcgtcca ttacagacgg 36540
aaacgtgata aacttctcag gtcagtacct agctaaataa ctatggccct ctacggaggg 36600
tcaataatgg aggttttatg attgagttcg acttcaagaa tgaggtccta aaagcctcgc 36660
ctatcgtcgg gaccgctgcg gctgatggtg ccagtcggtt cttctttggg ttaacactca 36720
acgaatggtt ctacgtcgct gctatcgcgt acaccgtggt gcagattggc gtcctaattt 36780
acaagacgat taagagcgga ggtaagacat gacgcagatg gacttagaga agttcctgtt 36840
aatgctggac actgaacgcg ctcgactcat gctgcaagac ctgcgggatg acacaaagcg 36900
ttcacctcag ctttacaacg ctatcgagaa gctgctagct cgccacaact ttgtactcag 36960
caaggtgtct gtggatgaga aacagttagc tgacatggag gcgttgaaca gggagtacga 37020
taaggtgctc tcagctactg aggacaatga cacagggtat ggtgtacagt aagtgttaga 37080
ctcaaggtca ttaccactat atgtagtggc ctttatggtt aacactaact agtggaggag 37140
actctacgtg aaaatctgag aaactaggag ggcaactatg ctcaaacttt tacgacaggc 37200
cgtcccgtgg ctggtggcag ggctcctgtt ctgttcgggc tactgggtag ctgacaataa 37260
gtgggaggcg aaagtaaaca atgagtacat cacgaaactt gaggcacgag agaatcaacg 37320
ggctgctgtc caaggtgaaa tcaacaaagt gtcagcagag tggcaagaca agatgtccgc 37380
gctggacggc agcactgata ggattattgc tgaccttaac cgcgataaca agcggctgcg 37440
catccgagtc aaacccacca gtggaacagt ccagacttac ggtcgatgcg tcattgatgg 37500
ttacgccgaa cttgacgaac gagatgctaa gcgtcttatc accatcggac tgaaaggtga 37560
cgaatggatt aaggccctcc agaagaccgt gagagccatg cagcaagaga aggaggtgaa 37620
accttgagtc aagacttagc ggcgcgtcag gcgcttatga ctgcccgtat gaaggcggac 37680
tttgtgttct ttctctttgt cctgtggaaa gccctatcac ttccttcccc taccagatgc 37740
cagattgaca ttgctcgaaa ggtgtctaat gggggcaacc gccgattcat ccttcaggct 37800
tttcgaggcg tgggtaagtc gttcctccta tgtgccttcg tggtctggaa gctatggaac 37860
aacccagact tgaagttcat gattgtgtcg gcctcaaagg aacgagccga tgcgaactcc 37920
atcttcatca agcgaatcat cgacctcatg cctcagcttc aggaactcaa gcctaagcag 37980
ggacagcgag atgcggttat cagcttcgac gttgggccag caaagccaga ccactcacct 38040
tcggttaagt cagttggtat cactggtcag ttgactggta gtcgtgctga catcctgatt 38100
gccgatgacg tggaggttcc taataactct gctactcagg ctgcgagaga ccgtctgtca 38160
gagcttgtga aagagttcga cgctatcctg aagccgggtg gtacaatcat ctatctgggt 38220
actcctcaga acgagatgac cctatatcgt gagctggaag gtcgtggata caccactact 38280
atctggcctg ctcgctatcc gcgcgataag aaggactggc agtcttacgg cgaccgtctg 38340
gctcctatgc ttcaggcaga tcttgaagag gaccctgagt ccttctactg gcgtccaact 38400
gatgaggttc gattcgacga tactgacctt aaggaacgtg agctgtccta cggtaaggct 38460
ggcttcgccc tacagttcat gcttaacccg aaccttagtg atgctgagaa gtacccactg 38520
aagctgcgtg accttatcgt agcggacttg gacccagcgt ccagcccaat ggtctaccaa 38580
tggttgccga accctcagaa caagcgtgag gacgttccta acgttggact catgggtgac 38640
tcgtaccaca cgtatcagac tgtaggttct gccttcagtt cgtacaccca gaagattctg 38700
gtcattgacc caagtggtcg aggtaaggat gagaccgggt atgtggttct gtaccagctc 38760
aacggctaca tcttcgctat ggaagtaggg ggtatgcgtg gcggctatga ggactctacg 38820
ctggaagctc tggctaagat tggtcgtaag tggaaggtca acgaatacgt cattgagggt 38880
aacttcggtg atggtatgta ccttgagttg ttcaagcctg tagcggcccg tacccatcca 38940
gcggctgtaa ctgaagtgaa gagtaaagga cagaaggaac tccgcatctg tgacgttctg 39000
gagcctatca tggggtctca ccgacttata gtcaacgctg ctgctatcgt ccaagactac 39060
cagacagcct ctgacaagga tggtgtgcgt aaccctatct actcgctctt ctaccagatg 39120
acccgtatct ctcgtgaacg tggagccttg gcacacgatg accgacttga tgcgctggct 39180
atcggtgtac agttcttcgt tgagtcgatg gctaaggatg ccaacaaagg cgaacgtgaa 39240
gtcactgagg agtggctgga ggaacagatg gagaacccaa ggaaaggctt cgagtccatc 39300
cacactgagt tctgggacaa tggggtccgg gtaactcacg atacggacga cgagctagga 39360
ctagggtcat acgttacgtt ccactagcta gatgaataac tataggcgaa aactgaatga 39420
atacgcggtt agtaacctat agttattacc agtctaacct actgttttac aaggagtttg 39480
gacttaacta tcactatagg aaagaccaat ggttacttat agtattaatg tagtgaataa 39540
acatatgcag actttatgca agaccttagg aggcagactc cgagttctta cctaaggctt 39600
gcaccgatgg aaggagggtg atattaatca taatccctcc aatacagata gtcacagacc 39660
atagatacag gaggtatgta gcatatggca aagaccaaag ctgttctcaa agctctggcg 39720
accaatagag ctacatacag gtttcttgct gctgttctac ttgctgctgg cgttactgct 39780
ggaagtcagt gggtcgggtg ggtcgagact ctcgtatgta ctctggtgtc tgagtgtcat 39840
taacgctgta atggtaacaa taaacgaaag acggacctaa ggtcagttca tagctgacgc 39900
tactctactg accttagcta ctgtagtcaa ggactttagg taacacctta agagaagctc 39960
acttag 39966
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> InvA-F
<400> 3
ggtgatggtc ttgtcgcc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> InvA-R
<400> 4
gctcgccttt gctggtt 17
Claims (6)
1.一株多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体，其特征在于：名称为沙门氏菌噬菌体（Salmonella phage）MDASK，保藏号为GDMCC NO：62376-B1，该噬菌体于2022年4月12日保存于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种制备权利要求1所述多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体的方法，其特征在于：将多重耐药肯塔基沙门菌接种于液体培养基中，培养至对数生长期，然后接入权利要求1所述多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体进行噬菌体培养；
所述的多重耐药肯塔基沙门菌名称为肯塔基沙门菌（Salmonella sp. Kentucky）10A20，保藏号为GDMCC NO：62376，该菌株于2022年4月12日保存于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的噬菌体的培养温度为37～50℃；
所述的噬菌体的培养pH范围为4～11；
所述的噬菌体的培养时间为1～4h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述的噬菌体的培养时间为3.5 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的液体培养基为LB肉汤培养基；
多重耐药肯塔基沙门菌的培养条件为：37℃，150～200rmp振荡培养4～6h。
6.权利要求1所述的多重耐药肯塔基沙门菌烈性噬菌体在制备针对肯塔基沙门菌的杀菌剂中的应用。
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| Isolation and Characterization of Potential Salmonella Phages Targeting Multidrug-Resistant and Major Serovars of Salmonella Derived From Broiler Production Chain in Thailand;Wattana Pelyuntha et al.;Frontiers in Microbiology;第12卷;摘要，第8页左栏第1段-第13页左栏第1段，表1-3 * |
| 广东省零售市场鸡肉中肯塔基沙门菌的流行情况及耐药性分析;王少君 等;畜牧兽医学报;第50卷(第12期);2509-2517 * |
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