CN114908137A - 高通量肿瘤药物筛查的方法与试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高通量肿瘤药物筛查的方法与试剂盒，属于药物筛查技术领域。其中，本发明的筛查方法包括：采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球；在所述肿瘤细胞微球中加入含药培养基进行培养；对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性和/或细胞迁移进行检测。本发明提供的高通量肿瘤药物筛查方法，以加胶U型底法为基础形成了细胞培养的基质微环境，无需额外设备和复杂模具即可以高通量、稳定、均匀、可控地生成肿瘤微球，实现体外三维培养，并且水凝胶还提供了观察肿瘤细胞迁移的环境，通过检测肿瘤生长、转移等重要指标实现对肿瘤药物高通量、高精度筛选，该方法操作简单、成本较低。

Description

高通量肿瘤药物筛查的方法与试剂盒
技术领域
本发明属于肿瘤细胞培养与药物筛查技术领域，具体涉及一种高通量肿瘤药物筛查的方法以及试剂盒。
背景技术
目前用于肿瘤药物筛选的模型分别是二维培养的细胞模型以及动物模型。其中，二维培养的细胞模型具有高通量和价格低的优点，但是存在低仿真性、没有器官结构、以及没有血管和肿瘤作用等问题，这使得二维肿瘤模型无法模拟真实肿瘤在三维情况下的状态，导致二维培养的肿瘤模型无法预测药物对肿瘤的效果。其次，采用小鼠的人源肿瘤异种移植模型(PDX模型)同样也具有问题，例如：成本高、通量小，同时小鼠模型的体外环境不同于人体环境。
基于此，三维培养模型的研究越来越得到重视，三维细胞培养可以更加精确地模拟肿瘤细胞所处的微环境，其重视了天然肿瘤细胞微环境的多样性，更接近生理条件，以及，三维细胞球能够自然地模拟肿瘤固有的代谢成分、例如：氧气、二氧化碳、营养物质、废物等，可以利用患者来源的三维类器官进行培养肿瘤微球其基因图谱和表型与原发患者具有高度相似性，其分子表达谱与药物筛选结果相匹配，预示了其在寻找肿瘤弱点和药物治疗反应方面的应用潜力，更具有临床意义。
三维培养细胞微球的方式，比较常用的方法是悬滴法，该方法利用重力作用，使细胞在悬液中自组装形成微球体，可高通量生成微球，但是该方法需要专用的液滴生成装置并将生成微球转移至培养板，制备过程相对复杂。
此外，培养表面的几何结构对细胞生长有直接影响，微模板法利用软件设计并制备具有阵列式图案的模具，在其上浇筑抗粘附的基质，利用成型的具有凹槽的基质模具进行细胞培养成球，该方法可以制备不同形状的模具从而使细胞自组装成不同形态，生产微球尺寸可控，并且通量高。该方法的缺点是每次都需要制备基质载体，且基质的种类影响细胞生长和后期药物实验。其他如利用抗粘附的塑料类材料制备具有阵列图案的培养板直接进行成球培养，该方法成本较高。
三维细胞微球的培养还包括旋转反应器法，该方法是利用旋转微生物反应器提供微重力环境，使细胞保持悬浮状态进而积聚成球，反应器沿X轴缓慢转动使细胞保持自由落体状态，该方法产量较高，但是微球尺寸不可控，很难实时监控微球的自组装情况，无法将所生成的微球分成单个进行实验，并且需要专门的旋转反应器设备。
采用U型底法进行三维细胞微球的培养，该方法操作非常简单，但是缺乏对细胞三维生长的支撑，也缺乏观察肿瘤细胞迁移的环境。因此，需要额外配置或改善培养的基质微环境，不利于肿瘤细胞的优质生长，更不适用于标准化的高通量药物筛选。此外，细胞培养过程中，部分培养单元因水分蒸发导致数据不准确，进而也对整体数据的标准化产生影响。
因此，针对上述技术问题，本发明提出一种高通量肿瘤药物筛查的方法与试剂盒。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种高通量肿瘤药物筛查的方法、一种用于高通量肿瘤药物筛查的试剂盒。
本发明的一方面，提供一种高通量肿瘤药物筛查的方法，包括如下步骤：
采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球；
在所述肿瘤细胞微球中加入含药培养基进行培养；
对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性和/或细胞迁移进行检测。
优选地，所述采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，包括：
形成肿瘤细胞悬液；
将所述肿瘤细胞悬液加入U型底培养板，所述U型底培养板的每个培养孔中的肿瘤细胞数为5×103个～2×104个；离心处理后在所述U型底培养板中加入完全培养基对所述肿瘤细胞进行培养；
吸弃所述完全培养基，在所述U型底培养板内加入与所述肿瘤细胞相对应的水凝胶培养成胶，以形成肿瘤细胞微球。
优选地，所述水凝胶包括基质胶Matrigel、细胞外基质、天然生物材料、由高聚物形成的水凝胶以及复合水凝胶中任意一者。
优选地，所述水凝胶的体积范围为30μL～100μL。
优选地，所述水凝胶的杨氏模量范围为0.5kPa～5kPa，1kPa～10kPa，1kPa～30kPa，10kPa～500kPa中任一者。
优选地，所述复合水凝胶包括水凝胶的单体与光引发剂；其中，所述水凝胶的单体为甲基丙烯酸酰化明胶和弹性蛋白形成的具有生物活性的特异性双网络水凝胶单体；
所述光引发剂为苯基(2.4.6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
优选地，所述培养成胶包括，采用波长范围为320nm～480nm的光照射所述U型底培养板30s～300s，并将所述U型底培养板置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％，静置时间范围为20min～40min的条件下培养成胶。
优选地，所述肿瘤细胞包括细胞系肿瘤细胞、患者组织的肿瘤原代细胞、干细胞分化技术制备的肿瘤细胞和利用基因编辑技术制备的肿瘤细胞中任意一者。
优选地，所述含药培养基包括抗肿瘤药物与完全培养基；其中，
所述抗肿瘤药物包括直接作用于DNA的抗肿瘤药物、影响DNA合成的抗肿瘤药物、作用于结构蛋白的抗肿瘤药物、分子靶向抗肿瘤药物以及调节激素的抗肿瘤药物中的一种或多种。
优选地，所述对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性进行检测，包括：
采用细胞活性检测试剂对培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞活性进行检测；和/或，
所述对培养后的肿瘤细胞微球的细胞迁移进行检测，包括：
获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态与细胞直径；
根据所述细胞形态与所述细胞直径，计算得到所述肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长以及多尺度熵中至少一者，以评估所述细胞迁移情况。
优选地，所述U型底培养板的四周设置有水槽。
本发明的另一方面，提供一种实现高通量肿瘤药物筛查方法的试剂盒，包括盒体，所述盒体内放置有U型底培养板、培养基、水凝胶、以及检测试剂；其中，所述U型底培养板四周设置有水槽。
优选地，所述盒体内还放置有肿瘤细胞、消化液、磷酸盐缓冲液、血清、生长因子、抗生素中的一种或多种。
本发明以加胶U型底法为基础，可以高通量、稳定、均匀、可控地生成肿瘤微球，以实现体外三维培养，通过检测肿瘤生长、转移等重要指标实现对肿瘤药物高通量、高精度筛选，该方法操作简单、成本较低。
附图说明
图1为本发明一实施例的一种高通量肿瘤药物筛查的方法流程框图；
图2为本发明实施例1中乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤微球药物作用细胞活性检测结果；
图3为本发明实施例1中乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤微球药物作用细胞迁移结果；
图4是本发明实施例1中乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤微球药物作用细胞迁移直径检测结果；
图5是本发明对照例1中乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤微球不加胶培养药物作用细胞活性检测结果；
图6是本发明对照例1中乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤微球不加胶和加胶三维培养的形状对比图；
图7是本发明实施例2中结肠癌细胞HT-29肿瘤微球药物作用细胞活性检测结果；
图8是本发明实施例2中结肠癌细胞HT-29肿瘤微球药物作用细胞迁移结果；
图9是本发明实施例2中结肠癌细胞HT-29肿瘤微球药物作用细胞迁移直径检测结果。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
如图1所示，本发明的一方面，提供一种高通量肿瘤药物检测或筛查的方法S100，包括：
S110、采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球。
具体地，步骤S110包括下述三个步骤：
第一、选取对数生长期的肿瘤细胞，经消化、收集肿瘤细胞，用完全培养基重悬调节肿瘤细胞浓度，以得到肿瘤细胞悬液。
在一些优选实施例中，肿瘤细胞悬液的浓度范围为1×104个/mL～5×105个/mL。
进一步地，在一些优选实施例中，肿瘤细胞来源于细胞系肿瘤细胞、患者组织的肿瘤原代细胞、和干细胞分化技术制备的肿瘤细胞和利用基因编辑技术制备的肿瘤细胞中任意一者。
在一些优选实施例中，肿瘤细胞种类包括肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、脑胶质瘤细胞以及骨癌细胞中任意一者，对此不做具体限定。
更进一步地，在一些优选实施例中，培养基为对肿瘤细胞进行培养的完全培养基，该完全培养基是在基础培养基中添加血清、抗生素等物质的培养基，基于血清可以促进细胞生长和繁殖，且基于抗生素可以防止培养过程染菌。
在另一些优选实施例中，培养基采用含有与肿瘤细胞相对应的生长因子的完全培养基，当然，培养基还可以选择不含有生长因子的完全培养基。
应当理解的是，上述完全培养基为与肿瘤细胞相对应的培养基，指不同细胞种类对应不同的培养基，其特定生长因子指不同细胞种类对应的生长因子不同，如乳腺癌细胞可以用胰岛素等。
第二、将上述步骤中形成的肿瘤细胞悬液加入至U型底培养板，室温离心处理后，在U型底培养板中加入完全培养基，在温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的条件下对U型底培养板中的肿瘤细胞培养4天。
在一些优选实施例中，U型底培养板的每个培养孔中肿瘤细胞数为5×103个～2×104个。每个培养孔内的肿瘤细胞数目在优选的范围内，可保证肿瘤细胞更优质的生长，而且更利于高通量药物筛选。更多的肿瘤细胞数目，容易导致培养的肿瘤微球过大，从而发生培养液难以进入到肿瘤微球内部，肿瘤微球内部坏死的情况；更大的肿瘤微球，药物也难以进入肿瘤微球内部，导致药物检测结果不准，而且需要频繁更换培养液，进一步发生药物代谢差异，更加导致药物测试结果的不准确。
在另一些优选实施例中，U型底培养板采用可拆卸式的96孔U型底板，24孔为一组，可适用于检测量较小的情况，以减少浪费。并且，采用U型底培养板培养肿瘤细胞微球操作简单，无需额外设备和复杂模具即可高通量生成均一的肿瘤细胞微球，成本较低。
在另一些优选实施例中，在U型底培养板的四周设置有水槽，通过水槽内容置有水，以向U型底培养板提供维持培养微环境的湿度，确保各培养单元处于潮湿的条件下，避免因水分蒸发导致结果数据不准确。
第三、吸弃完全培养基，在U型底培养板内加入与肿瘤细胞相应的水凝胶，采用波长范围为320nm～480nm的光照射所述U型底培养板30s～300s，并将所述U型底培养板置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％，静置时间范围为20min～40min的条件下培养成胶，以形成肿瘤细胞微球。
本实施例中不同肿瘤细胞种类对应不同的水凝胶，对于本领域技术人员来说，可以根据不同细胞生理微环境特点，选择符合其生长的特异性水凝胶。例如，水凝胶可选用基质胶Matrigel、细胞外基质、天然生物材料(例如：胶原、透明质酸等)、合成高聚物(例如：聚乳酸、聚酯等)形成的水凝胶以及复合水凝胶(例如：基于特异性细胞外基质或聚甲基丙烯酸化明胶的双网络水凝胶等)中任意一者。
具体地，本实施例以细胞外基质-Matrigel水凝胶为例，在冰上融化细胞外基质-Matrigel预混物，用预冷枪头加入孔板，37℃、5％二氧化碳培养30min成胶。
作为进一步的优选实施例，复合水凝胶包括有水凝胶的单体和光引发剂，其中，水凝胶单体为甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和弹性蛋白形成的具有生物活性的特异性双网络水凝胶，光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂。
作为进一步的优选实施例，与肿瘤细胞相对应的水凝胶的用量为30μL～100μL。水凝胶的用量在优选的范围内，为检测评估肿瘤细胞迁移和肿瘤细胞的优质生长，均提供更好的环境；水凝胶用量少于优选范围，不利于肿瘤细胞的迁移检测环境的构建；水凝胶用量多于优选范围，不利于肿瘤细胞的生长。
更进一步地，还可根据培养的肿瘤细胞类型，对水凝胶的机械性能范围(杨氏模量)进行优选，优选的杨氏模量范围可以更好地促进相应的肿瘤细胞生长。
在一些优选实施例中，当培养肠癌细胞时，选择与肠癌细胞相对应且杨氏模量范围为1kPa～10kPa的水凝胶的。
在另一些优选实施例中，当培养肺癌细胞时，选择与肺癌细胞相对应且杨氏模量范围为0.5kPa～5kPa的水凝胶。
在另一些优选实施例中，当培养肝癌细胞时，选择与肝癌细胞相对应且杨氏模量范围为1kPa～30kPa的水凝胶。
在另一些优选实施例中，当培养骨癌细胞时，选择与骨癌细胞相对应且杨氏模量范围为10kPa～500kPa的水凝胶。
本实施例的U型底板加胶后，一方面为细胞的生长提供支撑，模拟细胞体内生长环境，即提供细胞外基质环境；一方面胶中的特定因子或材料可以促进细胞生长、分化；一方面在胶中，可以观察到细胞的迁移情况，增加检测维度。由此，基于加胶的U型底板培养法可以实现肿瘤细胞的体外三维培养，并且可以高通量、稳定、均匀、可控地生成肿瘤微球。
S120、在肿瘤细胞微球中加入含有抗肿瘤药物的含药培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下进行培养。
需要说明的是，该步骤的含药培养基包括抗肿瘤药物和完全培养基，该完全培养基与前文记载的加入肿瘤细胞悬液中的完全培养基相同，均是与肿瘤细胞对应的培养基，也可以是含有与肿瘤细胞相对应的生长因子的培养基，差别仅在于该步骤的完全培养基中还加入了抗肿瘤药物。
在一些优选实施例中，抗肿瘤药物包括直接作用于DNA的抗肿瘤药物、影响DNA合成的抗肿瘤药物、作用于结构蛋白的抗肿瘤药物、分子靶向抗肿瘤药物、调节激素的抗肿瘤药物中的一种或多种。
作为进一步优选实施例，抗肿瘤药物可以采用RNA合成抑制剂的抗肿瘤药物、DNA合成抑制剂的抗肿瘤药物和微管抑制剂的抗肿瘤药物等。
作为更进一步优选实施例，抗肿瘤药物可以采用紫杉醇(Paclitacel)、多西他赛(Docetaxel)、多柔比星(Doxorubicin)、氟脲嘧啶(5-Fu)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、奥沙利铂、亚叶酸钙等。
S130、对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性和/或细胞迁移进行检测。
在一些优选实施例中，加入细胞活性检测试剂，避光孵育后酶标仪进行对应波长检测，以得到肿瘤细胞活性。
具体地，细胞活性检测试剂包括阿尔玛蓝、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、水溶性四唑盐(WST-1)、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)检测试剂等，对此不做具体限定。
作为进一步优选实施例，选择非终点细胞活性检测试剂阿尔玛蓝，在96孔U型培养板的每孔加入20μL阿尔玛蓝试剂，在37℃、5％二氧化碳避光孵育12h，酶标仪检测波长570nm，参照波长600nm。
在另一些优选实施例中，利用光学系统进行拍照，以得到肿瘤细胞图像，基于图像识别方法进一步得到肿瘤细胞迁移特性。
具体地，迁移评估指标包括培养后肿瘤细胞微球的直径、粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等。也就是说，基于光学系统拍照得到的图像，获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态、细胞直径和细胞迁移直径等，基于细胞形态、细胞直径等计算得出肿瘤细胞的粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等，以此评估肿瘤细胞迁移的特性。
作为进一步的优选实施例，可以使用配套高内涵三维肿瘤细胞实时成像分析仪器实时对细胞微球进行全自动化明场拍照。或者，还可以采用普通显微镜明场拍照分析肿瘤细胞迁移特性。再或者，还可以加入荧光染料，在避光孵育后，利用荧光显微镜拍照检测分析肿瘤细胞迁移特性。
作为更进一步的优选实施例，荧光染料包括各种活细胞荧光染料、死细胞荧光染料、探针，如CMTPX、CMFDA、Calcein-AM、碘化吡啶。
本发明的方法主要利用抗粘附的U型底的多孔培养板接种肿瘤细胞，离心后使细胞成团，加入凝胶模拟细胞生长微环境，进行细胞三维培养形成肿瘤细胞微球，再加入待筛选或待检测药物，在作用时间点，进行肿瘤细胞活性检测、肿瘤细胞微球形态分析和细胞微球直径计算，通过综合评估肿瘤细胞微球生长、转移情况，以实现药物筛查，具有较高的药物筛选效率，该方法简单，成本较低。
本发明的另一方面，提供一种用于高通量肿瘤药物筛查的试剂盒，即实现高通量肿瘤药物筛查方法的试剂盒，该试剂盒包括盒体，该盒体内放置有U型底培养板、培养基、水凝胶、以及检测试剂。
在一些优选实施例中，在U型底培养板的四周设置有水槽，通过水槽内容置有水，以向U型底培养板提供维持培养微环境的湿度，确保各培养单元处于潮湿的条件下，避免因水分蒸发导致结果数据不准确。
在另一些优选实施例中，培养基为对肿瘤细胞进行培养的完全培养基，该完全培养基为在基础培养基中添加血清、抗生素等物质，以基于血清促进细胞生长和繁殖，以及基于抗生素防止培养过程染菌。
作为进一步的优选实施例，培养基采用含有与肿瘤细胞相对应的生长因子的完全培养基。
在另一些优选实施例中，培养基为含药培养基，即培养基包括抗肿瘤药物以及与肿瘤细胞相对应的完全培养基。
在另一些优选实施例中，试剂盒盒体内还放置有肿瘤细胞、以及对肿瘤细胞进行消化处理的消化液、磷酸盐缓冲液、血清、生长因子、抗生素中至少一者。
应当理解的是，试剂盒的盒体内设置有多个单独放置区，上述U型底培养板、培养基、水凝胶、检测试剂、肿瘤细胞、消化液、磷酸盐缓冲液、血清、生长因子、抗生素等分别放置在各个单独放置区中，基于不同的过程选取不同的组分。
在一些优选实施例中，在对肿瘤细胞进行培养时，将培养基、肿瘤细胞以及水凝胶加入至U型底培养板中。
在另一些优选实施例中，在对肿瘤细胞消化时，将消化液加入至上述U型底培养板中，以形成肿瘤细胞悬液。
在另一些优选实施例中，在对肿瘤细胞的细胞活性或者细胞迁移行为进行检测时，将检测试剂加入至上述U型底培养板中，以对培养后的肿瘤细胞微球进行检测。
需要说明的是，利用该试剂盒对高通量肿瘤药物筛查的具体过程请参考前文记载，在此不再赘述。
基于本实施例的试剂盒能够检测肿瘤生长、转移等重要指标，进行肿瘤药物高通量、高精度筛选，有效提高肿瘤药物的筛选效率，还可以应用于肿瘤药物的毒理药理检测，为肿瘤药物研究提供参考数据，大大降低肿瘤药物开发过程中的临床前实验费用。
下面将结合几个具体实施例进一步说明基于试剂盒对高通量肿瘤药物筛查的方法：
实施例1
本示例以乳腺癌细胞MDA-MB-231的药物筛查方法为例进行说明，包括如下步骤：
S1、采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，具体包括：
第一、选取对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231，消化、收集细胞，用L-15完全培养基重悬调节乳腺癌细胞浓度至1×105个/mL，形成乳腺癌细胞悬液。
第二、将该用于接种的乳腺癌细胞悬液加入96孔U型底培养板，该U型底培养板周围设置有水槽，室温离心后，在U型底培养板中加入含有相应生长因子1mg/mL胰岛素的L-15完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养4天。
第三、吸弃培养基，加入乳腺细胞外基质-聚甲基丙烯酸化明胶水凝胶，在波长405nm，光照射1min的条件下成胶，以形成肿瘤细胞微球。
S2、在成胶后的乳腺癌细胞微球中分别加入空白对照二甲亚砜(DMSO)、含有药物紫杉醇(Paclitacel)、多西他赛(Docetaxel)、多柔比星(Doxorubicin)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、氟脲嘧啶(5-Fu)的含有相应生长因子1mg/mL胰岛素的L-15完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养。
S3、检测培养后乳腺癌细胞微球的肿瘤细胞活性以及肿瘤细胞迁移，具体如下：
第一、细胞活性检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前12h加入细胞活性检测试剂阿尔玛蓝20μL，避光孵育12h后，使用酶标仪进行检测，波长570nm，参照波长600nm，结果如图2与表1所示。结果表明，环磷酰胺作用后的肿瘤细胞活性增长，其他用药组作用后的肿瘤细胞活性均有不同程度降低，包括氟脲嘧啶组、多西他赛组以及紫杉醇作用后的肿瘤细胞活性均降低，其中，多柔比星和氟尿嘧啶组抑制肿瘤细胞活性最明显。
第二、细胞迁移检测包括：在第1、3、5、7、10天，利用配套高内涵三维肿瘤细胞实时成像分析仪器对细胞微球进行全自动化明场拍照，以得到肿瘤细胞微球图像，并基于图像获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态、细胞直径，再基于细胞形态与细胞直径，经计算分析后得出肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等，以得到肿瘤细胞球迁移结果，如图3、图4，以及表1所示。结果表明，环磷酰胺作用后的肿瘤细胞球正常增殖，肿瘤细胞直径变大；多柔比星作用后的肿瘤细胞球外部细胞散落，因此直径记为0。另外，氟尿嘧啶、多西他赛和紫杉醇作用后的肿瘤细胞球固化萎缩，肿瘤细胞球直径变小。
综上，通过本实施例的高通量肿瘤药物筛查试剂盒检测乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞活性以及细胞迁移状况，从而筛选出针对乳腺癌细胞MDA-MB-231合适的药物，例如：环磷酰胺无效，肿瘤细胞球正常生长，多柔比星明显有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，可以起到一定的效果，以及，氟尿嘧啶、多西他赛和紫杉醇均有效，肿瘤细胞球固化。
对照例1
本示例以乳腺癌细胞MDA-MB-231药物筛查方法为例进行说明，包括如下步骤：
S1、采用U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，具体包括：
第一、选取对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231，消化、收集细胞，用L-15完全培养基重悬调节乳腺癌细胞浓度至1×105个/mL，形成乳腺癌细胞悬液。
第二、将该用于接种的乳腺癌细胞悬液加入96孔U型底培养板，该U型底培养板周围设置有水槽，室温离心后，在U型底培养板中加入含有相应生长因子1mg/mL胰岛素的L-15完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养4天。
S2、加入空白对照二甲亚砜、含有药物紫杉醇、多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、氟脲嘧啶的含有相应生长因子1mg/mL胰岛素的L-15完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养。
S3、检测培养后乳腺癌细胞微球的肿瘤细胞活性以及肿瘤细胞迁移，具体如下：
第一、细胞活性检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前12h加入细胞活性检测试剂阿尔玛蓝20μL，避光孵育12h后，使用酶标仪进行检测，波长570nm，参照波长600nm，结果见图5。一并结合表1，结果显示，环磷酰胺作用后的肿瘤细胞活性增长，其他用药组作用后的肿瘤细胞活性均有不同程度降低，多柔比星和氟尿嘧啶组抑制肿瘤细胞活性最明显。
第二、细胞迁移检测包括：在第1、3、5、7、10天，利用配套高内涵三维肿瘤细胞实时成像分析仪器对细胞微球进行全自动化明场拍照，以得到肿瘤细胞图像，并基于图像获取肿瘤细胞球迁移结果，如图6与表1所示。结果表明，不加胶组的肿瘤细胞球散开，无法比较各组乳腺癌细胞的迁移情况。
本对照例采用未加胶U型底法，即在培养过程中没有加入水凝胶，没有生成模拟细胞生长的微环境，无法实现对肿瘤细胞进行三维培养，以使得无法检测肿瘤细胞球迁移情况，且细胞活性结果显示对药物敏感性更高，对临床指导参考价值较低。
实施例2
本示例以结肠癌细胞HT-29的药物筛查方法为例进行说明，包括如下步骤：
S1、采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，具体包括：
第一、选取对数生长期的结肠癌细胞HT-29，消化、收集细胞，用Mccoy’5a完全培养基重悬调节结肠癌细胞浓度至1×104个/mL，形成结肠癌细胞悬液。
第二、将该用于接种的结肠癌细胞悬液加入96孔U型底培养板，该U型底培养板周围设置有水槽，室温离心后，在U型底培养板中加入Mccoy’5a完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养4天。
第三、吸弃培养基，加入聚甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶，在波长395nm，光照射2min的条件下成胶，以形成肿瘤细胞微球。
S2、在成胶后的结肠癌细胞微球中分别加入空白对照二甲亚砜、含有药物紫杉醇、多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、氟脲嘧啶的Mccoy’5a完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养。
S3、检测培养后结肠癌细胞微球的肿瘤细胞活性以及肿瘤细胞迁移，具体如下：
第一、细胞活性检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前12h加入细胞活性检测试剂阿尔玛蓝20μL，避光孵育12h后，使用酶标仪进行检测，波长570nm，参照波长600nm，结果如图7与表1所示。结果表明，环磷酰胺作用后的肿瘤作用后细胞活性增长，其他用药组作用后的肿瘤细胞活性均有不同程度降低，包括氟脲嘧啶组、多西他赛组以及紫杉醇作用后的肿瘤细胞活性均降低，其中，多柔比星和氟尿嘧啶组抑制肿瘤细胞活性最明显。
第二、细胞迁移检测包括：在第1、3、5、7、10天，利用配套高内涵三维肿瘤细胞实时成像分析仪器对细胞微球进行全自动化明场拍照分析，以得到肿瘤细胞微球图像，并基于图像获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态、细胞直径，再基于细胞形态与细胞直径，经计算分析后得出肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等，以得到肿瘤细胞球迁移结果，如图8、图9以及表1。结果表明，环磷酰胺作用后的肿瘤细胞球正常增殖，肿瘤细胞直径变大；多柔比星和氟尿嘧啶用药后肿瘤细胞死亡散落；多西他赛和紫杉醇用药后肿瘤细胞球固化萎缩，肿瘤细胞球直径变小。
综上，通过本实施例的高通量肿瘤药物筛查试剂盒检测结肠癌细胞HT-29的细胞活性以及细胞迁移状况，从而筛选出针对结肠癌细胞HT-29合适的药物，例如：环磷酰胺无效，肿瘤细胞球正常生长，多柔比星明显有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，可以起到一定的效果，氟尿嘧啶有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，以及，多西他赛和紫杉醇也均有效，肿瘤细胞球固化。
实施例3
本示例以肺癌细胞NCI-H23的药物筛查方法为例进行说明，包括如下步骤：
S1、采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，具体包括：
第一、选取对数生长期的肺癌细胞NCI-H23，消化、收集细胞，用RPMI1640完全培养基重悬调节肺癌细胞浓度至5×104个/mL，以形成肺癌细胞悬液。
第一、将该用于接种的肺癌细胞悬液加入96孔U型底培养板，该U型底培养板周围设置有水槽，室温离心后，在U型底培养板中加入含有相应生长因子1mg/mL Glutamax的RPMI 1640完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养4天。
第三、吸弃培养基，加入肺细胞外基质-聚甲基丙烯酸化明胶水凝胶，在波长405nm，光照射1min的条件下成胶，以形成肿瘤细胞微球。
S2、在成胶后的肺癌细胞微球中分别加入空白对照二甲亚砜、含有药物紫杉醇、多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、氟脲嘧啶的含有相应生长因子1mg/mL Glutamax的RPMI 1640完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养。
S3、检测培养后肺癌细胞微球的肿瘤细胞活性以及肿瘤细胞迁移，具体如下：
第一、细胞活性检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前12h加入细胞活性检测试剂阿尔玛蓝20μL，避光孵育12h后，使用酶标仪进行检测，波长570nm，参照波长600nm，结果见表1。结果显示，环磷酰胺作用后肿瘤细胞活性增长，其他用药组作用后的肿瘤细胞活性均有不同程度降低，包括氟脲嘧啶组、多西他赛组以及紫杉醇细胞活性均降低，其中，多柔比星和氟尿嘧啶组抑制细胞活性最明显。
第二、细胞迁移检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前24h小时加入荧光探针CMTPX，避光孵育24h后，荧光显微镜拍照，以得到细胞微球图像，并基于图像获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态、细胞直径，再基于细胞形态与细胞直径，经计算分析后得到肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等，以得到肿瘤细胞球迁移结果，结果见表1。结果表明，环磷酰胺组作用后的肿瘤细胞球正常增殖，细胞直径变大；多柔比星和氟尿嘧啶用药后细胞死亡散落；多西他赛和紫杉醇用药后细胞球固化萎缩，细胞球直径变小。
综上，通过本实施例的高通量肿瘤药物筛查试剂盒检测肺癌细胞NCI-H23的细胞活性以及细胞迁移状况，从而筛选出针对肺癌细胞NCI-H23合适的药物，例如：环磷酰胺无效，肿瘤细胞球正常生长，多柔比星明显有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，可以起到一定的效果，氟尿嘧啶有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，以及，多西他赛和紫杉醇也均有效，肿瘤细胞球固化。
实施例4
本示例以结直肠癌原代细胞的药物筛查方法为例进行说明，包括如下步骤：
S1、采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，具体包括：
第一、选取来源于患者的结直肠癌原代细胞，消化、收集细胞，用Mccoy’5a完全培养基重悬调节结直肠癌原代细胞浓度至1×104个/mL，以形成结直肠癌细胞悬液。
第二、将该用于接种的结直肠癌细胞悬液加入96孔U型底培养板，该U型底培养板周围设置有水槽，室温离心后，在U型底培养板中加入含有相应生长因子2.2g/L NaHCO3的Mccoy’5a完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养4天。
第三、吸弃培养基，加入大肠细胞外基质-Matrigel水凝胶，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养，静置30min成胶，以形成肿瘤细胞微球。
S2、在成胶后的结直肠癌原代细胞微球中分别加入空白对照二甲亚砜、含有药物紫杉醇、亚叶酸钙、奥沙利铂、氟尿嘧啶中的一种或几种的含有相应生长因子2.2g/LNaHCO3的Mccoy’5a完全培养基，在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的条件下培养。
S3、检测培养后结直肠癌原代细胞微球的肿瘤细胞活性以及肿瘤细胞迁移，具体如下：
第一、细胞活性检测包括：在第1、3、5、7、10天，提前12h加入细胞活性检测试剂阿尔玛蓝20μL，避光孵育12h后，使用酶标仪进行检测，波长570nm，参照波长600nm，结果见表1。结果显示，环磷酰胺作用后肿瘤细胞活性增长，其他用药组作用后的肿瘤细胞活性均有不同程度降低，包括氟脲嘧啶组、多西他赛组以及紫杉醇作用后的肿瘤细胞活性均降低，其中，多柔比星和氟尿嘧啶组抑制肿瘤细胞活性最明显。
第二、细胞迁移检测包括：在第1、3、5、7、10天，利用配套高内涵三维肿瘤细胞实时成像分析仪器对细胞微球进行全自动化明场拍照，以得到细胞微球图像，并基于图像获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态、细胞直径，再基于细胞形态与细胞直径，经计算分析后得出肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长、多尺度熵等，以得到肿瘤细胞球迁移结果见表1。结果表明，环磷酰胺组作用后的肿瘤细胞球正常增殖，肿瘤细胞直径变大；多柔比星、氟尿嘧啶、多西他赛和紫杉醇用药后细胞球用药后细胞死亡散落。
综上，通过本实施例的高通量肿瘤药物筛查试剂盒检测结直肠癌原代细胞的细胞活性以及细胞迁移状况，从而筛选出针对结直肠癌原代细胞合适的药物，例如：环磷酰胺无效，肿瘤细胞球正常生长，多柔比星明显有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，可以起到一定的效果，氟尿嘧啶有效，肿瘤细胞球外部细胞散落，以及，多西他赛和紫杉醇也均有效，肿瘤细胞球固化。
表1各实施例中的高通量肿瘤药物筛查试剂盒对细胞活性和细胞迁移检测结果
Figure BDA0003727719460000171
本发明的高通量肿瘤药物筛查的方法可用于检测各种肿瘤细胞的细胞活性和细胞迁移状况，进而有效筛查出肿瘤药物，具有较高的临床指导参考价值。
本发明提供一种高通量肿瘤药物筛查的方法与用于高通量肿瘤药物筛查的试剂盒，具有以下有益效果：
第一、本发明采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，操作简单，基于水凝胶形成了细胞培养的基质微环境，无需额外设备和复杂模具即可以高通量、稳定、均匀、可控地生成肿瘤微球，实现体外三维培养，并且水凝胶还提供了观察肿瘤细胞迁移的环境；
第二、本发明的方法能够通过检测肿瘤细胞生长、转移等重要指标，可进行肿瘤药物高通量、高精度筛选，可提高肿瘤药物筛选效率，大大降低肿瘤药物开发过程中的临床前实验费用；
第三、本发明的方法可以应用于肿瘤药物的毒理药理检测，为肿瘤药物研究提供参考数据；
第四、本发明采用的U型底培养板四周设置有水槽，可确保各培养单元处于潮湿的条件下，避免因水分蒸发导致结果数据不准确；
第五、本发明的试剂盒可以提高肿瘤药物的筛选效率，大大降低肿瘤药物开发过程中的临床前实验费用。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高通量肿瘤药物筛查的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球；
在所述肿瘤细胞微球中加入含药培养基进行培养；
对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性和/或细胞迁移进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用加胶U型底法对肿瘤细胞进行三维培养，形成肿瘤细胞微球，包括：
形成肿瘤细胞悬液；
将所述肿瘤细胞悬液加入U型底培养板，所述U型底培养板的每个培养孔中的肿瘤细胞数为5×103个～2×104个；离心处理后在所述U型底培养板中加入完全培养基对所述肿瘤细胞进行培养；
吸弃所述完全培养基，在所述U型底培养板内加入与所述肿瘤细胞相对应的水凝胶培养成胶，以形成肿瘤细胞微球。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水凝胶包括基质胶Matrigel、细胞外基质、天然生物材料、由高聚物形成的水凝胶以及复合水凝胶中任意一者；和/或，所述水凝胶的体积范围为30μL～100μL；和/或，所述水凝胶的杨氏模量范围为0.5kPa～5kPa，1kPa～10kPa，1kPa～30kPa，10kPa～500kPa中任一者。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述复合水凝胶包括水凝胶的单体与光引发剂；其中，所述水凝胶的单体为甲基丙烯酸酰化明胶和弹性蛋白形成的具有生物活性的特异性双网络水凝胶；
所述光引发剂为苯基(2.4.6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养成胶包括：采用波长范围为320nm～480nm的光照射所述U型底培养板30s～300s，并将所述U型底培养板置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％，静置时间范围为20min～40min的条件下培养成胶。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括细胞系肿瘤细胞、患者组织的肿瘤原代细胞、干细胞分化技术制备的肿瘤细胞和利用基因编辑技术制备的肿瘤细胞中任意一者。
7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述含药培养基包括抗肿瘤药物与完全培养基；其中，
所述抗肿瘤药物包括直接作用于DNA的抗肿瘤药物、影响DNA合成的抗肿瘤药物、作用于结构蛋白的抗肿瘤药物、分子靶向抗肿瘤药物以及调节激素的抗肿瘤药物中的一种或多种。
8.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述对培养后的肿瘤细胞微球的细胞活性进行检测，包括：
采用细胞活性检测试剂对培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞活性进行检测；和/或，
所述对培养后的肿瘤细胞微球的细胞迁移进行检测，包括：
获取培养后肿瘤细胞微球中肿瘤细胞的细胞形态与细胞直径；
根据所述细胞形态与所述细胞直径，计算得到所述肿瘤细胞微球的粗糙度、圆率、冗余周长以及多尺度熵中至少一者，以评估所述细胞迁移情况。
9.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其特征在于，所述U型底培养板的四周设置有水槽。
10.一种实现权利要求1至9任一项所述高通量肿瘤药物筛查方法的试剂盒，其特征在于，包括盒体，所述盒体内放置有U型底培养板、培养基、水凝胶、检测试剂；其中，所述U型底培养板四周设置有水槽；以及，
所述盒体内还放置有肿瘤细胞、消化液、磷酸盐缓冲液、血清、生长因子、抗生素中的一种或多种。
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