CN114908006B - 一株格氏乳杆菌及其在降低血尿酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株格氏乳杆菌及其在降低血尿酸中的应用。本发明中的格氏乳杆菌已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22950。本发明格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)可以通过口服进入肠道，并可在肠道内有效降解食物源中嘌呤及其代谢前体物质；该菌株及其制剂对尿酸形成的前体具有广泛的降解作用。

Description

一株格氏乳杆菌及其在降低血尿酸中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及其在降低血尿酸中的应用。
背景技术
健康人体血清中的尿酸水平处于一个动态的范围，其中健康男性血清中的尿酸水平在208unmol/L～428umol/L之间。通常认为，血清中较高的尿酸水平(高尿酸血症)，是引起痛风等疾病的重要原因[1 , 2]。近年的研究亦发现，高尿酸血症亦可增加罹患动脉硬化及慢性肾病(chronic kidney disease)等因不良生活习惯所导致的慢性病(lifestyle-related diseases)的风险[3]。故有效的降低血清中的尿酸水平对高尿酸血症人群具有重要的意义。
临床上对高尿酸血症的治疗，除采用抑制尿酸合成(别嘌醇、非布司他)的药物及增加尿酸排泄(苯溴马隆、丙磺舒)的药物外，避免高嘌呤食物的摄入亦是降低血清中尿酸水平的有效方法[4，5，6]。
尿酸在血液中的合成途径如图1.所示。如图1.可知，血液中尿酸的合成前体为黄嘌呤，而黄嘌呤通过鸟嘌呤、黄嘌呤核苷及次黄嘌呤这三种代谢中间产物生成，而这三种代谢产物及其前体，例如肌酐、次黄苷酸及鸟嘌呤核苷等，均广泛存在于食物中，并可以被肠道所吸收，故认为在肠道中减少尿酸及其前体的摄入水平，既可以改善血清中的尿酸水平。
在日本，推荐的对痛风及高尿酸血症患者饮食中嘌呤的摄入量为<400mg/day[7]。因为嘌呤广泛存在于动植物细胞中，故精确限制嘌呤摄取极其困难。此外，嘌呤摄取的限制还需限制次黄嘌呤核苷等的摄取，由此削弱了食物的风味，结果导致人们很难长时间遵循嘌呤限制的膳食。因此，若能在肠道内降低食物中嘌呤的水平，减少人体对嘌呤的吸收则对降低血清中的尿酸水平具有重要的意义。
日本明治乳业曾首先发现特定的乳酸菌具有降解尿酸代谢前体的功能，并发现可降解肌苷及鸟嘌呤核苷酸的特殊菌株存在于：发酵乳杆菌MEP181504(Lactobacillusfermentum)、短乳杆菌EMP181507(Lactobacillus brevis)、口乳杆菌NITE P-223(Lactobacillus oris)及格氏乳杆菌JCM8787(Lactobacillus gasseri)等种水平；除此亦发现发酵乳杆菌MEP 181504(L.fermentum)及短乳杆菌MEP 181507(L.brevis)亦具有分解次黄嘌呤及鸟嘌呤的能力(特開2013-48636(P2013-48636A)。日本雪印乳业进一步研究亦发现，格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、假双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌及动物双歧杆菌中的一些特定菌株亦存在降解鸟嘌呤核苷酸、肌苷及腺苷的功能(JP 2017-31102A)。但值得注意的是，上述公司所报道的菌株降解肌苷及鸟嘌呤核苷酸的产物为次黄嘌呤及鸟嘌呤，虽降解率可达到90％以上，但其降解产物(次黄嘌呤、鸟嘌呤)并不能进一步降解，而这两种物质亦可以被人体所吸收并作为尿酸合成的前体(见图1.)，故这些物质的产生并不利于血尿酸水平的降低。
江苏微康生物近期亦报道了其具有较强的降解腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠能力的菌株，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG08，但与前述报道一样，该菌亦不能降解次黄嘌呤及鸟嘌呤(CN 110747146 A)。
综上所述，现有已报到菌株虽然可以较为高效的将肌苷及鸟嘌呤等尿酸前体降解为次黄嘌呤及鸟嘌呤，但是因为其不具有进一步降解产物的能力，导致次黄嘌呤及鸟嘌呤积累，而这两种物质亦可被人体转化为黄嘌呤进而转化为尿酸，故上述菌株难以从根本上降低嘌呤总量。
参考文献
1.Benedict,J.D.；Forsham,P.H.；Stetten,D.,Jr.The metabolism of uricacid in the normal andgouty human studied with the aid of isotopic uricacid.J.Biol.Chem.1949,181,183–193.2.Garrel,D.R.；Verdy,M.；PetitClerc,C.；Martin,C.,Bruke,D.；Hamet,P.Milk-and soy-proteiningestion:acute effect onserum uric acid concentration.Am.J.Clin.Nutr.1991,53,665–669.3.Becker,M.A.；Chohan,S.We can make gout management more successful now.Curr.Opin.
Rheumatol.2008,20,167–172.
4.Choi,H.K.；Atkinson,K.；Karlson,E.W.；Willett,W.；Curhan,G.Purine-RichFoods,Dairy andProtein Intake,and the Risk of Gout in Men.N.Engl.J.Med.2004,350,1093–1103.
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6.Villegas,R.；Xiang,Y.B.；Elasy,T.；Xu,W.H.；Cai,H.；Cai,Q.；Linton,M.F.；Fazio,S.；Zheng,W.；Shu,X.O.Purine-Rich Foods,Protein Intake,and the Prevalenceof Hyperuricemia:TheShanghai Men’s Health Study.Nutr.Metab.Cardiovasc.Dis.2012,22,409–416.
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发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一株格氏乳杆菌及其在肠道内降低血尿酸中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一株格氏乳杆菌，该菌株为格氏乳杆菌SYP-B4432(BKR-007)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.22950，保藏日期2021年7月26日。
所述格氏乳杆菌培养于MRS培养液中，在37℃下培养保存。
一种格氏乳杆菌的应用，所述格氏乳杆菌在降低血尿酸中的应用。
一种降低血尿酸的制剂，制剂为含所述的格氏乳杆菌。
所述制剂含有该菌株的培养物、培养菌悬液、发酵液或前述灭活后物质。
所述制剂中格氏乳杆菌于MRS培养液中，在30-37℃培养OD600nm至1.2。
所述制剂为以所述的格氏乳杆菌作为活性成分配以辅料制备片剂、胶囊剂、口服液、冻干粉中的一种或几种口服制剂。
一种降低血尿酸的制剂的应用，所述制剂在在降低血尿酸中的应用。
所述制剂在在降低血尿酸以及广泛的尿酸前体中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)可以通过口服进入肠道，并可在肠道内有效降解食物源中嘌呤及其代谢前体物质；该菌株及其制剂对尿酸形成的前体具有广泛的降解作用，与已知专利菌株相比，除可降解鸟嘌呤核苷酸、肌苷外，尤其对鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤、次黄核苷酸、鸟嘌呤、黄苷酸、尿酸具有极强的降解能力，同时亦对黄嘌呤及黄嘌呤核苷亦具有一定的降解能力与已经报道的具有降解尿酸及其部分前体的菌株相比(表3.)，菌株可以良好的降解尿酸的直接前体次黄嘌呤(Hypoxanthine)，其转化率可达99％，而其它菌株不能将其降解。此外，菌株具有降解黄苷(Xanthosine)及黄嘌呤(Xanthine)的能力，其转化率分别为21％及44％，而其它菌株未见报道对这两种底物的转化能力。
附图说明
图1为血液中尿酸的合成途径图.信息来源为KEGG Purine metabolism-Homosapiens(human)and Mus musculus(mouse).在这一代谢过程中,人体不能将尿酸进一步降解,而在其它生物体内(小鼠),则可将尿酸进一步的降解为尿囊素(虚线表示。
图2为本发明实施例所述的在不同时间下格氏乳杆菌对尿酸及其尿酸代谢前体的转化率图；其中，纵轴0.0至1.0代表转化率0％至100％。
图3A为本发明实施例提的格氏乳杆菌在人工胃液的衰减情况图；其中纵轴0.0至1.0代表转化率0％至100％。
图3B为本发明实施例提的格氏乳杆菌在人工肠液中的衰减情况；其中纵轴0.0至1.0代表转化率0％至100％。
图4为本发明实施例提的格氏乳杆菌连续35天喂食大鼠血清中尿酸的含量图。
图5为本发明实施例提的连续喂食35天停药后大鼠血清中尿酸的含量图。
图6为本发明实施例提的摄取高嘌呤食物后菌株对人体血清中尿酸水平的影响；其中图6A.为对照组,为12名志愿者摄取高嘌呤食物前,不食用菌株后1～4h血清中的尿酸浓度曲线；图6B.为12名志愿者在摄取高嘌呤食物前,补充3×1010CFU剂量的菌株,在进食2h血清中的尿酸浓度曲线；图6C.为12名志愿者在摄取高嘌呤食物前,补充1×1010CFU剂量的菌株,在进食2h血清中的尿酸浓度曲线；图6D.为图6A～C中每组志愿者在同一时间下血尿酸的平均值比较结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明菌株具有广泛的嘌呤代谢能力，其能降解次黄嘌呤及鸟嘌呤，以及其进一步代谢产物黄嘌呤及尿酸均可以被有效降解，故可以从根本上降低食物源中的嘌呤总量进而减少人体对这些尿酸前体的吸收。
实施例1菌株BKR-007的生理功能发现、鉴定及遗传稳定性分析：
本发明菌株BKR-007即为菌株SYP-B4432，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.22950，保藏日期2021年7月26日。
将上述菌株接种于MRS培养基，37℃培养至OD600为1.2，培养后的发酵液每2ml装于离心管，4000rpm离心10min，弃上清液回收菌体，待用。
分别将30mg次黄嘌呤(Hypoxanthine)、鸟嘌呤(Guanine)及黄嘌呤(Xanthine)分别溶解于100ml pH 7.0的PBS缓冲液中，制备反应溶液。
将上述反应溶液分别加入上述弃上清液的含有菌体沉淀的离心管中(对照组用等体积的PBS替代菌体)，每管加0.75ml反应液，重悬菌体后，37℃震荡孵育60min，孵育结束时加入30ul 0.1mol/L HClO4终止反应，并12000rpm离心15min取上清液进行HPLC色谱分析。
用KH2PO4(20mmol/L，pH 6.0)：甲醇＝95:5为流动相进行等度洗脱，柱温25℃，流速1ml/min，洗脱时间15min。(安捷伦1260液相色谱仪，ZORBAX XDB-C18，150×4.6mm，检测器为DAD)。
基于HPLC实验组与对照组峰面积的的比率，进一步利用如下公式计算20个菌株对尿酸代谢前体的降解率。
降解率＝(1-实验组峰面积/对照组峰面积)×100％
对于次黄嘌呤(Hypoxanthine)、鸟嘌呤(Guanine)及黄嘌呤(Xanthine)这三种不同的底物，筛选出对这三种底物均具有转化能力的菌株SYP-B4432。体外反应1h内，对次黄嘌呤的降解率为98.5％，黄嘌呤为44.0％，对鸟嘌呤的降解率为44.5％。
将上述获得菌株经16S rDNA鉴定，
16S rDNA鉴定所采用通用引物为：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
菌株DNA经PCR扩增后，送至送上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)对所测序列进行相似度比对，进而确定其种属。
菌株经16s rDNA鉴定为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)SYP-B4432(BKR-007)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.22950，保藏日期2021年7月26日。
2)遗传稳定性分析及生理生化特征：
将上述分离获得菌株于MRS平板上按照常规方式进行连续传代10次，利用GenIII微孔板，通过对94个不同生化试验所提供的表型进行检测，并通过Biolog鉴定系统(Microlog-M，MicroStation，
Figure GDA0004218282720000051
)中的软件，通过读取GenIII微孔板上所表现出的表型图谱来对本菌株进行鉴定。通过Biolog鉴定系统分别对第一代F1及第十代F10的表型进行鉴定及比较，结果如表2.及表3.所示。
结果提示，第一代菌株F1及第十代菌株F10在对碳源的利用特征及其化学敏感度特征均未发生改变，证明本发明菌株SYP-B4432具有稳定的生理及遗传学特征。
菌株BKR-007的主要特征为：
(1)弱利用的糖类为：D-半乳糖醛酸、密二糖、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖醛酸、3-甲酰葡糖、D-果糖、L-果糖、D-果糖-6-磷酸、L-鼠李糖。
(2)强利用的糖类为：糊精、a-D-葡糖、果胶、a-D-乳糖、D甘露糖、D-麦芽糖、D-果糖、D-海藻糖、b-甲酰-D-葡萄糖、D-半乳糖、L-乳糖、D-纤维二糖、D-水杨苷、龙胆二糖、N-乙酰-D-葡萄糖、葡糖醛酰胺、蔗糖、N-乙酰-b-D甘露糖胺、D-松二糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、乳酸钠。
(3)盐耐受性：1％NaCl溶液中生长优于4％NaCl溶液，8％浓度NaCl中不可生长。
(4)PH耐受：pH6.0时生长优于pH5.0。
表1.菌株BKR-007碳源利用实验的表型结果.其中F1为第一代菌株,F10为第十代菌株.F10为第十代菌株.其表型结果一致,提示该菌株具有遗传稳定性.菌株BKR-007提取自6个月婴儿粪便，母乳喂养，无抗生素及益生菌服用史.
Figure GDA0004218282720000061
注：上述表格中w为弱阳性，+为阳性，-为阴性。
表2.菌株BKR-007化学敏感性实验的表型结果.其中F1为第一代菌株,F10为第十代菌株.其表型结果一致,提示该菌株具有遗传稳定性.
Figure GDA0004218282720000062
Figure GDA0004218282720000071
注：上述表格中w为弱阳性，+为阳性，-为阴性。
实施例2菌株BKR-007体外降解尿酸及其它前体的能力：
基于尿酸代谢途径图1.所示，除黄嘌呤(Hypoxanthine)、鸟嘌呤(Guanine)及黄嘌呤(Xanthine)这三种尿酸代谢产物，亦存在鸟嘌呤核苷酸(Guanylic acid)、鸟嘌呤核苷(Guanosine)、黄苷酸(Xanthylic acid)、次黄苷酸(Inosinic acid)、肌酐(Inosine)及黄嘌呤核苷(Xanthosine)等其它尿酸代谢前体，故本发明拟利用菌株SYP-B4432对尿酸(Urate)及上述尿酸代谢前体进行反应，考察其体外对这些物质的降解能力。
将保存于甘油管的菌株BKR-007接种于MRS培养基，37℃培养至OD600为1.2，培养后的发酵液每2ml装于离心管，4000rpm离心10min，弃上清液回收菌体。
分别将30mg的次黄嘌呤(Hypoxanthine)、鸟嘌呤(Guanine)、黄嘌呤(Xanthine)、鸟嘌呤核苷酸(Guanylic acid)、鸟嘌呤核苷(Guanosine)、黄苷酸(Xanthylic acid)、次黄苷酸(Inosinic acid)、肌酐(Inosine)、黄嘌呤核苷(Xanthosine)及尿酸(Urate)各自溶解于100ml pH 7.0的PBS缓冲液中，制备反应溶液。
将上述反应溶液分别加入含有菌体沉淀的离心管中(对照组用等体积的PBS替代菌体)，每管加0.75ml反应液，重悬菌体后，37℃震荡孵育60min，孵育结束时加入30ul0.1mol/L HClO4终止反应，并12000rpm离心15min取上清液进行进一步分析。
(1)对次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、尿酸的检测采用质谱法测定代谢物的浓度。质谱条件如下：三重四级杆质谱仪(Agilent 1290系列)，反相色谱柱：Dikma spursil C18-EP，流速1mL/min，柱温25℃，测定波长254nm，进样20μL，流动相：A相为10mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇溶液，梯度程序设置如下：0min，1％B；20min，70％B；22min，95％B；24min，1％B；30min，1％B。
(2)对其它底物的检测，采用HPLC色谱进行分析，条件如下：用KH2PO4(20mmol/L，pH6.0)：甲醇＝95:5为流动相进行等度洗脱，柱温25℃，流速1ml/min，洗脱时间15min。(安捷伦1260液相色谱仪，ZORBAX XDB-C18，150×4.6mm，检测器为DAD)基于HPLC实验组与对照组峰面积的的比率，进一步利用如下公式计算菌株对尿酸以及尿酸代谢前体(共10个)的降解率。
降解率＝(1-实验组峰面积/对照组峰面积)×100％
实验结果见图2.所示；同时与现阶段公开菌株进行对比(参见
表3)。
Figure GDA0004218282720000091
由图2.可知，本发明菌株BKR-007除对次黄嘌呤(Hypoxanthine)、鸟嘌呤(Guanine)及黄嘌呤(Xanthine)这三种尿酸代谢产物具有降解能力，亦对鸟嘌呤核苷酸(Guanylic acid)、鸟嘌呤核苷(Guanosine)、黄苷酸(Xanthylic acid)、次黄苷酸(Inosinic acid)、肌酐(Inosine)及黄嘌呤核苷(Xanthosine)等其它尿酸代谢前体也具有突出的降解能力。
与已经报道的具有降解尿酸及其部分前体的菌株相比(表3.)，菌株BKR-007可以良好的降解尿酸的直接前体次黄嘌呤(Hypoxanthine)，其转化率可达99％，而其它菌株不能将其降解。此外，菌株BKR-007具有降解黄苷(Xanthosine)及黄嘌呤(Xanthine)的能力，其转化率分别为21％及44％，而其它菌株未见报道对这两种底物的转化能力。
实施例3菌株BKR-007对模拟胃液及胆盐的耐受能力分析
人工模拟胃液：取稀盐酸16.4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g(100N.F.U/mg)，摇匀后，加水稀释至1000ml。考虑到胃在用餐前后pH变化(1.5-4.5)，分别取人工胃液调pH1.5，2.5，3.5，4.5。
人工模拟肠液：即磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH 6.8)。取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节p H值至6.8；另取胰酶10g(250N.F.U/mg)，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml。考虑到人体小肠中胆汁盐含量在0.03％-0.3％内波动，分别设计胆汁盐浓度在0.03％，0.1％，0.2％，0.3％。
取20ml上述实施例2培养获得菌液，4000g，4℃，离心5min，弃上清后，用不同PH值的人工胃液各20ml(PH为1.5，2.5，3.5，4.5)、不同胆汁盐浓度的人工肠液(胆汁盐浓度0.03％，0.1％，0.2％，0.3％)各20ml分别配置不同的悬浮菌体，反应0min,15min,30min,60min,90min，120min,180min取样并稀释至106后取100μ涂布于MRS固体培养基，37℃厌氧培养。实验结果见图3。
由图3A和图3B结果提示，菌株BKR-007在不同pH下的人工胃液中保持3h，其存活率分别为22.7％(pH1.5)、48.3％(pH2.5)、59.2％(pH3.5)、67.6％(pH4.5)；在不同胆盐浓度下处理3h，其存活率分别为45.4％(0.03％胆盐)、36.5％(0.1％胆盐)、9.1％(0.2％胆盐)、0％(0.3％)。证明其可穿过胃液进入肠道。
实施例4菌株BKR-007对Caco-2细胞的粘附性能分析
将上述实施例2培养好的菌株BKR-007于4000rpm、4℃离心15min，收集菌体用PBS缓冲液洗涤3次，再用DMEM调节菌液浓度至109CFU/mL，将菌悬液加入到已培养好的Caco-2单层细胞中，37℃共培养2h，再用甲醇固定30min后染色，在电镜下观察20个视野100个细胞，计算菌株BKR-007对细胞的粘附力，该菌粘附能力平均可达18.5±0.5个/细胞。
实施例5菌株BKR-007干预大鼠高血尿酸血症的影响及其在大鼠体内的定值
将保存于甘油管的菌株BKR-007接种于MRS培养基，37℃培养至OD600为1.2，培养后的发酵液装于离心管，4000rpm离心10min，弃上清液回收菌体。利用生理盐水将菌体重悬至所需浓度制成菌液备用。
高尿酸大鼠模型采用给大鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立，实验动物采用雄性Wistar大鼠60只，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机将其平均分成6组，每组实验条件如表4.所示：
如表4.所述，老鼠全天自由进食高嘌呤食物，每天上午对大鼠进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，每天晚间灌胃可降低或潜在降低尿酸水平的药物及菌液。每7天清晨(高尿酸造模前)检测其血清中的尿酸水平，连续进行35天，实验结果如图4.所示。
表4.菌株BKR-007对高尿酸血症大鼠作用的实验条件.各组每7天进行血清检测其体内尿酸水平,连续进行35天,之后3～6组晚间停药只灌注生理盐水,每14天进行血清检测其体内尿酸水平,连续进行28天.
Figure GDA0004218282720000111
由图4.可知，健康大鼠具有尿酸代谢能力,在连续喂食高尿酸食物后其血清中尿酸浓度较为平稳(Blank control),平均为77.17umol/L；在注射氧嗪酸钾抑制尿酸代谢后,其血尿酸水平持续维持在较高水平(Negative control),平均可达到195.47umol/L,证明造模成功；在尿酸抑制剂别嘌醇的作用下,大鼠血尿酸可迅速降低至95.46umol/L，接近健康大鼠水平(Positive control)；在高浓度益生菌灌胃下,于第21天大鼠血尿酸水平达到平稳水平134.63umol/L(High concentration group)，其降尿酸能力低于别嘌醇组；在低浓度益生菌灌胃下,于第28天大鼠血尿酸水平达到平稳水平136.97umol/L(Lowconcentration group)；同时亦发现喂食死菌体大鼠血尿酸持续维持在188.80umol/L,对大鼠没有明显的降低血尿酸的效果(Inactivated group).
第一阶段完成后，停止灌胃别嘌醇、活菌株及死菌株，以生理盐水替代，连续培养老鼠28天，每两周检测其血清中的尿酸水平，实验结果如图5.所示。
如图5.可知，喂食高尿酸食物的健康大鼠(Blank control),注射尿酸代谢抑制剂的高尿酸大鼠(Negative control)及喂食死菌组(Inactivated group)在停药(菌)后,其血尿酸水平与停药(活菌)前没有显著变化,分别为:70.77umol/L,194.17umol/L及194.5umol/L.阳性对照别嘌醇组(Positive control)在停药后,大鼠血清中尿酸水平迅速升高并达到194.67umol/L,与不加药的阴性对照组(Negative control)相当。而喂食高浓度(High concentration group)及低浓度(Low concentration group)菌株的大鼠在停止喂食菌株后，连续28天,其体内尿酸水平均较阴性对照组为低，分别为156.00umol/L及165.33umol/L,提示与抗尿酸药别嘌醇不同，菌株BKR-007可在大鼠肠道中定植并持续发挥降尿酸作用。
实施例6菌株BKR-007冻干粉对健康人体血清中尿酸水平的影响
将保存于甘油管的菌株BKR-007接种于MRS培养基，37℃培养至OD600为1.2，培养后的发酵液装于离心管，4000rpm离心10min，弃上清液回收菌体。
将上述菌株作为活性成分，并匹配辅料，主要辅料为：海藻糖(10％w/w)、脱脂乳粉(8％w/w)、麦芽糊精(5％w/w)、维生素C(0.5％w/w)及蔗糖(2％.w/w)制备冻干粉菌剂。
将按上述比例将各辅料混合溶解于无菌水后115℃灭菌30min，冷却后与所收集的菌体以质量比为2：1混合冻干。
冻干后的菌粉经稀释涂布测出活菌数，与麦芽糊精调配成2.5×109CFU/g及7.5×109CFU/g的菌粉，并进行包装成袋(2g/袋)。
36名健康志愿者的招募来自于中国辽宁省沈阳市，选取年龄为20～55岁，清晨空腹血清尿酸值为208～428umol/L，无高尿酸血症病史，无其它严重疾病史(如糖尿病、高血压及其它心脑血管疾病)，无乳清蛋白过敏史。
作为实验期间的限制，从实验的开始日至结束日均禁止使用或摄入可能会影响本实验的营养辅助品、健康食品、医药品或医药外品等(例如，苯溴马隆，阿洛普林，丙磺舒和非布索坦药物，利尿剂，阿司匹林和其他通用药物)。在实验期间，按照指示摄入每日规定量的实验食物。
本实验严格按照国际药理学临床伦理审查委员会的要求，受试者基于《赫尔辛基宣言》的伦理原则，遵守流行病学研究的伦理准则，充分知晓了目的、内容，方法等后，签署了书面同意。
36名健康志愿者基于相似的年龄及血尿酸水平，平均分为三组。其中A组为对照组，所食用的产品中不加含菌株BKR-007冻干粉菌剂(以麦芽糊精填充，2g/袋共两袋)；B组为菌株BKR-007冻干粉菌剂高剂量摄入组,单次摄入活菌剂量为3×1010CFU(填充1.5×1010CFU/g的菌粉，2g/袋共两袋)，C组为菌株BKR-007冻干粉菌剂低剂量组，单次摄入活菌剂量为1×1010CFU/g(填充0.5×1010CFU/g的菌粉，2g/袋共两袋)。
36名健康志愿者所摄入的高嘌呤饮食的主材为：白带鱼(367mg/100g)200g，蚌蛤(421mg/100g)200g，鸡肝(298mg/100g)100g。辅料为青椒，或萝卜，主食为米饭。其单次饮食嘌呤摄入量约为1.9g。
所有健康志愿者于实验前一天晚上20：0后禁食，7：30吃早餐，以鸡蛋、牛奶及白米粥等为主食。至中午11：00A、B、C三组采集第一管静脉血，11：30A、B、C三组分别摄入各自冻干粉，并利用30min摄入高嘌呤饮食。12：00开始，每1h采集静脉血，持续4h至实验完成。
各组志愿者血清中尿酸的变化水平如图6.所示。
图6.A～C分别为对照组(不摄入菌株BKR-007)、高剂量摄入组(3×1010CFU)及低剂量摄入组(1×1010CFU/g)的各个健康志愿者(12人/组)在0～4h中血清尿酸代谢曲线。其中对照组(图6.A)12名健康志愿者在进食后血清中尿酸于2h达到峰值,并维持至3h,至4h基本达到初始水平；高剂量摄入组(图6.B)12名健康志愿者在虽在进食2h血清中尿酸水平达到顶峰，在第3h即发生明显回落；低剂量摄入组(图6.C)12名健康志愿者在血清中尿酸于2h达到高峰后，3h开始回落但回落速度低于高剂量组。
通过对对照组、高剂量组及低剂量组各组12名志愿者同一时间下血尿酸的平均值比较(如图6.D)可知，菌株BKR-007可在进食高嘌呤食物后，显著降低血清中的尿酸峰值，其中高剂量组进食2h血清中平均尿酸浓度为361umol/L,3h血清中平均尿酸浓度为346umol/L，低剂量组2h为376umol/L，3h为362umol/L，分别较对照组2h的385umol/L及3h的378umol/L降低了6.13％(2h)，8.56％(3h)及2.19％(2h)，4.10％(3h)。
该结果提示，在服用菌株BKR-007后，可以缓解因进食高嘌呤食物而造成的血清中尿酸水平的一过性增高。

Claims (6)

1.一株格氏乳杆菌，其特征在于：该菌株为格氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.22950，保藏日期2021年7月26日。
2.根据权利要求1所述的格氏乳杆菌，其特征在于：所述格氏乳杆菌培养于MRS培养液中，在37 ℃下培养保存。
3.一种降低血尿酸的制剂，其特征在于：制剂为含权利要求1所述的格氏乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的降低血尿酸的制剂，其特征在于：所述制剂含有该菌株的培养菌悬液。
5. 根据权利要求4所述的降低血尿酸的制剂，其特征在于：所述制剂中格氏乳杆菌于MRS培养液中，在35-39 ℃培养OD600nm至1.2。
6.根据权利要求3所述的降低血尿酸的制剂，其特征在于：所述制剂为以权利要求1所述的格氏乳杆菌作为活性成分配以辅料制备片剂、胶囊剂、口服液、冻干粉中的一种或几种口服制剂。
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