CN114903030A - 一种活性有核细胞的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种活性有核细胞的保存方法，所述方法包括以下步骤：步骤1、活性有核细胞样本的制备：组织样本采用红细胞裂解液或基于密度原理的密度梯度离心液，以去除红细胞等非有核细胞；步骤2、活性有核细胞沉降与吸附：将含有活性有核细胞的细胞悬液滴加到包被有带电荷物质的载体上，进行沉降，吸附；步骤3、固定：使用醛类或醇类固定剂或其组合固定上述沉降并吸附到载体上的细胞。步骤4、保存：对固定后的载体进行冷藏或冷冻保存。

Description

一种活性有核细胞的保存方法

技术领域：

本发明主要涉及活性有核细胞的保存方法，包括有核活性细胞样本制备与配套载体的修饰方法，结合使用了电荷吸附、活细胞沉降、层层包被的方法，达到无损、全面、温和、经济地保存活性有核细胞的目的。

背景技术：

根据经济合作与发展组织(OECD)的定义，“生物样本库(Biobank)是一种集中保存各种人类生物材料(Human biological material)，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统”。这些生物样本库(Biobank)为血液病、免疫系统疾病、糖尿病、恶性肿瘤等重大疾病的研究起到了非常重要的推动作用。

有核细胞的样本制备与保存是生物样本库非常重要的组成部分。目前最常用的方式，是采用液基细胞学或超低温冷冻法。液基细胞学是脱落细胞学的一部分，是把按传统方式难以处理的脱落细胞学标本放入一种中介的液体中去，以去除血液、粘液等影响诊断的干扰成分，达到提高诊断率的目的。处理方法包含离心法、自然沉降法和膜式负压吸引法。离心法因采用较高的转速使细胞瞬间与玻片接触，会导致绝大部分的细胞丢失，仅能留存少量样本信息；自然沉降法，虽然方式非常温和，但因载体的吸附结合能力不足，同样会造成绝大多数细胞难以有效吸附。或需采用高温结合长时间沉降的方式，但这种方式首先是会造成细胞状态的严重变化与信息失真，其次也会导致较长的处理时间，难以应对样本库制备所需的简单、方便、快速的要求；膜式负压吸引法，采用过滤膜结合负压的方式过滤保留细胞，亦会造成粒径或者刚性较小的细胞大量流失。而超低温冷冻法，是采用-80℃及以下的低温条件对获取的细胞进行冷冻保存，存在着复温后细胞损失、保存条件严苛的劣势。

以上两种常规方法，在完整完全保存样本信息、保存条件要求等方面均存在一定的缺陷。尤其是针对样本中极其微量的细胞及其信息，存在非常大的损失风险。

针对以上的缺陷，本发明拟采用简单的大分子量带电物质层层包被的修饰手段，联合特定的样本制备方法，达到有核活性细胞温和、快速、低成本、长效的制备与保存效果。

发明内容：

本发明提供一种活性有核细胞保存方法，所述保存方法，包括将活性有核细胞用包被有正电荷的载体吸附的步骤，所述方法可以便捷、高效、完整、长期、低成本地达到活性有核细胞样本保存的目的。

为此，本发明提供一种活性有核细胞保存方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、活性有核细胞样本的制备：组织样本采用红细胞裂解液或基于密度原理的密度梯度离心液，以去除红细胞等非有核细胞；

步骤2、活性有核细胞沉降与吸附：将含有活性有核细胞的细胞悬液滴加到包被有带电荷物质的载体上，进行沉降，吸附；

步骤3、固定：使用醛类或醇类固定剂或其组合固定上述沉降并吸附到载体上的细胞；

步骤4、保存：对固定后的载体进行冷藏或冷冻保存；

其中，步骤1所述细胞等渗溶液，选自：PBS、生理盐水、等渗葡萄糖液、Hanks、D-Hanks等；其中，步骤2所述稀释倍数，在定量检测的应用场景下可达到的效果是，具体细胞密度为100-700000个/cm²，其中，步骤2所述沉降步骤，时间具体为10-50分钟；其中，步骤3所述固定，采用醛类或醇类固定剂，可单独类别使用或两种类别混用。优选地，为两种类别混用。更优选地，为先使用醛类固定剂、再使用醇类固定剂。

本发明的核心技术在于提供步骤2所述的包被有带电荷物质的载体及其制备方法，所述的包被有带电荷物质的载体其为一种包被带电荷物质并经过羟基化修饰的载玻片，其中所述载玻片材质选自：玻璃、石英、PDMS等；所述羟基化修饰，为向载玻片分子中引入羟基的步骤，选自：使用等离子体清洗、酸洗、过氧化物清洗、碱洗载玻片等的步骤；所述带电荷物质，选自分子量大于等于20000的带正电荷或带负电荷的物质，优选分子量40000-80000的带正电荷或带负电荷的物质；所述包被，其方法包括先将载体用带正电荷物质包被，再将载体用带负电荷物质包被的步骤，重复该步骤2-8次，最后再包被一层带正电荷物质。

本发明所述包被有带电荷物质的载体的制备方法，其中，所述羟基化方法优选为暴露于O₂等离子体中。

所述带电荷物质选自：聚乙烯亚胺(PEI)，PLL，聚对苯乙烯磺酸钠(PSS)，PAH，PLGA，PDDA，PVAM，PVA，Chitosan，PAA，HA，AlG，DeX等。优选的，所述带正电荷物质是聚乙烯亚胺，带负电荷物质是聚对苯乙烯磺酸钠。

其中，所述包被优选是带正电荷物质聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度0.01-5％的溶液中涂布于被羟基化的载体表面，再将配制好的浓度为0.01-5％聚对苯乙烯磺酸钠溶液涂布于已经涂布聚乙烯亚胺的载体表面。优选聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度0.01-2％的溶液，聚对苯乙烯磺酸钠配制成重量百分浓度0.01-2％的溶液。最优选的其中，聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度1％的溶液，聚对苯乙烯磺酸钠配制成重量百分浓度1％的溶液。

其中，所述包被是先将带正电荷物质涂布于载体上，其方法是将载体表面用带正电荷物质溶液浸润(或喷涂)不少于10秒，优选1-10分钟，更优选2-4分钟，然后再将带负电荷物质涂布于载体上，其方法是将载体表面用带负电荷物质溶液浸润(或喷涂)不少于10秒，优选1-10分钟，更优选2-4分钟，为一个循环，一个循环内可包含必要的清洗步骤，如此反复3-8次，优选3-6次，更优选3-4次；最后一次再采用带正电荷物质溶液浸润不少于3分钟，优选4-10分钟，更优选4-5分钟。

本发明所述包被有带电荷物质的载体的制备方法，最优选的制备方法如下

1)标准级载玻片，在50W，70mTorr条件下暴露于O₂等离子中5min；

2)等离子体处理后的载玻片，使用分子量70000的重量百分比为1％的聚乙烯亚胺水溶液浸润5min，用水冲洗；

3)再使用分子量80000的重量百分比为1％的聚对苯乙烯磺酸钠水溶液浸润5min，用水冲洗；

4)重复步骤2)，3)的操作2次，最后使用分子量70000的重量百分比为1％的聚乙烯亚胺水溶液浸润5min，晾干。

本发明在对载体进行电荷包被的过程中发现，采用单次正电荷的包被方式，一是吸附能力不足，远不能达到理想的全面完整保留有核活细胞信息的目的，且在后续处理中已吸附的细胞不耐冲洗易损失；二是单次包被的载体很快会效力降低，货架期较短。但选用合适分子量的带电物质及其组合，采用层层包被的方式包被，最外层同样包被正电荷物质，结合本发明中的样本制备方法，可以起到意想不到的理想效果，包括90％以上的活细胞吸附效果、可长时间保存(已至26个月)、耐受极端清洗条件不解离(自来水直接冲洗24小时无损失)、载体保存条件简单(密封保存)与活性长期不变(已至26个月)等。究其原因，即大分子量的带电物质，经过三次及三次以上的组装后，最外层包被带正电荷物质的载体，形成了粗糙化的表面，形成了特殊的拓扑形貌，利于活性细胞的静电吸附与驱化黏连、纳米匹配的多因素综合作用。其中粗糙程度的影响因素具体为：1.控制正负电荷分子量：正负电荷分子量越大，形成的表面粗糙程度大；2.包被的层数，粗糙度一般会随包被层数的增加而增加。

本发明通过本发明的操作步骤，形成了载体上包被带正电荷物质的粗糙表面，其可以用以下参数中的任意一个进行定义：

1、表面粗糙度，介于0.02-1um之间。

2、显微放大倍数100倍情况下，镜下可见粗糙颗粒。

本发明意料之外的作用是相较于国内外已知的类似产品(Paul Marienfeld，0900000)，同样条件下本发明可以用更温和的条件(室温vs 37℃)、更短的反应时间(10-15分钟vs 40-60分钟)达到类似的效果。更温和条件可以有效避免高温带来的活性细胞损伤，更短的反应时间可以提高样本制备的效率。另外，以上提到的国外类似产品也存在保存条件较为苛刻的问题，需要单个载玻片以浸润的方式在特定保护溶液中保存，才能保证其有效性。极大的限制了大规模应用的前景，也会对生产、包装、储运、环境等造成较大的压力。

另外，本发明制得的耗材成本也远低于进口同类产品(Paul Marienfeld，0901000)，相差几十倍之多，使得整个方法的经济价值也十分突出，非常有利于有核活性细胞样本的大规模制备与长期保存，将有力地推动免疫类、恶性肿瘤类、心脑血管类疾病的早期诊断、疗效判断、预后等，对多种疾病的提前预测与防治，乃至于发生发展的机制研究、新型药物的研发等，都具有极大的现实与潜在的意义。

以下是对本发明名词术语的解释

组织样本：生物器官、组织、体细胞等构成的样本。

有核细胞：指有细胞核的细胞。

活性有核细胞：指具备生物活性、有细胞核的细胞。

非有核细胞：指没有细胞核结构的细胞。

细胞等渗溶液：指与细胞正常生存环境相匹配的，具备恒定范围渗透压的溶液。

酶解、超声、物理剪切等方式进行前处理：本文中特指采用生物酶降解、超声波破碎、物理剪切等方式，对组织形式的样本进行均质化的处理，使其尽可能变成较为分散的状态。

活性有核细胞沉降与吸附：指对具备生活活性、有细胞核的细胞，利用其在细胞膜完整的情况下密度比介质溶液大的特点，使其能够自然下沉到载体表面与之接触，再利用活细胞表面细胞膜带负电荷等特点与载体相吸附、粘合在一起。

固定：利用物理及/或化学方法，使被固定物保持形貌、保持稳定的蛋白状态的处理方法与手段。

羟基化修饰：指向化合物分子中引入羟基的反应。

本发明的优点：

1、对有核活细胞粘附能力强，在利于保持活细胞状态的温和处理条件下回收率/剩余率明显高于现有技术产品，且能够耐受后续的清洗、免疫荧光染色等下游的处理而不解离；

2、规定保存条件下，已制备的有核细胞样本长时间保存效果无影响；

3、本发明涉及的载体工艺简单、保存条件简单、货架期长、成本适合。

具体实施方式(下列实施例意为示例而非限制本发明)：

实施例1

包被有带电荷物质的载体的制备：

1)标准级载玻片(CITOTEST，80302-0004)用等离子体处理，步骤如下：

暴露于O₂等离子中5min(50W，70mTorr)。

2)等离子体处理后的载玻片，使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝1800、10000、20000、70000)水溶液浸润5min，用水冲洗。

3)使用1％聚(对苯乙烯磺酸钠)(OKA，XW90029861，Mw＝80000)水溶液浸润5min，用水冲洗。

4)如此反复操作3次后(共包被三次)，最后使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝1800、10000、20000、70000)水溶液浸润5min，自然晾干。

用不同分子量的1％聚乙烯亚胺，分别进行制备，得到4种不同分子量包被的载体。取上述4种载体，光镜下观察粗糙程度，在100倍物镜下观察，可见聚乙烯亚胺分子量20000、70000组有明显的粗糙颗粒感。

取上述制备的载体，采用实施例2、3中的有核细胞处理方式制备，结果可见各组均可见有核细胞留存，且免疫荧光染色效果较好。但剩余有核细胞数量差异较大，分子量大于等于20000的测试组效果较好。

综上，说明多层包被方法下，载体表面的粗糙程度与带电物质的分子量呈现正相关性。且有核活细胞的沉降粘附数量与粗糙度、带电物质的分子量等也呈现正相关的关系。

为了进一步提升粘附效果，同时验证粘附效果与包被层数的关系，我们进行如下的测试：标准级载玻片(CITOTEST，80302-0004)经过等离子体处理后，使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝70000)水溶液浸润5min，工艺用水冲洗。使用1％聚(对苯乙烯磺酸钠)(OKA，XW90029861，Mw＝80000)水溶液浸润5min，工艺用水冲洗。如此反复1、3、5、7、9次后，最后使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝70000)水溶液浸润5min，自然晾干。

取上述制备的载体，采用实施例2、3中的有核细胞处理方式制备，结果如下：

由上表可见，当包被层数只有1层时，能够留存的有核细胞量非常少，说明单层包被的方式保留细胞的能力差。当继续增加包被的层数时，保留细胞的数量增加，在5至7层时达到了极大值，且数量相仿。但继续增加包被层数时，细胞数量出现了下降。说明在3-8层之间是比较理想的状态。

综上，我们确定如下条件，用作后续测试的载体包被方法：

标准级载玻片(CITOTEST，80302-0004)经过等离子体处理后，使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝70000)水溶液浸润5min，工艺用水冲洗。使用1％聚(对苯乙烯磺酸钠)(OKA，XW90029861，Mw＝80000)水溶液浸润5min，工艺用水冲洗。如此反复5次后，最后使用1％聚乙烯亚胺(Mw＝70000)水溶液浸润5min，自然晾干，抽真空避光保存。

实施例2样本制备方法示例

使用EDTA抗凝管通过肘静脉采集人外周血10mL，5次颠倒混匀。使用1×RBC裂解缓冲液(eBioscience，00-4333-57)以10比1的比例混匀，室温裂解10min，500×g离心10min，弃除上清，加入PBS(Gbico，10010072)并吹打混匀，再次500×g离心10min，弃除上清。使用血球计数板针对剩余细胞悬液进行WBC计数，调整细胞浓度为5000000个/mL，滴加1mL细胞悬液至约10cm²的上述实施例1中制备的载体。湿盒室温自然沉降20min，10％福尔马林溶液浸泡15min，无水乙醇浸泡10min，自然晾干后，-20℃冷冻保存。

实施例3样本制备效果的测试

取实施例2中的已制备样本，恢复至室温。

使用0.5％TX100-PBS溶液透化15min，PBS清洗3次。2％BSA-PBS溶液封闭30min。加入2％BSA-PBS溶液配制的1％CD4-AF594抗体(Abcam，ab277931)、2％CD8-AF488抗体(Abcam，ab196462)，37℃湿盒孵育1h，PBS清洗3次。加入2ug/mL DAPI-PBS溶液显色5min，PBS清洗3次。使用Mounting Medium(Abcam，ab104139)封片。Bioview allegro plus荧光显微镜下观察染色效果,并扫描有核细胞总数。

结果显示，CD4/CD8/DAPI显色良好，保持细胞良好的抗原状态。93-99％有核细胞可被有效回收，并在经历后续免疫荧光染色后基本无损失。

实施例4已制备样本抗解离能力测试

取实施例2中的已制备样本，恢复至室温。

分别采用PBS浸泡(湿盒、室温)24h、自来水流水直接冲洗24h的方式来进行抗解离能力测试。然后采用实施例3中的方式进行DAPI显色与扫描。

结果显示，约92％-98％有核细胞可被有效回收，显示出极端优异的抗解离能力。

实施例5已制备样本保存效果测试

分别于1、3、6、12、24、26个月，取出实施例2中制备的冷冻保存样本。按实施例3中的方法进行免疫荧光染色与计数测试，结果显示效果无影响。

实施例6载体保存效果测试

分别于1、3、6、12、18、24、26个月，取出实施例1中制备的载体，按实施例2、3的方法进行测试，结果显示效果无影响。

实施例7同类产品效果比对测试

为了对比测试本发明的实际效果，选取下列市售产品进行综合测试比对，样品1、Adhesion slides(简称PM),采用正电荷包被技术，产自德国Paul Marienfeld GmbH&Co.KG。

样品2、SuperFrost Plus(简称VMR),采用正电荷包被技术，产自美国ThermoFisher。

样品3、PLATINUM PRO Adhesive Glass Slide(简称PP),采用PLATINUM PRO纳米正电荷包被技术，产自日本松浪硝子工业株式会社。

虽然都采用了正电荷包被技术，但由于我们在正电荷包被的基础上，额外采用了多层包被方法，增加了玻片粗糙度，十分有利于活细胞与此类形貌的表面进行拓扑适配。这种先进的仿生学方式，将正负电荷识别与纳米结构匹配协同作用，经实测可以出人意料地大幅度提升活性有核细胞的粘附作用，同时可以降低沉降粘附的作用温度、反应时间等，提高效率的同时又可以降低对活性细胞的活性影响，尽量留存活性细胞真实完整的生物学信息。

按照实施例2、实施例3的方法进行测试，每组重复3次，使用高通量内涵荧光显微镜自动扫描与计数，剩余有核细胞情况如下：

实施例8其他样品制备方法学对比测试

为对比不同方法学/组合的测试效果，选取下列产品进行综合测试比对：

SS按照实施例2、实施例3的方法进行测试，其他组各自说明书操作(使用实施例2中制备的浓度约为5000000/mL的样本共1mL)，每组重复3次，使用高通量内涵荧光显微镜自动扫描与计数，剩余有核细胞情况如下：

由此看见，本发明所产生的包被载体与配套方法，可以在温和的条件下、极短时间内有效地进行大量活细胞样本制备，并可长时间保存；兼具了优良的效果、低成本效益、载体货架期长等优点，是一种理想的有核活细胞样本制备手段。

Claims (10)

1.一种活性有核细胞保存方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、活性有核细胞样本的制备：组织样本采用红细胞裂解液或基于密度原理的密度梯度离心液，以去除红细胞等非有核细胞；

步骤2、活性有核细胞沉降与吸附：将含有活性有核细胞的细胞悬液滴加到包被有带电荷物质的载体上，进行沉降，吸附；

步骤3、固定：使用醛类或醇类固定剂或其组合固定上述沉降并吸附到载体上的细胞；

步骤4、保存：对固定后的载体进行冷藏或冷冻保存；

其特征在于，步骤2所述的包被有带电荷物质的载体为一种包被带电荷物质并经过羟基化修饰的载玻片，其中载玻片材质选自：玻璃、石英、PDMS等；所述羟基化修饰，即向载玻片分子中引入羟基的步骤，选自：使用等离子体清洗、酸洗、过氧化物清洗、碱洗载玻片的步骤；所述带电荷物质选自：聚乙烯亚胺(PEI)，PLL，聚对苯乙烯磺酸钠(PSS)，PAH，PLGA，PDDA，PVAM，PVA，Chitosan，PAA，HA，AlG，DeX等分子量大于等于20000的物质，优选分子量40000-80000的带正电荷或带负电荷的物质；所述包被其方法为，先将载体用带正电荷物质包被，再将载体用带负电荷物质包被的步骤，重复该步骤2-8次，最后再包被一层带正电荷物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述羟基化方法优选为暴露于O₂等离子体中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述带正电荷物质优选是聚乙烯亚胺，带负电荷物质优选是聚对苯乙烯磺酸钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述包被优选是带正电荷物质聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度0.01-5％的溶液中涂布于被羟基化的载体表面，再将配制好的浓度为0.01-5％聚对苯乙烯磺酸钠溶液涂布于已经涂布聚乙烯亚胺的载体表面。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中，优选聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度0.01-2％的溶液，聚对苯乙烯磺酸钠配制成重量百分浓度0.01-2％的溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中，优选聚乙烯亚胺配制成重量百分浓度1％的水溶液，聚对苯乙烯磺酸钠配制成重量百分浓度1％的水溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中，所述包被是先将带正电荷物质涂布于载体上，其方法是将载体表面用带正电荷物质溶液浸润(或喷涂)不少于10秒，优选1-10分钟，更优选2-4分钟，然后再将带负电荷物质涂布于载体上，其方法是将载体表面用带负电荷物质溶液浸润(或喷涂)不少于10秒，优选1-10分钟，更优选2-4分钟，为一个循环，一个循环内可包含必要的清洗步骤，如此反复3-8次，优选4-6次；最后一次再采用带正电荷物质溶液浸润不少于3分钟，优选4-10分钟更，更优选4-5分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述细胞等渗溶液，选自：PBS、生理盐水、等渗葡萄糖液、Hanks、D-Hanks等；其中，步骤2在定量检测的应用场景下可达到的效果是，具体细胞密度为100-700000个/cm²，其中，步骤2所述沉降步骤，时间具体为10-50分钟；其中，步骤3所述固定，采用醛类或醇类固定剂，可单独类别使用或两种类别混用。优选地，为两种类别混用。更优选地，为先使用醛类固定剂、再使用醇类固定剂。

9.根据权利要求1所述的方法，该方法中，步骤1中针对器官、组织等样本，可优先采用酶解、超声、物理剪切等方式进行前处理，然后再结合红细胞裂解也或密度分层液进行有核细胞的搜集。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述的包被有带电荷物质的载体，最优选制备方法如下：

1)标准级载玻片，在50W，70mTorr条件下暴露于O₂等离子中5min；

2)等离子体处理后的载玻片，使用分子量70000的重量百分比为1％的聚乙烯亚胺水溶液浸润5min，用水冲洗；

3)再使用分子量80000的重量百分比为1％的聚对苯乙烯磺酸钠水溶液浸润5min，用水冲洗；

4)重复步骤2)，3)的操作2次，最后使用分子量70000的重量百分比为1％的聚乙烯亚胺水溶液浸润5min，晾干。