CN114901295A - 嵌合抗原受体t细胞疗法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于制备、生产、处理、培养、分离或制造适合于免疫或细胞疗法的细胞的方法以及其在细胞疗法中的用途。

Description

嵌合抗原受体T细胞疗法

技术领域

本申请涉及CAR-T细胞、其制备方法以及使用其治疗癌的方法。

背景技术

人癌本质上由正常细胞构成，这些正常细胞发生了遗传转化或表观遗传转化而变成异常癌细胞。癌细胞表达与正常细胞所表达的那些不同的蛋白质和其他抗原。身体的先天免疫系统可使用这些异常肿瘤抗原来特异性地靶向和杀死癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来防止免疫细胞(诸如T和B淋巴细胞)成功靶向癌细胞。人T细胞疗法依赖于离体富集或修饰的人T细胞以靶向和杀死受试者(例如患者)的癌细胞。已经开发了制备具有富集浓度的能够靶向肿瘤抗原的天然存在的T细胞的T细胞群体；去除循环肿瘤细胞；和/或基因修饰T细胞以特异性地靶向已知的癌抗原，从而产生用于癌疗法的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的群体的各种技术。这些疗法中的一些疗法已经显示出对肿瘤大小和患者存活的有希望的效果。

发明内容

本文所述的任何方面或实施方案可与如本文所公开的任何其他方面或实施方案组合。虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是该描述旨在示出而非限制本发明的范围，本发明的范围部分地由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改形式在以下实施方案/权利要求的范围内。

实施方案1：一种用于治疗对其有需要的受试者的套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的T细胞产物。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中所述MCL和B细胞ALL是复发性或难治性MCL和B细胞ALL，任选地其中所述MCL是经典的、母细胞样(blastoid)和多形性MCL。

实施方案3：根据实施方案1和2中任一项所述的方法，其中所述MCL和B细胞ALL对化学疗法、放射疗法、免疫疗法(包括T细胞疗法和/或用抗体或抗体-药物缀合物治疗)、自体干细胞移植或它们的任何组合中的一种或多种疗法是难治性的，或已在所述一种或多种疗法之后复发。

实施方案4：根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受1至5种既往治疗，任选地其中所述既往治疗中的至少一种选自自体SCT、抗CD20抗体、含蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法和/或Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)。

实施方案5：根据实施方案4所述的方法，其中所述BTKi是依鲁替尼(ibrutinib)或阿卡替尼(acalabrutinib)。

实施方案6：根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中R/R B细胞ALL被定义为对一线疗法是难治性的(即，原发性难治性的)，在第一次缓解之后≤12个月复发，在≥2个既往线的全身性疗法之后复发或是难治性的，或者在同种异体干细胞移植(SCT)之后复发，任选地其中所述受试者需要具有≥5％的骨髓母细胞、0或1的美国东部肿瘤协作组体能状态(Eastern Cooperative Oncology Group performance status)和/或足够的肾、肝和心脏功能。

实施方案7：根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中如果所述B细胞ALL受试者已经接受既往博纳吐单抗(blinatumomab)，则所述受试者需要具有CD19表达≥90％的白血病母细胞。

实施方案8：根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术之后和在调理性化学疗法/淋巴耗竭化学疗法之前接受桥接疗法。

实施方案9：根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述MCL受试者接受在T细胞输注之前的第五天、第四天和第三天中的每一天静脉内给予的500mg/m2环磷酰胺和30mg/m2氟达拉滨两者的淋巴耗竭化学疗法方案。

实施方案10：根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者接受在T细胞输注前第四天、第三天、第二天中的每一天静脉内(IV)给予的每天25mg/m2氟达拉滨以及在输注前第二天IV给予的每天900mg/m2环磷酰胺的淋巴耗竭方案。

实施方案11：根据实施方案8至10中任一项所述的方法，其中所述MCL桥接疗法选自地塞米松(例如，每天PO或IV给予20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)；甲泼尼龙、依鲁替尼(例如，每天PO给予560mg)和/或阿卡替尼(例如每天两次PO给予100mg)；免疫调节剂；R-CHOP，苯达莫司汀；烷化剂；和/或铂基药剂，其中所述桥接疗法在白细胞单采术之后施用，并且在例如调理性化学疗法之前5天或更短时间内完成。

实施方案12：根据实施方案8至10中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者可以接受以下桥接化学疗法方案中的任何一种或多种：

实施方案13：根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物包含通过阳性富集和随后对循环癌细胞进行部分或完全耗竭由外周血单核细胞(PBMC)制备的CD4+和CD8+CAR T细胞。

实施方案14：根据实施方案13所述的方法，其中所述PBMC通过阳性选择CD4+和CD8+细胞来富集T细胞，在IL-2的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，然后用含有FMC63-28Z CAR(一种包含抗CD19单链可变片段(scFv)、CD28和CD3-ζ结构域的嵌合抗原受体(CAR))的复制缺陷型病毒载体进行转导。

实施方案15：根据实施方案13和14中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物包含比含有来自白细胞单采术产物的T细胞的T细胞产物更少的癌细胞，所述来自白细胞单采术产物的T细胞尚未对CD4+和CD8+T细胞进行阳性选择。

实施方案16：根据实施方案13至15中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物相对于包含来自白细胞单采术产物的T细胞的T细胞产物具有其他优异的产物属性，所述来自白细胞单采术产物的T细胞尚未对CD4+和CD8+T细胞进行阳性选择/富集。

实施方案17：根据实施方案16所述的方法，其中所述优异的产物属性选自增加的CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞百分比、降低的分化的T细胞百分比、增加的CD3+细胞百分比、降低的IFN-γ产生、降低的CD3-细胞百分比。

实施方案18：根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中向所述MCL受试者施用一个或多个剂量的1.8×10⁶个、1.9×10⁶个或2×10⁶个CAR阳性活T细胞/kg体重，其中最大值为2×10⁸个CAR阳性活T细胞(对于100kg及以上的患者)，并且向所述B细胞ALL受试者施用0.5×10⁶、1×10⁶个或2×10⁶个CAR阳性活T细胞/kg体重，其中最大值为2×10⁸个CAR阳性活T细胞(对于100kg及以上的患者)。

实施方案19：根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经对所述第一次输注实现完全应答，则所述受试者可以接受抗CD19 CAR T细胞的第二次输注，如果在缓解>3个月后进展，则所提供的CD19表达已被保留并且中和针对所述CAR的抗体不是可疑的，其中使用所述Lugano分类评估应答。

实施方案20：根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中在T细胞施用后监测所述受试者的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的体征和症状。

实施方案21：根据实施方案20所述的方法，其中在输注后每天监测所述受试者的CRS和神经毒性的体征和症状，持续至少七天，优选持续四周。

实施方案22：根据实施方案20和21中任一项所述的方法，其中与CRS相关的体征或症状包括发烧、恶寒、疲劳、心动过速、恶心、缺氧和低血压，并且与神经事件相关的体征或症状包括脑病、癫痫发作、意识水平变化、言语障碍、震颤和意识错乱。

实施方案23：根据实施方案20至22中任一项所述的方法，其中MCL受试者中的细胞因子释放综合征根据以下方案进行管理：

实施方案24：根据实施方案20至23中任一项所述的方法，其中MCL受试者中的神经毒性根据以下方案进行管理：

实施方案25：根据实施方案1至24中任一项所述的方法，其中所述MCL受试者是通过Ki-67肿瘤增殖指数≥50％和/或TP53突变的存在确定的高风险患者。

实施方案26：根据实施方案20至22中任一项所述的方法，其中B细胞ALL受试者中的CRS根据以下方案进行管理：

实施方案27：根据实施方案20至22和26中任一项所述的方法，其中B细胞ALL受试者中的神经毒性根据以下两种方案之一进行管理：

实施方案28：根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者可以接受以下桥接化学疗法方案中的任何一种或多种：

实施方案29：表达抗CD19 CAR的自体T细胞，其用于根据实施方案1至28中任一项所述的用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的方法中。

实施方案30：表达抗CD19 CAR的自体T细胞在制造根据实施方案1至28中任一项所述的用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的药物中的用途。

实施方案31：一种预测以下各项的方法：

(i)受试者对CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)的客观应答，所述预测方法包括测量峰值CAR T细胞水平并将它们与参考标准进行比较，其中客观应答与峰值CAR T细胞水平呈正相关，其中客观应答包括完全应答和部分应答两者，并且其中所有应答均使用Lugano分类进行评估；

(ii)响应于CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)的最小残留疾病(例如，在第4周)，所述预测方法包括测量峰值CAR T细胞水平并将它们与参考标准进行比较，其中阴性最小残留疾病与较高的峰值CAR T细胞水平相关；

(iii)在接受CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)的受试者中≥3级CRS和/或≥3级神经事件(NE)，所述预测方法包括测量治疗后的峰值CART细胞扩增并将所述水平与参考值进行比较，其中所述CAR T细胞扩增越多，所述≥3级CRS和/或≥3级NE事件的机会越大；

(iv)≥3级CRS和/或≥3级NE，所述预测方法包括测量在CAR T细胞治疗(任选地根据实施方案1至28中任一项所述的方法)后的GM-CSF和IL-6的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中这些细胞因子的峰值水平越高，≥3级CRS和/或≥3级NE的机会越大；

(v)在接受CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)的受试者中的≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗后血清铁蛋白的峰值水平并将它与参考水平进行比较，其中铁蛋白的所述峰值水平越高，≥3级CRS的机会越大；

(vi)≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗(任选地，实施方案1至28中任一项所述的)后血清IL-2和IFN-γ的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中IL-2和IFN-γ的所述峰值水平越高，≥3级NE的机会越大；

(vii)≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗(任选地，实施方案1至28中任一项所述的)后C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平并将它们与参考水平进行比较，其中C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的所述脑脊液水平越高，≥3级NE的机会越大；

(viii)CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)后的≥3级CRS，所述预测方法包括测量在抗CD19 CART治疗之后IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和/或穿孔素的峰值血清水平，并且将所述水平与参考水平进行比较，其中IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和/或穿孔素的所述峰值血清水平与≥3级CRS呈正相关；

(ix)在对B细胞ALL进行CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的方法)后的≥3级CRS，所述预测方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后的IL-15峰值血清水平并将所述水平与参考水平进行比较，其中IL-15的所述峰值血清水平与≥3级CRS呈负相关；

(x)CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项的方法)后的≥3级CRS和/或≥3级NE，所述预测方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B的峰值血清水平，并且将所述水平与参考水平进行比较，其中IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B的所述峰值血清水平与≥3级CRS和≥3级NE呈正相关；

(xi)在CAR T细胞治疗(任选地，根据实施方案1至28中任一项所述的)后4周/一个月时患者是否将呈MRD(10^-5的灵敏度)阴性，所述预测方法包括测量治疗后的IFN-γ、IL-6和/或IL-2的峰值血清水平并将所述水平与参考标准进行比较，其中IFN-γ、IL-6和/或IL-2的所述峰值血清水平与在一个月时的MRD阴性呈正相关。

实施方案32：根据实施方案20至24、26、27和30至31中任一项所述的方法，其中CRS和NE通过Lee等人，《血液》(Blood)，2014年，124:188-195。

实施方案33：根据实施方案31所述的方法，其中所述参考标准通过在生物标志物领域中通常使用的任何方法(诸如具有已知应答、毒性等级和MRD水平的患者群体的四分位数分析)来建立。

实施方案34：根据实施方案31所述的方法，其中CAR T细胞水平通过血液中的CAR基因拷贝/微克DNA来测量。

实施方案35：根据实施方案1至43中任一项所述的方法，所述方法还包括进行CART细胞输注后降低与≥3级CRS和/或≥3级NE呈正相关的细胞因子的水平/活性以减少≥3级CRS和/或≥3级NE。

实施方案36：一种改善在对其有需要的受试者中CAR T细胞治疗(例如，经典的、母细胞样和多形性MCL和B细胞ALL)的有效性的方法，所述方法包括操纵施用于所述受试者的所述T细胞产物的T细胞表型，任选地其中所述操纵包括在生产期间增加所述CD3+T细胞的数量、减少CD3-细胞的数量、增加CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞的数量/百分比和/或降低在所述T细胞产物中的分化细胞的数量/百分比，降低所述T细胞的IFN-γ产生水平，其中所述改善是相对于在没有任何有意操纵CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞的数量/百分比和/或在所述T细胞产物中的分化细胞的数量/百分比的情况下制备的T细胞产物的有效性而观察到的。

附图说明

图1A-图1F：由Ki-67增殖指数定义的预后组中的可比较的药效学概况以及在具有突变TP53的患者中的细胞因子水平增加的趋势。

图2A-图2I：在实现MRD阴性状态的患者中血清中的选定细胞因子的峰值水平增加。

图3：ZUMA-3研究设计。CAR，嵌合抗原受体；DLT，剂量限制性毒性。

图4：ZUMA-3CONSORT图。*AE是3级肺肿块(n＝1)、1级硬脑膜下血肿(n＝1)和3级发热性嗜中性粒细胞减少(n＝1)；

AE是4级败血症(n＝1)和5级败血症(n＝1)；

一名患者在由于深度静脉血栓形成(研究排除标准)而同情用药下确实接受了KTE-X19。AE，不良事件。

图5：完全应答率的亚组分析。BM，骨髓；ORR，总体缓解率；SCT，干细胞移植。

图6：按剂量水平的应答持续时间、无复发生存期和总生存期。

图7：峰值CAR T细胞扩增和与应答、最小残留疾病和毒性的关联性。

图8：CAR T细胞曲线下面积和与应答、最小残留疾病和毒性的关联性。AE，不良事件；AUC，曲线下面积；CAR，嵌合抗原受体；CRS，细胞因子释放综合征；MRD，最小残留疾病。

图9：随时间推移的峰值细胞因子水平。

图10：在基线处和输注后峰值处的血液血清样品中的炎症标志物。*值表示使用的测定的定量下限。

值表示使用的测定的定量上限。AE，不良事件；CAR，嵌合抗原受体；CCL，C-C基序配体；CRP，C反应蛋白；CXCL，C-X-C基序趋化因子配体；FGFBF，成纤维细胞生长因子基本形式；FLT-1，fms相关受体酪氨酸激酶1GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；ICAM-1，细胞间粘附分子1；IFN，干扰素；IL，白介素；MCP，单核细胞化学引诱剂蛋白1；MDC，巨噬细胞来源的趋化因子；MIP，巨噬细胞炎症蛋白；PDL1，程序性死亡配体1；PLGF，胎盘生长因子；Rα，受体α；RA，受体拮抗剂；SAA，血清淀粉样蛋白A；SFASL，可溶性Fas配体；TARC，胸腺和激活调节细胞因子；TNF，肿瘤坏死因子；VCAM，血管细胞粘附蛋白；VEGF，血管内皮生长因子；VEGFC，血管内皮生长因子C；VEGFD，血管内皮生长因子D。

图11：血清生物标志物与细胞因子释放综合征和神经事件的关联性。*值表示使用的测定的定量下限。

值表示使用的测定的定量上限。CRP，C反应蛋白；CXCL，C-X-C基序趋化因子配体；GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；IFNγ，干扰素γ；IL，白介素；IP，干扰素γ诱导蛋白；MCP，单核细胞引诱剂蛋白；Rα，受体α；RA，受体拮抗剂；SAA，血清淀粉样蛋白A。

图12：在MCL形态学亚组之间KTE-X19的药效学概况。AUC，曲线下面积；CAR，嵌合抗原受体；CXCL10，C-X-C基序趋化因子配体10；IFN-g，干扰素γ；IL，白介素；MCL，套细胞淋巴瘤；MCP-1，单核细胞化学引诱剂蛋白1；MIP-1β，巨噬细胞炎症蛋白1β；PD-L1，编程死亡配体1；PRF，穿孔素；Rα，受体α；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

图13：在MCL形态学亚组之间KTE-X19的药理学概况。

图14：在既往BTKi亚组之间KTE-X19的药效学概况。AUC，曲线下面积；CAR，嵌合抗原受体；CXCL10，C-X-C基序趋化因子配体10；IFN-g，干扰素γ；IL，白介素；MCL，套细胞淋巴瘤；MCP-1，单核细胞化学引诱剂蛋白1；MIP-1β，巨噬细胞炎症蛋白1β；PD-L1，编程死亡配体1；PRF，穿孔素；Rα，受体α；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

图15：在既往BTKi亚组之间KTE-X19的药理学概况。

图16：在亚组之间的进行性应答率。

具体实施方式

除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个术语应具有下文所阐述的含义。在整个本申请中阐述了附加定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的含义。例如，“生物医学与分子生物学简明词典(The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)”，Juo,Pei-Show，第2版，2002年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary ofCell and Molecular Biology)”，第3版，1999年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and MolecularBiology)”，修订版，2000年，牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的公开内容并不限制本申请的各个方面，其可以参考作为整体的本说明书。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Juo，“生物医学与分子生物学简明词典(TheConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)”，第2版，2001年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell&MolecularBiology)”，第5版，2013年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)”，Cammack等人编辑，第2版，2006年，牛津大学出版社(Oxford University Press)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

冠词“一个/一种(a/an)”是指任何叙述或列举的组分的“一个或多个/一种或多种”。

术语“约”或“基本上由…组成”是指在如本领域普通技术人员所确定的某个值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分地取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由…组成”可意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上由…组成”可意指至多10％(即，±10％)的范围。例如，约3mg可包括在2.7mg与3.3mg之间的任何数量(对于10％)。关于生物系统或过程，该术语可意指至多一个数量级或至多5倍的值。当在本申请和权利要求中提供某些值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上由…组成”的含义包括在该值或组成的可接受误差范围。任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围包括在所叙述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。术语“和/或”是指两个指定特征或部件中的每一者连同或不连同另一者。因此，如在本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)；类似地，如在诸如“A、B和/或C”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

术语“例如”和“即”仅以举例的方式使用，并非旨在进行限制，并且不被解释为仅指代说明书中明确列举的那些项目。

术语“或更多”、“至少”、“超过”等例如“至少一个”包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。

术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二”等包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。

在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”之类的变型形式被理解为暗示包含所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。应当理解，无论本文在何处用语言“包括”描述各方面，还提供了按照“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似方面。术语“由…组成”排除未在权利要求中指明的任何要素、步骤或成分。至于Gray,53F.2d 520,11USPQ 255(CCPA1931)；片面地Davis,80USPQ 448,450(Bd.App.1948)(“由…组成”定义为“闭合权利要求以包括除通常与其相关的杂质以外的与所叙述的那些材料不同的材料”)。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。

除非特别说明或从上下文明显看出，如本文所用，术语“约”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分地取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“大约”可意指在一个或超过一个标准偏差内。“约”或“大约”可意指至多10％(即，±10％)的范围。因此，“约”可被理解为在比所述值大或小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。例如，约5mg可包括4.5mg与5.5mg之间的任何量。此外，特别是对于生物系统或过程而言，这些术语可意指某个值的至多一个数量级或至多5倍。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应被假定在该特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

术语“激活”、“激活的”等是指被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞(包括但不限于免疫细胞(例如，T细胞))状态。激活可能与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”主要是指正在经历细胞分裂的T细胞。T细胞激活可以通过一种或多种生物标志物的T细胞表达增加来表征，该一种或多种生物标志物包括但不限于CD57、PD1、CD107a、CD25、CD137、CD69和/或CD71。用于活化和扩增T细胞的方法在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利6,905,874、6,867,041；和6,797,514；以及PCT公布WO2012/079000中，这些专利的内容据此全文以引用方式并入。通常，此类方法包括在有某些细胞因子(诸如IL-2、IL-7和/或IL-15)的情况下在溶液(诸如进料、培养物和/或生长培养基)中使细胞(诸如T细胞)与可以附着、涂覆或结合到珠粒或其他表面上的激活剂、刺激剂或共刺激剂(诸如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)接触。附着在同一珠粒上的激活剂(诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体)充当“替代”抗原递呈细胞(APC)。一个示例是

系统，这是一种用于人T细胞的生理活化的CD3/CD28激活剂/刺激剂系统。在一个实施方案中，使用在美国专利6,040,177和5,827,642以及PCT公布WO2012/129514(这些专利的内容据此全文以引用方式并入)中描述的方法，用某些抗体和/或细胞因子激活并刺激T细胞以增殖。

术语“施用”(administration、Administering等)是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入受试者中。用于通过本文所公开的方法制备的免疫细胞的示例性施用途径包括静脉内(i.v.或IV)、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径(例如，通过注射或输注)。肠胃外施用途径是指除了肠内和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。在一个实施方案中，通过本发明方法制备的免疫细胞(例如，T细胞)通过注射或输注施用。非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。也可以一次、两次或在一个或多个延长的时间段内多次执行施用。在施用一种或多种治疗剂(例如，细胞)的情况下，该施用可伴随地或序贯地进行。序贯施用包括仅在已完成另一种或多种药剂的施用之后才施用一种药剂。

术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性结合抗原的免疫球蛋白。一般而言，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条H链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可包含三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和/或CH4。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白可以来源于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如，IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可以通过重组方法人源化，以降低其在人体内的免疫原性。在未明确说明的情况下，并且除非上下文另外指示，否则术语“抗体”还包括前述免疫球蛋白中的任一种免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，单价和二价的片段或部分，以及单链抗体。

“抗原结合分子”、“抗体片段”等是指小于整个抗体的任何抗体部分。抗原结合分子可包含抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体以及由抗原结合分子形成的多特异性抗体。在一个方面，CD19CAR构建体包含抗CD19单链FV。“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的重链可变(V_H)结构域和轻链可变(V_L)结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般来讲，Fv多肽还包含V_H结构域和V_L结构域之间的多肽接头，这使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。本文所使用的所有抗体相关术语均采用本领域中的惯常含义并且为本领域普通技术人员所充分理解。

“抗原”是指引起免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)都可用作抗原。抗原可内源表达，即由基因组DNA表达，或者可重组表达。抗原可特异于某种组织(诸如癌细胞)，或者其可广泛表达。另外，较大分子的片段可充当抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。

术语“中和”是指结合配体并防止或降低该配体的生物学作用的抗原结合分子、scFv、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点，或通过间接方式(例如，配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质执行生物学功能。

术语“自体”是指来源于同一个体并且稍后再次引入该个体的任何材料。例如，本文所述的工程改造的自体细胞疗法方法涉及从个体(诸如供体或患者)收集淋巴细胞，然后将其工程改造以表达CAR构建体，随后施用回同一个体中。

术语“同种异体”是指来源于一个个体并且随后引入相同物种的另一个个体的任何材料，例如同种异体T细胞移植。

“癌”是指一组广泛的特征在于体内异常细胞的不受控制生长的各种疾病。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，该恶性肿瘤侵袭邻近组织并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。“癌”或“癌组织”可包括各个阶段的肿瘤。在一个实施方案中，癌或肿瘤处于0期，使得例如该癌或肿瘤在非常早期的发育中并且尚未转移。在另一个实施方案中，癌或肿瘤处于I期，使得例如该癌或肿瘤的大小相对较小，没有扩散到附近的组织中，并且尚未转移。在其他实施方案中，癌或肿瘤处于II期或III期，使得例如该癌或肿瘤大于0期或I期中，并且其已经生长到相邻组织中，但其尚未转移，除了潜在地淋巴结之外。在附加实施方案中，癌或肿瘤处于IV期，使得例如该癌或肿瘤已转移。IV期也可以称为晚期或转移性癌。

如本文所用，“抗肿瘤作用”是指可表现为但不限于肿瘤体积减小、对肿瘤生长的抑制、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、转移数量/程度减小、总体或无进展生存期增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状改善的生物学作用。抗肿瘤作用还可指肿瘤发生的预防，例如疫苗。

术语“无进展生存期”(PFS)是指从治疗日期到疾病进展日期(根据一般指南，诸如修订的IWG恶性淋巴瘤应答标准(revised IWG Response Criteria for MalignantLymphoma))或由于任何原因的死亡的时间。术语“疾病进展”可通过在X射线照片上的恶性病变的测量来评估，或者其他方法不应报告为不良事件。在没有体征和症状的情况下由于疾病进展引起的死亡可以被报告为原发性肿瘤类型(例如，DLBCL)。术语“应答持续时间”(DOR)是指受试者的第一客观应答到确认疾病进展的日期(根据一般指南，诸如修订的IWG恶性淋巴瘤应答标准)或死亡之间的时间段。术语“总生存期”(OS)是指从治疗日期到死亡日期的时间。

“细胞因子”是指由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答的非抗体蛋白。在一个实施方案中，响应于疗法释放一种或多种细胞因子。在其他实施方案中，响应于疗法分泌的那些细胞因子可以指示或提示有效疗法。在一个实施方案中，“细胞因子”是指对与特异性抗原接触作出应答而由一个细胞释放的非抗体蛋白，其中该细胞因子与第二个细胞发生相互作用以介导第二个细胞中的应答。如本文所用，“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介体作用于另一个细胞的蛋白质。细胞因子可由细胞内源表达或施用给受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可在受体细胞中诱导各种应答。细胞因子可包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应子和急性期蛋白。例如，包括白介素(IL)7和IL-15在内的稳态细胞因子促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎细胞因子可促进炎性应答。稳态细胞因子的示例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎细胞因子的示例包括但不限于IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管细胞粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应子的示例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)和穿孔素。急性期蛋白的示例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。

“趋化因子”是一种介导细胞趋化性或定向运动的细胞因子。趋化因子的示例包括但不限于IL-8、IL-16、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3、巨噬细胞源趋化因子(MDC或CCL22)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、γ诱导蛋白10(IP-10)和胸腺活化调节趋化因子(TARC或CCL17)。

“治疗有效量”、“治疗有效剂量”等是指通过本发明方法产生(产生T细胞产物)并且当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护或治疗受试者免于疾病的发作或促进疾病消退(如通过疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和的增加和持续时间增加、和/或防止由于疾病折磨引起的损伤或失能所证明的)的细胞(诸如免疫细胞或工程改造的T细胞)的量。可使用技术人员已知的多种方法(诸如在临床试验期间的人类受试者中、在预测对人的功效的动物模型系统中或通过在体外测定法中测定药剂的活性)来评估促进疾病消退的能力。在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法的供体T细胞(例如，用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从不是患者的受试者获得用于T细胞疗法的供体T细胞。可以以治疗有效量施用T细胞。例如，治疗有效量的T细胞可以是至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹个或至少约10¹⁰个。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞是约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR T细胞是约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于每kg体重约1×10⁶与约2×10⁶个CAR阳性活T细胞之间直至约1×10⁸个CAR阳性活T细胞的最大剂量。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于约0.4×10⁸与约2×10⁸个CAR阳性活T细胞之间。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞是约0.4×10⁸、约0.5×10⁸、约0.6×10⁸、约0.7×10⁸、约0.8×10⁸、约0.9×10⁸、约1.0×10⁸、约1.1×10⁸、约1.2×10⁸、约1.3×10⁸、约1.4×10⁸、约1.5×10⁸、约1.6×10⁸、约1.7×10⁸、约1.8×10⁸、约1.9×10⁸或约2.0×10⁸个CAR阳性活T细胞。

如本文所用，术语“淋巴细胞”可包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞、NK-T细胞或B细胞。NK细胞是一种细胞毒性(对细胞有毒的)淋巴细胞，其代表固有免疫系统的主要组分。NK细胞通过细胞凋亡或程序性细胞死亡过程排斥被病毒感染的肿瘤和细胞。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要活化即可杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。T细胞受体(TCR)将它们自身与其他淋巴细胞类型区分开。胸腺是免疫系统的专门器官，主要负责T细胞的成熟。

存在几种类型的“免疫细胞”，包括但不限于巨噬细胞(例如，肿瘤相关巨噬细胞)、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞、T细胞、NK-T细胞、肥大细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)和树突状细胞。术语还包括这些免疫细胞的前体。造血干细胞和/或祖细胞可通过本领域已知的方法从骨髓、脐带血、细胞因子动员之后的成年外周血等衍生。一些前体细胞是可分化成淋巴样谱系(例如淋巴样谱系的造血干细胞或祖细胞)的那些细胞。可用于免疫疗法的附加免疫细胞实例描述于美国公布20180273601中，该专利全文以引用方式并入本文。

T细胞还有几种类型，即：辅助T细胞(例如，CD4+细胞、效应T_EFF细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞溶解T细胞、CD8+T细胞或杀伤性T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆T_SCM细胞(如幼稚细胞)是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的，但它们还表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多记忆细胞特有的功能属性)；(ii)中央记忆T_CM细胞表达L-选择素并且是CCR7⁺和CD45RO⁺的，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，然而(iii)效应记忆T_EM细胞不表达L-选择素或CCR7，但确实表达CD45RO并产生效应细胞因子如IFNγ和IL-4)、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞，或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。在肿瘤内发现的T细胞被称为“肿瘤浸润性淋巴细胞”(TIL)。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。其制造抗体和抗原并发挥抗原递呈细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用活化后转变为记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟B细胞在其名称所来源的骨髓中形成。

“幼稚”T细胞是指保持免疫未分化的成熟T细胞。在胸腺中阳性和阴性选择后，T细胞作为CD4⁺或CD8⁺幼稚T细胞出现。在它们的幼稚状态中，T细胞表达L-选择素(CD62L⁺)、IL-7受体α(IL-7R-α)和CD132，但它们不表达CD25、CD44、CD69或CD45RO。如本文所用，“未成熟”还可以指表现出幼稚T细胞或未成熟T细胞(诸如T_SCM细胞或T_CM--细胞)的表型特征的T细胞。例如，未成熟T细胞可以表达L-选择素(CD62L⁺)、IL-7Rα、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1中的一种或多种。幼稚或未成熟T细胞可以与末端分化效应T细胞(诸如T_EM细胞和T_EFF细胞)形成对比。

如本文所提及的“T细胞功能”是指健康T细胞的正常特征。T细胞功能可包括T细胞增殖、T细胞活性和/或细胞溶解活性。在一个实施方案中，在某种氧气和/或压力条件下制备T细胞的本申请的方法将增加一个或多个T细胞功能，从而使T细胞更适合和/或更有效用于治疗目的。在一些实施方案中，与缺乏某种氧气和/或压力的条件下的那些相比，根据本发明方法制备的T细胞具有增加的T细胞功能。在其他实施方案中，与在缺乏某种氧气和/或压力的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法制备的T细胞将具有增加的T细胞增殖。在附加实施方案中，与在缺乏某种氧气和/或压力的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法制备的T细胞具有增加的T细胞活性。在另外的实施方案中，与在缺乏某种氧气和/或压力的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法制备的T细胞具有增加的细胞溶解活性。

术语细胞“增殖”(proliferation或proliferating等)是指细胞通过细胞分裂以数字生长的能力。增殖可通过用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色细胞来测量。可能在体外(例如，在T细胞培养期间)或在体内(例如在施用免疫细胞疗法(例如，T细胞疗法)之后)发生细胞增殖。细胞增殖可通过本文所述或本领域已知的方法来测量或确定。例如，可通过活细胞密度(VCD)或总活细胞(TVC)来测量或确定细胞增殖。VCD或TVC可以是理论的(在某个时间点从培养物中获取等分试样或样品以确定细胞数目，然后将该细胞数量乘以研究开始时的培养体积)或实际的(在某个时间点从培养物中获取等分试样或样品以确定细胞数量，然后将该细胞数量乘以在某个时间点的实际培养体积)。术语“T细胞活性”是指健康T细胞常见的任何活性。在一个实施方案中，T细胞活性包括细胞因子产生(诸如INFγ、IL-2和/或TNFα)。在其他实施方案中，T细胞活性包括产生一种或多种选自干扰素γ(IFNγ或IFN-γ)、组织坏死因子α(TNFα或IFNα)和两者的细胞因子。术语“细胞溶解活性”、“细胞毒性”等是指T细胞破坏靶细胞的能力。在一个实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。在其他实施方案中，T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，并且靶细胞表达靶抗原。

术语“基因工程改造的”、“基因编辑”或“工程改造的”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于删除编码区或非编码区或者其一部分，或者插入编码区或其一部分。在一个实施方案中，经修饰的细胞是可从患者或供体获得的淋巴细胞(例如T细胞)。可修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

术语“转导”和“转导的”是指通过病毒载体将外源DNA引入细胞的过程(参见Jones等人，“遗传学：原理与分析(Genetics:principles and analysis)”，波士顿：琼斯和巴特利特出版社(Boston:Jones&Bartlett Publ.)，(1998))。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、乳头病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或它们的任何组合。

本申请的嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)和T细胞受体(TCR)是基因工程改造的受体。根据本领域已知的技术，这些工程改造的受体可容易地插入包括T细胞在内的免疫细胞中并由其表达。使用CAR，可对单个受体进行编程，使其既识别特异性抗原，又在结合该抗原时激活免疫细胞以攻击并破坏携带或表达该抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可靶向并杀死肿瘤细胞。在一个实施方案中，根据本申请制备的细胞是具有包含抗原结合分子、共刺激结构域和激活结构域的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体的细胞。共刺激结构域可包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一个实施方案中，细胞外结构域包含铰链或截短的铰链结构域。

“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和中性粒细胞)和这些细胞中的任何细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，导致选择性地靶向、结合、损害、破坏和/或清除来自脊椎动物身体的侵入病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。

术语“免疫疗法”(immunotherapy或immune therapy等)是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗罹患疾病或者有患上疾病或遭受疾病复发的风险的受试者。免疫疗法的实例包括但不限于T细胞和NK细胞疗法。T细胞疗法可包括过继性T细胞疗法、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程改造的自体细胞疗法和同种异体T细胞移植。本领域技术人员将认识到本文所公开的制备免疫细胞的方法将增强任何癌或移植的T细胞疗法的功效。T细胞疗法的示例描述于美国专利公布号2014/0154228和2002/0006409；美国专利号7,741,465；6,319,494；和5,728,388；以及PCT公布号WO 2008/081035中，这些专利全文以引用方式并入。

术语“工程改造的自体细胞疗法”(可缩写为“eACT^TM”，也称为过继细胞转移)是通过其收集患者自身的T细胞并随后对这些细胞进行基因改造以识别和靶向在一种或多种特异性肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原的过程。可以将T细胞工程改造以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。对CAR阳性(+)T细胞进行工程改造以表达对某种肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变区片段(scFv)，该scFv连接到包含共刺激结构域和激活结构域的细胞内信号传导部分。共刺激结构域可以是源自以下物质的信号传导区：CD28、CTLA4、CD16、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、可诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、ICOS-L、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1(CDl la/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性地结合的配体或它们的任何组合。激活结构域可以来源于例如CD3，诸如CD3ζ、ε、δ、γ等。在一个实施方案中，该CAR被设计成具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。CAR scFv可以被设计成靶向例如CD19，该CD19是由B细胞谱系中的细胞(包括所有正常B细胞和B细胞恶性肿瘤，包括但不限于NHL、CLL和非T细胞ALL)表达的跨膜蛋白质。示例性CAR+T细胞疗法和构建体描述于美国专利公布2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中，这些专利公布据此全文以引用方式并入。

如本文所用，“共刺激信号”是指与诸如TCR/CD3连接之类的初级信号联合引起T细胞应答(诸如但不限于增殖和/或对关键分子的上调或下调)的信号。

如本文所用，“共刺激配体”包括抗原递呈细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子。共刺激配体的结合提供了介导T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了刺激分子提供的初级信号之外的信号，例如，通过T细胞受体(TCR)/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合。共刺激配体可包括但不限于3/TR6、4-1BB配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、与B7-H3特异性结合的配体、淋巴毒素β受体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、OX40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)L1。共刺激配体包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。

“共刺激分子”是T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于，“共刺激分子”是T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96(触觉)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、MHCI类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号转导淋巴细胞活化分子、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或者它们的片段、截短或组合。

在一些方面，可通过从受试者获得的T细胞来获得本申请的细胞。在一个方面，T细胞可以获自例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，T细胞可衍生自本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLL^TM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。在一些方面，洗涤通过血液单采术收集的细胞以去除血浆级分，并将其置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理。在一些方面，用任何溶液(例如，具有中和PH值或PBS的溶液)或培养基洗涤细胞。应当理解，可使用洗涤步骤，诸如通过使用半自动流通式离心机，例如Cobe^TM2991细胞处理器、Baxter CytoMate^TM等。在一些方面，将洗涤的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液或者具有或不具有缓冲液的其他盐溶液中。在一些方面，去除血液单采术样品的不需要的组分。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布2013/0287748中，该专利公布据此全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，通过裂解红血细胞并耗竭单核细胞(例如通过使用通过PERCOLL^TM梯度的离心)来从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，通过本领域已知的阳性或阴性选择技术来进一步分离T细胞的特定亚群，诸如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可使用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成通过阴性选择的T细胞群的富集。在一些实施方案中，可使用经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在一些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本公开中的感兴趣的细胞群。

在一个实施方案中，使用涂覆有抗CD3抗体的Dynabeads从PBMC中分离CD3+T细胞。使用CD8微珠(例如德国天美旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))或CD4微珠(例如德国天美旎生物技术公司)通过阳性选择进一步单独分离CD8+和CD4+T细胞。

在一些实施方案中，使用如本文所述的方法将PBMC直接用于免疫细胞(诸如CAR)的基因修饰。在一些实施方案中，在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。

本文所述的一种或多种免疫细胞可获自任何来源，包括例如人供体。供体可以是需要抗癌治疗(例如，用通过本文所述的方法产生的一种免疫细胞治疗)的受试者(即，自体供体)，或可以是捐献淋巴细胞样品的个体(即同种异体供体)，所述淋巴细胞样品在产生通过本文所述的方法产生的细胞群体后将被用于治疗不同的个体或癌患者。免疫细胞可以在体外从造血干细胞群分化或者免疫细胞可以从供体获得。免疫细胞群可通过本领域使用的任何合适的方法从供体获得。例如，淋巴细胞群可通过任何合适的体外方法、静脉穿刺或其他血液采集方法获得，通过所述方法获得具有或不具有淋巴细胞的血液样品。淋巴细胞群通过血液单采术获得。可从包含一种或多种免疫细胞的任何组织(包括但不限于肿瘤)收集一种或多种免疫细胞。从受试者收集肿瘤或其部分，并从肿瘤组织中分离一种或多种免疫细胞。任何T细胞都可用于本文所公开的方法中，包括适合用于T细胞疗法的任何免疫细胞。例如，可用于本申请的一种或多种细胞可选自由以下组成的组：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T细胞、CAR T细胞、工程改造的TCR T细胞、自然杀伤T细胞、树突状细胞和外周血淋巴细胞。T细胞可获自例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，T细胞可衍生自本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLL^TM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。T细胞还可获自人工胸腺类器官(ATO)细胞培养系统，其复制人类胸腺环境以支持T细胞从原代和重新编程的多能干细胞的有效离体分化。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布号2013/0287748、PCT公布号WO2015/120096和WO2017/070395中，所有这些专利公布全体以引用方式全文并入本文以用于描述这些方法的目的。在一个实施方案中，T细胞是肿瘤浸润性白细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种T细胞表达CD8，例如，是CD8⁺T细胞。在其他实施方案中，所述一种或多种T细胞表达CD4，例如，是CD4⁺T细胞。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布号2013/0287748、PCT公布号WO2015/120096和WO2017/070395中，所有这些专利公布全体以引用方式全文并入本文以用于描述这些方法的目的。

免疫细胞和其前体细胞可通过可用方法分离(参见例如Rowland-Jones等人，《淋巴细胞：实际应用(Lymphocytes:A Practical Approach)》，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，纽约(New York)，1999年)。免疫细胞或其前体细胞的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他造血细胞来源。可以使用阴性选择方法来去除不是所需免疫细胞的细胞。此外，阳性选择方法可以分离或富集所需的免疫细胞或其前体细胞，或者可以采用阳性和阴性选择方法的组合。单克隆抗体(MAb)可用于鉴定与某些细胞谱系相关的标志物和/或阳性和阴性选择两者的分化阶段。如果要分离某些类型的细胞(例如，某些类型的T细胞)，各种细胞表面标志物或标志物的组合(包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD34(对于造血干细胞和祖细胞)等)可用于分离细胞，如本领域熟知的(参见Kearse，《T细胞方案：开发和激活(T Cell Protocols:Development and Activation)》，Humana出版社，美国新泽西州托特瓦(Totowa N.J.)2000年；De Libero，T细胞方案(T Cell Protocols)，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》中的第514卷，Humana出版社，美国新泽西州托特瓦(Totowa N.J.)(2009))。

PBMC可以直接用于免疫细胞的基因修饰(诸如CAR)。在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。在一个实施方案中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞的每一种相关的细胞表面抗原，可以将CD8+细胞进一步分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。在其他实施方案中，中央记忆T细胞的表型标志物的表达包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L和CD127并且对颗粒酶B是阴性的。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD8+、CD45RO+和CD62L+T细胞。在某个实施方案中，效应T细胞对CCR7、CD28、CD62L和CD127是阴性的并且对颗粒酶B和穿孔素是阳性的。在附加实施方案中，可以将CD4+T细胞进一步分选为亚群。例如，可通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群来将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。

本文所述的方法进一步包括在从供体收获与暴露从供体受试者获得的一种或多种细胞之间富集或制备从供体获得的免疫细胞群。富集免疫细胞(例如所述一种或多种T细胞)群可以通过任何合适的分离方法完成，所述分离方法包括但不限于使用分离介质(例如，FICOLL-PAQUE^TM、ROSETTESEP^TMHLA总淋巴细胞富集混合物、淋巴细胞分离培养基(LSA)(MP生物医疗公司(MP Biomedical)目录号0850494X)等)、通过过滤或淘选进行细胞大小、形状或密度分离、免疫磁性分离(例如，磁性激活细胞分选系统，MACS)、荧光分离(例如，荧光激活细胞分选系统，FACS)或基于珠粒的柱分离。

在一个实施方案中，从供体受试者获得T细胞。在其他实施方案中，供体受试者是罹患癌或肿瘤的人类患者。在附加实施方案中，供体受试者是未罹患癌或肿瘤的人类患者。本申请还提供了组合物或制剂，其包含药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在某些实施方案中，组合物或制剂包含赋形剂。术语组合物或制剂在本文可互换使用。术语组合物、治疗组合物、治疗有效组合物、药物组合物、药学上有效的组合物和药学上可接受的组合物在本文可互换使用。可以选择组合物以用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，诸如口服。组合物可由本领域技术人员通过已知的方法制备。使用缓冲剂将组合物保持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。当考虑肠胃外施用时，组合物呈药学上可接受的溶媒中的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，该水溶液包含本文所述的组合物，有或没有附加治疗剂。举例来说，用于肠胃外注射的溶媒是无菌蒸馏水，在其中将本文所述的组合物与或不与至少一种附加治疗剂一起配制为适当保存的无菌等渗溶液。制备涉及将所需药剂与聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体一起配制，以提供产品的受控或持续释放，然后将其通过积存注射进行递送。此外，可植入药物递送装置可以用于引入所需的治疗剂。

在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法的供体T细胞(例如，用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从不是患者的受试者获得用于T细胞疗法的供体T细胞。可以以治疗有效量施用T细胞。例如，治疗有效量的T细胞可以是至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹个或至少约10¹⁰个。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞是约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR T细胞是约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于每kg体重约1×10⁶与约2×10⁶个CAR阳性活T细胞之间直至约1×10⁸个CAR阳性活T细胞的最大剂量。

如本文所用，“患者”包括罹患疾病或障碍(包括癌(例如，淋巴瘤或白血病))的任何人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。术语“供体受试者”是指其细胞被获得以进行进一步体外工程改造的受试者。供体受试者可以是将用通过本文所述的方法产生的细胞群治疗的癌患者(即，自体供体)，或者可以是捐献淋巴细胞样品的个体(即，同种异体供体)，该淋巴细胞样品在产生通过本文所述的方法产生的细胞群后将用于治疗不同的个体或癌患者。接受通过本发明方法制备的细胞的那些受试者可以被称为“受体受试者”。

术语“刺激”(stimulation或stimulating等)是指通过刺激分子与其同源配体的结合而诱导的初级应答，其中该结合介导信号转导事件。“刺激分子”是T细胞上的分子(例如，T细胞受体(TCR)/CD3复合物)，其与抗原递呈细胞上递呈的同源刺激配体特异性结合。“刺激配体”是当在抗原递呈细胞(例如，人工抗原递呈细胞(aAPC)、树突状细胞、B细胞等)上递呈时可与T细胞上的刺激分子特异性结合，从而介导T细胞的初级应答(包括但不限于激活、起始免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体包括但不限于装载有肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。如本文所用，“激活的”或“活性的”是指已经被刺激的T细胞。活性T细胞可以通过选自CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L和CD134的一种或多种标志物的表达来表征。

术语“外源激活材料”是指源自外部来源的任何激活物质。例如，可商购获得或重组产生外源抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、外源IL-7或外源IL-15。当添加到一种或多种T细胞中或与一种或多种T细胞接触时，“外源IL-2”、“外源IL-7”或“外源IL-15”表示T细胞不产生此类IL-2、IL-7和/或IL-15。在与“外源”IL-2、IL-7或IL-15混合之前的T细胞可以含有由T细胞产生的或与T细胞一起从受试者分离的痕量(即，内源性“外源”IL-2、IL-7或IL-15)。本文所述的一种或多种T细胞可以通过本领域已知的任何手段与外源抗CD3抗体、抗CD28抗体、“外源”IL-2、IL-7和/或IL-15接触，所述手段包括向培养基中添加分离的“外源”IL-2、IL-7和/或IL-15、在培养基中包含抗CD3抗体、抗CD28抗体、“外源”IL-2、IL-7和/或IL-15、或者通过除了所述一种或多种T细胞之外的在培养物中的一种或多种细胞(诸如通过饲养层)表达“外源”IL-2、IL-7和/或IL-15。

如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。在一个实施方案中，体外细胞包括T细胞。

术语“持久性”是指例如一种或多种施用于受试者的移植免疫细胞或其祖细胞(例如，分化或成熟的T细胞)以可检测的水平在所述受试者中保留一段时间的能力。如本文所用，增加一种或多种移植免疫细胞或其祖细胞(例如，分化或成熟的T细胞)的持久性是指增加施用后在受试者中可检测到移植免疫细胞的时间量。例如，一种或多种移植免疫细胞的体内持久性可以增加至少约至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。此类，与未通过本文所公开的本发明方法制备的一种或多种移植免疫细胞相比，一种或多种移植免疫细胞的体内持久性可以增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

术语“减少”和“降低”在本文可互换使用并且指示任何小于原始值的变化。“减少”和“降低”是相对术语，需要测量前和测量后之间的比较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。如本文所用，术语“调节”T细胞成熟是指使用本文所述的任何干预控制一种或多种细胞(诸如T细胞)的成熟和/或分化。例如，调节是指失活、延迟或抑制T细胞成熟。在另一个实例中，调节是指加速或促进T细胞成熟。术语“延迟或抑制T细胞成熟”是指将一种或多种T细胞维持在未成熟或未分化状态。例如，“延迟或抑制T细胞成熟”可以是指将T细胞维持在幼稚或T_CM状态，与进展到T_EM或T_EFF-状态相反。此外，“延迟或抑制T细胞成熟”可以是指增加或富集T细胞混合群体中的未成熟或未分化T细胞(例如，幼稚T细胞和/或T_CM--细胞)的总百分比。可以例如通过筛选各种基因的表达以及在T细胞表面上表达的各种蛋白质的存在来确定T细胞的状态(例如，如成熟或未成熟)。例如，选自由L-选择素(CD62L+)、IL-7R-α、CD132、CR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1及它们的任何组合组成的组的一种或多种标志物的存在可以指示较少成熟的未分化T细胞。

受试者/患者的“治疗”或“处理”是指在受试者/患者上执行的任何类型的干预或过程，或对受试者/患者施用通过本申请制备的一种或多种T细胞，目的是逆转、缓解、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症或病症或者生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一个方面，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个方面，“治疗”或“处理”包括完全缓解。

在以下小节中进一步详细描述本申请的各个方面。

患有具有高水平的表达CD19的循环肿瘤细胞的B细胞恶性肿瘤的患者代表具有非常高的未满足需求的群体。例如，套细胞淋巴瘤(MCL)对复发性或难治性设定中的治疗具有挑战性，并且依然不可治愈。二线和更高级别的化学疗法无标准护理。治疗选项包括细胞毒性化学疗法、蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、酪氨酸激酶抑制剂和干细胞移植(自体[ASCT]和同种异体干细胞移植[allo-SCT]两者)。方案的选择受到既往疗法、共存病和肿瘤化学敏感性的影响。尽管用Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTK抑制剂)观察到高初始应答率，但大多数患者将最终发展进行性疾病。需要新的治疗策略来改善其疾病尚未有效地用化学免疫疗法、干细胞移植和BTK抑制剂控制的患有r/r MCL的患者的不良预后。

CD19 CAR-T中使用的抗CD19 CAR T细胞疗法或产物可以由患者自身的T细胞制成，通过适合具有循环肿瘤细胞负荷的B细胞恶性肿瘤的白细胞单采术来最小化最终产物中的表达CD19的肿瘤细胞。来自白细胞单采术产物的收获的白细胞的T细胞可以通过选择CD4+/CD8+T细胞进行富集，用抗CD3抗体和抗CD28抗体来激活，和/或用包含抗CD19 CAR基因的病毒载体进行转导。方法的更多细节可以在公布为WO2015/120096的PCT/US2015/014520和公布为WO2017/070395的PCT/US2016/057983中找到。在一个实施方案中，所述细胞未用AKT抑制剂、IL-7和IL-15处理。可以繁殖这些工程改造的T细胞以产生足够数量的细胞以实现治疗效果。此类过程去除表达CD19的恶性和正常B细胞，这可以减少抗CD19 CAR T细胞的激活、扩增和耗竭。

免疫细胞的激活、转导和/或扩增可以在任何合适的时间进行，该合适的时间允许(i)在工程改造的免疫细胞群中产生足够数量的细胞，用于施用于患者的至少一个剂量，(ii)与典型的较长过程相比产生具有有利比例的幼态细胞的工程改造的免疫细胞群，或(iii)(i)和(ii)两者。合适的时间可能涉及几个参数，包括一种或多种细胞的群体、由免疫细胞表达的细胞表面受体、所使用的载体、具有治疗效果所需的剂量和/或其他变量。激活时间可以是0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或多于21天。与本领域已知的扩增方法相比，根据本申请的方法的激活时间将被减少。例如，激活时间可以更短至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或者可以更短75％。此外，扩增时间可以是0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或多于21天。与本领域已知的扩增方法相比，根据本申请的方法的扩增时间将被减少。例如，扩增时间可以更短至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或者可以更短75％。在一个实施方案中，细胞扩增的时间为约3天，并且从富集产生工程改造的免疫细胞的细胞群开始的时间为约6天。

可以通过本领域已知的任何方法测量一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延迟或抑制。例如，可以通过检测一种或多种生物标志物的存在来测量一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延迟或抑制。一种或多种生物标志物的存在可以通过本领域已知的任何方法检测，所述任何方法包括但不限于免疫组织化学和/或荧光激活细胞分选(FACS)。一种或多种生物标志物选自由以下组成的组：L-选择素(CD62L⁺)、IL-7Rα、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1或它们的任何组合。在某些方面，一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延迟或抑制可以通过检测L-选择素(CD62L⁺)、IL-7Rα和CD132中的一种或多种的存在来测量。本领域技术人员将认识到，尽管本发明方法可以增加收集的细胞群中未成熟和未分化的T细胞或DC细胞的相对比例，但仍然可以存在一些成熟和分化的细胞。因此，一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延迟或抑制可以通过计算在将从供体受试者获得的一种或多种细胞暴露于具有或不具有高于大气压的压力的低氧培养条件之前和之后在细胞群中的未成熟和未分化细胞的总百分比来测量。本文所公开的方法可以增加T细胞群中未成熟和未分化T细胞的百分比。

本文所述的方法还包括用一种或多种T细胞刺激剂刺激细胞群(诸如淋巴细胞)，以在合适的条件下产生激活的T细胞群。一种或多种合适的T细胞刺激剂的任何组合都可以用于产生激活的T细胞群，该合适的T细胞刺激剂包括但不限于靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段(例如，抗CD2抗体、抗CD3抗体(诸如OKT-3)、抗CD28抗体或其功能片段)或任何其他合适的丝裂原(例如，十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(conA)、脂多糖(LPS)、美洲商陆丝裂原(PWM)或T细胞刺激或共刺激分子的天然配体。

用于刺激或激活如本文所述的免疫细胞群的合适条件还包括温度、持续一定时间量和/或在CO₂水平的存在下。刺激的温度可以为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃、约34℃-38℃、约35℃-37℃、约36℃-38℃、约36℃-37℃或约37℃。

用于刺激或激活如本文所述的免疫细胞群的另一种条件还可以包括刺激或激活的时间。刺激的时间为约24-72小时、约24-36小时、约30–42小时、约36–48小时、约40–52小时、约42–54小时、约44–56小时、约46–58小时、约48–60小时、约54–66小时、或约60–72小时、约44–52小时、约40–44小时、约40–48小时、约40–52小时、或约40–56小时。在一个实施方案中，刺激的时间为约48小时或至少约48小时。

用于刺激或激活如本文所述的免疫细胞群的其他条件可以还包括CO₂水平。用于刺激的CO₂水平为约1.0–10％CO₂、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％或约10.0％CO₂、约3–7％CO₂、约4–6％CO₂、约4.5–5.5％CO₂。在一个实施方案中，用于刺激的CO₂水平为约5％CO₂。

用于刺激或激活免疫细胞群的条件还可以包括温度、用于刺激的一定时间量、和/或在CO₂水平的存在下的任何组合。例如，刺激免疫细胞群的步骤可以包括在约36-38℃的温度下以及在约4.5％–5.5％CO₂的CO₂水平的存在下将免疫细胞群用一种或多种免疫细胞刺激剂刺激约44-52小时的时间量。可将本申请的一种或多种免疫细胞施用于受试者，用于进行免疫或细胞疗法。因此，可从需要免疫或细胞疗法的受试者收集一种或多种免疫细胞。一旦收集，可在施用于受试者之前将一种或多种免疫细胞处理任何合适的时间段。

通过本文的方法制备的淋巴细胞或所得产物的浓度、量或群体为约1.0–10.0×10⁶个细胞/mL。在某些方面，浓度为约1.0–2.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–3.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–4.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–5.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–6.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–7.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–8.0×10⁶个细胞/mL、1.0–9.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–10.0×10⁶个细胞/mL、约1.0–1.2×10⁶个细胞/mL、约1.0–1.4×10⁶个细胞/mL、约1.0–1.6×10⁶个细胞/mL、约1.0–1.8×10⁶个细胞/mL、约1.0–2.0×10⁶个细胞/mL、至少约1.0×10⁶个细胞/mL、至少约1.1×10⁶个细胞/mL、至少约1.2×10⁶个细胞/mL、至少约1.3×10⁶个细胞/mL、至少约1.4×10⁶个细胞/mL、至少约1.5×10⁶个细胞/mL、至少约1.6×10⁶个细胞/mL、至少约1.7×10⁶个细胞/mL、至少约1.8×10⁶个细胞/mL、至少约1.9×10⁶个细胞/mL、至少约2.0×10⁶个细胞/mL、至少约4.0×10⁶个细胞/mL、至少约6.0×10⁶个细胞/mL、至少约8.0×10⁶个细胞/mL或至少约10.0×10⁶个细胞/mL。

一种抗CD3抗体(或其功能片段)、抗CD28抗体(或其功能片段)或抗CD3抗体和抗CD28抗体的组合可以根据连同或独立于将从供体受试者获得的一种或多种细胞暴露于具有或不具有高于大气压的压力的低氧培养条件刺激淋巴细胞群的步骤来使用。可以使用任何可溶性或固定的抗CD2抗体、抗CD3抗体和/或抗CD28抗体或它们的功能片段(例如，克隆OKT3(抗CD3)、克隆145-2C11(抗CD3)、克隆UCHT1(抗CD3)、克隆L293(抗CD28)、克隆15E8(抗CD28))。在一些方面，抗体可以从本领域已知的供应商商业购买，该已知的供应商包括但不限于德国天美旎生物技术公司、BD生物科学公司(BD Biosciences)(例如，1mg/mL纯的MACSGMP CD3，部件号170-076-116)和eBioscience公司。此外，本领域技术人员将理解如何通过标准方法产生抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些方面，根据刺激淋巴细胞群的步骤使用的一种或多种T细胞刺激剂包括在T细胞细胞因子的存在下靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段。在一个实施方案中，所述一种或多种T细胞刺激剂包括抗CD3抗体和IL-2。在某些实施方案中，T细胞刺激剂包括浓度为50ng/mL的抗CD3抗体。抗CD3抗体的浓度为约20ng/mL-100ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL或约100ng/mL。在替代方面，不需要T细胞激活。

本文所述的方法还包括使用单个或多个病毒转导周期用包含编码细胞表面受体的核酸分子的病毒载体转导激活的免疫细胞群，以产生转导的免疫细胞群。已经将几种重组病毒用作病毒载体以将遗传物质递送到细胞。可以根据转导步骤使用的病毒载体可以是任何亲宅性或双向性病毒载体，包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体和重组腺相关病毒(AAV)载体。所述方法还包括用逆转录病毒转导所述一种或多种免疫细胞。在一个方面，用于转导激活的免疫细胞群的病毒载体是MSGV1γ逆转录病毒载体。在一个实施方案中，用于转导激活的免疫细胞群的病毒载体是由以下文献所描述的PG13-CD19-H3载体：Kochenderfer，《免疫治疗杂志》(J.Immunother.)32(7):689–702(2009)。根据该方面的一个方面，病毒载体在对病毒载体制造具有特异性的培养基(在本文中称为病毒载体接种物)中的悬浮培养物中生长。根据本文所述的方法，可以在病毒载体接种物中使用用于生长病毒载体的任何合适的生长培养基和/或补充剂。根据一些方面，然后在转导步骤期间将病毒载体接种物添加到下文所述的无血清培养基中。在一些方面，所述一种或多种免疫细胞可以用逆转录病毒转导。在一个实施方案中，逆转录病毒包含编码细胞表面受体的异源基因。在另一个实施方案中，细胞表面受体可以结合靶细胞表面上(例如，肿瘤细胞表面上)的抗原。除了任选地将从供体受试者获得的一种或多种细胞暴露于具有或不具有高于大气压的压力的低氧培养条件之外，用于转导如本文所述的激活的免疫细胞群的条件可以包括特定时间、在特定温度下和/或在特定CO₂水平的存在下。转导温度为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃、约34℃-38℃、约35℃-37℃、约36℃-38℃、约36℃-37℃。在一个实施方案中，转导温度为约37℃。预定的转导温度可以为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃或约39℃、约34℃-39℃、约35℃-37℃。在一个实施方案中，预定的转导温度可以为约36℃-38℃、约36℃-37℃或约37℃。转导时间为约12小时-36小时、约12小时-16小时、约12小时-20小时、约12小时-24小时、约12小时-28小时、约12小时-32小时、约20小时或至少约20小时，为约16小时-24小时、约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时或至少约26小时。用于转导的CO₂水平为约1.0–10％CO₂、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％CO₂、约3–7％CO₂、约4–6％CO₂、约4.5–5.5％CO₂或约5％CO₂。

转导如本文所述的激活的免疫细胞群可以在一定时间段、在某个温度下和/或在特定CO₂水平的存在下以任何组合进行：温度为约36℃-38℃，持续约16小时-24小时的时间量，以及在约4.5％-5.5％CO₂的CO₂水平的存在下。免疫细胞可以通过本申请方法中的任何一种方法与制备用于免疫疗法的T细胞的任何制造方法的组合来制备，该任何制造方法包括但不限于PCT公布WO2015/120096和WO2017/070395中所述的那些，所述专利出于描述这些方法的目的全文以引用方式并入本文；用于制备阿基仑赛或

的任何和所有方法；用于制备替沙仑赛/Kymriah^TM的任何和所有方法；用于制备免疫疗法用“现成”T细胞的任何和所有方法；以及制备向人施用的淋巴细胞的任何其他方法。该制造方法可以适于从获自患者的细胞去除循环肿瘤细胞。

可对CAR-T细胞进行工程改造以表达其他分子，并且这些CAR-T细胞可为以下示例性类型或本领域中可用的其他类型中的任何一种：第一、第二、第三、第四、第五或更多种CAR-T细胞；装甲(Armored)CAR-T细胞、运动CAR-T细胞、TRUCK T细胞、开关受体CAR-T细胞；基因编辑的CAR T细胞；双重受体CAR T细胞；自杀CAR T细胞、药物诱导型CAR-T细胞、synNotch诱导型CAR T细胞；以及抑制性CAR T细胞。在一个方面，T细胞是自体T细胞。在一个方面，T细胞是自体干细胞(用于自体干细胞疗法或ASCT)。在一个方面，T细胞是非自体T细胞。

细胞(诸如免疫细胞或T细胞)在分离或选择后使用已知方法进行基因修饰，或者在进行基因修饰之前在体外进行激活和/或扩增(或在祖细胞的情况下分化)。用本文所述的嵌合抗原受体对免疫细胞(例如，T细胞)进行基因修饰(例如，用包含一个或多个编码CAR的核苷酸序列的病毒载体进行转导)，并在体外激活和/或扩增。用于激活和扩增T细胞的方法可以在美国专利6,905,874、6,867,041；和6,797,514以及PCT公布WO2012/079000中找到，这些专利据此全文以引用方式并入。一般来讲，此类方法可以包括在具有某些细胞因子(诸如IL-2)的培养基中使PBMC或分离的T细胞与可以附着于珠粒或其他表面的刺激剂和共刺激剂(诸如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)接触。可以施用

系统，这是一种用于人T细胞的生理激活的CD3/CD28激活剂/刺激剂系统。T细胞可以用合适的饲养细胞、抗体和/或细胞因子激活和刺激以增殖，如美国专利6,040,177和5,827,642以及PCT公布WO2012/129514中所述，所述专利据此全文以引用方式并入。

由工程改造的免疫细胞表达的细胞表面受体可以是由CAR靶向的任何抗原或分子，诸如抗CD19 CAR、FMC63-28Z CAR或FMC63-CD828BBZ CAR(Kochenderfer等人，《免疫治疗杂志》(J Immunother.)2009,32(7):689；Locke等人，《血液》(Blood)，2010年，116(20):4099，两篇文献的主题据此以引用方式并入。在某些方面，预定剂量的工程改造的免疫细胞可以为超过约1百万到少于约3百万个转导的工程改造的T细胞/kg。在一个实施方案中，预定剂量的工程改造的T细胞可以为超过约1百万到约2百万个转导的工程改造的T细胞/千克体重(细胞/kg)。预定剂量的工程改造的T细胞可以为超过1百万到约2百万、至少约2百万到少于约3百万个转导的工程改造的T细胞/千克体重(细胞/kg)。在一个实施方案中，预定剂量的工程改造的T细胞可以为约2百万个转导的工程改造的T细胞/kg。在另一个实施方案中，预定剂量的工程改造的T细胞可以为至少约2百万个转导的工程改造的T细胞/kg。预定剂量的工程改造的T细胞的实例可以为约2.0百万、约2.1百万、约2.2百万、约2.3百万、约2.4百万、约2.5百万、约2.6百万、约2.7百万、约2.8百万或约2.9百万个转导的工程改造的T细胞/kg。

本文所述的方法包括增加或富集一种或多种转导的免疫细胞群持续一段时间以产生工程改造的免疫细胞群。扩增时间可以是任何合适的时间，该任何合适的时间允许(i)在工程改造的免疫细胞群中产生足够数量的细胞，用于施用于患者的至少一个剂量，(ii)与典型的较长过程相比产生具有有利比例的幼态细胞的工程改造的免疫细胞群，或(iii)(i)和(ii)两者。该时间将取决于由免疫细胞表达的细胞表面受体、所使用的载体、具有治疗效果所需的剂量和其他变量。预定的扩增时间可以是0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或多于21天。在一个实施方案中，与本领域已知的方法相比，本发明方法的扩增时间减少了。例如，预定的扩增时间可以更短至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或者可以更短75％。在一个实例中，扩增时间为约3天，并且从富集产生工程改造的免疫细胞的淋巴细胞群开始的时间为约6天。

用于扩增转导的免疫细胞群的条件可以包括温度和/或在一定CO₂水平的存在下。在某些方面，温度为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃、约35℃-37℃、约36℃-37℃或约37℃。CO₂水平为1.0-10％CO₂、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％CO₂、约4.5-5.5％CO₂、约5％CO₂、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％或约6.5％CO₂。

本文所述的方法的每个步骤可以在密闭系统中执行。密闭系统可以是使用任何合适的细胞培养袋(例如，德国天美旎生物技术公司

GMP细胞分化袋、奥利金生物医学公司(Origen Biomedical)透气性生命细胞培养袋(PermaLife Cell Culture bags))的密闭袋培养系统。在密闭袋培养系统中使用的细胞培养袋可以在转导步骤期间用重组人纤连蛋白片段涂覆。重组人纤连蛋白片段可以包括三个功能结构域：中央细胞结合结构域、肝素结合结构域II和CS1序列。重组人纤连蛋白片段可以通过辅助靶细胞和病毒载体的共定位来增加逆转录病毒转导免疫细胞的基因转移效率。在一个实施方案中，重组人纤连蛋白片段是

(日本宝生物工程株式会社(Takara Bio,Japan))。细胞培养袋涂覆有重组人纤连蛋白片段，其浓度为约1μg/mL-60μg/mL或约1μg/mL-40μg/mL、约1μg/mL-20μg/mL、20μg/mL-40μg/mL、40μg/mL-60μg/mL、约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL、约15μg/mL、约16μg/mL、约17μg/mL、约18μg/mL、约19μg/mL、约20μg/mL、约2μg/mL-5μg/mL、约2μg/mL-10μg/mL、约2μg/mL-20μg/mL、约2μg/mL-25μg/mL、约2μg/mL-30μg/mL、约2μg/mL-35μg/mL、约2μg/mL-40μg/mL、约2μg/mL-50μg/mL、约2μg/mL-60μg/mL、至少约2μg/mL、至少约5μg/mL、至少约10μg/mL、至少约15μg/mL、至少约20μg/mL、至少约25μg/mL、至少约30μg/mL、至少约40μg/mL、至少约50μg/mL、或至少约60μg/mL重组人纤连蛋白片段。在一个实施方案中，细胞培养袋涂覆有至少约10μg/mL重组人纤连蛋白片段。在密闭袋培养系统中使用的细胞培养袋可以任选地在转导步骤期间用人白蛋白血清(HSA)封闭。在另一个实施方案中，在转导步骤期间，细胞培养袋不用HSA封闭。

通过上述方法产生的工程改造的免疫细胞群可以任选地冷冻保存，使得以后可以使用该细胞。本文还提供了一种用于冷冻保存工程改造的免疫细胞群的方法。这种方法可以包括用稀释剂溶液洗涤和浓缩工程改造的免疫细胞群的步骤。例如，稀释剂溶液是生理盐水、0.9％盐水、PlasmaLyte A(PL)、5％葡萄糖/0.45％NaCl盐水溶液(D5)、人血清白蛋白(HSA)或其组合。另外，可以将HSA添加到经洗涤和浓缩的细胞中，以在解冻后改善细胞活力和细胞恢复。在另一个方面，洗涤溶液是生理盐水，并且向经洗涤和浓缩的细胞补充HSA(5％)。该方法还可以包括产生冷冻保存混合物的步骤，其中该冷冻保存混合物包括稀释剂溶液中的稀释细胞群和合适的冷冻保存溶液。冷冻保存溶液可以是任何合适的冷冻保存溶液，包括但不限于CryoStor10(生物生命溶液公司(BioLife Solution))，其以1:1或2:1的比率与工程改造的免疫细胞的稀释剂溶液混合。可以添加HSA以提供在冷冻保存混合物中的最终浓度为约1.0-10％、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约1-3％HSA、约1-4％HSA、约1-5％HSA、约1-7％HSA、约2-4％HSA、约2-5％HSA、约2-6％HSA、约2-7％HAS或约2.5％HSA。工程改造的免疫细胞群的冷冻保存可以包括用0.9％生理盐水洗涤细胞，将最终浓度为5％的HSA添加到经洗涤的细胞中，并且用CryoStorTM CS10将细胞1:1稀释(对于在最终冷冻保存混合物中2.5％HSA的最终浓度)。在一些方面，该方法还包括将冷冻保存混合物冷冻的步骤。另外，冷冻保存混合物在受控速率冷冻机中使用限定的冷冻循环以介于约1×10⁶至约1.5×10⁷个细胞/mL冷冻保存混合物之间的细胞浓度进行冷冻。该方法还可以包括将冷冻保存混合物储存在气相液氮中的步骤。

可以将通过本文所述的方法产生的工程改造的免疫细胞群以预定剂量冷冻保存。预定剂量可以是治疗有效剂量，其可以是如下文所提供的任何治疗有效剂量。预定剂量的工程改造的免疫细胞可以取决于由免疫细胞表达的细胞表面受体(例如，细胞上表达的细胞表面受体的亲和力和密度)、靶细胞的类型、疾病的性质或被治疗的病理病症或它们的组合。

在一个实施方案中，可以将工程改造的T细胞群以约1百万个工程改造的T细胞/千克体重(细胞/kg)的预定剂量冷冻保存。在某些实施方案中，可以将工程改造的T细胞群以约500,000个到约1百万个工程改造的T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在某些实施方案中，可以将工程改造的T细胞群以至少约1百万、至少约2百万、至少约3百万、至少约4百万、至少约5百万、至少约6百万、至少约7百万、至少约8百万、至少约9百万、至少约1000万个工程改造的T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在其他方面，可以将工程改造的T细胞群以少于1百万个细胞/kg、1百万个细胞/kg、2百万个细胞/kg、3百万个细胞/kg、4百万个细胞/kg、5百万个细胞/kg、6百万个细胞/kg、7百万个细胞/kg、8百万个细胞/kg、9百万个细胞/kg、1000万个细胞/kg、超过1000万个细胞/kg、超过2000万个细胞/kg、超过3000万个细胞/kg、超过4000万个细胞/kg、超过5000万个细胞/kg、超过6000万个细胞/kg、超过7000万个细胞/kg、超过8000万个细胞/kg、超过9000万个细胞/kg或超过1亿个细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在某些方面，可以将工程改造的T细胞群以约1百万个到约2百万个工程改造的T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。可以将工程改造的T细胞群以在约1百万个细胞至约2百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约3百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约4百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约5百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约6百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约7百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约8百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约9百万个细胞/kg之间、约1百万个细胞至约1000万个细胞/kg之间的预定剂量冷冻保存。可以基于受试者的体重计算工程改造的T细胞群的预定剂量。在一个实例中，可以将工程改造的T细胞群冷冻保存在约0.5-200mL的冷冻保存培养基中。此外，可以将工程改造的T细胞群在约0.5mL、约1.0mL、约5.0mL、约10.0mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL或约100mL、约10-30mL、约10-50mL、约10-70mL、约10-90mL、约50-70mL、约50-90mL、约50-110mL、约50-150mL或约100-200mL的冷冻保存培养基中冷冻保存。在某些方面，工程改造的T细胞群可以优选地在约50-70mL冷冻保存培养基中冷冻保存。

在一个实施方案中，使用不含添加血清的无血清培养基来执行以下中的至少一者：(a)使免疫细胞群与外源IL-2、外源IL-7、外源IL-15和/或其他细胞因子接触，(b)刺激免疫细胞群，(c)转导激活的免疫细胞群，以及(d)扩增转导的免疫细胞群。在一些方面，使用不含添加血清的无血清培养基执行(a)至(d)中的每一者。如本文所提及，术语“无血清培养基”或“无血清培养基”意指所使用的生长培养基未补充有血清(例如，人血清或牛血清)。换句话说，出于支持培养细胞的活力、激活和生长的目的，不将血清作为单独分离和不同的成分添加到培养基中。根据本文所述的方法，任何合适的免疫细胞生长培养基都可以用于在悬浮液中培养细胞。例如，免疫细胞生长培养基可以包括但不限于无菌低葡萄糖溶液，该无菌低葡萄糖溶液包含合适量的缓冲液、丙酮酸镁、丙酮酸钙、丙酮酸钠和碳酸氢钠。在一个方面，T细胞生长培养基是OPTMIZER^TM(生命技术公司(Life Technologies))。与用于产生工程改造的免疫细胞的典型方法相比，本文所述的方法可以使用未补充有血清(例如，人或牛)的培养基。

本申请提供用T细胞治疗癌的各种方法。在一个方面，T细胞是针对CD19的CAR-T细胞，其可以通过本申请方法中的任何一种方法与制备用于免疫疗法的T细胞的制造方法的任何步骤的组合来制备，该任何生产方法包括但不限于PCT公布WO2015/120096和WO2017/070395中所述的那些，所述两篇专利出于描述这些方法的目的全文以引用方式并入本文；用于制备阿基仑赛或

的任何和所有方法；用于制备替沙仑赛/Kymriah^TM的任何和所有方法；用于制备免疫疗法用“现成”T细胞的任何和所有方法；以及制备向人施用的淋巴细胞的任何其他方法。在一些方面，该制造方法适于从获自患者的细胞特异性地去除循环肿瘤细胞。

在一个方面，T细胞是通过PCT/US2016/057983中所述的方法制备的CD19 CAR-T细胞。在一个实施方案中，由白细胞单采术产物制备耗竭循环肿瘤细胞的T细胞群。这些细胞可以如PCT/US2016/057983中所述制备，并且在本文中进一步描述为CD19 CAR-T细胞。简而言之，CD19 CAR-T是自体CAR T细胞产物，其中受试者的T细胞被工程改造以表达由与CD28和CD3ζ激活结构域连接的针对CD19的单链抗体片段组成的受体，导致清除表达CD19的细胞。在CAR与CD19⁺靶细胞接合后，CD3ζ结构域激活下游信号传导级联，其导致T细胞激活、增殖和获得效应功能，诸如细胞毒性。CD28的细胞内信号传导结构域提供了与初级CD3ζ信号一起起作用的共刺激信号，以增强T细胞功能，包括白介素(IL)-2产生。总之，这些信号可以刺激CAR T细胞的增殖并直接杀死靶细胞。此外，激活的T细胞可以分泌细胞因子、趋化因子和可以募集并激活附加抗肿瘤免疫细胞的其他分子。CD19 CAR-T细胞中的抗CD19 CAR可以包含FMC63-28Z。

由于某些癌中存在循环肿瘤细胞，CD19 CAR-T细胞的制造包括CD4⁺和CD8⁺T细胞富集步骤。T细胞富集或分离步骤可以减少白细胞单采术物质中的表达的CD19的循环肿瘤细胞，并且可以涉及在制造期间激活、扩增和耗竭抗CD19 CAR T细胞。

本文所述的方法可以增强免疫或细胞疗法的治疗结果或功效，该免疫或细胞疗法可以是选自由以下组成的组的过继T细胞疗法：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程改造的自体细胞疗法(eACT^TM)、同种异体T细胞移植、非T细胞移植及它们的任何组合。过继T细胞疗法广泛包括任何选择、体外富集以及向患者施用识别和能够结合肿瘤细胞的自体或同种异体T细胞。TIL免疫疗法是一种过继T细胞疗法类型，其中能够浸润肿瘤组织的淋巴细胞被分离、体外富集和施用于患者。TIL细胞可以是自体的或同种异体的。自体细胞疗法是过继T细胞疗法，其涉及分离能够靶向患者的肿瘤细胞的T细胞，体外富集T细胞并且将T细胞施用回同一患者。同种异体T细胞移植可以包括离体扩增的天然存在的T细胞或基因工程改造的T细胞的移植。如上文更详细描述的工程改造的自体细胞疗法是过继T细胞疗法，其中患者自身的淋巴细胞被分离，基因修饰以表达肿瘤靶向分子，体外扩增和施用回患者。非T细胞移植可以包括具有非T细胞(诸如但不限于自然杀伤(NK)细胞)的自体或同种异体疗法。

本申请的免疫细胞疗法是工程改造的自体细胞疗法(eACT^TM)。根据该方面，该方法可包括从供体收集免疫细胞。然后可以使分离的免疫细胞与外源激活试剂(例如细胞因子)接触，扩增并工程改造以表达嵌合抗原受体(“工程改造的CAR T细胞”)或T细胞受体(“工程改造的TCR T细胞”)。在一些方面，工程改造的免疫细胞治疗受试者的肿瘤。例如，用逆转录病毒转导所述一种或多种免疫细胞，所述逆转录病毒包括编码细胞表面受体的异源基因。在一个实施方案中，细胞表面受体能够结合靶细胞表面上(例如肿瘤细胞表面上)的抗原。在一些实施方案中，细胞表面受体是嵌合抗原受体或T细胞受体。在另一个实施方案中，可以将所述一种或多种免疫细胞工程改造以表达嵌合抗原受体。嵌合抗原受体可以包含与肿瘤抗原的结合分子。结合分子可以是抗体或其抗原结合分子。例如，抗原结合分子可以选自scFv、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2和dAb以及它们的任何片段或组合。嵌合抗原受体还可以包括铰链区。铰链区可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28或CD8α的铰链区。在一个实施方案中，铰链区衍生自IgG4的铰链区。嵌合抗原受体还可以包含跨膜结构域。跨膜结构域可以是任何跨膜分子的跨膜结构域，该跨膜结构域是免疫细胞上的共受体或免疫球蛋白超家族成员的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域衍生自以下物质的跨膜结构域：CD28、CD28T、CD8α、CD4或CD19。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含衍生自CD28跨膜结构域的结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含衍生自CD28T跨膜结构域的结构域。嵌合抗原受体还可以包含一个或多个共刺激信号传导区。例如，共刺激信号传导区可以是CD28、CD28T、OX-40、41BB、CD27、诱导型T细胞共刺激(ICOS)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、Igα(CD79a)或Fcγ受体的信号传导区。在另外的实施方案中，共刺激信号传导区是CD28信号传导区。在另一个实施方案中，共刺激信号传导区是CD28T信号传导区。在附加实施方案中，嵌合抗原受体还包含CD3ζ信号传导结构域。

在一些方面，肿瘤抗原选自707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、AFP(阿尔法(a)-甲胎蛋白)、ART-4(由T4细胞识别的腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-连环蛋白/m、b-连环蛋白/突变的)、BCMA(B细胞成熟抗原)、Bcr-abl(裂点簇区-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化簇19)、CD20(分化簇20)、CD22(分化簇22)、CD30(分化簇30)、CD33(分化簇33)、CD44v7/8(分化簇44，外显子7/8)、CAMEL(黑色素瘤上的CTL识别的抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽1)、CASP-8(半胱天冬酶8)、CDC27m(突变的细胞分裂周期蛋白27)、CDK4/m(突变的环化素依赖性激酶4)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌/睾丸(抗原))、Cyp-B(亲环蛋白B)、DAM(黑色素瘤上的分化抗原)、EGFR(表皮生长因子受体)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、EGP-2(表皮糖蛋白2)、EGP-40(表皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同源物-2、-3、4)、ELF2M(突变的延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets变体基因6/急性髓样白血病1基因ETS)、FBP(叶酸盐结合蛋白)、fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(二唾液酸神经节苷2)、GD3(二唾液酸神经节苷3)、GnT-V(N-乙酰葡糖胺转移酶V)、Gp100(糖蛋白100kD)、HAGE(解旋酶抗原)、HER-2/neu(人表皮受体2/神经的；也称为EGFR2)、HLA-A(人白细胞抗原A)、HPV(人乳头瘤病毒)、HSP70-2M(突变的热休克蛋白70-2)、HST-2(人环状体肿瘤因子2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠道羧基酯酶)、IL-13R-a2(白介素13受体亚基α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入区受体)、κ轻链、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基转移酶)、LeY(Lewis-Y抗体)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、MAGE(黑色素瘤抗原)、MAGE-A1(黑色素瘤相关抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、鼠CMV感染细胞、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑色素瘤抗原1/黑色素瘤抗原A)、MC1R(黑皮质素1受体)、肌球蛋白/m(突变的肌球蛋白)、MUC1(粘蛋白1)、MUM-1、-2、-3(黑色素瘤遍在突变蛋白1、2、3)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、NKG2D(自然杀伤组2、成员D)配体、NY-BR-1(纽约乳腺分化抗原1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)、癌胚胎抗原(h5T4)、P15(蛋白质15)、p190较小bcr-abl(190KD蛋白质bcr-abl)、Pml/RARa(前髓细胞性白血病/视黄酸受体a)、PRAME(黑色素瘤的优先表达抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE(肾抗原)、RU1或RU2(肾遍在蛋白1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(排斥肿瘤的鳞状抗原1或3)、SSX1、-2、-3、4(滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4)、TAA(肿瘤相关抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、TEL/AML1(易位Ets家族白血病/急性髓样白血病1)、TPI/m(突变的磷酸丙糖异构酶)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1或gp75)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)、WT1(Wilms肿瘤基因)、以及它们的任何组合。在一个实施方案中，肿瘤抗原是CD19。

T细胞疗法包括向患者施用表达T细胞受体的工程改造的T细胞(“工程改造的TCRT细胞”)。T细胞受体(TCR)可以包含与肿瘤抗原的结合分子。在一些方面，肿瘤抗原选自由以下组成的组：707-AP、AFP、ART-4、BAGE、BCMA、Bcr-abl、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44v7/8、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、Erbb2、3、4、ELF2M、ETV6-AML1、FBP、fAchR、G250、GAGE、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A、HPV、HSP70-2M、HST-2、hTERT或hTRT、iCE、IL-13R-a2、KIAA0205、KDR、κ轻链、LAGE、LDLR/FUT、LeY、L1CAM、MAGE、MAGE-A1、间皮素、鼠CMV感染细胞、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NKG2D配体、NY-BR-1、NY-ESO-1、癌胚胎抗原、P15、p190较小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SSX1、-2、-3、4、TAA、TAG-72、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF-R2、WT1以及它们的任何组合。

“CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法”是指嵌合抗原受体(CAR)阳性免疫细胞的悬浮液。此类免疫疗法的实例是Clear CAR-T疗法，其使用不含循环肿瘤细胞并富集CD4+/CD8+T细胞的CAR-T细胞。另一个实例是阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)(也称为Axi-cel^TM，

)。参见Kochenderfer等人，《免疫治疗杂志》(JImmunother)，2009年；32:689-702。其他非限制性实例包括JCAR017、JCAR015、JCAR014、Kymriah(tisagenlecleucel)、Uppsala U.抗CD19CAR(NCT02132624)和UCART19(Celectis)。参见Sadelain等人，《自然综述：癌(Nature Rev.Cancer)》，第3卷，2003年；Ruella等人，《最新血液恶性肿瘤报告(Curr Hematol Malig Rep.)》，纽约施普林格出版社(Springer,NY)，2016年；以及Sadelain等人，《癌发现》(Cancer Discovery)(2013年4月)。为了制备CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法，可以收集患者自身的T细胞并且将其离体通过逆转录转导进行基因修饰而表达嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含连接到CD28和CD3-ζ共刺激结构域的抗CD19单链可变区片段(scFv)。在一些实施方案中，所述CAR包含与4-1BB和CD3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗CD19单链可变片段(scFv)。可以扩增抗CD19 CAR T细胞并将其输注回患者体内，其中它们可以识别并消除表达CD19的靶细胞。

在一个方面，所述TCR包含与病毒癌基因的结合分子。在一个实施方案中，病毒癌基因选自人乳头瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)。在其他实施方案中，TCR包含与睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原的结合分子。在一个实施方案中，睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原选自由以下组成的组：NY-ESO-1、滑膜肉瘤X裂点2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)及它们的任何组合。在另一个实施方案中，TCR包含与谱系特异性抗原的结合分子。在附加实施方案中，谱系特异性抗原选自由以下组成的组：由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)及它们的任何组合。在某些实施方案中，T细胞疗法包括向患者施用表达与CD19结合的嵌合抗原受体的工程改造的CAR T细胞并且还包含CD28共刺激结构域和CD3-ζ信号传导区。在附加实施方案中，该T细胞疗法包括向患者施用KTE-C19。在一个方面，抗原部分还包括但不限于Epstein-Barr病毒(EBV)抗原(例如，EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2)、甲型肝炎病毒抗原(例如，VP1、VP2、VP3)、乙型肝炎病毒抗原(例如，HBsAg、HBcAg、HBeAg)、丙型肝炎病毒抗原(例如，包膜糖蛋白E1和E2)、单纯疱疹病毒1型、2型或8型(HSV1、HSV2或HSV8)病毒抗原(例如，糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、UL20、UL32、US43、UL45、UL49A)、巨细胞病毒(CMV)病毒抗原(例如，糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM或其他包膜蛋白)、人免疫缺陷病毒(HIV)病毒抗原(糖蛋白gp120、gp41或p24)、流感病毒抗原(例如，血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA))、麻疹或流行性腮腺炎病毒抗原、人乳头瘤病毒(HPV)病毒抗原(例如，L1、L2)、副流感病毒病毒抗原、风疹病毒病毒抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)病毒抗原或水痘-带状疱疹病毒病毒抗原。在此类方面，细胞表面受体可以是任何TCR、或识别病毒感染靶细胞上的任何前述病毒抗原的任何CAR。在其他方面，抗原部分与具有免疫或炎症功能障碍的细胞相关。此类抗原部分可以包括但不限于髓磷脂碱蛋白(MBP)、髓磷脂蛋白脂质蛋白质(PLP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、癌胚抗原(CEA)、胰岛素原、谷氨酰胺脱羧酶(GAD65、GAD67)、热休克蛋白(HSP)或参与致病性自身免疫过程或与之相关的任何其他组织特异性抗原。

本文所公开的方法可以涉及包括将一种或多种T细胞转移到患者的T细胞疗法。可以以治疗有效量施用T细胞。例如，治疗有效量的T细胞(例如，工程改造的CAR+T细胞或工程改造的TCR+T细胞)可以是至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹个或至少约10¹⁰个。在另一个方面，治疗有效量的T细胞(例如，工程改造的CAR+T细胞或工程改造的TCR+T细胞)是约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一个实施方案中，治疗有效量的T细胞(例如，工程改造的CAR+T细胞或工程改造的TCR+T细胞)是约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一个实施方案中，CD19 CAR-T细胞的量为2×10⁶个细胞/kg，对于≥100kg的受试者最大剂量为2×10⁸个细胞。在另一个实施方案中，CD19 CAR-T细胞的量为0.5×10⁶个细胞/kg，对于≥100kg的受试者最大剂量为0.5×10⁸个细胞。

可以在施用T细胞疗法之前对患者进行预调理或淋巴耗竭。可以根据本领域已知的任何方法预调理患者，该已知的任何方法包括但不限于用一种或多种化学疗法药物和/或放射疗法治疗。在一些方面，预调理可以包括减少内源性淋巴细胞的数量、去除细胞因子水平、增加一种或多种稳态细胞因子或促炎症因子的血清水平、增强在调理之后施用的T细胞的效应功能、增强T细胞疗法之前的抗原呈递细胞激活和/或可用性或者它们的任何组合的任何治疗。预调理可以包括增加受试者的一种或多种细胞因子的血清水平。所述方法还包括施用化学疗法药。化学疗法药可以是淋巴耗竭(预调理)化学疗法药。有益的预调理治疗方案连同相关的有益生物标记物一起描述于美国专利9,855,298中，该专利据此全文以引用方式并入本文。这些临时专利申请描述了例如调理需要T细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向患者施用指定有益剂量的环磷酰胺(200mg/m²/天与2000mg/m²/天之间)和指定剂量的氟达拉滨(20mg/m²/天与900mg/m²/天之间)。一种这样的剂量方案涉及治疗患者，包括在向患者施用治疗有效量的工程改造的T细胞之前，持续三天每天向患者施用约500mg/m²/天的环磷酰胺和约60mg/m²/天的氟达拉滨。在一个方面，该调理方案包括持续3天的500mg/m²环磷酰胺+30mg/m²氟达拉滨。它们可以在第-4天、第-3天和第-2天或在第-5天、第-4天和第-3天施用(第0天是施用细胞的那天)。在一个实施方案中，该调理方案包括每天200mg/m²、250mg/m²、300mg/m²、400v、500mg/m²环磷酰胺持续2天、3天或4天和20mg/m²、25mg/m²或30mg/m²氟达拉滨持续2天、3天或4天。在一个实施方案中，以及在白细胞单采术之后，调理性化学疗法(每天30mg/m²氟达拉滨和每天500mg/m²环磷酰胺)在静脉内输注CD19 CAR-T细胞的悬浮液之前第-5天、第-4天和第-3天施用。在一些实施方案中，静脉内输注时间在15和120分钟之间。在一个实施方案中，静脉内输注时间在1和240分钟之间。在一些实施方案中，静脉内输注时间至多30分钟。在一些实施方案中，静脉内输注时间为至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至多100分钟。在一些实施方案中，输注量在50和100mL之间。在一些实施方案中，输注量在20和100ml之间。在一些实施方案中，输注体积为约30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL或约65mL。在一些实施方案中，输注量为约68mL。在一些实施方案中，悬浮液已经被冷冻并且在解冻的6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时内使用。在一些实施方案中，悬浮液尚未被冷冻。在一些实施方案中，从输液袋输注该免疫疗法。在一些实施方案中，在输注期间搅拌输液袋。在一些实施方案中，在解冻后3小时内施用该免疫疗法。在一些实施方案中，该悬浮液还包含白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白以约2％至3％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白以约2.5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白以约1％、2％、3％、4％或5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方案中，该悬浮液还包含DMSO。在一些实施方案中，DMSO以约4％至6％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，DMSO以约5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，DMSO以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(v/v)的量存在。

本文所公开的方法可用于治疗受试者的癌、减小肿瘤的大小、杀死肿瘤细胞、防止肿瘤细胞增殖、防止肿瘤的生长、消除患者的肿瘤、防止肿瘤的复发、防止肿瘤转移、诱导患者的缓解或它们的任何组合。在某些方面，所述方法可以诱导完全应答。在其他方面，所述方法可以诱导部分应答。

可治疗的癌包括未血管化、尚未充分血管化或血管化的肿瘤。癌还可包括实体瘤或非实体瘤。

在一个实施方案中，该方法可以被用于治疗携带高水平的表达CD19的循环肿瘤细胞的B细胞恶性肿瘤，并且将被指示用于具有高未满足需求的不同患者群。

MCL的示例性治疗

在一些实施方案中，恶性肿瘤可以是套细胞淋巴瘤(MCL)。MCL是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的侵袭性亚型。MCL占美国(US)的所有新NHL病例的大约6％和西欧(Western Europe)的恶性淋巴瘤的5％至7％，在美国和欧洲的MCL的估计年度发生率为每100,000个人大约1至2例。MCL影响男性的可能性多于女性，并且诊断的中值年龄为68岁。在一些实施方案中，复发性或难治性(r/r)MCL对于用同种异体干细胞移植(allo-SCT)进行治疗是复发性或难治性的，如果患者疾病在移植之前被显示为化学敏感的，则同种异体干细胞移植本身对于患有r/r MCL的患者中的大约25％可能导致持久缓解，但allo-SCT也与高达40％的治疗相关死亡率相关。

在一些实施方案中，r/r MCL对于用硼替佐米、来那度胺和替西罗莫司治疗是复发性或难治性的，用硼替佐米、来那度胺和替西罗莫司治疗本身导致在22％至32％范围内的ORR。Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂诸如依鲁替尼和阿卡替尼分别导致患有r/r MCL的患者中68％和81％的ORR。然而，大多数患者在BTK抑制剂治疗之后进展并且响应于挽救疗法具有较差的结果，其中ORR范围为20％至42％，应答的中值持续时间(DOR)范围为3至5.4个月，并且中值OS范围为2.5至9个月。在一些实施方案中，本公开提供了可以用于治疗具有不良预后因子(诸如高Ki67肿瘤增殖指数表达(≥30％或≥50％)和突变的TP53)的癌。在一些实施方案中，癌是MCL。在一些实施方案中，MCL形态是经典的、多形性的或母细胞样的。在一些实施方案中，Ki-67指数可以介于5％与80％之间。在一些实施方案中，Ki-67指数为约38％。在一些实施方案中，高风险患者具有≥50％的Ki-67和/或通过下一代测序测得的TP53突变。在一些实施方案中，患者年龄≥18岁。在一些实施方案中，MCL通过细胞周期蛋白D1过表达和/或存在t(11:14)的记录在病理上进行确认。

在一些实施方案中，CAR T细胞干预包含T细胞，该T细胞从耗竭循环淋巴瘤细胞的T细胞群进行扩增并且通过从白细胞单采术样品中阳性选择单核细胞而富集CD4+/CD8+T细胞，该白细胞单采术样品在IL-2的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，然后用含有抗CD19 CAR构建体的复制缺陷型病毒载体转导。在一些实施方案中，CAR构建体是FMC63-28ZCAR。使用该方法产生的CAR T细胞可以被称为KTE-X19。在一些实施方案中，细胞是自体的。在一些实施方案中，细胞是异源的。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为2×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为1×10⁶个抗CD19 CART细胞/kg。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为1.6×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg、1.8×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg或1.9×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。在一些实施方案中，CD19 CAR构建体含有CD3ζT细胞激活结构域和CD28信号传导结构域。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之后，在第-5天、第-4天和第-3天每天25mg/m²氟达拉滨和在第-2天每天900mg/m²环磷酰胺的调理疗法后的第0天以单次输注施用CAR T细胞。在一些实施方案中，该调理疗法包括持续3天的每天300mg/m²环磷酰胺和每天30mg/m²氟达拉滨。在一些实施方案中，调理性化学疗法包括在第-5天、第-4天和第-3天每天30mg/m²氟达拉滨和每天500mg/m²环磷酰胺。在一些实施方案中，患者还可以在输注抗CD19 CAR T细胞之前大约30至60分钟接受对乙酰氨基酚和苯海拉明或另一种H1抗组胺剂。在一些实施方案中，患者接受一个或多个附加剂量的抗CD19 CAR T细胞。

在一些实施方案中，MCL癌是复发性/难治性MCL(r/r MCL)。在一些实施方案中，患者已经接受一种或多种既往治疗。在一些实施方案中，患者已经接受1至5种既往治疗。在一些实施方案中，既往治疗可以包括自体SCT、抗CD20抗体、含蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法和/或Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)。在一些实施方案中，BTKi是依鲁替尼(Ibr)。在一些实施方案中，BTKi是阿卡替尼(Acala)。在一些实施方案中，本公开表明，与先前用阿卡替尼治疗的患者相比，先前用依鲁替尼治疗的MCL患者对抗CD19 CAR T细胞疗法具有更明显的应答。因此，本公开提供了一种用抗CD19 CAR T细胞疗法治疗r/r MCL的方法，其中该患者先前已经用依鲁替尼或阿卡替尼治疗并且其癌优选地对依鲁替尼或阿卡替尼是复发性/难治性的。在一些实施方案中，BTKi是替拉鲁替尼(tirabrutinib)(ONO-4059)、泽布替尼(BGB-3111)、CGI-1746或spebrutinib(AVL-292、CC-292)。

在一些实施方案中，本公开表明对于接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者，中值(范围)峰值CAR T细胞水平分别为95.9(0.4–2589.5)、13.7(0.2–182.4)或115.9(17.2–1753.6)。在一些实施方案中，患有MCL的患者中的抗CD19 CAR T细胞疗法的ORR/CR率是在接受既往依鲁替尼的患者中的94％/65％、在接受既往阿卡替尼的患者中的80％/40％和在接受两种BTKi的患者中的100％/100％。在一些实施方案中，接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者中的12个月存活率分别为81％、80％或100％。在一些实施方案中，CAR T细胞扩增与先前用依鲁替尼和/或阿卡替尼治疗的患者中的ORR/CR率相关。因此，在一个实施方案中，用依鲁替尼和阿卡替尼两者治疗患者。在一个实施方案中，本公开提供了一种通过测量峰值CAR T细胞水平并将它们与参考标准进行比较来预测先前用依鲁替尼和/或阿卡替尼治疗的MCL患者中的ORR/CR的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种基于对CAR T细胞峰值水平/基线肿瘤负荷(CEN和INV)的测量来预测进行性应答的方法。在一个实施方案中，比率越高，在/到12个月时有进行性应答的可能性越高。在一个实施方案中，在0.00001与0.005之间的比率预测在/到12个月时无应答。在一个实施方案中，在0.006与0.3之间的比率预测在/到12个月时复发。在一个实施方案中，在0.4与1之间的比率预测在/到12个月时有进行性应答。在一个实施方案中，该比率可以由本领域普通技术人员从平均群体确定。

在一些实施方案中，附加纳入标准包括实施例2中列出的那些。在一些实施方案中，附加排除标准包括实施例2中列出的那些。

在一些实施方案中，患者可能在白细胞单采术之后已经接受了用地塞米松(例如，每天PO或IV给予20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)、甲泼尼龙、依鲁替尼(例如，每天PO给予560mg)和/或阿卡替尼(例如每天两次PO给予100mg)的桥接疗法(在白细胞单采术之后和在化学疗法之前)，并且例如在调理性化学疗法之前5天或更短时间内完成。在一些实施方案中，此类患者可能具有高疾病负荷。在一些实施方案中，桥接疗法选自免疫调节剂、R-CHOP、苯达莫司汀、烷化剂和/或铂基试剂。

在一些实施方案中，本公开表明对CAR T细胞输注有反应的所有MCL患者实现了T细胞扩增，然而未反应的患者未观察到扩增。在一些实施方案中，应答是客观应答(完全应答+部分应答)。本公开表明CAR T细胞水平在前28天中与ORR相关，其中在第0天到第28天的曲线下面积(AUC_0-28)和峰值水平在应答者中比在无应答者中高了>200倍，表明较高的扩增导致更好且可能更深的应答，还如与MRD阳性患者(在第4周)相比在最小残留疾病(MRD，10^-5的灵敏度)阴性患者中的峰值/AUC CAR T细胞水平高了>80倍所指示的。因此，本公开提供了一种预测对CAR T细胞治疗MCL的患者应答和MRD的方法，该方法包括测量峰值/AUC CART细胞水平并将其与参考标准进行比较。在一些实施方案中，在CAR T细胞施用之后第8天和第15天之间观察到峰值CAR T细胞扩增。在一些实施方案中，通过qPCR测量CAR T细胞水平。在一些实施方案中，通过下一代测序监测峰值CAR T细胞水平、AUC_0-28和/或MRD。在一些实例中，在血液的细胞/微升中测量CAR T细胞数量。在一些实例中，通过CAR基因拷贝数/μg宿主DNA来测量CAR T细胞数量。在一些实例中，如以下文献中所述测量CAR T细胞数量：Kochenderfer J.N等人《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncol.)2015；33:540-549。在一个实施方案中，如以下文献所述测量CAR T细胞水平：Locke FL等人《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25(1):285-295。

在一些实施方案中，本公开表明在应答者与无应答者的T细胞扩增之间存在差异。在一些实施方案中，本公开表明应答者(具有完全缓解和部分缓解的那些)中的中值峰值抗CD19 CAR T细胞水平为102.4个细胞/μL(范围：0.2至2589.5个细胞/μL；n＝51)，在无应答者中为12.0个细胞/μL(范围：0.2至1364.0个细胞/μL，n＝8)。在一些实施方案中，本公开表明中值AUC第0-28天(AUC_0-28)在具有客观应答的患者中为1487.0个细胞/μL·天(范围：3.8至2.77×10⁴个细胞/μL·天；n＝51)，在无应答者中为169.5个细胞/μL·天(范围：1.8至1.17 10×10⁴个细胞/μL·天；n＝8)。在未接受皮质类固醇也未接受托珠单抗的患者(n＝18)中的中值峰值(24.7个细胞/μL)抗CD19 CAR T细胞(峰值：和AUC_0-28水平(360.4个细胞/μL·天)类似于仅接受皮质类固醇的患者(n＝2)的那些(峰值：24.2个细胞/μL；AUC_0-28：367.8个细胞/μL·天)。在仅接受托珠单抗的患者(n＝10)中，平均峰值抗CD19 CAR T细胞为86.5个细胞/μL，AUC_0-28为1188.9个细胞/μL·天。在接受皮质类固醇和托珠单抗两者的患者(n＝37)中，平均峰值为167.2个细胞/μL，AUC_0-28为1996.0个细胞/μL·天。中值峰值抗CD19CAR T细胞值在年龄≥65岁的患者(n＝39)中为74.1个细胞/μL，在年龄<65岁的患者(n＝28)中为112.5个细胞/μL。中值抗CD19 CAR T细胞AUC_0-28值在年龄≥65岁的患者中为876.5个细胞/μL·天，在年龄<65岁的患者中为1640.2个细胞/μL·天。性别对抗CD19 CART细胞的AUC _0-28和C_max没有显著影响。因此，本公开提供了一种预测MCL中的应答的方法，该方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后的T细胞扩增并将该水平与参考标准进行比较。

在一些实施方案中，本公开表明CAR T细胞扩增在≥3级MCL患者中比在具有≤3级CRS和NE事件的患者中更高。因此，本公开提供了一种预测≥3级CRS和NE事件的方法，该方法包括测量在CAR T细胞治疗之后的CAR T细胞扩增并将该水平与参考值进行比较，其中该CAR T细胞扩增越高，≥3级CRS和NE事件的机会越大。

在一些实施方案中，通过蛋白质或mRNA水平(其一)测量细胞因子水平。在一些实施方案中，细胞因子水平如以下文献中所述进行测量：Locke FL等人《分子治疗》(MolTher.)，2017；25(1):285-295。

在一些实施方案中，本公开表明血清GM-CSF和IL-6峰值水平(在CAR T细胞施用后约8天达到)与在MCL患者中的≥3级CRS和≥3级NE呈正相关。因此，本公开提供了一种预测≥3级CRS和≥3级NE的方法，该方法包括测量CAR T细胞施用后的GM-CSF和IL-6的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中这些细胞因子的峰值水平越高，≥3级CRS和NE的机会越大。

在一些实施方案中，本公开表明血清铁蛋白与MCL患者中的≥3级CRS呈正相关。因此，本公开提供了一种预测≥3级CRS的方法，该方法包括测量CAR T细胞施用后的血清铁蛋白的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中该铁蛋白峰值水平越高，≥3级CRS的机会越大。

在一些实施方案中，本公开表明血清IL-2和IFN-γ与MCL患者中的≥3级NE呈正相关。因此，本公开提供了一种预测≥3级CRS的方法，该方法包括测量CAR T细胞施用后的血清IL-2和IFN-γ的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中IL-2和IFN-γ的峰值水平越高，≥3级NE的机会越大。

在一些实施方案中，本公开表明C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平与MCL患者中的≥3级NE呈正相关。因此，本公开提供了一种预测≥3级CRS的方法，该方法包括测量CAR T细胞施用后的C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平并将它们与参考水平进行比较，其中所述C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平越高，≥3级NE的机会越大。在一些实施方案中，根据表13和/或表14管理一个或多个不良事件。

在一些实施方案中，本公开表明与≥3级CRS呈正相关的细胞因子峰值血清水平包括IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素。在一些实施方案中，本公开表明与≥3级NE相关的细胞因子峰值血清水平包括IL-2、IL-1Ra、IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-12p40、IFN-γ、IL-10、MCP-4、MIP-1b和颗粒酶B。在一些实施方案中，本公开表明与≥3级CRS和NE两者相关的细胞因子包括IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B。在一些实施方案中，细胞因子血清水平在CAR T细胞施用的7天内达到峰值。因此，本公开提供了一种预测CAR T细胞施用后的≥3级CRS的方法，该方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后的IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和/或穿孔素的峰值血清水平并且将该水平与参考标准进行比较。因此，本公开还提供了一种预测MCL中的≥3级CRS和≥3级NE的方法，该方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后的IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B的峰值血清水平并且将该水平与参考标准进行比较。

在一些实施方案中，本公开表明相对于野生型TP53在具有突变的TP53的MCL的患者中有增加的增殖性(IL-15、IL-2)和炎症性(IL-6、IL-2Rα、sPD-L1和VCAM-1)峰值细胞因子水平的趋势。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种改善对MCL中的CAR T细胞治疗的应答的方法，该方法包括操纵在CAR T细胞施用之后的增殖和/或炎症细胞因子的水平。

在一些实施方案中，本公开表明相对于在一个月时呈MRD阳性的患者，对于在CART细胞施用后一个月时呈MRD阴性的患者，存在增加的IFN-γ和IL-6峰值水平和增加的IL-2的趋势。因此，本公开提供了一种预测患者是否在MCL中呈MRD阴性的方法，该方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后的IFN-γ、IL-6和/或IL-2的峰值血清水平并将该水平与参考标准进行比较。

在一些实施方案中，本公开表明T细胞产物表型在MCL类型之间变化。在一些实施方案中，本公开表明在所制造的抗CD19 CAR T细胞产物中，患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者的中值(范围)CD4+/CD8+T细胞比率分别为0.7(0.04–2.8)、0.6(0.2–1.1)或0.7(0.5–2.0)。产物T细胞表型(中值[范围])包括较少分化的CCR7+T细胞(经典的为40.0％[2.6–88.8]；母细胞样为35.3％[14.3–73.4]；多形性为80.8％[57.3–88.8])以及效应和效应记忆CCR7-T细胞(经典的为59.9％[11.1–97.4]；母细胞样为64.8％[26.6–85.7]；多形性为19.2％[11.1–42.7])。在一些实施方案中，本公开表明患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者的12个月存活率分别为86.7％、67.9％或100％。因此，本公开提供了一种通过操纵向患者施用的T细胞产物表型来改善对经典的、母细胞样或多形性MCL的治疗的方法。

B细胞ALL的示例性治疗

B-ALL细胞通常表达CD19，并且靶向CD19的CAR T细胞疗法是R/RB-ALL的治疗方法。Pehlivan K.C.等人，《最新血液恶性肿瘤报告》(Curr Hematol Malig Rep.)2018；13(5):396-406。含有CD3ζ和CD28共刺激结构域的抗CD19 CAR T细胞疗法开发于美国国家癌研究所(National Cancer Institute)(Kochenderfer JN等人，《免疫治疗杂志》(JImmunother.)，2009；32(7):689-702；Kochenderfer JN等人，《血液》(Blood)，2010；116(19):3875-3886)，其在患有R/R B-ALL的儿童和年龄≤30岁的成人中的1期试验中在中值10个月随访后显示出70％的总体缓解率。Lee DW等人《柳叶刀》(Lancet.)2015；385(9967):517-528。在患有R/R B-ALL的成人中的1期试验中评估的类似CAR构建体提供了在中值29个月随访时83％的完全缓解(CR)率和中值12.9个月的总生存期(OS)。Park JH等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2018；378(5):449-459。在这些研究中，从未富集CD4+/CD8+T细胞的白细胞单采术样品制备CAR T细胞。

在一些实施方案中，本发明涉及一种T细胞产物，其中该T细胞从耗竭循环淋巴瘤细胞的T细胞群进行扩增并且通过从白细胞单采术样品中阳性选择单核细胞而富集CD4+/CD8+T细胞，该白细胞单采术样品在IL-2的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，然后用含有抗CD19 CAR构建体的复制缺陷型病毒载体转导。在一些实施方案中，此类T细胞产物可以用于治疗ALL、CLL、AML。在一些实施方案中，CAR构建体是FMC63-28Z CAR。在一些实施方案中，细胞是自体的。在一些实施方案中，细胞是异源的。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为2×10⁶个抗CD19CAR T细胞/kg。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为1×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。在一些实施方案中，CAR阳性T细胞的剂量为1.6×10⁶个抗CD19CAR T细胞/kg、1.8×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg或1.9×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。在一些实施方案中，CD19 CAR构建体含有CD3ζT细胞激活结构域和CD28信号传导结构域。在一些实施方案中，T细胞产物是KTE-X19。在一些实施方案中，本公开表明如前述段落中所述制备的抗CAR T细胞产物可以用于B细胞ALL和B细胞NHL中。在一个实施方案中，T细胞产物具有表23的产物的特征。在一些实施方案中，产物特征可以选自特定亚群的T细胞的百分比(幼稚、中央记忆、效应和效应记忆)、CD4+细胞的百分比、CD8+细胞的百分比和CD4/CD8比率。在一些实施方案中，产物特征是在表达CD19的靶癌细胞(例如，Toledo)细胞与抗CD19 CAR T产物细胞以1:1比率混合的共培养物中的IFNγ产生水平(pg/mL)。在一个实施方案中，可以使用合格的ELISA在孵育后24小时在细胞培养基中测量IFNγ。在一些实施方案中，这些产物特征中的一种或多种产物特征优于由没有CD4+/CD8+阳性细胞富集的白细胞单采术制备的抗CAR T细胞的产物特征。在一些实施方案中，优良的产物特征可以选自具有幼稚表型(CD45RA+CCR7+)的细胞的百分比增加、具有分化表型(CCR7-)的细胞的百分比降低、产生IFNγ的细胞的水平降低和CD8+细胞水平增加。在一些实施方案中，抗CD19 T细胞产物包含T_CM、中央记忆T细胞(CD45RA-CCR7+)；T_EFF，效应T细胞(CD45RA+CCR7-)；T_EM，效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)；和/或T_N，幼稚样T细胞(CD45RA+CCR7+)。在一些实施方案中，该产物包含T_N幼稚样T细胞(意指为CD45RA+CCR7+的T细胞)并且包含干样记忆细胞。在一些实施方案中，T细胞产物是KTE-X19。在一些实施方案中，KTE-X19具有≥190pg/mL的IFN-γ产生。在某些实施方案中，KTE-X19具有≥90％的CD3+细胞。在一些其他实施方案中，KTE-X19中的NK细胞的百分比为0.1％(范围为0.0％-2.8％)。在一些附加实施方案中，KTE-X19中的CD3^-细胞杂质的百分比为0.5％(范围为0.3％-3.9％)。

在一些实施方案中，癌是复发性/难治性的B细胞ALL。在一些实施方案中，患者为≤21岁。在一些实施方案中，患者为≤21岁，体重≥10kg，并且具有B细胞ALL，该B细胞ALL是原发性难治性的，在第一次诊断的18个月内复发，在≥2线全身性疗法之后是复发性/难治性的，或者在登记之前至少100天在同种异体干细胞移植之后是复发性/难治性的。在一个实施方案中，癌是缓慢进展淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，癌是侵袭性B细胞淋巴瘤，其包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、套细胞淋巴瘤及其母细胞样变体和B淋巴母细胞样淋巴瘤的许多类型、亚型和变体。DLBCL可以是DLBCL NOS、富集T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、CNS的原发性DLBCL、原发性皮肤DLBCL、老年人的腿类型EBV阳性DLBCL。大B细胞的其他淋巴瘤包括与慢性炎症相关的原发性纵隔(胸腺)LBCL、DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿病、ALK阳性LBCL、血浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中产生的大B细胞淋巴瘤和原发性渗出性淋巴瘤。其他类型的淋巴瘤包括具有介于DLBCL与伯基特淋巴瘤之间的特征的不可分类的B细胞淋巴瘤和具有介于DLBCL与经典霍奇金淋巴瘤之间的不可分类的B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、MALT的结节外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤(华氏巨球蛋白血症)和原代性渗出性淋巴瘤。癌可以处于从1期到4期的任何阶段。

ALL是一种常见的儿童恶性肿瘤，构成大约80％的儿童白血病和大约25％的所有儿童癌。大约20％的儿科患者在初始疗法后不会实现长期缓解，并且5年总体生存率为大约55％。Hunger SP等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2015；373:1541-1552；Sun W等人，《白血病》(Leukemia.)2018；32:2316-2325；Rheingold SR等人，《临床肿瘤杂志》(JClin Oncol.)2019；37(增刊，摘要):10008；以及Oskarsson T等人，《血液学》(Haematologica.)2016；101:68-76。对于以下患者结果较差：早期复发或在初始治疗后具有原发性难治性疾病的患者；在干细胞移植后患有难治性/复发性疾病的患者；和多发性复发性患者。Sun W等人，《白血病》(Leukemia.)2018；32:2316-2325；Rheingold SR等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)2019；37(增刊，摘要):10008；Oskarsson T等人，《血液学》(Haematologica.)2016；101:68-76；Nguyen K等人，《白血病》(Leukemia.)2008；22:2142-2150；Crotta A等人，《最新医学研究观点》(Curr Med Res Opin.)2018；34:435-440；Schrappe M等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2012；366:1371-1381。初始诊断的18个月内复发的患者通常具有21％-28％的5年总体生存率。Rheingold SR等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)2019；37(增刊，摘要):10008；Nguyen K等人，《白血病》(Leukemia.)2008；22:2142-2150。实现缓解的可能性和EFS的持续时间随每个后续线的挽救疗法而减少。Sun W等人，《白血病》(Leukemia.)2018；32:2316-2325。患有R/R ALL的小儿和青少年患者在用新型疗法博纳吐单抗和奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)治疗后的结果仍然不良，其中1年总体生存率为约36％，突出了对更有效的治疗选择的需要。vonStackelberg A等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)2016；34:4381-4389。10；BhojwaniD等人，《白血病》(Leukemia.)2019；33:884-892。

在一些实施方案中，癌是B细胞NHL，并且关键登记标准包括年龄<18岁，体重≥10kg，经组织学确认的未另外指定的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL NOS)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤或在DLBCL与BL之间的未分类B细胞淋巴瘤，具有≥1个可测量病变。在一个实施方案中，对于NHL治疗，该疾病可以是原发性难治性的，在≥2线全身性疗法之后是复发性/难治性的，或者在登记≥100天之前在进行自体或同种异体干细胞移植之后是复发性/难治性的。在登记4周内患有急性移植物抗宿主病或需要治疗的慢性移植物抗宿主病的患者可能不符合资格。

在一些实施方案中，这些B细胞ALL和/或B细胞NHL患者接受在第-4天、第-3天和第-2天每天25mg/m²氟达拉滨和在第-2天每天900mg/m²环磷酰胺的调理性化学疗法，然后在第0天以1×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的目标剂量单次输注富集CD4+/CD8+的抗CD19 CART细胞(如上文刚刚所述制备的)。

在一些实施方案中，本公开提供了CD4+/CD8+富集的/癌细胞耗竭的抗CD19 CAR T细胞成功地治疗B细胞ALL的用途，其中该患者的年龄为≥18岁，患有R/R B细胞ALL，定义为对第一线疗法是难治性的(即，原发性难治的)，在第一次缓解之后≤12个月复发，在≥2个既往线的全身性疗法之后是复发性或难治的，或在同种异体干细胞移植(SCT)之后是复发性的。在一些实施方案中，需要患者具有≥5％的骨髓母细胞、0或1的美国东部肿瘤协作组体能状态以及足够的肾、肝和心脏功能。对于接受既往的博纳吐单抗的患者，需要具有CD19表达≥90％的白血病母细胞。具有费城染色体阳性(Ph+)疾病、共存的髓外疾病、没有神经学变化的中枢神经系统(CNS)-2疾病(脑脊髓液[CSF]母细胞具有<5个白细胞/mm³)患者和患有唐氏综合征的患者符合资格。与神经学变化无关的CNS-3疾病(CSF母细胞具有≥5个白细胞/mm³)和CNS障碍病史被排除。在一些实施方案中，在实施例9中描述了附加纳入和排除标准。

在一些实施方案中，患者可以患有原发性难治性的癌。在一些实施方案中，患者可以患有在SCT之后复发的癌。在一些实施方案中，患者可能已经接受既往博纳吐单抗，其可能已经是在抗CD19 CAR T细胞疗法之前使用的最后一种疗法。在一些实施方案中，患者基线特征是在表18中所述的患者中的任何一名患者的患者基线特性。

在一些实施方案中，按2×10⁶、1×10⁶或0.5×10⁶个CAR T细胞/kg向这些B细胞ALL患者施用。在一些实施方案中，0.5×10⁶个CAR T细胞/kg以总体积为40mL的制剂施用。在另一个实施方案中，0.5×10⁶个CAR T细胞/kg以总体积为68mL的制剂施用。在一些实施方案中，CAR T细胞产物以20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、500mL、700mL、800mL、900mL或1000mL的总体积配制。在一些实施方案中，40mL制剂旨在在冷冻/解冻过程期间维持细胞密度和细胞活力。

在一些实施方案中，治疗与不良事件相关。在一些实施方案中，根据表13、表14、表16或它们的组合中的任一者来管理一个或多个不良事件。在一些实施方案中，根据表16原始管理指南(Original Management Guidelines)来管理一个或多个不良事件。在一些实施方案中，根据表16的修订管理指南来管理一个或多个不良事件。在一些实施方案中，可以施用升压药来治疗CRS。在一些实施方案中，与CRS相关的体征或症状包括发烧、恶寒、疲劳、心动过速、恶心、缺氧和低血压。在一些实施方案中，与神经事件相关的体征或症状包括脑病、癫痫发作、意识水平变化、言语障碍、震颤和意识错乱。

在一些实施方案中，患者在基线处可以具有高疾病负荷，其被定义为通过局部查看在骨髓中具有>25％的的白血病母细胞或在外周循环中具有≥1,000个母细胞/mm³)。在一些实施方案中，患者可以在白细胞单采术之后和在调理性化学疗法之前接受桥接化学疗法。在一些实施方案中，桥接化学疗法遵循表17的预定桥接化学疗法方案中的一种桥接化学疗法方案。

在一些实施方案中，在从桥接化学疗法≥7天或5个半衰期(如果更短)清除后施用调理性化学疗法/淋巴耗竭方案。在一些实施方案中，调理性化学疗法/淋巴耗竭方案由在第-4天、第-3天和第-2天每天静脉内(IV)给予25mg/m²氟达拉滨和在第-2天每天IV给予900mg/m²环磷酰胺组成。在第0天，可以施用单次输注抗CD19 CAR T细胞。在一些实施方案中，可以在稍后的时间施用抗CD19 CAR T细胞的附加输注。在一些实施方案中，实现对第一次输注的完全应答的患者可以接受抗CD19 CAR T细胞的第二次输注，如果在缓解>3个月后进展，则所提供的CD19表达已被保留并且中和针对所述CAR的抗体不是可疑的。

在一些实施方案中，液滴数字聚合酶链反应可以用于测量血液中转导的抗CD19CAR+T细胞的存在、扩增和持久性。在一些实施方案中，该程序如以下文献中所述进行：Locke F.L.等人，《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25(1):285-295。在一些实施方案中，本公开提供一种治疗方法，其中CAR T细胞水平如表22所述。在一些实施方案中，本公开表明在复发时可能无法检测到CAR T细胞。中值峰值CAR T细胞水平可能在用1×10⁶个CAR T细胞/kg的情况下最高，并且在接受原始的与修订的AE管理的患者之间可能相似。在一些实施方案中，实现CR/CRi的患者具有比无应答者更大的中值峰值扩增，如具有不可检测的MRD与可检测的MRD的患者那样。与≤2级NE的患者相比，在≥3级NE的患者中还观察到较高的中值峰值扩增。复发的一些患者在复发时可能具有可检测的CD19阳性细胞或者可能不具有可检测的CD19阳性细胞。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术(NeoGenomics公司，美国佛罗里达州迈尔斯堡(Fort Myers,FL))根据以下文献中所述的方法来评估未检测到的MRD(定义为<1个白血病细胞/10,000个活细胞)：Borowitz MJ,Wood BL,Devidas M等人，《血液》(Blood)，2015；126(8):964-971；Bruggemann M.等人，《血液进展》(Blood Adv.)2017；1(25):2456-2466；或Gupta S.等人，《白血病》(Leukemia.)2018；32(6):1370-1379。

在一些实施方案中，本公开表明一些细胞因子、趋化因子和促炎症标志物的峰值水平发生在第7天。在一些实施方案中，与1×10⁶个CAR T细胞/kg相比在给予2×10⁶个CAR T细胞/kg的患者中这些中的一些趋于更高(IL-15、CRP、SAA、CXCL10、IFNγ)，或者在用修订的AE管理的患者中比用原始的AE管理的患者中更低(IL-6、铁蛋白、IL-1RA、IFNγ 、IL-8、CXCL10、MCP-1)。在一些实施方案中，这些蛋白质/生物标志物的水平如图9、图10和图11中所述变化。因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于使用这些蛋白质水平作为≥3级和/或0-2级CRS的生物标志物的方法。在一些实施方案中，本公开提供了根据其在图11中的值使用这些蛋白质水平作为≥3级和/或0-2级CRS的生物标志物的方法。

在一些实施方案中，本公开表明具有≥3级CRS的患者中的峰值IL-15血清水平较低。在一些实施方案中，本公开提供了几种促炎症标志物的中值峰值水平在患有≥3级CRS的患者和具有≥3级NE的患者中趋于更高(IFNγ、IL-8、GM-CSF、IL-1RA、CXCL10、MCP-1、颗粒酶B)，如图11中所述。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于通过测量血清IL-15的峰值水平并与参考标准进行比较来预测患者是否将患有≥3级CRS的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于通过测量IFNγ、IL-8、GM-CSF、IL-1RA、CXCL10、MCP-1和/或颗粒酶B的峰值水平并与参考标准进行比较来预测患者是否将患有≥3级CRS和/或≥3级NE的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种通过施用降低这些生物标志物中的一种或多种的水平的药剂来改进抗CD19 CAR T细胞疗法的方法。

参考水平/标准可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来建立。它们用于鉴定可以进行比较的阈值或值的组(例如，四分位数)以确定每个受试者的所测量值(细胞因子水平、CAR T细胞数量等)落入哪个组或者高于或低于该阈值。这些组是由所选择的不同群体的比较建立的，如本领域典型的。取决于测量值落入的位置，人们可以预测许多治疗特征，诸如客观应答、CRS级别、NE级别等。

在某些实施方案中，癌可以选自源自以下各项的肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、癌症、AIDS相关癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/杆状瘤、中枢神经系统癌、B细胞白血病、淋巴瘤或其他B细胞恶性肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统癌、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性脊髓增生性障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、胚胎肿瘤、中枢神经系统癌、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤因肉瘤家族肿瘤颅外生殖细胞瘤、颅外生殖细胞瘤肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、恶性肿瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、软组织肉瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌伴有隐匿性原发性中线束癌(涉及NUT基因)、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性髓性白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性障碍、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间体分化松果体瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始性神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(gastric/stomach)癌、幕上原始性神经外胚层肿瘤、t细胞淋巴瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、Wilms肿瘤。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗该癌。

在一个实施方案中，该方法可以用于治疗肿瘤，其中该肿瘤是淋巴瘤或白血病。淋巴瘤和白血病是特异性地影响淋巴细胞的血液癌。血液中的所有白细胞均源自骨髓中发现的单一类型的多能造血干细胞。这种干细胞产生骨髓祖细胞和淋巴祖细胞两者，然后该骨髓祖细胞和淋巴祖细胞产生在体内发现的各种类型的白细胞。由骨髓祖细胞产生的白细胞包括T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)、自然杀伤细胞和浆细胞。由淋巴祖细胞产生的白细胞包括巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。淋巴瘤和白血病可能影响患者中的这些细胞类型中的一种或多种细胞类型。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗该肿瘤。

通常，淋巴瘤可以被分成至少两个子组：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是源自B淋巴细胞、T淋巴细胞或自然杀伤细胞的异质癌组。在美国，B细胞淋巴瘤代表80-85％的所报告病例。在2013年，估计发生了大约69,740例与疾病相关的新的NHL病例和超过19,000例死亡病例。非霍奇金淋巴瘤是最普遍的血液恶性肿瘤，并且是男性和女性中新癌的第七大主要部位，并且占所有新癌病例的4％和与癌相关的死亡病例的3％。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗该淋巴瘤。

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是NHL的最常见亚型，占NHL病例的大约30％。每年在美国有大约22,000例新诊断的DLBCL。其被分类为侵袭性淋巴瘤，其中大多数患者用常规化学疗法治愈(NCCN指南NHL2014)。DLBCL的第一线疗法通常包括具有利妥昔单抗的含蒽环霉素的方案，诸如R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)，其具有约80％的客观应答率和约50％的完全应答率，其中约三分之一的患者患有对初始疗法的难治性疾病或在R-CHOP后复发。对于在对第一线疗法作出应答后复发的那些患者，大约40-60％的患者可以实现对附加化学疗法的第二次应答。用于自体干细胞移植(ASCT)的符合资格患者的第二线疗法的护理标准包括利妥昔单抗和组合化学疗法，诸如R-ICE(利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)和R-DHAP(利妥昔单抗、地塞米松、阿糖胞苷和顺铂)，它们各自具有约63％的客观应答率和约26％的完全应答率。响应于第二线疗法并且被认为足够适合移植的患者接受与高剂量化学疗法和ASCT的组合，其在大约一半的移植患者中是治愈的。ASCT失败的患者具有非常不好的预后，也没有治愈选项。与DLBCL相比，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)具有不同的临床、病理和分子特征。PMBCL被认为由胸腺(延髓)B细胞产生，并且代表大约3％的诊断患有DLBCL的患者。PMBCL通常在较年轻的成年群体中在生命的第四十年中鉴定出，女性略微占主导。基因表达谱表明PMBCL与霍奇金淋巴瘤重叠的去调节途径。PMBCL的初始疗法通常包括具有利妥昔单抗的含蒽环霉素的方案，诸如输注剂量可调整的依托泊苷、多柔比星和环磷酰胺以及长春新碱、泼尼松和利妥昔单抗(DA-EPOCH-R)，具有或不具有受累区域放射治疗。卵泡淋巴瘤(FL)、B细胞淋巴瘤是NHL的最常见的懒惰(缓慢生长)形式，占所有NHL的大约20％至30％。一些患有FL的患者将组织学地转化(TFL)为DLBCL，DLBCL更具侵袭性并且与不良结果相关。向DLBCL的组织学转化以大约3％的年度速率进行15年，其中转化的风险继续在随后的年度中下降。组织学转化的生物机制是未知的。TFL的初始治疗受到滤泡性淋巴瘤的既往疗法的影响，但通常包括具有利妥昔单抗的含蒽环霉素的方案以消除疾病的侵袭性组分。复发性/难治性PMBCL和TFL的治疗选项与DLBCL中的治疗选项相似。鉴于这些疾病的低患病率，尚未在这些患者群体中进行大量的前瞻性随机化研究。患有化学疗法难治性疾病的患者与患有难治性DLBCL的患者具有类似或更差的预后。举例来说，患有难治性、侵袭性NHL的受试者(例如，DLBCL、PMBCL和TFL)具有主要未满足的医疗需求，并且在这些群体中需要用新颖治疗进行进一步研究。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗该DLBCL。

本公开的CAR T细胞治疗可以作为第一线治疗或第二或稍后线的治疗施用。在一些实施方案中，CAR T细胞治疗作为第三线、第四线、第五线等等施用。既往疗法线可以是任何既往抗癌疗法，包括但不限于布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)、检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体、帕博利珠单抗(Keytruda)、西米普利单抗(Libtayo)、纳武利尤单抗(Opdivo)；抗PD-L1抗体、阿替利珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)、度伐利尤单抗(Imfinzi)；抗CTLA-4抗体、伊匹单抗(Yervoy))、抗CD19抗体(例如，博纳吐单抗)、抗CD52抗体(例如，阿仑单抗)；同种异体干细胞移植、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、全身化疗、利妥昔单抗、蒽环霉素、奥法木单抗以及它们的组合。既往疗法还可与本申请的CD19 CAR T疗法联合使用。在一个方面，符合资格的患者可患有对最近疗法难治的疾病或在自体造血干细胞移植(HSCT/ASCT)后1年内复发。可以向患有或疑似患有难治性和/或对一个或多个线的既往疗法复发的癌的患者施用CAR T细胞治疗。癌可能对第一线疗法是难治性的(即，原发性难治性)或对一个或多个线的疗法是难治性的。、癌可能在第一次缓解之后的十二个月复发、在两个或更多个线的既往疗法之后复发或是难治性的，或者在HSCT/ASCT之后复发。在一些实施方案中，癌对依鲁替尼或阿卡替尼是难治的。在一些实施方案中，癌是NHL，并且疾病必须是原发性难治性的，在两个或更多个线的全身性疗法之后是复发性/难治性的，或在登记入CAR T细胞疗法之前≥100天和停止免疫抑制药物≥4周在自体或同种异体干细胞移植后是复发性/难治性的。在某些实施方案中，CAR T细胞疗法是KTE-X19。

因此，该方法可以用于治疗淋巴瘤或白血病，其中该淋巴瘤或白血病是B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的实例包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、FL、边缘区淋巴瘤(MZL)、结节外(MALT淋巴瘤)、结节(单核细胞样B细胞淋巴瘤)、脾脏弥漫性大细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和淋巴母细胞性淋巴瘤。在一些方面，淋巴瘤或白血病选自B细胞慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤(例如，华氏巨球蛋白血症)、脾脏边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病、浆细胞肿瘤(例如，浆细胞骨髓瘤(即，多发性骨髓瘤、或浆细胞瘤)、结节外边缘区B细胞淋巴瘤(例如、MALT淋巴瘤)、节点边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化的滤泡性淋巴瘤(TFL)、原发性皮肤毛囊中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Epstein-Barr病毒阳性DLBCL、淋巴细胞样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中产生的大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、T细胞性幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结节外NK/T细胞淋巴瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤伴有复发性遗传异常、T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些方面，癌对一种或多种既往治疗是难治性的，和/或癌在一种或多种既往治疗之后已经复发。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗白血病或淋巴瘤。

在一个实施方案中，癌选自滤泡性淋巴瘤、转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和原发性纵膈(胸腺)大B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌是弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌对化学疗法、放射疗法、免疫疗法(包括T细胞疗法和/或用抗体或抗体-药物缀合物治疗)、自体干细胞移植或它们的任何组合中的一种或多种疗法是难治性的，或已在所述一种或多种疗法之后复发。在一个实施方案中，癌是难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，用KTE-X19治疗该癌。

在一些实施方案中，CAR T细胞治疗是KTE-X19，并且癌选自MCL、ALL、CLL和SLL。在一些实施方案中，CAR T细胞治疗是KTE-X19，并且癌是NHL。在一些实施方案中，癌选自未另外指定的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL NOS)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤或在DLBCL与BL之间的未分类B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌是复发/难治的。在一些实施方案中，KTE-X19治疗作为第一线、第二线疗法或者在1个或多个既往线的疗法之后施用。在一些实施方案中，患者是小儿患者、青少年患者、成年患者、小于65岁、超过65岁或任何其他年龄组的患者。

在一些实施方案中，本文所公开的包含免疫细胞的组合物可以与任何数量的附加治疗剂联合施用。在一个实施方案中，附加治疗剂与T细胞疗法同时施用。在一个实施方案中，附加治疗剂在T细胞疗法之前、期间和/或之后施用。在一个实施方案中，预防性地施用一种或多种附加治疗剂。在一个方面，包含免疫细胞的组合物与用于管理不良事件的药剂(其中许多在本申请别处(包括实施例部分)进行了描述)联合施用。这些药剂可以管理不良反应的一种或多种体征和症状，所述体征和症状诸如发烧、低血压、心动过速、缺氧和发冷，包括心律失常(包括心房纤颤和室性心动过速)、心脏骤停、心力衰竭、肾功能不全、毛细血管渗漏综合征、低血压、缺氧、器官毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症/巨噬细胞激活综合征(HLH/MAS)、癫痫、脑病、头痛、震颤、眩晕、失语、谵妄、失眠焦虑、过敏反应、发烧性中性粒细胞减少、血小板减少、中性粒细胞减少和贫血。

此类药剂的实例包括但不限于托珠单抗、类固醇(例如，甲泼尼龙)、兔抗胸腺细胞球蛋白。在一些方面，可以施用万古霉素和氨曲南(各每天两次IV给予1mg)用于非中性白细胞减少症发烧。在一些方面，该方法还包括施用非镇静的抗癫痫药物以用于癫痫预防；施用促红细胞生成素、阿法达贝泊汀、血小板输注、非格司亭或培非格司亭中的至少一种；和/或施用托珠单抗、司妥昔单抗。在一个方面，该药剂是CSF家族成员诸如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，也称为CSF2)。GM-CSF可由多种造血和非造血细胞类型在受到刺激时产生，并且其可激活/“启动”髓细胞群以产生炎性介质，诸如TNF和白介素1β(IL1β)。在一些实施方案中，GM-CSF抑制剂是结合并中和循环GM-CSF的抗体。在一些实施方案中，抗体选自仑兹鲁单抗；那美芦单抗(AMG203)；GSK3196165/MOR103/奥替利单抗(GSK/MorphoSys)、KB002和KB003(KaloBios)、MT203(Micromet和Nycomed)以及MORAb-022/瑾司鲁单抗(Morphotek)。在一些实施方案中，抗体是该抗体的生物仿制药。在一些实施方案中，拮抗剂是E21R，即拮抗GM-CSF的功能的GM-CSF修饰形式。在一些实施方案中，抑制剂/拮抗剂是小分子。在一个实施方案中，CSF家族成员是M-CSF(也称为巨噬细胞集落刺激因子或CSF1)。抑制或拮抗CSF1的药剂的非限制性示例包括小分子、抗体、嵌合抗原受体、融合蛋白和其他药剂。在一个实施方案中，CSF1抑制剂或拮抗剂是抗CSF1抗体。在一个实施方案中，抗CSF1抗体选自由罗氏公司(例如，RG7155)、辉瑞公司(Pfizer)(PD-0360324)、诺华公司(MCS110/拉妥珠单抗)制备的那些抗体或任何一种所述抗体的生物仿制药型式。在一些实施方案中，抑制剂或拮抗剂使GM-CSF-R-α(亦称CSF2R)或CSF1R受体的活性失活。在一些实施方案中，抑制剂选自马夫利木单抗(以前称为CAM-3001)，一种目前正由医学免疫公司开发的全人源GM-CSF受体α单克隆抗体；卡比拉单抗(Five Prime Therapeutics)；LY3022855(IMC-CS4)(礼来公司)，依米妥珠单抗，也称为RG7155或RO5509554；FPA008，一种人源化单克隆抗体(Five Prime/BMS)；AMG820(安进公司)；ARRY-382(Array Biopharma)；MCS110(诺华公司)；PLX3397(Plexxikon)；ELB041/AFS98/TG3003(ElsaLys Bio、Transgene)、SNDX-6352(Syndax)。在一些实施方案中，抑制剂或拮抗剂在CAR-T细胞中表达。在一些实施方案中，抑制剂是小分子(例如，杂芳基酰胺、喹啉酮系列、吡啶并嘧啶系列)；BLZ945(诺华公司)、PLX7486、ARRY-382、Pexidrtinib(也称为PLX3397)或5-((5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)甲基)-N-06-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)吡啶-2-胺；由Ambit Siosciences公司提供的GW 2580(CAS 870483-87-7)、

(CAS 623142-96-1)、AC708或者在以下文献中列出的任何CSF1R抑制剂：Cannarile等人，《癌免疫治疗杂志》(Journal for ImmunoTherapyof Cancer)2017年，5:53和US20180371093，所述文献出于它们公开抑制剂的目的以引用方式并入本文。GM-CSF或其受体的附加中和抗体已在本领域中进行了描述，包括例如“GM-CSF作为炎性/自身免疫疾病的靶标：现有证据和未来治疗潜力(GM-CSF as a target ininflammatory/autoimmune disease:current evidence and future therapeuticpotential)”，Hamilton,J.A.，《临床免疫学专家评论》(Expert Rev.Clin.Immunol.)，2015年；以及“靶向炎性疾病的GM-CSF(Targeting GM-CSF in inflammatory diseases)”，Wicks,I.P.、Roberts,A.W.，《自然综述：风湿病学》(Nat.Rev.Rheumatol.)，2016年。在其他实施方案中，该药剂是抗IL6或抗IL6受体阻断剂，包括托珠单抗和司妥昔单抗。

在一个方面，治疗剂是化学疗法剂。化学疗法剂的实例包括烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄性激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；布沙莫司汀；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOLTM，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和多西他赛(

罗纳普朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，诸如TargretinTM(蓓萨罗丁)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯帕米霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些方面，包含本文所公开的表达CAR和/或TCR的免疫效应细胞的组合物可与用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂联合施用，该抗激素剂诸如为抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬、LY117018、奥那司通和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下，还施用化学疗法剂的组合，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺

多柔比星(羟基多柔比星)、长春新碱

和泼尼松。

这些化学疗法剂可以在工程改造的细胞或核酸施用的同时或施用后一周内施用。在其他方面，化学疗法剂在工程改造的细胞或核酸施用后1至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月或1周至12个月施用。在一些方面，化学疗法剂在施用该细胞或核酸之前至少1个月施用。在一些方面，所述方法还包括施用两种或更多种化学疗法剂。

多种附加治疗剂可与本文所述的组合物或药剂/治疗联合/组合使用。例如，潜在有用的附加治疗剂包括PD-1抑制剂，诸如纳武单抗

派姆单抗

派姆单抗、匹地利珠单抗(CureTech)和阿特珠单抗(罗氏公司(Roche))、托珠单抗(具有和不具有皮质类固醇；GM-CSF、CSF1、GM-CSFR、或CSF1R GM-CSF、CSF1、GM-CSFR或CSF1R的抑制剂(抗CSF1抗体选自由以下公司制造的那些：罗氏公司(例如，RG7155)、辉瑞公司(Pfizer)(PD-0360324)、诺华公司(Novartis)(MCS110/lacnotuzumab))、Mavrilimumab(以前为CAM-3001)、最近由米迪缪尼公司(MedImmune,Inc.)开发的完全人GM-CSF受体α单克隆抗体；卡比拉单抗(Five Prime Therapeutics)；LY3022855(IMC-CS4)(礼来公司)，依米妥珠单抗，也称为RG7155或RO5509554；FPA008，一种人源化单克隆抗体(Five Prime/BMS)；AMG820(安进公司)；ARRY-382(Array Biopharma)；MCS110(诺华公司)；PLX3397(Plexxikon)；ELB041/AFS98/TG3003(ElsaLys Bio、Transgene)、SNDX-6352(Syndax)。在一些方面，抑制剂或拮抗剂在CAR-T细胞中表达。在一些方面，抑制剂是小分子(例如，杂芳基酰胺、喹啉酮系列、吡啶并嘧啶系列)；BLZ945(诺华公司)、PLX7486、ARRY-382、Pexidrtinib(也称为PLX3397)或5-((5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)甲基)-N-06-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)吡啶-2-胺；由Ambit Siosciences公司提供的GW 2580(CAS 870483-87-7)、

(CAS 623142-96-1)、AC708或者在以下文献中列出的任何CSF1R抑制剂：Cannarile等人，《癌免疫治疗杂志》(Journal for ImmunoTherapy of Cancer)，2017年，5:53和US20180371093，所述文献出于它们公开抑制剂的目的以引用方式并入本文。在本领域中已经描述了针对GM-CSF或其受体的附加中和抗体。适合与本文所公开的组合物或药剂/治疗和方法联合使用的附加治疗剂包括但不限于依鲁替尼

奥法木单抗

利妥昔单抗

贝伐珠单抗

曲妥珠单抗

恩美曲妥珠单抗

伊马替尼

西妥昔单抗

帕尼单抗

卡妥索单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、吉妥珠单抗、厄洛替尼、吉非替尼、凡德他尼、阿法替尼、拉帕替尼、来那替尼、来那度胺、阿西替尼、马赛替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、托珠单抗、妥拉尼布、来他替尼、阿西替尼、西地尼布、乐伐替尼、尼达尼布、帕唑帕尼、瑞格非尼、司马沙尼、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼、妥拉尼布、凡德他尼、恩曲替尼、卡博替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、普纳替尼、拉多替尼、博舒替尼、来他替尼、鲁索替尼、帕克替尼、考比替尼、司美替尼、曲美替尼、比美替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、克唑替尼、阿柏西普、阿地伯肽(adipotide)、地尼白介素、mTOR抑制剂诸如依维莫司和替西罗莫司、hedgehog抑制剂诸如索尼德吉和维莫德吉、CDK抑制剂诸如CDK抑制剂(帕博西尼)。

包含免疫细胞的组合物或药剂/治疗与或可以与抗炎剂一起施用。抗炎剂或抗炎药可包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、皮质类固醇、氢化可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)；非甾体抗炎药(NSAIDS)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化剂(sialylate)。示例性镇痛药包括对乙酰氨基酚、羟考酮、曲马朵或盐酸丙氧芬。示例性糖皮质激素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包括针对细胞表面标记物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂诸如TNF拮抗剂(例如，依那西普

阿达木单抗

和英夫利昔单抗

趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包括单克隆抗体以及分子的重组形式。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、金制剂(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。

本文所述的组合物或药剂/治疗可以与作为附加治疗剂的细胞因子和/或细胞因子调节剂联合施用。细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO、

)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，肿瘤坏死因子诸如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。在一个实施方案中，本文所述的组合物与类固醇或皮质类固醇联合施用。

皮质类固醇治疗可以用于治疗不良事件。在检测到不良事件的任何症状之前和/或在检测到不良事件之后，可以预防性地使用皮质类固醇(或任何其他类固醇以及不良事件的任何其他治疗)。它们可以在T细胞施用之前、在T细胞施用当天(在T细胞施用之前、之后和/或期间)和/或在T细胞施用之后施用一天或多天。它们可以在调理性疗法之前、期间或之后施用。任何皮质类固醇对于该使用都可为适当的。在一个实施方案中，皮质类固醇是地塞米松。在一些实施方案中，皮质类固醇是甲泼尼龙。在一些实施方案中，联合施用这两种物质。在一些实施方案中，糖皮质激素包括合成和非合成糖皮质激素。示例性糖皮质激素包括但不限于：阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松(例如，二丙酸倍氯米松)、倍他米松(例如，倍他米松17戊酸酯、倍他米松醋酸钠、倍他米松磷酸钠、戊酸倍他米松)、布地奈德、氯倍他索(例如，丙酸氯倍他索)、氯倍他松、氯可托龙(例如，新戊酸氯可托龙)、氯泼尼醇、皮质酮、可的松和氢化可的松(例如，醋酸氢化可的松)、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松(例如，21-磷酸地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠)、双氟拉松(例如，双醋酸双氟拉松)、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟氢可的松(例如，醋酸氟氢可的松)、氟米松(例如，新戊酸氟米松)、氟尼缩松、氟轻松(例如，醋酸氟轻松)、氟轻松醋酸酯、氟可丁、氟可龙、氟米龙(例如，醋酸氟米龙)、氟培龙(例如，醋酸氟培龙)、氟泼尼定、氟泼尼龙、氟氢缩松、氟替卡松(例如，丙酸氟替卡松)、福莫可他、哈西奈德、卤贝他索、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松(例如，氢化可的松21-丁酸酯、氢化可的松醋丙酯、醋酸氢化可的松、丙丁氢化可的松、丁酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、半琥珀酸氢化可的松、丙丁酸氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、戊酸氢化可的松)、依碳氯替泼诺、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙(醋丙甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、半琥珀酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠)、莫米松(例如，糠酸莫米松)、帕拉米松(例如，醋酸帕拉米松)、泼尼卡酯、泼尼松龙(例如，泼尼松龙25-二乙氨基醋酸酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙21-半琥珀酸酯、醋酸泼尼松龙；法呢酸泼尼松龙、半琥珀酸泼尼松龙、泼尼松龙-21(β-D-葡糖苷酸)、间磺苯甲酸泼尼松龙、司替泼尼松龙、丁乙酸泼尼松龙、四氢邻苯二甲酸泼尼松龙)、泼尼松、戊酸泼尼松龙、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙(例如，曲安奈德、苯曲安奈德、己曲安奈德、曲安奈德21棕榈酸酯、曲安西龙双醋酸酯)。这些糖皮质激素及其盐在例如以下文献中详细讨论：《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)，A.Osol编辑，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.)(1980年第16版)和《雷明顿：药学科学和实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，第22版，宾夕法尼亚州费城的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)(2013年)以及任何其他版本，这些文献据此以引用方式并入。在一些实施方案中，糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。在一个实施方案中，糖皮质激素是地塞米松。在其他实施方案中，类固醇是盐皮质激素。可在本文提供的方法中使用任何其他类固醇。

可按照可适应于不良事件(例如，CRS和NE)的严重程度/级别的任何施用剂量和频率来施用该一种或多种皮质类固醇。表13、表14和表16提供了用于管理CRS和NE的给药方案的示例。在另一个实施方案中，皮质类固醇施用包括口服或静脉内施用10mg地塞米松，每天1至4次。另一个实施方案(有时称为“高剂量”皮质类固醇)包括每天单独或与地塞米松联合静脉内施用1g甲基强的松。在一些实施方案中，按每天1至2mg/kg的剂量施用该一种或多种皮质类固醇。

可按有效改善与不良事件(诸如与CRS或神经毒性)相关的一种或多种症状的任何量施用皮质类固醇。可例如按每剂在或约在0.1与100mg之间、0.1至80mg、0.1至60mg、0.1至40mg、0.1至30mg、0.1至20mg、0.1至15mg、0.1至10mg、0.1至5mg、0.2至40mg、0.2至30mg、0.2至20mg、0.2至15mg、0.2至10mg、0.2至5mg、0.4至40mg、0.4至30mg、0.4至20mg、0.4至15mg、0.4至10mg、0.4至5mg、0.4至4mg、1至20mg、1至15mg或1至10mg的量，向70kg成人受试者施用皮质类固醇(例如，糖皮质激素)。通常，按每剂在或约在0.4与20mg之间，例如在或约在0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg的量，向普通成人受试者施用皮质类固醇(诸如糖皮质激素)。

在一些实施方案中，可例如按在或约在0.001mg/kg(受试者)、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.025mg/kg、0.03mg/kg、0.035mg/kg、0.04mg/kg、0.045mg/kg、0.05mg/kg、0.055mg/kg、0.06mg/kg、0.065mg/kg、0.07mg/kg、0.075mg/kg、0.08mg/kg、0.085mg/kg、0.09mg/kg、0.095mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.50mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.65mg/kg、0.70mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.90mg/kg、0.95mg/kg、1mg/kg、1.05mg/kg、1.1mg/kg、1.15mg/kg、1.20mg/kg、1.25mg/kg、1.3mg/kg、1.35mg/kg或1.4mg/kg的剂量，向通常重约70kg至75kg的普通成人受试者施用皮质类固醇。

一般来讲，施用的皮质类固醇的剂量取决于特定皮质类固醇，因为不同皮质类固醇之间存在效力差异。通常应当理解，药物的效力各不相同，因此要获得等效的效果，剂量会改变。各种糖皮质激素和给药途径的效力方面的等效性是熟知的。与等效类固醇给药(以非时间治疗方式)相关的信息可见于《英国国家处方集》(British National Formulary，BNF)37，1999年3月。

在一些实施方案中，不良事件/反应可以选自以下中的一个或多个：

其他不良反应包括：胃肠道障碍；干口；感染和侵染障碍：真菌感染；代谢和营养障碍：脱水；神经系统障碍：共济失调、癫痫发作、颅内压力增加；呼吸道、胸部和纵隔障碍：呼吸衰竭、肺水肿；皮肤和皮下组织障碍：皮疹；血管障碍：出血。

在一个实施方案中，细胞因子释放综合征的症状包括但不限于发烧、寒颤、疲劳、厌食、肌痛、arthalgia、恶心、呕吐、头痛、皮疹、腹泻、呕吐、头痛、皮疹、腹泻、呼吸急促、低氧血症、心动过速、低血压、脉压宽、早期心输出量增加、晚期心输出量增加减弱、幻觉、震颤、步态改变、癫痫发作和死亡。在一个实施方案中，对CRS进行分级的方法描述于Neelapu等人，《自然评论-临床肿瘤学》(Nat Rev Clin Oncol.)，15(1):47-62，2018年以及Lee等人，《血液》(Blood)，2014年；124:188-195。在一个实施方案中，神经毒性/神经事件可以通过Lee等人，《血液》(Blood)，2014年；124:188-195中所述的方法进行分级。

在一些实施方案中，不良事件用托珠单抗(或另一种抗IL6/IL6R药剂/拮抗剂)、皮质类固醇疗法或抗癫痫药物来管理以进行毒性预防。在一些实施方案中，不良事件通过选自GM-CSF、CSF1、GM-CSFR或CSF1R的抑制剂、抗胸腺细胞球蛋白、lenzilumab、mavrilimumab、细胞因子和抗炎剂的一种或多种药剂来管理。

在一些实施方案中，本公开提供了防止发展对本公开的T细胞治疗的不良反应或降低其严重程度的方法。在一些实施方案中，细胞疗法与一种或多种预防、延迟不良事件的发作、减少不良事件的症状、治疗不良事件的药剂一起施用，从而，该不良事件包括细胞因子释放综合征和神经毒性。在一个实施方案中，上文已经描述了该药剂。在其他实施方案中，该药剂在下文进行了描述。在一些实施方案中，该药剂通过本说明书中别处所描述的方法和剂量之一在施用细胞之前、之后或同时施用。在一个实施方案中，将该药剂施用于可能易感染疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者。

在这方面，所公开的方法可以包括施用“预防有效量”的托珠单抗、皮质类固醇疗法和/或抗癫痫药物用于毒性预防。在一些实施方案中，该方法包括施用GM-CSF、CSF1、GM-CSFR或CSF1R的抑制剂、lenzilumab、mavrilimumab、细胞因子和/或抗炎剂。药理学和/或生理学效应可以是预防性的，即，该效应完全或部分预防疾病或其症状。“预防有效量”可以是指对于实现期望的预防性结果(例如，预防不良反应的发作)有效(在剂量上和所必需的时间段)的量。

在一些实施方案中，该方法包括在任何受试者中的不良反应的管理。在一些实施方案中，不良反应选自细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性、超敏反应、严重感染、血细胞减少和低丙球蛋白血症。在一些实施方案中，不良反应的体征和症状选自发烧、低血压、心动过速、缺氧和发冷，包括心律失常(包括心房纤颤和室性心动过速)、心脏骤停、心力衰竭、肾功能不全、毛细血管渗漏综合征、低血压、缺氧、器官毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症/巨噬细胞活化综合征(HLH/MAS)、癫痫、脑病、头痛、震颤、眩晕、失语、谵妄、失眠焦虑、过敏反应、发热性中性粒细胞减少、血小板减少、中性粒细胞减少和贫血。在一些实施方案中，基于不良事件的生物标志物中的一种或多种生物标志物鉴定和选择患者。在一些实施方案中，已经简单地通过临床呈现(例如，毒性症状的存在和级别)来鉴定和选择患者。在一些实施方案中，不良事件通过表13、表14、表16和表17中的任何一种方案来管理。

在一些实施方案中，该方法包括预防或降低嵌合受体治疗中的CRS的严重程度。在一些实施方案中，工程改造的CAR T细胞在施用于患者后失活。在一些实施方案中，该方法包括基于临床表现来鉴定CRS。在一些实施方案中，该方法包括评估并治疗发烧、缺氧和低血压的其他病因。应使用连续心脏遥测术和脉膊血氧测定法监测发生≥2级CRS(例如，低血压、对补液无应答或需补氧的缺氧)的患者。在一些实施方案中，对于发生严重CRS的患者，考虑执行超声心动图以评估心脏功能。对于严重或危及生命的CRS，可考虑重症监护支持疗法。在一些实施方案中，该方法包括在输注后，在经认证的医疗机构处至少每天监测患者的CRS体征和症状，持续7天。在一些实施方案中，该方法包括在输注后，监测患者的CRS的体征或症状4周。在一些实施方案中，该方法包括如果在任何时候出现CRS的体征或症状，则建议患者立即就医。在一些实施方案中，在表现出CRS的首发体征时，用支持性护理、托珠单抗或托珠单抗和皮质类固醇进行治疗。

在一些实施方案中，该方法包括监测患者的神经毒性的体征和症状。在一些实施方案中，该方法包括排除神经症状的其他病因。应使用连续心脏遥测术和脉膊血氧测定法监测发生≥2级神经毒性的患者。为严重或危及生命的神经毒性提供重症监护支持疗法。在一些实施方案中，神经毒性的症状选自脑病、头痛、震颤、头晕、失语、谵妄、失眠和焦虑。

在一些实施方案中，该细胞治疗在施用治疗和/或预防(预防性)不良事件的一种或多种症状的一种或多种药剂(例如，类固醇)或治疗(例如，斑块切除)之前、期间/同时和/或之后施用。预防有效量是指在一定剂量下且在必要的时间段内有效达到期望的预防结果的量。在一个实施方案中，预防有效量在疾病的较早期阶段之前或之时用于受试者。在一个实施方案中，预防有效量将小于治疗有效量。在一个实施方案中，向将接受、症状接受或已经接受细胞疗法的任何患者施用不良事件治疗或预防。在一些实施方案中，管理不良事件的方法包括在输注后，在经认证的医疗机构处至少每天监测患者的神经毒性体征和症状，持续7天。在一些实施方案中，该方法包括在输注后，监测患者的神经毒性和/或CRS的体征或症状4周。

在一些实施方案中，本公开提供了两种管理接受用类固醇和抗IL6/抗IL-6R抗体的CAR T细胞治疗的受试者中的不良事件的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种管理不良事件的方法，其中如果在3天后没有改善和对于所有≥1级神经事件，则启动皮质类固醇疗法用于管理所有1级CRS的病例。在一个实施方案中，如果在3天后没有改善和对于所有≥2级神经事件，则启动托珠单抗用于所有1级CRS的病例。在一个实施方案中，本公开提供了一种减少在CAR T细胞施用之后接受不良事件管理的患者中的总体类固醇暴露的方法，该方法包括如果在3天后没有改善以及对于所有≥1级神经事件，则启动皮质类固醇疗法用于管理所有1级CRS的病例，和/或如果在3天后没有改善和对于所有≥2级神经事件，则启动托珠单抗。在一个实施方案中，皮质类固醇和托珠单抗以选自实施例部分中例示的那些方案的方案施用。在一个实施方案中，本公开表明较早期类固醇使用与严重感染的风险增加、CAR T细胞扩增减少或肿瘤应答减少不相关。

在一个实施方案中，本公开支持左乙拉西坦预防在CAR T细胞癌治疗中的安全性。在一个实施方案中，癌是NHL。在一个实施方案中，癌是R/R LBCL，并且患者接受KTE-X19。因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种管理用CAR T细胞治疗的患者中的不良事件的方法，该方法包括向该患者施用预防性剂量的抗癫痫药物。在一些实施方案中，如果在中断预防性左乙拉西坦后发生神经事件，则患者在CAR T细胞治疗的第0天开始(调理后)并且还在≥2级神经毒性发作时接受左乙拉西坦(例如，每天两次口服或静脉内给予750mg)。在一个实施方案中，如果患者未经历任何≥2级神经毒性，则左乙拉西坦逐渐减量并且如临床上所指示中断。在一个实施方案中，将左乙拉西坦预防与任何其他不良事件管理方案组合。

在一个实施方案中，患者可以在第0天开始接受左乙拉西坦(每天两次口服或静脉内给予750mg)。在≥2级神经事件的发作时，将左乙拉西坦剂量增加至每天两次1000mg。在一个实施方案中，如果患者未经历任何≥2级神经事件，则左乙拉西坦逐渐减量并且如临床上所指示停药。在第2天患者还接受托珠单抗(在1小时内IV给予8mg/kg[不超过800mg])。可以在患有共存病或年龄年长的患者的2级CRS发作时推荐或者在≥3级CRS的情况下推荐进一步的托珠单抗(±皮质类固醇)。对于经历≥2级神经事件的患者，启动托珠单抗，并且对于患有共存病或年龄年长的患者，或者如果存在≥3级神经事件的任何发生，尽管使用了托珠单抗仍有症状恶化时，添加皮质类固醇。

在一个实施方案中，本公开表明预防性类固醇使用似乎降低了与早期类固醇使用施用相似程度的严重CRS和NE的比率。因此，本公开提供了用于管理CAR T细胞疗法中的不良事件的方法，其中患者在第0天(在输注之前)、第1天和第2天接受PO给予的地塞米松10mg。当3天支持性护理之后未观察到改善时，还可以从1级NE和1级CRS开始施用类固醇。如果在支持性护理24小时后未观察到改善，那么也可以施用托珠单抗用于管理≥1级CRS。在一个实施方案中，本公开表明用中和和/或耗竭GM-CSF的抗体的CAR T细胞疗法的不良事件管理防止或减少了所治疗患者中的治疗相关CRS和/或NE。在一个实施方案中，该抗体是lenzilumab。

在一些实施方案中，通过施用作为IL-6或IL-6受体(IL-6R)的拮抗剂或抑制剂的一种/多种药剂来管理不良事件。在一些实施方案中，该药剂是中和IL-6活性的抗体，诸如结合IL-6或IL-6R的抗体或抗原结合片段。例如，在一些实施方案中，该药剂是或包括托珠单抗(阿替珠单抗(atlizumab))或沙利姆单抗、抗IL-6R抗体。在一些实施方案中，该药剂是美国专利8,562,991中描述的抗IL-6R抗体。在一些情况下，靶向IL-6的药剂是抗TL-6抗体，诸如司妥昔单抗、艾西莫单抗、ALD518/BMS-945429、西卢卡单抗(CNTO 136)、CPSI-2634、ARGX 109、FE301、FM101或奥洛珠单抗(CDP6038)及它们的组合。在一些实施方案中，该药剂可通过抑制配体-受体相互作用来中和IL-6活性。在一些实施方案中，IL-6/IL-6R拮抗剂或抑制剂是IL-6突变蛋白，诸如美国专利5591827中所述的IL-6突变蛋白。在一些实施方案中，作为IL-6/IL-6R拮抗剂或抑制剂的药剂是小分子、蛋白质或肽或者核酸。

在一些实施方案中，可用于管理不良反应及其症状的其他药剂包括细胞因子受体或细胞因子的拮抗剂或抑制剂。在一些实施方案中，细胞因子或受体是IL-10、TL-6、TL-6受体、IFNy、IFNGR、IL-2、IL-2R/CD25、MCP-1、CCR2、CCR4、MIP13、CCR5、TNFα、TNFR1诸如TL-6受体(IL-6R)、IL-2受体(IL-2R/CD25)、MCP-1(CCL2)受体(CCR2或CCR4)、TGF-β受体(TGF-βI、II或III)、IFN-γ受体(IFNGR)、MIP1P受体(例如，CCR5)、TNFα受体(例如，TNFR1)、IL-1受体(IL1-Ra/IL-1RP)或IL-10受体(IL-10R)、IL-1和IL-1Rα/IL-1β。在一些实施方案中，该药剂包括司妥昔单抗、沙利姆单抗、奥洛珠单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、ALD518/BMS-945429、西卢卡单抗(CNTO 136)、CPSI-2634、ARGX 109、FE301或FM101。在一些实施方案中，该药剂是细胞因子的拮抗剂或抑制剂，该细胞因子诸如为转化生长因子β(TGF-β)、白介素6(TL-6)、白介素10(IL-10)、IL-2、MIP13(CCL4)、TNFα、IL-1、干扰素γ(IFN-γ)或单核细胞趋化蛋白-I(MCP-1)。在一些实施方案中，该药剂是靶向细胞因子受体(例如，抑制细胞因子受体或作为细胞因子受体的拮抗剂)的药剂，该细胞因子受体诸如为TL-6受体(IL-6R)、IL-2受体(IL-2R/CD25)、MCP-1(CCL2)受体(CCR2或CCR4)、TGF-β受体(TGF-βI、II或III)、IFN-γ受体(IFNGR)、MIP1P受体(例如，CCR5)、TNFα受体(例如，TNFR1)、IL-1受体(IL1-Ra/IL-1RP)或IL-10受体(IL-10R)及它们的组合。在一些实施方案中，该药剂通过本说明书中别处所描述的方法和剂量之一在施用细胞之前、之后或同时施用。

在一些实施方案中，以约1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至8mg/kg、2mg/kg至6mg/kg、2mg/kg至4mg/kg或6mg/kg至8mg/kg(均包括端值)的剂量施用该药剂，或以至少或至少约2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg或8mg/kg的剂量施用该药剂。在一些实施方案中，以约1mg/kg至12mg/kg(诸如为或为约10mg/kg)的剂量施用。在一些实施方案中，通过静脉内输注来施用该药剂。在一个实施方案中，该药剂是托珠单抗。在一些实施方案中，该药剂(例如，特异性托珠单抗)通过本说明书中别处所描述的方法和剂量之一在施用细胞之前、之后或同时施用。

在一些实施方案中，该方法包括基于临床表现来鉴定CRS。在一些实施方案中，该方法包括评估并治疗发烧、缺氧和低血压的其他病因。如果观察到或怀疑有CRS，则可根据方案A中的推荐来管理CRS，所述推荐还可与本公开的其他治疗(包括CSF/CSFR1轴的中和或减少)联合使用。应使用连续心脏遥测术和脉膊血氧测定法监测发生≥2级CRS(例如，低血压、对补液无应答或需补氧的缺氧)的患者。在一些实施方案中，对于发生严重CRS的患者，考虑执行超声心动图以评估心脏功能。对于严重或危及生命的CRS，可考虑重症监护支持疗法。在一些实施方案中，在本文所公开的方法中，可使用托珠单抗的生物仿制药或等效药代替托珠单抗。在其他实施方案中，可使用另一种抗IL6R代替托珠单抗。

在一些实施方案中，根据以下方案(方案A)来管理不良事件：

(a)Lee DW等人，2014年，细胞因子释放综合征诊断和管理的当前概念(Currentconcepts in the diagnosis and management of cytokine releasesyndrome)，《血液》(Blood)，2014年7月10日；第124卷，第2期，第188–195页。

(b)有关神经毒性的管理，请参阅表2。

(c)有关详细信息，请参阅

(托珠单抗)处方信息，https://www.gene.com/download/pdf/actemra_prescribing.pdf(上次访问时间：2017年10月18日)。其中指出了美国初次批准的时间为2010年。

神经毒性

在一些实施方案中，该方法包括监测患者的神经毒性的体征和症状。在一些实施方案中，该方法包括排除神经症状的其他病因。应使用连续心脏遥测术和脉膊血氧测定法监测发生≥2级神经毒性的患者。为严重或危及生命的神经毒性提供重症监护支持疗法。对于任何≥2级神经毒性，考虑非镇静的抗癫痫药物(例如，左乙拉西坦)以用于癫痫预防。以下治疗可与本公开的其他治疗(包括CSF/CSFR1轴的中和或减少)联合使用。

在一些实施方案中，根据以下方案(方案B)来管理不良事件：

采用皮质类固醇的附加安全管理策略

在1级下施用皮质类固醇和/或托珠单抗可被视为预防性的。可在所有CRS和NE严重性级别下在所有方案中提供支持性护理。在用于管理与CRS相关的不良事件的方案的一个实施方案中，按如下方式施用托珠单抗和/或皮质类固醇：1级CRS：无托珠单抗；无皮质类固醇；2级CRS：托珠单抗(仅在并存病或较大年龄的情况下)；和/或皮质类固醇(仅在并存病或较大年龄的情况下)；3级CRS：托珠单抗；和/或皮质类固醇；4级CRS：托珠单抗；和/或皮质类固醇。在用于管理与CRS相关的不良事件的方案的另一个实施方案中，按如下方式施用托珠单抗和/或皮质类固醇：1级CRS：托珠单抗(如果3天后无改善)；和/或皮质类固醇(如果3天后无改善)；2级CRS：托珠单抗；和/或皮质类固醇；3级CRS：托珠单抗；和/或皮质类固醇；4级CRS：托珠单抗；和/或皮质类固醇，高剂量。

在用于管理与NE相关的不良事件的方案的一个实施方案中，按如下方式施用托珠单抗和/或皮质类固醇：1级NE：无托珠单抗；无皮质类固醇；2级NE：无托珠单抗；无皮质类固醇；3级NE：托珠单抗；和/或皮质类固醇(只有在托珠单抗未起到改善作用时才采用标准剂量)；4级NE：托珠单抗；和/或皮质类固醇。在用于管理与NE相关的不良事件的方案的另一个实施方案中，按如下方式施用托珠单抗和/或皮质类固醇：1级NE：无托珠单抗；和/或皮质类固醇；2级NE：托珠单抗；和/或皮质类固醇；3级NE：托珠单抗；和/或皮质类固醇，高剂量；4级NE：托珠单抗；和/或皮质类固醇，高剂量。在一个实施方案中，在CRS级别≥2时开始皮质类固醇治疗并且在CRS级别≥2时开始托珠单抗治疗。在一个实施方案中，在CRS级别≥1时开始皮质类固醇治疗并且在CRS级别≥1时开始托珠单抗治疗。在一个实施方案中，在NE级别≥3时开始皮质类固醇治疗并且在CRS级别≥3时开始托珠单抗治疗。在一个实施方案中，在CRS级别≥1时开始皮质类固醇治疗并且在CRS级别≥2时开始托珠单抗治疗。在一些实施方案中，第2天施用的托珠单抗的预防性使用可降低≥3级CRS的速率。可按照可适应于不良事件(例如，CRS和NE)的严重程度/级别的任何施用剂量和频率来施用该一种或多种皮质类固醇。表1和表2分别提供了用于管理CRS和NE的给药方案的示例。在另一个实施方案中，皮质类固醇施用包括口服或静脉内施用10mg地塞米松，每天1至4次。另一个实施方案(有时称为“高剂量”皮质类固醇)包括每天单独或与地塞米松联合静脉内施用1g甲基强的松。在一些实施方案中，一种或多种皮质类固醇以每天1mg/kg-2mg/kg的剂量施用。通常，所施用的皮质类固醇的剂量取决于具体的皮质类固醇，因为不同皮质类固醇之间存在效力差异。通常应当理解，药物的效力各不相同，因此要获得等效的效果，剂量会改变。各种糖皮质激素和给药途径的效力方面的等效性是熟知的。与等效类固醇给药(以非长期治疗方式)有关的信息可以在英国国家处方集(British National Formulary，BNF)37(1999年3月)中找到。本申请还提供了通过本申请方法制备的细胞的剂量和施用，例如CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法的输注袋，其包含在大约68mL中用于输注的嵌合抗原受体(CAR)阳性T细胞悬浮液。在一些实施方案中，在大约40mL中配制用于输注的CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR T细胞产物以35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、500mL、700mL、800mL、900mL、1000mL的总体积配制。在一个方面，通过本申请方法制备的细胞的剂量和施用(例如，CD19定向的基因修饰的自体T细胞免疫疗法的输注袋)包含在大约40mL中的1×10⁶个CAR-T阳性细胞悬浮液。目标剂量可介于每kg体重约1×10⁶与约2×10⁶个CAR阳性活T细胞之间，最大值为2×10⁸个CAR阳性活T细胞。

在一些实施方案中，剂型包含用于在单次使用的患者特异性输注袋中输注的细胞悬浮液；施用途径是静脉内的；每个单次使用的患者特异性袋中的全部内容物通过重力或蠕动泵在30分钟内输注。在一个实施方案中，给药方案是由2.0×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg体重(±20％)组成的单次输注，其中最大剂量为2×10⁸个抗CD19 CAR T细胞(对于≥100kg的受试者)。在一些实施方案中，构成剂量的T细胞是CD19 CAR-T细胞。

在一些实施方案中，该CD19定向的T细胞免疫疗法是KTE-X19，其如本申请中别处所述制备。在一个实施方案中，KTE-X19可以用于治疗MCL、ALL、CLL、SLL和任何其他B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法是通过本申请方法中的一种方法制备的Axi-cel^TM(

阿基仑赛)。落入这些方法的范围内的CAR T细胞量、给药方案、施用方法、受试者、癌在本申请的其他地方描述，这些方法在进行或不进行预调理的情况下单独或与另一种化学疗法剂联合施用给本申请的其他地方描述的任何患者。

以下实施例旨在说明本申请的各个方面。因此，所讨论的特定方面不应被解释为对本申请范围的限制。例如，尽管以下实施例针对用抗CD19嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞，但是本领域技术人员将理解，本文所述的方法可以适用于用任何CAR转导的免疫细胞。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本申请范围的情况下可以进行各种等效的改变和修改，并且应当理解，此类等效方面将被包括在本文中。此外，本申请中引用的所有参考文献均据此全文以引用方式并入，如同在本文中完全阐述一样。

本文提及的专利和科学文献建立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利和公布或未公布的美国专利申请以引用方式并入本文。本文引用的所有公布的外国专利和专利申请均据此以引用方式并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、词典、文档、手稿、基因组数据库序列和科学文献均据此以引用方式并入。

根据附图和以下具体实施方式(包括实施例)，本公开的其他特征和优点将显而易见。

实施例

实施例1

在本研究中，用自体抗CD19 CAR-T细胞治疗接受过1至5种既往疗法(包括Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTKi))的患有R/R MCL的患者。

患有R/R MCL的符合资格的患者(年龄≥18岁)具有ECOG得分0-1和≤5个既往疗法，包括化学疗法、抗CD20抗体和BTK抑制剂(BTKi)。患者经历白细胞单采术和化学疗法(每天300mg/m²环磷酰胺和每天30mg/m²氟达拉滨，持续3天)，然后以2×10⁶个CAR T细胞/kg的目标剂量输注CD19 CAR-T。患者可以在白细胞单采术后和化学疗法之前接受地塞米松、依鲁替尼或阿卡替尼的桥接疗法。主要终点是根据Lugano分类的客观应答率(ORR[完全应答(CR)+部分应答(PR)])。研究者使用修订的IWG恶性淋巴瘤应答标准来评估中期功效终点。关键的次要终点是应答的持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)、OS、不良事件(AE)的频率、血液中CAR T细胞的水平和血清中细胞因子的水平。

28名患者接受了CD19 CAR-T细胞和≥1年的随访(中值13.2个月[范围，11.5-18.5])。百分之四十三的患者具有ECOG得分1，21％的患者具有母细胞样形态，82％的患者具有IV期疾病，50％的患者具有中间/高风险MIPI，86％的患者接受了中值4种(范围，1至5种)既往疗法，并且57％的患者对最后一种既往疗法是难治性的。在28名患者中的20名患者中，中值Ki-67指数为38％(范围，5％-80％)。八名患者接受了桥接疗法；所有患者在桥接疗法后都有疾病。ORR为86％(95％CI，67％-96％)，CR率为57％(95％CI，37％-76％)。75％的应答者保持有应答，并且64％的治疗患者具有进行性应答。DOR、PFS和OS的12个月估计值分别为83％(95％CI、60％-93％)、71％(95％CI、50％-84％)、86％(95％CI、66％-94％)，并且未获得中值。≥3级AE(≥20％的患者)为贫血(54％)、血小板计数减少(39％)、中性粒细胞减少(36％)、嗜中性粒细胞计数减少(32％)、白细胞计数减少(29％)、脑病(25％)和高血压(21％)。在18％的患者中报告了由Lee DW等人《血液》(Blood)2014年；124:188评估的3/4级细胞因子释放综合征(CRS)，表现为低血压(14％)、缺氧(14％)和发热(11％)。在46％的患者中报告了3/4级神经事件(NE)，并且包括脑病(25％)、意识错乱状态(14％)和失语(11％)。未发生5级CRS或NE。所有CRS事件和大多数NE(17名患者中的15名患者)都是可逆的。至发作的中值时间和CRS消退分别为2天(范围，1-7天)和13天(范围，4-60天)。NE的中值发作时间为6天(范围，1-15天)和消退的中值时间为20天(范围，9-99天)。如通过峰值和曲线下面积所测量的中值CAR T细胞水平分别为99个细胞/μL(范围，0.4-2589)和1542个细胞/μL(范围，5.5-27239)。在第8天与第15天之间观察到峰值CAR T细胞扩增，并且随时间下降。

实施例2

本实施例提供了对上述研究的附加分析。符合资格的患者年龄≥18岁，具有病理确认的MCL，具有记录的细胞周期蛋白D1过表达或存在t(11；14)，并且对MCL的1-5个既往方案是复发性/难治性的。既往疗法必须包括含有蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法、抗CD20单克隆抗体、和依鲁替尼或阿卡替尼。所有患者接受了既往BTKi。尽管患者必须具有既往BTKi疗法，但是不需要作为研究进入之前的最后一线疗法，并且患者不需要对BTKi疗法是难治性的。符合资格的患者具有绝对淋巴细胞计数≥100/μL。在CD19CAR-T细胞输注的6周内经历自体SCT或具有既往CD19靶向疗法或同种异体SCT的患者被排除。

附加纳入标准包括：至少1个可测量的病变。先前已经辐照的病变仅在完成放射疗法后记录进展时才被认为是可测量的；如果唯一可测量的疾病是淋巴结疾病，则至少1个淋巴结应该为≥2cm；脑的磁共振成像(MRI)未显示中枢神经系统(CNS)淋巴瘤的证据；除了全身性抑制性/刺激性免疫检查点疗法之外，在患者计划进行白细胞单采术的时候，从任何既往全身疗法或BTKi(依鲁替尼或阿卡替尼)开始必须经过至少2周或5个半衰期(以较短者为准)；在患者计划进行白细胞单采术(例如，伊匹木单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、OX40激动剂、4-1BB激动剂)的时候，从任何既往全身性抑制性/刺激性免疫检查点分子疗法开始必须经过至少3个半衰期；既往疗法产生的毒性必须已经稳定，并恢复至≤1级(无临床相关的毒性除外，诸如脱发)；0或1的美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态；绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1000/μL；血小板计数≥75000/μL；绝对淋巴细胞计数≥100/μL；将足够的肾、肝、肺和心脏功能定义为：肌酐清除率(如通过Cockcroft Gault所估计)≥60cc/min；血清丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶≤2.5正常上限(ULN)；总胆红素≤1.5mg/dL，患有吉尔伯特综合征的患者除外心射血分数≥50％，没有心包积液的证据，如由超声心动图(ECHO)所确定，并且没有临床相关的心电图(ECG)结果；没有临床相关的胸腔积液；室内空气中的基线氧饱和度>92％；并且有生育潜力的女性必须具有阴性血清或尿液怀孕测试。已经经历外科手术灭菌或已经绝经至少2年的女性不被认为有生育潜力。

附加排除标准包括：除非至少3年的无疾病，否则除了非黑色素瘤皮肤癌或原位癌(例如，宫颈、膀胱、乳腺)之外的恶性肿瘤史；同种异体干细胞移植史；既往CAR疗法或其他基因修饰T-细胞疗法；氨基糖苷类所致的重度速发型超敏反应史；真菌、细菌、病毒或其他感染的存在不受控制或需要静脉内(IV)抗微生物剂进行管理。如果响应于活性治疗并且在用医疗监测器会诊之后，允许简单的尿路感染(UTI)和不复杂的细菌性咽炎；人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或者急性或慢性活性乙型肝炎或丙型肝炎感染史。具有肝炎感染史的患者必须清除其感染，如通过标准血清学和遗传测试所确定；存在任何内置线或管(例如，经皮肾造瘘术管、内置Foley导尿管、胆汁输送管或脾脏/腹膜/心包导管)。Ommaya储液器和专用中心静脉进入导管，诸如Port-a-Cath或Hickman导管是允许的；具有可检测脑脊液恶性细胞或脑转移或具有CNS淋巴瘤、脑脊髓性恶性细胞或脑转移的病史的患者；CNS病症(诸如癫痫发作病症、脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病、大脑水肿、可逆性后部脑病综合征或具有CNS累及的任何自身免疫性疾病)的病史或存在；在登记的12个月内心肌梗塞、心血管成形术或支架植入、不稳定型心绞痛、活动性心律失常或其他临床相关心脏疾病的病史；具有心房或心室淋巴瘤累及的患者；在登记的过去6个月内的症状性深静脉血栓形成或肺栓塞的病史；由于进行性或即将来临的肿瘤紧急情况(例如，肿瘤肿块效应、肿瘤消散综合征)而可能需要紧急治疗；原发性免疫缺陷；可能干扰研究治疗的安全性或功效评估的任何医学病症；对本研究中使用的任何药剂的严重速发型过敏反应的病史；在计划开始调理性方案之前，活疫苗≤6周；由于制备型化学疗法对胎儿或婴儿的潜在危险作用，怀孕或哺乳的有生育潜力的女性；从同意的时候到完成CD19 CAR-T细胞治疗后6个月，不愿意实践生育控制的两种性别的患者；在研究者的判断中，患者不太可能完成所有方案所需的研究访视或程序(包括随访访视)或遵守研究的参与要求；和自身免疫性疾病史(例如，克罗恩病、类风湿性关节炎、全身性狼疮)，导致末端器官损伤或在过去2年内需要全身性免疫抑制/全身性疾病变调剂。

所有患者经历白细胞单采术以获得细胞用于CD19 CAR-T细胞治疗制造。制造方法相对于阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)的制造方法进行了修改，以通过阳性富集CD4⁺/CD8⁺细胞去除循环淋巴瘤细胞。在第0天单次静脉内输注2×10⁶个CAR T细胞/kg的CD19CAR-T细胞之前，在第-5天、第-4天和第-3天施用氟达拉滨(每天30mg/m²)和环磷酰胺(每天500mg/m²)的调理性化学疗法。从在大B细胞淋巴瘤中的阿基仑赛和在急性淋巴母细胞性白血病中的CD19 CAR-T细胞的研究中通告剂量。Neelapu SS等人，《新英格兰医学杂志》(TheNew England journal of medicine)2017年；377:2531；Locke FL等人，《分子治疗》(MolTher.)2017年；25:285；Shah BD等人，《临床肿瘤学杂志》(Journal of ClinicalOncology)2019；37:(增刊；摘要7006)；以及Lee DW等人，《肿瘤学年报：欧洲医学肿瘤学协会/ESMO的官方日志》(Annals of oncology:official journal of the EuropeanSociety for Medical Oncology/ESMO)2017；28:1008PD，所有这些文献均全文以引用方式并入本文。在白细胞单采术之后和在调理性疗法之前，允许具有高疾病负荷的患者在研究者的判断下接受地塞米松或等效皮质类固醇、依鲁替尼或阿卡替尼的桥接疗法，其后进行重复基线正电子发射断层摄影术-计算机断层摄影术(PET-CT)扫描。桥接疗法的目标不是治愈性的，而是保持患者在整个制造期稳定。需要CD19 CAR-T细胞输注后的住院直到第7天。

主要终点是如使用Lugano分类通过独立放射学审查委员会(IRRC)评估的客观应答率(ORR[完全应答(CR)+部分应答(PR)])。Cheson等人，《临床肿瘤学杂志》(J ClinOncol)，2014年；32:3059-68。为了确认CR，除了PET-CT之外还需要骨髓评估。次要终点包括应答持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)、OS、研究者评估的ORR(根据Cheson等人，《临床肿瘤学杂志》(J Clin Oncol)，2007年；25:579-86)、不良事件(AE)的发生率、血液中的CAR T细胞水平和血清中的细胞因子、以及欧洲生活质量-5维-每个维度5个水平(EuropeanQuality ofLife-5Dimensions with 5levels per dimension)(EQ-5D-5L))中随时间的分数变化。如先前所报告评估CAR T细胞存在、扩增和持久性和血清细胞因子以及它们与临床结果的关联性。Kochenderfer JN等人，《临床肿瘤杂志》(JClin Oncol.)2017年；35:1803-13；Locke FL等人，《分子治疗》(Mol Ther.)2017年；25:285-95中，两篇文献均全文以引用方式并入本文。

评估从基线到第6个月的EQ-5D-5L得分变化。细胞因子释放综合征(CRS)根据以下进行分级：Lee等人，《血液》(Blood)2014年；124:188，所述文献全文以引用方式并入本文。使用国家癌症研究所的不良事件普通术语标准(National Cancer Institute CommonTerminology Criteria for Adverse Events)版本4.03来对AE(包括神经事件)和CRS症状的严重程度进行分级。最小残留疾病(MRD；10^-5灵敏度)是在基线处和第1个月、第3个月和第6个月时在冷冻保存的外周血单核细胞中评估的探索性分析，并且使用clonoSEQ测定通过下一代测序(适应生物技术公司(Adaptive Biotechnologies)，美国华盛顿州西雅图(Seattle,WA))来进行分析。

对于所有患者，在基线处、在输注后4周以及在治疗后期间以规则间隔需要对疾病特异性部位进行正电子发射断层摄影术-计算机断层摄影术(PET-CT)扫描。为了确认在基线处具有骨髓疾病累及的患者和在基线处具有不确定骨髓累及的患者中的完全应答，或者如果没有完成基线骨髓活检或结果不可用，需要骨髓抽吸/活检。具有CNS恶性肿瘤症状的患者在筛选时进行腰椎穿刺，以检查脑脊液(CSF)。对于在抗CD19 CAR T细胞输注后具有新的≥2级神经毒性发作的患者，如适用也进行了腰椎穿刺。另外，对于签署同意书的任选部分的患者，在抗CD19 CAR T细胞输注之前在基线处和在抗CD19 CAR T细胞输注之后(第5天±3天)进行腰椎穿刺以收集CSF；将样品提交到中心实验室并分析细胞因子水平的变化。

根据方案所需，在第4周疾病评估后6个月对60名患者进行登记、治疗和评估应答之后，进行主要功效分析。该分析具有≥96％的效力以区分具有50％真实应答率的活性疗法和应答率≤25％的疗法，其中单侧α水平为0.025。使用精确的二项式检验来分析ORR。在上述60名功效可评估患者中分析了所有功效终点，包括如使用Kaplan-Meier估计所评估的至事件终点的时间。在所有治疗的患者中进行安全性分析(n＝68)。使用Wilcoxon秩和检验测量结果与CAR T细胞和细胞因子水平之间的关联性；使用Holm程序调整P值。完整分析集(N＝74)：由所有登记的/白细胞单采术的患者组成，并且用于患者处置的总结。安全性分析集(n＝68)：定义为用任何剂量的抗CD19 CAR T细胞治疗的所有患者。此分析集用于人口统计学和基线特征的总结以及全部安全性分析。推理分析(功效可评估)集(n＝60)：由前60名治疗的CD19 CAR-T细胞患者组成。此分析集用于在主要分析的时候的客观应答率的主要终点的假设测试，以及所有其他功效分析。主要终点的假设是使用中心评估的对CD19 CAR-T细胞的ORR将大于使用精确的二项式检验在0.025的单侧显著性水平下的预先指定的25％历史控制率。在推理分析集中检验该假设。基于在研究方案开发的时候公布的2项回顾性研究先验确定ORR的历史控制率。在这2项研究中，在患有复发性/难治性MCL的患者中评估挽救疗法后的结果，该患者在用BTKi治疗(符合研究资格所要求的既往疗法)后进展。这些研究表明，在接受BTKi之前具有≥3个既往线的复发性/难治性MCL患者对挽救疗法的ORR为大约25％。Wang M等人，《柳叶刀》(Lancet)2018；391:659；Martin P等人，《血液》(Blood)2016年；127:1559，两篇文献均全文以引用方式并入本文。

登记了74名患者；为71名患者制得了CD19 CAR-T细胞，并且已施用于68名患者。在治疗60名患者后进行的主要功效分析表现出93％的ORR(67％完全应答)。在12.3个月的中值随访(范围，7.0个月-32.3个月)时，57％的患者保持缓解并且未达到中值应答持续时间。估计的12个月无进展生存率和总体生存率分别为61％和83％。常见≥3级不良事件为血细胞减少(94％)和感染(32％)。分别在15％和31％的患者中发生≥3级细胞因子释放综合征和神经事件；没有致命的。发生两个5级感染性不良事件。

为71名患者(96％)制得了CD19 CAR-T细胞，并且已施用于68名患者(92％)。从白细胞单采术至将CD19 CAR-T细胞递送到研究站点的中值时间为16天(范围，11天-128天)。具有制得的CD19 CAR-T细胞的一名患者由于在白细胞单采术后快速PD用苯达莫司汀-利妥昔单抗来治疗，使得患者不符合资格进入研究。在稍后发展PD之后，患者的原始产物在初始白细胞单采术日期后127天从制造设施运送，1天后到达治疗站点。三名具有制造问题的患者由于AE(n＝1；深静脉血栓形成)、由于进行性疾病引起死亡(PD；n＝1)或同意退出(n＝1)而未继续进行附加单采术。两名附加患者由于来自PD的死亡在调理性化学疗法之前中断。在接受调理性化学疗法之后，具有进行性房颤(排除标准)的1名患者被认为不符合资格进行CD19 CAR-T细胞输注。功效可评估患者的中位随访为12.3个月(范围，7.0个月-32.3个月)；28名患者随访≥24个月。

中值年龄为65岁(范围，38-79岁)，并且57名(84％)患者是男性。(表1)65％的患者具有ECOG体能状态得分0并且35％的患者具有ECOG体能状态得分1。患者在基线处具有高风险特征，包括IV期疾病(85％)、母细胞样或多形性形态(31％)、Ki-67增殖指数≥30％(40/49[82％])(Wang ML等人，《柳叶刀肿瘤学》(The Lancet Oncology)2016；17:48)以及TP53突变(6/36[17％])。百分之八十一的患者已接受≥3个既往线疗法(中值，3[范围1-5])。

表1.基线患者特征

^*排除骨髓和脾脏累及。

在诊断时。

研究者报告了一名患者在诊断时具有κ轻链受限的MCL。有10名患者形态学报告为未知。^§在诊断时49名患者的Ki-67数据可用。

在序贯完全应答之间发生的诱导加合并/维持和/或所有治疗被计数为1个方案。BTKi，Bruton酪氨酸激酶抑制剂；ECOG，美国东部肿瘤协作组；MCL，套细胞淋巴瘤；MIPI，套细胞淋巴瘤国际预后指数；SCT，干细胞移植。

所有患者都进行到BTKi(依鲁替尼n＝58；阿卡替尼n＝16；两者n＝6)，并且43％的患者具有既往自体SCT(表2)。从排除桥接的最后BTKi疗法结束到CD19 CAR-T细胞输注的中值时间是88天(范围，25天-1047天)。百分之四十的患者对最后一种疗法是难治性的，包括在最后一次疗法后具有确认进展的3名依鲁替尼不耐受患者。二十五名患者(37％)接受依鲁替尼(n＝14)、阿卡替尼(n＝5)、地塞米松(n＝12)和/或甲泼尼龙(n＝2)的桥接疗法。桥接后扫描显示，大多数患者的肿瘤负荷高于筛选时的中值。

表2：桥接疗法

特征	N＝68
		任何桥接疗法，n(％)	25(37)
依鲁替尼	14(21)
		阿卡替尼	5(7)
地塞米松	12(18)
		甲泼尼龙	2(3)
BTKi和类固醇两者，n(％)	6(9)
		依鲁替尼+类固醇	4(6)
阿卡替尼+类固醇	2(3)

BTKi，Bruton酪氨酸激酶抑制剂。

具有最小7个月随访的用CD19 CAR-T治疗的方案指定的60名患者中的IRRC评估的ORR为93％(95％CI，84-98)，具有67％CR率和27％PR率。在IRRC评估和研究者评估的ORR之间观察到高度一致性(95％)(表3)。

表3：基于研究者评估的在功效可评估患者中的应答(根据Cheson BD等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)2007年；25:57)和根据Lugano分类(2014)通过IRRC审查的在意向治疗(Intent-to-Treat)患者中的反应。

^*分析时没有评估。

一致性是其IRRC评估的读段匹配研究者评估的读段的受试者的百分比。CR，完全应答；IRRC，独立放射学审查委员会；N/A，不适用；ORR，客观应答率。

所有登记患者(n＝74)的IRRC评估的ORR为85％(95％CI，75-92)，具有59％CR率。ORR在关键亚组之间是一致的，关键亚组包括年龄、复发性/难治性亚组、既往疗法数量、MCL形态、疾病阶段、结节外疾病、骨髓累及、简化MIPI、CD19阳性、肿瘤负荷、血清乳酸脱氢酶水平、TP53突变状态、Ki-67指数，使用托珠单抗或类固醇进行AE管理、以及桥接疗法的使用。到初始应答的中值时间为1.0个月(范围，0.8-3.1)，并且到CR的中值时间为3.0个月(范围，0.9-9.3)。在最初实现PR或SD的42名患者中，24名患者(57％)(包括21名具有PR初始应答和3名具有SD初始应答)随后在初始应答后中值2.2个月(范围，1.8-8.3)之后转化为CR；这24名患者中的18名患者保持缓解。在29/60名患者(48％)中进行MRD分析；24/29名患者(83％[19CR；5PR])在第4周为MRD阴性，并且具有可用数据的15/19名患者(79％)在第6周保持MRD阴性。由于缺乏用于校准的福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤活检样品的可用性，无法评估所有患者中的MRD，这是方法学所必需的，并且用于建立在血液中随时间跟踪的主要重排的IgH(VDJ或DJ)、IgK或IgL受体基因序列。在响应于CD19 CAR-T细胞后进展的两名患者在初始输注后大约1年和2.6年接受第二次输注；对这些患者进行了分析。

中位随访12.3个月(中值(95％CI))之后尚未达到中位DOR；未达到(8.6，NE)。未达到中值无进展生存期(95％CI)(9.2，NE)。也未达到中值总生存期(95％CI)(24.0，NE)。所有患者的百分五十七和78％CR患者保持缓解。然而，治疗的前28名患者的中值随访为27.0个月(范围；25.3-32.3)，其中43％在没有附加疗法的情况下继续缓解。进行性应答率在关键协变量之间是一致的，关键协变量包括年龄、MCL形态、复发性/难治性亚组、Ki-67指数、疾病阶段、结节外疾病、骨髓累及、简化的MIPI、TP53突变、CD19阳性、桥接疗法、肿瘤负荷以及托珠单抗或类固醇的使用。在基线处具有CD19-肿瘤的3名患者实现CR并且在数据截止时保持进行性应答。未达到中值PFS和OS，估计12个月率分别为61％(95％CI，45-74)和83％(95％CI，71-91)。尽管在样品大小上有限，但是PFS的亚组分析显示，6个月PFS率在具有母细胞样或多形性形态、TP53突变或Ki-67指数≥50％的患者之间是一致的。在该分析的时候，所有患者的76％仍然存活。在具有应答的患者中，14名患者具有PD。一名具有PR的患者经历了同种异体SCT。

这项研究显示在患有复发性/难治性MCL的方案指定的60名患者中的ORR为93％，所有这些患者在BTKi疗法之后复发或对BTKi疗法是是难治性的。在单次输注后，该ORR包括67％CR率。在12.3个月的中值随访之后，未达到中值DOR；57％的所有患者和78％的CR患者保持应答。用CD19 CAR-T细胞治疗的二十八(28)名患者具有27个月的较长中值随访(范围，25.3-32.3)，并且43％的患者在没有附加疗法的情况下继续处于缓解状态。包括进行性应答的应答率在包括具有高风险特征的患者的关键亚组中大体上相似。Ki-67≥50％的患者、以及具有母细胞样/多形性形态或TP53突变的患者具有高ORR和与整个群体相似的6个月PFS率，表明CD19CAR-T细胞治疗有益于通常具有较差预后的患者。

在CAR T细胞输注后反应的所有患者实现了T细胞扩增。在非应答患者中未观察到这种扩增，这表明应答可能与足够的CAR T细胞扩增有关。类似于先前研究，在前28天中CART细胞水平与ORR相关，表明与阳性患者相比，较高的扩增导致更好且可能更深的应答，如由MRD阴性中的>80倍更高的峰值/AUC CAR T细胞水平所指示。无论是否施用桥接疗法应答率也都相似，并且与桥接前扫描相比，桥接后扫描的大多数患者(87％)具有增加的SPD。

所有治疗的患者都经历了≥1级AE，在99％的治疗患者中有≥3级AE(表2)。任何级别的最常见AE为发热(94％)、中性粒细胞减少(87％)、血小板减少(74％)和贫血(68％)。最常见的≥3级AE是中性粒细胞减少(85％)、血小板减少(51％)、贫血(50％)和感染(32％)。百分之二十六的患者在CD19 CAR-T细胞后>90天具有≥3级血细胞减少，包括中性粒细胞减少(16％)、血小板减少(16％)和贫血(12％)。在91％的患者中发生了CRS(表4)。没有患者由于CRS而死亡。大多数病例为1/2级(76％)，其中15％患者中出现≥3级CRS。最常见的≥3级CRS症状为低血压(22％)、缺氧(18％)和发热(11％)。对于CRS管理，59％的患者接受了托珠单抗，22％接受了类固醇和16％需要血管抑制剂。输注后到任何级别和≥3级CRS发作的中值时间分别为2天(范围，1-13)和4天(范围，1-9)；在11天的中值内所有事件消退。

表4：不良事件、细胞因子释放综合征和神经事件

*包括在≥30％的患者中发生的不良事件以及在≥15％的患者中发生的CRS的症状和神经事件。

计算出了CRS行中经历CRS的62名患者的百分比。

百分之六十三的患者经历了NE(表4)。无患者由于NE死亡。在32％的患者中发生1/2级NE，并且在31％的患者中发生≥3级NE。常见的≥3级NE为脑病(19％)、意识错乱状态(12％)和失语(4％)。一名患者发展了4级大脑水肿并且用侵袭性多模态疗法(包括脑室造口术)完全恢复。托珠单抗和类固醇分别用于治疗26％和38％患者中的NE。到任何级别和≥3级NE发作的中值时间分别为7天(范围，1-32)和8天(范围，5-24)。NE的中值持续时间为12天，在37/43名患者(86％)中事件完全消退。如此分析，4名患者具有进行性事件，包括1级震颤(n＝3)、2级注意集中障碍(n＝1)和1级感觉迟钝(n＝1)。在68％的患者中发生严重的AE(表5)。

表5：在至少3名患者中发生的严重不良事件

百分之三十二的患者经历≥3级感染。最常见为肺炎(9％)(表6)。

表6：在至少2名患者中发生感染

^*一名患者死于葡萄球菌菌血症。一名患者死于机化性肺炎(在感染情况中发生急性肾损伤，并且尸体剖检期间发现除了机化性肺炎之外还具有先前未诊断的肺栓塞)。

两个病例发生2级巨细胞病毒感染(3％)。3级低丙球蛋白血症和3级肿瘤消散综合征在1名患者中发生一次(1％)。二十二名患者(32％)接受静脉内免疫球蛋白疗法。没有报告有复制能力的逆转录病毒、EBV相关淋巴组织增殖、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症或CD19 CAR-T细胞相关二级癌的病例。EQ-5D得分竭示在第4周患者报告的健康相关生活质量中从基线减少，到第3个月观察到活动性、自我护理、日常活动和整体健康(EQ-5D直观模拟量表)的改善，其中总体健康在大多数患者中到第6个月返回到基线或更好的水平(表7)。

表7：在访视时的EQ-5D总结

^*EQ-5D直观模拟量表(VAS)评估从0到100的标度的总体健康，其中较高得分指示更好的健康状态。EQ-5D，欧洲生活质量-5维；N/A，不适用；SD，标准偏差

接受CD19 CAR-T细胞的十六名患者(24％)主要因PD而死亡(n＝14[21％])。两名患者具有5级AE(3％)，包括具有与调理性化学疗法相关的机化性肺炎的1名患者以及具有与调理性化学疗法和CD19 CAR-T细胞治疗有关的葡萄球菌菌血症的1名患者。

在CD19 CAR-T细胞输注之后到峰值抗CD19 CAR T细胞水平的中值时间为15天(范围，8-31)，并且在存在正常中值B细胞水平的情况下在数据截止的时候具有可评估样品的一些患者(6/10[60％])中在24个月时仍然可检测到细胞。如通过qPCR所测量，在具有进行性应答和复发的患者中，血液中随时间推移的CAR T细胞持久性显示出随时间衰退。

快速扩增、至基线的消退和随时间推移的清除率与具有CD28和CD3ζ共刺激结构域的抗CD19 CAR T细胞的已知作用机制一致。对CD19 CAR-T细胞治疗的没有应答的所有4名患者在基线处具有可检测的B细胞；没有患者在研究的任何点经历过B细胞发育不良。虽然与基线肿瘤负荷没有关联性，但是扩增与应答相关(P＝0.0036)，曲线下面积(AUC)和峰值在应答者比在无应答者中高了>200倍，在第4周MRD阴性与MRD阳性患者之间具有相似的趋势。对于CRS和NE两者，具有≥3级事件的患者中的扩增高于具有≤2级事件的患者，并且在CD19 CAR-T细胞输注后在接受托珠单抗±类固醇的患者中注意到最高峰值和AUC。对于评估的细胞因子，到峰值的中值时间为8天；大多数到28天时消退到基线水平。血清粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(IL)-6与≥3级CRS和NE相关。血清铁蛋白仅与≥3级CRS相关，然而血清IL-2和干扰素-γ仅与≥3级NE相关。另外，脑脊液细胞因子分析揭示在具有≥3级NE的患者中的C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和血管细胞粘附分子1的水平更高。在任何患者中都未观察到抗CAR抗体的诱导。

≥3级CRS和NE的比率与先前在侵袭性NHL中用抗CD19 CAR T细胞疗法的情况下报道的那些比率相似。Neelapu SS等人，《新英格兰医学杂志》(The New England journal ofmedicine)2017年；377:2531；Schuster SJ等人，《新英格兰医学杂志》(The New Englandjournal of medicine)2019年；380:45。没有由于CRS或NE的死亡，并且大多数症状发生在治疗早期并且通常是可逆的，并且没有长期临床后遗症损害日常生活的活动。在峰值血清细胞因子与≥3级CRS和/或≥3级神经事件之间观察到的关联性表明CD19CAR-T细胞在这些毒性中的作用，因为观察到它们与血液中CAR T细胞的上升和峰值水平相称。CAR和骨髓细胞相关血清细胞因子、趋化因子和效应分子的峰值水平与毒性的关联性与在NHL的情况中使用类似的CAR构建体的先前公开的数据一致。^10,13发生了一个4级大脑水肿的病例，但患者完全恢复并且在24个月随访时保持CR，没有未消退的神经后遗症。患者报告的结果类似地表明在CD19 CAR-T细胞疗法之后没有长期的生活质量缺陷。

实施例3

本实施例提供了对上述研究的附加分析。患有R/R MCL的符合资格的患者(年龄≥18岁)具有ECOG得分0-1和≤5个既往疗法，包括化学疗法、抗CD20抗体和BTKi。患者经历白细胞单采术和化学疗法(在第-5天、第-4天和第-3天，每天300mg/m2环磷酰胺和每天30mg/m2氟达拉滨，持续3天)，然后在第0天通过单次输注以2×10⁶个CAR T细胞/kg的目标剂量单次输注CD19 CAR-T细胞。CD19 CAR构建体含有CD3ζT细胞激活结构域和CD28信号传导结构域。制造方法从白细胞单采术产物中去除表达CD19的循环白血病细胞。Sabatino M等人，《血液》(Blood)2016年；128:1227。

一些患者接受与地塞米松(每天PO或IV给予的20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)、依鲁替尼(每天PO给予560mg)或阿卡替尼(每天两次PO给予的100mg)的桥接疗法，在白细胞单采术之后施用并且在起始调理性化学疗法之前完成≤5天；桥接后需要PET-CT。主要终点是客观应答率(ORR[完全应答(CR)+部分应答])。关键的次要终点是应答的持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)、OS、不良事件(AE)的频率、血液中CAR T细胞的水平和血清中细胞因子的水平。功效和安全性分析包括接受CD19 CAR-T细胞疗法的所有患者。

关键纳入标准包括R/R MCL，其被定义为在最后一个方案之后的疾病进展或未能对最后一个方案表现出CR或PR；必须包括含有蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法和抗CD20单克隆抗体疗法和依鲁替尼或阿卡替尼的一种至五种既往疗法；≥1个可测量的病变；年龄≥18岁ECOG为0或1；以及足够的骨髓、肾、肝、肺和心脏功能。关键排除标准包括既往自体干细胞移植(alloSCT)；既往CD19靶向疗法；既往CAR T细胞疗法；临床相关感染；以及MCL或其他CNS病症的病史或当前CNS累及。

总共68名患者接受了CD19 CAR-T细胞疗法。此处提供了更新的安全性(68名患者)和功效(60名患者)结果，其中中值随访为12.3个月[范围7.0-32.3])。总共28名患者(47％)具有≥24个月随访。至初始应答的中值时间为1.0个月[范围0.8-3.1]并且至完全应答的中值时间为3.0个月[范围0.9-9.3]。总共24名患者(40％)从PR/SD转化为CR，其中21名患者(35％)从PR转化为CR，并且3名患者(5％)从SD转化为CR。

中值年龄为65岁(范围，38-79岁)，并且39名(57％)患者是男性。百分之一百(100％)的患者具有ECOG得分0/1，25％的患者具有母细胞样形态，85％的患者具有IV期疾病，56％的患者具有中/高风险MIPI，81％的患者接受了3种或更多种既往疗法，中值3(范围，1-5)种既往疗法，99％的患者接受了既往蒽环霉素或苯达莫司汀，100％的患者接受了既往抗CD20单克隆抗体，并且100％苯达莫司汀接受了既往BTKi(85％依鲁替尼、24％阿卡替尼和9％两者)。四十三名(43％)患者在autoSCT之后复发，56％的患者对依鲁替尼是难治性的，并且12％的患者对阿卡替尼是难治性的。34/49名患者具有可用的数据，Ki-67指数为≥50％。二十五名(37％)患者接受了桥接疗法(21％依鲁替尼、7％阿卡替尼、18％地塞米松、3％甲泼尼龙、9％BTKi和类固醇两者、6％依鲁替尼和类固醇、3％阿卡替尼和类固醇)；23/25名患者具有桥接后PET-CT以在CD19 CAR-T细胞输注之前记录可测量的疾病(20/23名患者具有从筛选时增加的SPD mm²；3/23名患者具有从筛选时略微降低的SPD mm²)。

在功效可评估和ITT患者两者中观察到高ORR。对于ORR为95％一致性；对于CR为90％一致性。研究者评估的ORR在60名功效可评估的患者中为88％(95％CI，77％-95％)，其中CR率为70％(95％CI，57％-81％)，PR率为18％(95％CI，10％-30％)。通过IRRC评估的60名功效可评估患者中的ORR为93％(95％CI，84％-98％)，其中CR率为67％(95％CI，53％-78％)，PR率为27％(95％CI，16％-40％)。ORR在关键亚组(年龄、MCL形态、Ki-67指数、疾病阶段、简化MIPI、使用类固醇进行AE管理、托珠单抗使用和桥接疗法使用)之间是一致的。ITT患者中的研究者评估的ORR为80％(95％CI，69％-88％)，其中CR率为59％(95％CI，47％-71％)，PR率为20％(95％CI，12％-31％)。通过IRRC评估的ITT患者中的ORR为85％(95％CI，75％-92％)，其中CR率为59％(95％CI，47％-71％)，PR率为26％(95％CI，16％-37％)。

中位随访12.3个月之后尚未达到中位DOR。所有患者的百分之五十七(57％)和78％的CR患者保持缓解。前28名治疗的患者具有27.0个月的中值随访(范围，25.3-32.3)，其中的43％在没有附加疗法的情况下保持持续缓解。在12.3个月的中值随访之后未达到中值PFS和中值OS。12个月PFS率(95％CI)为61％(45％-74％)。12个月OS率(95％CI)为83％(71％-91％)。

超过35％的患者具有治疗出现的不良事件(0％1级；1％2级；16％3级；76％4级和3％5级)。最常见的≥3级AE(≥20％的患者)是中性粒细胞减少(69％，4级)、血小板减少(35％，4级)、贫血(50％，3级)、低磷血症(22％，3级)。没有患者因细胞因子释放综合征(CRS)死亡。在15％的患者中报告了≥3级CRS(通过Lee DW等人《血液》(Blood)，2014,124:188评估)。任何级别CRS的最常见症状为低血压(51％)、缺氧(34％)和发热(91％)。不良事件管理包括托珠单抗(59％)和皮质类固醇(22％)。至发作的中值时间为2天(范围1-13)，中值持续时间为11天，并且62/62名(100％)的具有任何级别CRS的患者的事件已消退。

在63％的患者中报告了任何级别的神经事件(NE)(31％具有≥3级NE)并且包括脑病(31％)、意识错乱状态(21％)和震颤(35％)。没有患者死于神经事件。一名患者具有4级大脑水肿，其用侵袭性多模态疗法完全消退，该侵袭性多模态疗法包括脑室造口术和IV给予兔、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)。所有CRS事件和大多数NE(43名患者中的37名患者)都是可逆的。至发作的中值时间和NE持续时间分别为7天(范围，1-32天)和12天。

与无应答者相比，CAR T细胞的较高峰值水平与应答者相关(客观应答)。CAR T细胞的较高峰值水平与第4周的阴性MRD而不是阳性MRD相关。在CD19 CAR-T细胞输注后的抗CD19 CAR T细胞水平达到峰值的中值时间为15天(范围，8-31)。在具有可评估样品(6/10[60％])的大多数患者中，在24个月时可检测到抗CD19 CAR T细胞。扩增与应答和MRD状态相关。在≥3级的患者中的扩增比≤2级CRS和神经事件的患者中更多。

在峰值血清生物标志物水平和毒性之间观察到几种关联性。与≥3级CRS相关的分析物包括IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素。与≥3级神经事件相关的分析物包括IL-2、IL-1Ra、IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-12p40、IFN-γ、IL-10、MCP-4、MIP-1b和颗粒酶B。并且与≥3级CRS和神经事件两者相关的分析物包括IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B。

在单次输注中施用的本文所述的CD19 CAR-T细胞治疗显示出在R/RMCL中的高比率持久应答。93％ORR(包括67％CR率)是具有既往BTKi衰竭的患者的最高报告的疾病控制率。在治疗的初始28名患者中，在随访≥24个月后，43％的患者保持缓解。安全性概况与在抗CD19 CAR T细胞疗法在侵袭性NHL中的先前研究中报告的结果一致。没有因CRS或神经学事件的死亡；大多数症状发生在治疗早期，并且通常是可逆的。功效、可靠和快速制造以及可管理的毒性鉴定了本文所述的CD19 CAR-T细胞治疗在治疗患有未满足医疗需求的R/RMCL患者中的作用。

实施例4

本实施例提供了上述临床研究的附加分析。符合资格的患者年龄≥18岁，具有病理确认的MCL，具有记录的细胞周期蛋白D1过表达或存在t(11；14)，并且对MCL的1-5个既往方案是复发性/难治性的。既往疗法必须包括含有蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法、抗CD20单克隆抗体、和依鲁替尼或阿卡替尼。所有患者接受了既往BTKi。尽管患者必须具有既往BTKi疗法，但是不需要作为研究进入之前的最后一线疗法，并且患者不需要对BTKi疗法是难治性的。符合资格的患者具有绝对淋巴细胞计数≥100/μL。在CD19CAR-T细胞输注的6周内经历自体SCT或具有既往CD19靶向疗法或同种异体SCT的患者被排除。所有患者经历白细胞单采术以获得细胞用于CD19CAR-T细胞治疗制造。患者接受任选的桥接疗法，其包括地塞米松(每天PO或IV给予20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)、依鲁替尼(每天通过口腔(PO)给予560mg)或阿卡替尼(每天两次PO给予100mg)。制造方法相对于阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)的制造方法进行了修改，以通过阳性富集CD4⁺/CD8⁺细胞去除循环淋巴瘤细胞。此产物在本文中被称为“CAR T细胞”。此产物也可以被鉴定为KTE-X19。在第0天单次静脉内输注2×10⁶个CAR T细胞/kg的CD19 CAR-T细胞之前，在第-5天、第-4天和第-3天施用氟达拉滨(每天30mg/m²)和环磷酰胺(每天500mg/m²)的调理性化学疗法。关于患者治疗的更多细节可以在实施例2中找到。

本研究的目标是双重的。首先，是为了比较临床试验ZUMA-2中由TP53(肿瘤蛋白p53)基因突变状态和Ki-67肿瘤增殖指数定义的较低和较高风险患者中的CAR T产物的药理学概况。具有高风险MCL特征(包括肿瘤蛋白p53基因(TP53)突变和高Ki-67增殖指数)的患者通常用当前标准疗法的情况下具有不良预后。Cheah CY等人，《临床肿瘤杂志》(J ClinOncol.)，2016；34:1256-1269。这项分析中的较低风险患者具有Ki-67增殖指数<50％(通过中央评估)或野生型TP53；高风险患者具有Ki-67≥50％或通过下一代测序确定的TP53突变。在ZUMA-2的主要功效分析(N＝60)中，在12.3个月的中值随访之后，ORR为93％(67％CR)。57％的所有患者和78％的CR患者具有进行性应答。ORR通常在ZUMA-2中的较低和较高风险患者之间(包括在具有Ki-67增殖指数<或≥50％和未突变与突变的TP53的患者中)相当。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(New Engl JMed.)，2020；382:1331-1342。

第二个目标是表征在早期(第28天)实现最小残留疾病(MRD)阴性状态的患者和具有4级神经毒性的那些患者的药效学概况。在ZUMA-2的先前分析结果中，在第0-28天通过峰值和曲线下面积(AUC)确定的血液中的CAR T细胞水平与ORR(包括不可检测的MRD)和≥3级CRS和神经事件相关。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(New Engl J Med.)，2020年；382:1331-1342。在该分析中，CRS和神经事件主要是可逆的(N＝68名治疗的患者)：15％具有≥3级CRS；31％的患者具有≥3级神经事件；并且两名患者具有5级AE(其中的一个是CAR T产物相关的)。如先前所报告，通过下一代测序评估MRD(10^-5灵敏度)。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(New Engl J Med.)，2020年；382:1331-1342。

该更新报告了用CAR T细胞治疗的在ZUMA-2中的所有68名患者的药理学数据。产物属性、血液中的CAR T细胞水平和血清中的细胞因子水平以及其与临床结果的关联性，通过使用先前所描述的方法进行分析。Locke FL等人，《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25:285-295。Wilcoxon秩和检验用于测量亚组结果与CAR T细胞和细胞因子水平之间的关联性。P值未针对多次检验进行调整。

CAR T细胞产物属性通常在由Ki-67增殖指数和TP53突变状态定义的预后组中相当。有朝向在高Ki-67亚组中的更多分化表型和在具有TP53突变的患者中的基于CD4的表型的趋势。(表8)。

表8

^a在所有68名治疗的患者中，65名总患者的产物特征数据可用。48/49名总患者的产物特征数据可用，所有患者的Ki-67数据可用，并且36名患者的TP53突变数据可用。TP53，肿瘤蛋白p53基因

在具有由Ki-67增殖指数和TP53突变状态定义的不同预后因素的组中还存在相当的CAR T细胞扩增。施用后在血液中的CAR T细胞的峰值水平和AUC两者在具有野生型与突变的TP53或Ki-67增殖指数<50％与≥50％的患者中相当，这与这些亚组中的功效相当一致。患者的客观应答率(ORR)的主要终点显示在表9中。至应答的中值时间为28天(范围：24至92天)，中值随访时间为12.3个月。28名患者的潜在随访≥24个月，并且这些患者中的12名患者保持缓解。基于完全应答和应答持续时间(DOR)建立功效。

Ki-67增殖指数<50％与≥50％的患者的ORR为100％与94％，然而Ki-67增殖指数<50％与≥50％的患者的CR率为64％与78％。表9：Ki-67增殖指数数据可用的患者的数量为49名。

表9

	ORR(95％CI)，％	CR率(95％CI)，％
			Ki-67 PI<50％	100(77–100)	64(35–87)
Ki-67 PI≥50％	94(79–99)	78(60–91)

对于具有野生型与突变的TP53的患者的ORR均为100％，然而野生型与突变的TP53患者的CR率为67％与100％。表10：TP53数据可用的患者的数量为36名。所有六名具有TP53突变的患者和所有30名没有突变的患者都有反应。在具有TP53突变的六名患者中，三名患者具有≥3级神经毒性，两名患者具有≥3级CRS

表10

	ORR(95％CI)，％	CR率(95％CI)，％
			TP53突变	100(54–100)	100(54–100)
TP53非突变	100(88–100)	67(47–83)

在治疗前、第0天和到在CAR T细胞输注后第28天的不同时间点，测量血清中至多44种生物标志物，包括IL(白介素)、INF-γ(干扰素γ)、MCP-1(单核细胞化学引诱剂蛋白1)、IL-2Rα(IL-2受体α)、sPD-L1(可溶性编程性死亡配体1)和sVCAM(可溶性血管细胞粘附分子)。关于增殖性(IL-15、IL-2)、炎症性(IL-6、IL-2Rα、sPD-L1和VCAM-1)、免疫调节性(IFN-γ、IL-10)、趋化因子(IL-8和MCP-1)和效应子细胞因子(颗粒酶B)，具有Ki-67增殖指数<50％与≥50％的两个预后组的药效学概况是相当的。此外相对于野生型TP53在具有突变的TP53的患者中有增加的增殖性(IL-15、IL-2)和炎症性(IL-6、IL-2Rα、sPD-L1和VCAM-1)细胞因子水平的趋势。图1A-图1F。

在实现MRD阴性状态的患者中，血清中的选定细胞因子的峰值水平也有增加。在68名患者中的29名患者(43％)中分析MRD；这些患者中的24名患者(83％[19名患者具有完全应答和5名具有部分应答])在CAR T细胞施用后一个月呈MRD阴性。在CAR T细胞施用后一个月，MRD阴性(n＝24/29)与阳性患者(n＝5/29)具有增加的干扰素(IFN)-γ和白介素(IL)-6中值峰值水平和增加的IL-2的趋势。在治疗的7天内血清中的细胞因子水平达到峰值。对于PD-L1和颗粒酶B观察到一致的趋势。在1个月时呈MRD阴性的患者中还观察到在治疗后14天内测量的峰值CAR T细胞水平增加。图2A-图2I。

六名患者发展出4级神经事件，包括一名具有大脑水肿。三名患者同时具有4级CRS。与没有神经事件的患者相比，具有4级神经事件的患者显示出促炎症血清生物标志物(例如，IFNγ、MCP-1、TNF-α、IL-2和IL-6)的峰值水平增加。

大脑水肿在侵袭性多模态疗法后完全消退。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(New Engl J Med.)，2020；382:1331-1342。在该患者中，CAR T细胞的扩增和IL-2的峰值血清水平最高；与其他研究/ZUMA-2患者的中值相比，在该患者中多种细胞因子的上升高了几倍。表11：

表11

^a在具有可用数据的66名患者中。

CAR T细胞药代动力学和药效学概况在具有与较低和较高风险(由Ki-67和突变的TP53定义)相关的不同预后标志物状态的MCL患者组之间是相当的，与相当的临床应答率一致。具有突变的TP53的患者中的促炎症标志物水平有更高的趋势。

CAR T细胞施用的药效学概况与功效(在1个月时的MRD状态)和4级治疗出现的神经事件相关。发展出大脑水肿的患者具有最高的峰值CAR T细胞水平和血清IL-2、以及升高的治疗后促炎症标志物。

实施例5

针对具有复发性或难治性套细胞淋巴瘤(MCL)的CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法治疗患者进行2期单臂临床研究，该患者已经接受了一种或多种既往治疗(其可以包含抗CD20抗体、含蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法、和/或Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)(诸如依鲁替尼或阿卡替尼))。符合资格的患者还在其最后一次治疗或对其最近一次治疗的难治性疾病之后具有疾病进展。研究排除具有活动性或严重感染、既往同种异体造血干细胞移植(HSCT)、可检测的脑脊液恶性细胞或脑转移以及中枢神经系统(CNS)淋巴瘤或CNS障碍的任何病史的患者。

通过白细胞单采术程序获得患者的外周血单核细胞。单核细胞通过选择CD4+和CD8+细胞来富集T细胞，在IL-2的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，然后用含有FMC63-28Z CAR(一种包含抗CD19单链可变片段(scFv)、CD28和CD3-ζ结构域的嵌合抗原受体(CAR))的复制缺陷型病毒载体进行转导。不受任何假设的束缚，选择CD4+细胞和CD8+细胞可以在离体制造过程期间包括的患者白细胞单采术材料中具有减少的潜在表达CD19的循环肿瘤细胞。该过程的T细胞产物可以被鉴定为KTE-X19。将抗CD19 CAR T细胞扩增，洗涤，配制成悬浮液，并且冷冻保存。在接受抗CD19 CAR T细胞疗法之前，用在输注CAR T细胞之前的第五天、第四天和第三天中的每一天静脉内给予的500mg/m²环磷酰胺和30mg/m²氟达拉滨的淋巴耗竭化学疗法方案治疗患者；患者还可以在输注抗CD19 CAR T细胞之前大约30至60分钟接受对乙酰氨基酚和苯海拉明或另一种H1抗组胺剂。避免了全身性皮质类固醇的预防性使用，因为其可能干扰CAR T细胞的活性。

目标剂量为2×10⁶个CAR阳性活T细胞或抗CD19 CAR T细胞/kg体重，其中最大剂量为2×10⁸个抗CD19 CAR T细胞(对于100kg及以上的患者)细胞。68名患者接受了单次输注(通过重力或蠕动泵持续大约30分钟)的抗CD19 CAR T细胞，并且在他们的第4周疾病评估后至少6个月跟踪这些患者中的60名患者，将它们作确定为功效可评估。56名患者接受2×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg；1名患者接受1×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的剂量，1名患者接受1.6×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的剂量，2名患者接受1.8×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的剂量，并且-2名患者接受1.9×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的剂量。在这60名患者中，中值年龄为65岁(范围：38至79岁)，51名患者是男性，56名患者是白人。50名患者患有IV期疾病。基于简化的套细胞淋巴瘤国际预后指数(s-MIPI)，25名患者被分类为低风险，25名患者被分类为中间风险，8名患者被分类为高风险，并且2名患者具有未知风险状态。20名患者具有按照方案执行的基线骨髓检查；这些患者之中，10名患者呈阴性，8名患者呈阳性，并且2名患者不确定。所有60名功效可评估患者中的既往疗法的中值数量为3(范围：两至五)。26名患者在自体HSCT之后复发或对自体HSCT是难治性的。21名患者在其最后一次MCL治疗后复发，而36名患者对其最后一次MCL治疗是难治性的。14名患者具有母细胞样MCL。在白血病去除术之后以及在输注抗CD19 CAR T细胞之前，21名患者接受了桥接疗法。19名患者用BTKi治疗，14名患者用皮质类固醇治疗，并且6名患者用BTKi和皮质类固醇两者治疗。53名患者接受在抗CD19 CAR T疗法(第0天)之前的第五天、第四天和第三天中的每一天静脉内给予的500mg/m²环磷酰胺和30mg/m²氟达拉滨两者的淋巴耗竭化学疗法方案。剩余的7名患者在CAR T疗法之前4天或更多天内接受了相同剂量的淋巴耗竭化学疗法。患者的客观应答率(ORR)的主要终点显示在表12中。至应答的中值时间为28天(范围：24至92天)，中值随访时间为12.3个月。二十八名患者的潜在随访≥24个月，并且这些患者中的十二名患者保持缓解。基于完全应答和应答持续时间(DOR)建立功效。

表12

CI，置信区间；NE，不可估；NR，未达到；PR，部分缓解。

a.结果在所有应答者之中得出。从首次客观应答日期到进展或死亡的日期测量DOR。

b.检查过的值。

在82名患者中的75名患者中观察到CRS(细胞因子释放综合征)，包括在82名患者中的15名患者中的≥3级(Lee分级系统1)CRS。至CRS发作的中值时间为3天(范围：1至13天)，并且CRS的中值持续时间为10天(范围：1至50天)。在患有CRS的患者中，关键表现(即发生在>10％患者中的表现)包括发烧(99％的患者)、低血压(60％的患者)、缺氧(37％的患者)、恶寒(33％的患者)、心动过速(37％的患者)、头痛(24％的患者)、疲劳(19％的患者)、恶心(13％的患者)、丙氨酸转氨酶增加(13％的患者)、天冬氨酸转氨酶增加(12％的患者)和腹泻(11％的患者)。与CRS相关的严重事件包括低血压、发烧、缺氧、急性肾损伤和心动过速。响应于CRS，患者可能已经按照表13中的适应症接受了托珠单抗和/或皮质类固醇。

表13

a.Lee DW等人，2014年。细胞因子释放综合征诊断和管理的当前概念(Currentconcepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome)，《血液》(Blood)，2014年7月10日；124(2):188-195。

b.有关神经毒性的管理，请参阅表14。

c.有关详细信息，请参考托珠单抗处方信息

在53名患者中观察到神经事件，他们中有20名经历了3级或更高级的(严重或危及生命的)不良反应。至神经事件发作的中值时间为6天(范围：1至32天)。66名患者中有52名的神经事件消退，中值持续时间为21天(范围：2至454天)。3名患者在死亡的时候具有进行性神经事件，包括1名具有严重脑病的患者。剩余的未消退的神经事件是1级或2级。54患者通过神经事件的发作经历了CRS。5名患者未经历具有神经事件的CRS，并且8名患者在CRS消退之后发展出神经事件。56名患者在输注抗CD19 CAR T细胞后7(七)天内经历了第一次CRS或神经事件。

最常见的神经事件(发生在>10％的患者中)包括脑病(51％的患者)、头痛(35％的患者)、震颤(38的患者)、失语(23％的患者)和谵妄(16％的患者)。在治疗后发生了包括脑病、失语和癫痫发作的严重事件。在至少百分之十的治疗患者中观察到的一些不良反应包括：血液和淋巴系统障碍(凝血病、心脏病、心动过速、心动过缓、非心室心律失常)；胃肠道障碍(恶心、便秘、腹泻、腹痛、口腔疼痛、呕吐、吞咽困难)；一般障碍和施用部位病症(发热、疲劳、恶寒、水肿、疼痛)；免疫系统障碍(细胞因子释放综合征，低丙球蛋白血症)；感染和侵染(病原体未指定的感染、病毒感染、细菌感染)；代谢和营养障碍(食欲减少)、肌肉骨骼和结缔组织障碍(肌肉骨骼疼痛、运动功能障碍)；神经系统障碍(脑病、震颤；头痛、失语、头晕、神经病)；精神障碍(失眠、谵妄、焦虑)；肾脏和泌尿障碍(肾功能不全、尿液输出减少)；呼吸道、胸廓和纵隔障碍(缺氧、咳嗽、呼吸困难、胸膜积液)；皮肤和皮下组织障碍(皮疹)；和血管障碍(低血压、高血压、血栓形成)。经历2级或更高级的神经毒性的患者可以按照表14中所示的适应症进行治疗。

表14

a.基于常见不良事件术语标准的严重程度。

在输注抗CD19 CAR T细胞后，通过测量血液中细胞因子、趋化因子和其他分子的瞬时升高，在四周间隔内评估药效学应答。分析IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-α、IFN-γ和/或sIL2Rα的水平。在输注后4天和8天之间通常观察到这些细胞因子水平的峰值升高，并且水平通常在28天内返回到基线。预期B细胞发育不良的时段。输注后，抗CD19 CAR T细胞的初始扩增随后到3个月时下降到近似基线水平。在输注后的前7天至15天内发生抗CD19 CART细胞的峰值水平。结果表明，血液中抗CD19 CAR T细胞的水平与客观应答(即完全缓解(CR)或部分缓解(PR))相关。应答者(具有完全缓解和部分缓解的那些)中的中值峰值抗CD19 CAR T细胞水平为102.4个细胞/μL(范围：0.2至2589.5个细胞/μL；n＝51)，在无应答者中为12.0个细胞/μL(范围：0.2至1364.0个细胞/μL，n＝8)。中值AUC第0-28天(AUC_0-28)在具有客观应答的患者中为1487.0个细胞/μL·天(范围：3.8至2.77×10⁴个细胞/μL·天；n＝51)，在无应答者中为169.5个细胞/μL·天(范围：1.8至1.17 10×10⁴个细胞/μL·天；n＝8)。在未接受皮质类固醇也未接受托珠单抗的患者(n＝18)中的中值峰值(24.7个细胞/μL)抗CD19 CAR T细胞(峰值：和AUC_0-28水平(360.4个细胞/μL·天)类似于仅接受皮质类固醇的患者(n＝2)的那些(峰值：24.2个细胞/μL；AUC_0-28：367.8个细胞/μL·天)。在仅接受托珠单抗的患者(n＝10)中，平均峰值抗CD19 CAR T细胞为86.5个细胞/μL，AUC_0-28为1188.9个细胞/μL·天。在接受皮质类固醇和托珠单抗两者的患者(n＝37)中，平均峰值为167.2个细胞/μL，AUC_0-28为1996.0个细胞/μL·天。中值峰值抗CD19 CAR T细胞值在年龄≥65岁的患者(n＝39)中为74.1个细胞/μL，在年龄<65岁的患者(n＝28)中为112.5个细胞/μL。中值抗CD19 CAR T细胞AUC_0-28值在年龄≥65岁的患者中为876.5个细胞/μL·天，在年龄<65岁的患者中为1640.2个细胞/μL·天。性别对抗CD19 CAR T细胞的AUC _0-28和C_max没有显著影响。

实施例6

BTKi疗法后进展的MCL患者用挽救疗法仅具有5.8个月的中值总生存期。ZUMA-2(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02601313)是在1至5种既往疗法(包括BTKi)之后的R/RMCL患者的2期注册的多中心研究。向患者施用自体抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法，如实施例5中所述制备和施用。该抗CD19 CAR T细胞产物可以被称为KTE-X19。在ZUMA-2的主要分析(N＝60)中，用抗CD19 CAR T细胞治疗的客观应答率(ORR)(中值随访12.3个月)为93％(67％完全应答[CR]率)。本实施例描述了如实施例5中所述制备的抗CD19 CAR T细胞治疗的药理学概况的比较分析和通过MCL形态和既往BTKi暴露(依鲁替尼[依鲁替尼]和/或阿卡替尼[阿卡替尼])的结果、伴随基本产物属性表征。

患有R/R MCL的符合资格的患者经历白细胞单采术和调理性化学疗法，然后单次输注2×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。使用先前所述的方法(参见先前实施例)评估产物属性(例如，抗CD19 CAR T细胞在与CD19+细胞一起共培养后的IFNγ产生)、血液中的CAR T细胞水平和血清中的细胞因子水平。报告了60名功效可评估患者的临床结果；报告了所有68名治疗患者的产物属性和药理学数据。

在基线处，40名患者(59％)患有经典的MCL，17名患者(25％)具有母细胞样MCL，并且4名患者(6％)具有多形性MCL，如研究者评估的。在研究进入之前，52名患者(76％)具有既往依鲁替尼，10名患者(15％)具有既往阿卡替尼，并且6名患者(9％)具有两者；88％的患者患有BTKi难治性疾病。在所制造的抗CD19 CAR T细胞产物中，患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者的中值(范围)CD4+/CD8+T细胞比率分别为0.7(0.04–2.8)、0.6(0.2–1.1)或0.7(0.5–2.0)。产物T细胞表型(中值[范围])包括较少分化的CCR7+T细胞(经典的为40.0％[2.6–88.8]；母细胞样为35.3％[14.3–73.4]；多形性为80.8％[57.3–88.8])以及效应和效应记忆CCR7-T细胞(经典的为59.9％[11.1–97.4]；母细胞样为64.8％[26.6–85.7]；多形性为19.2％[11.1–42.7])。在患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者中共培养物的中值(范围)干扰素(IFN)-γ水平分别为6309.5pg/mL(424.0–20,000)、6510.0pg/mL(2709.0–18,000)或7687.5pg/mL(424.0–12,000)。在患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者中，中值(范围)峰值CAR T细胞水平分别为77.6个细胞/μL(0.2–2241.6)、35.0个细胞/μL(0.2–2589.5)或144.9个细胞/μL(39.2–431.3)。ORR/CR率在患有经典的MCL的患者中为93％/65％，在患有母细胞样MCL的患者中为88％/53％，并且在患有多形性MCL的患者中为100％/75％。患有经典的、母细胞样或多形性MCL的患者的12个月存活率分别为86.7％、67.9％或100％。≥3级细胞因子释放综合征(CRS)和神经事件发生在15％和38％的患有经典的MCL的患者中、6％和8％的患有母细胞样MCL的患者中和25％和50％的患有多形性MCL的患者中。

对于接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者，在所制造的抗CD19CAR T细胞产物中的中值CD4+/CD8+T细胞比率分别为0.7(范围，0.04–3.7)、0.6(范围，0.3–1.2)或1.0(范围，0.7–1.9)。产物T细胞表型(中值[范围])包括较少分化的CCR7+T细胞(依鲁替尼39.3％[2.6–86.4]；阿卡替尼42.7％[16.3-88.8]；两者49.5％[14.3–83.0])和CCR7-效应和效应记忆T细胞(依鲁替尼60.6[13.7-97.4]；阿卡替尼57.3％[11.1-83.8]；两者50.6％[17.0-85.7])。在接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者中共培养物的中值(范围)IFN-γ水平分别为6496.0pg/mL(424.0–20,000)、5972.5pg/mL(2502.0–18,000)或7985.5pg/mL(2709.0–12,000)。对于接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者，中值(范围)峰值CAR T细胞水平分别为95.9(0.4–2589.5)、13.7(0.2–182.4)或115.9(17.2–1753.6)。ORR/CR率在接受既往依鲁替尼的患者中为94％/65％，在接受既往阿卡替尼的患者中为80％/40％，并且在接受两种BTKi的患者中为100％/100％。在接受既往依鲁替尼、阿卡替尼或两者的患者中的12个月存活率分别为81％、80％或100％。≥3级CRS和神经事件发生在17％和31％的接受既往依鲁替尼的患者中，10％和10％的接受既往阿卡替尼的患者中和0％和67％的接受两种BTKi的患者中。虽然治疗后CAR T细胞水平在具有母细胞样形态或先前用单独的阿卡替尼治疗的患者中较低，但是通过临床结果的类似趋势反映，由MCL形态或既往BTKi定义的所有亚组从抗CD19CAR T细胞治疗中获得临床益处。

实施例7

本实施例提供了用于ZUMA-2中的所有患者的功效、安全性和药理学的更新分析，其中最小随访1年。患有R/R MCL的符合资格的患者经历了白细胞单采术和调理性化学疗法，然后单次输注抗CD19 CAR T细胞疗法(2×10⁶个CAR T细胞/kg)，如在先前实施例中所述。主要终点是根据Lugano分类通过独立审查委员会评估的ORR(CR+部分应答)。报告了具有≥1年随访的60名治疗患者的功效数据；为所有68名治疗患者呈现了安全性数据。

中位随访为17.5个月(范围，12.3–37.6)；ORR为92％(95％CI，81.6–97.2)，CR率为67％(95％CI，53.3–78.3)。在所有功效可评估的患者中，48％的患者在数据截止时具有进行性应答。应答持续时间、无进展生存期(PFS)或总生存期未达到中值；15个月的估计值分别为58.6％(95％CI，42.5–71.7)、59.2％(95％CI，44.6–71.2)或76.0％(95％CI，62.8–85.1)。在实现CR的患者中，未达到中值PFS(15个月的PFS率，75.1％[95％CI，56.8–86.5])；在实现部分应答的那些中，中值PFS为3.1个月(95％CI，2.3–5.2)。在无反应患者中中值PFS为1.1个月(95％CI，0.9–3.0)。前28名治疗的患者具有32.3个月的中值随访(范围，30.6–37.6)；39.3％的这些患者在没有进一步疗法的情况下保持持续缓解。

常见的≥3级不良事件为中性粒细胞减少(85％)、血小板减少(53％)、贫血(53％)和感染(34％)。在输注后≥30天在60％患者中报告了≥3级血细胞减少。在15％的患者中发生了≥3级细胞因子释放综合征；59％的患者接受了托珠单抗进行CRS管理。在31％的患者中报告了≥3级神经事件(NE)，并且38％的患者接受了类固醇进行NE管理。所有CRS事件和大部分NE(37/43)消退。没有5级CRS事件或NE，并且随着附加的随访而发生新的5级事件。存在2例2级巨细胞病毒感染，1例≥3级低丙球蛋白血症和≥3级肿瘤消散综合征中的每一者，并且没有Epstein-Barr病毒相关淋巴增殖的病例，有复制能力的逆转录病毒、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症或抗CD19 CAR T细胞相关的二级癌。

中值峰值CAR T细胞水平和中值曲线下面积(第0-28天)在12个月时具有进行性应答的患者中为98.9个细胞/μL(范围，0.2–2565.8)和1394.9个细胞/μL(范围，3.8–27,700)，在12个月时复发的患者中为202.6个细胞/μL(范围，1.6–2589.5)和2312.3个细胞/μL(范围，19.0–27,200)，以及在无应答者中为0.4个个细胞/μL(范围，0.2–95.9)和5.5个细胞/μL(范围，1.8–1089.1)。在具有可用数据的57名功效可评估患者中，84％的患者在基线处具有可通过流式细胞术检测的B细胞。在12个月时进行性应答中的那些患者中，具有可评估样品的26名患者中的10名患者(38％)在3个月时具有可检测的B细胞，18名患者中的10名患者(56％)在12个月时具有可检测的B细胞；基因标记的CAR T细胞在28名可评估患者中的5名患者(17％)中在12个月时不再可检测到。ZUMA-2研究继续显示在患有R/R MCL的患者中对具有可管理的安全性的抗CD19 CAR T细胞疗法的显著且持久的临床益处。在该患者群体内，其缺乏治愈性治疗选项，大多数患者实现了持久的CR，并且没有报告新的安全性信号。尽管在实现客观应答的患者中早期CAR T细胞扩增较高，但是稍后复发的那些患者显示出升高的CAR T细胞水平，这指向MCL中的第二治疗失败的替代机制。

实施例8

尽管大约80-85％的患有ALL的患者在初始治疗后实现持久的完全缓解(CR)，但是患有复发性或难治性(R/R)ALL的剩余15-20％患者具有不利结果，其中在≤40％的患有复发性疾病的患者中具有2年无事件生存期。如上所述制备的抗CD19 CAR T细胞疗法显示出高完全应答率，患有R/R B细胞淋巴瘤的成年患者具有可管理的安全性概况(参见先前实施例)。特别是参见例如实施例5)。ZUMA-4(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02625480)是在患有R/R B细胞ALL或NHL的小儿和青少年患者中评估该抗CD19 CAR T细胞疗法的1/2期研究。ZUMA-4的1期结束间断分析显示了抗CD19 CAR T细胞疗法用优化的给药和不良事件(AE)管理策略治疗患有R/R ALL的小儿患者的可行性。2期ZUMA-4的方案已经被修改为包括更广泛的B细胞ALL登记标准，焦点是具有与较差结果相关的早期复发的患者，并且添加了NHL群组。

关键的B细胞ALL登记标准包括年龄≤21岁，体重≥10kg，并且具有B细胞ALL，该B细胞ALL是原发性难治性的，在第一次诊断的18个月内复发，在≥2线全身性疗法之后是复发性/难治性的，或者在登记之前至少100天在同种异体干细胞移植之后是复发性/难治性的。B细胞ALL也是在登记之前≥100天和停止免疫抑制药物≥4周在自体干细胞移植后的B前体细胞ALL R/R。Lansky(年龄<16岁)或Karnofsky(年龄≥16岁)体能状态为PS≥80，体重≥6kg。符合资格的患者包括患有CNS-1疾病的患者、患有CNS-2疾病而没有临床上明显的神经变化的患者、以及患有>5％BM母细胞或MRD阳性疾病的患者(通过流式细胞术或PCR确定的阈值10^-4)。CNS-1疾病由CSF中无可检测淋巴母细胞定义；CNS-2疾病由可检测的疾病和CSF中的白细胞计数<5/μL定义。CNS-3疾病由CSF中的WBC≥5/μL定义。疾病负荷标准已经被修改为还包括在登记时具有最小残留疾病阳性疾病的患者。如果对酪氨酸激酶抑制剂疗法不耐受或如果在≥2种酪氨酸激酶抑制剂疗法后为复发性/难治性的，那么患有费城染色体阳性ALL的患者符合资格。还包括接受既往博纳吐单抗的患者。具有慢性骨髓性白血病淋巴样原始细胞危象或临床上显著感染的患者不符合资格。患有伯基特白血病/淋巴瘤的患者也不符合资格。

对于B细胞NHL，关键登记标准包括年龄<18岁，体重≥10kg，经组织学确认的未另外指定的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL NOS)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤或在DLBCL与BL之间的未分类B细胞淋巴瘤，具有≥1个可测量病变。对于NHL，疾病必须已经是原发性难治性的，在≥2线全身性疗法之后是复发性/难治性的，或者在登记≥100天之前在进行自体或同种异体干细胞移植之后是复发性/难治性的。患者必须已经停止免疫抑制剂药物≥4周。Lansky(年龄<16岁)或Karnofsky(年龄≥16岁)体能状态为PS≥80，体重≥6kg。还包括接受既往博纳吐单抗的患者。患者必须接受在最小抗CD20 mAb和含蒽环霉素的化学疗法下的足够的既往疗法，并且具有一个或多个可测量的病变。在登记4周内患有急性移植物抗宿主病或需要治疗的慢性移植物抗宿主病的患者不符合资格。尽管在本研究中接受KTE-X19的患者符合资格进行再治疗，排除具有既往CAR T细胞疗法或其他基因修饰的T细胞疗法的患者。还排除具有心脏淋巴瘤累及的患者或者由于肿瘤肿块效应需要紧急治疗的患者。对ALL和NHL群组的附加排除包括：具有临床显著感染的患者；患有在登记4周内需要治疗的急性或慢性GVHD的患者、在过去6个月内接受阿仑单抗(或其他抗CD52抗体)、在过去3个月内接受氯法拉滨或克拉屈滨、在过去3周内接受PEG-天冬酰胺酶或在过去28天内接受供体白细胞输注(DLI)的患者。

排除具有CNS累及和某些异常的患者。已经接受既往博纳吐单抗治疗的、患有中枢神经系统1疾病(脑脊液中无可检测的淋巴母细胞)、存在淋巴母细胞和具有神经症状和没有临床上明显的神经变化的中枢神经系统2疾病(可检测的疾病，但在脑脊液中的白细胞计数<5/μL)的患者可能包括在ALL和NHL群组中。排除存在淋巴母细胞和具有神经症状的患者、有或没有神经症状存在淋巴母细胞的中枢神经系统3疾病(在CSF中WBC≥5/μL)疾病、通过成像确定的具有任何CNS肿瘤肿块和/或脑膜旁肿块的患者、任何CNS障碍诸如脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病的病史或存在、或具有CNS累及的任何自身免疫性疾病、可逆性后部脑病综合征或具有结构缺陷的大脑水肿、在过去12个月内中风或暂时性缺血性发作的病史、以及需要活性抗惊厥药物的癫痫发作。排除除了博纳吐单抗之外接受既往CD19定向的疗法的患者。

患者接受在第-4天、第-3天和第-2天给予的25mg/m²氟达拉滨和在第-2天给予的900mg/m²环磷酰胺的调理性化学疗法，然后在第0天以1×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg的目标剂量单次输注抗CD19 CAR T细胞。对于ALL，2期主要目标是评估抗CD19 CAR T细胞功效，如通过总CR率(具有不完全血液血恢复的CR和CR)评估。对于NHL，2期主要目标是通过客观应答率(CR+部分应答)评估抗CD19 CAR T细胞疗法功效。ALL和NHL群组的2期次要目标包括安全性和耐受性、附加功效终点和患者报告的结果得分的变化。

在先前实施例(诸如实施例5(也称为KTE-X19))中描述了本研究中使用的CAR T细胞治疗，其是用于治疗复发性/难治性套细胞淋巴瘤和其他复发性/难治性血液恶性肿瘤的自体抗CD19 CAR T细胞疗法。来自单采术产物的PBMC通过CD4+/CD8+阳性选择富集T细胞，这导致去除恶性细胞。所得的T细胞在IL-2的存在下用抗CD3抗体/抗CD28抗体激活，逆转录病毒转导以引入抗CAR基因构建体(FMC63-28Z CAR)并且扩增到所需剂量。可以将扩增的T细胞冷冻进行运输并运送回患者进行输注。阿基仑赛通过不同的方法制备，如例如ParkJ.H.等人，《新英格兰医学杂志》(NEngl J Med.)，2018；378(5):449-459；以及Lee D.W.等人，《柳叶刀》(Lancet.)2015；385(9967):517-528中所述。在患有R/R B-ALL的成年患者中，KTE-X19治疗改善了1期中的CR率、CRi率或安全性概况。Shah BD等人，《临床肿瘤杂志》(JClin Oncol.)2019；37(增刊，摘要):7006。

在1期中的DLT评估期间，起始剂量为2×10⁶个抗CD19 CAR T细胞/kg。DLT被定义为持续>7天的3级非血液学AE和4级非血液学AE(无论持续时间如何，方案指定的例外)或持续>30天的4级血液学AE。还检查了在68mL体积或40mL体积中的1×10⁶个CAR-T细胞的剂量。接受40mL、1×10⁶群组的患者接受了修改的AE管理。基于可用数据，在2期中使用40mL中的1×10⁶个细胞/kg。1期研究的结果显示了94％的MRD阴性，并且在患有R/R B-ALL的小儿和青少年患者中观察到73％的CR+Cri。结果还显示了与已知毒性一致的可管理的AE概况，并且用优化的剂量制剂和修改的安全性管理时NE的发生率和严重程度较低。Wayne AS等人，《儿科血液学和癌症》(Pediatr Blood Cancer.)2019；66(增刊):S24。

在2期中，筛选患者并对其进行白细胞单采术，然后在第-4天开始调理性化学疗法。桥接疗法可以在研究者的判断下在白细胞单采术之后施用，并且必须在调理性化学疗法之前完成≥7天或5个半衰期。在第0天输注KTE-X19。第一次疾病评估发生在第28天。在第2周、第4周、第2个月和第3个月发生治疗后安全性和功效评估。患者每3个月直到第18个月和在第24个月和第60个月之间每6个月进行随访。从第6年开始，患者每年返回一次持续长达15年。总共50名患有R/R ALL的患者和16名患有R/RNHL的患者用1×10⁶个KTE-X19细胞/kg的40mL制剂登记。当前研究的2期中的患者还包括NHL群组和用于R/R B-ALL的扩大的登记标准，以包括与较差的结果相关的早期第一次复发的患者以及患有MRD阳性疾病的患者。主要目标是对于ALL如通过总体CR率(CR和Cri)评估以及对于NHL通过ORR(CR+PR)评估的功效。次要目标包括安全性、耐受性、DOR、OS、无复发生存期(RFS)/无进展生存期(PFS)和患者报告的结果(PRO)的评估。对于ALL，附加次要目标包括对MRD阴性率和allo-SCT率的评估。对于总体CR率(仅ALL群组)，将确定发生率和精确的双侧95％CI。使用精确的二项式检验，将在0.025的单侧α水平下比较35％的应答率。对于MRD阴性率(仅ALL群组)，将确定发生率和精确的双侧95％CI。如果总体CR率的统计检验是显著的，则使用精确的二项式检验将MRD阴性率与在0.025的单侧α水平下的30％的比率进行比较。对于DOR和OS，将确定Kaplan-Meier估计值和双侧95％CI。对于AlloSCT率(仅ALL群组)，将确定在mITT集中的发生率和精确的双侧95％CI。就安全性而言，将确定AE的发生率(包括所有、严重的、致命的、CTCAE版本4.03≥3级)、和在输注日期当天或之后发作的治疗相关AE。对于NHL群组，将不检验特定的假设。在该群组中计划的样品大小的情况下，假设观察到的ORR为63％(10/16名患者)、69％(11/16)、75％(12/16名患者)和81％(13/16名患者)，估计的ORR的95％精确CI的下限将分别为35％、41％、48％和54％。

实施例9

本实施例报告了ZUMA-3(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02614066)的1期结果，该ZUMA-3是一项在患有复发性/难治性(R/R)B细胞ALL的成人中评估包括CD3ζ和CD28共刺激结构域并且如先前实施例中所述进行制备(CD4+/CD8+富集/去除恶性细胞)的自体抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的1/2期研究。用于制备已去除癌细胞的抗CD19 CAR T细胞的这一方案降低了在离体制造期间抗CD19 CAR T细胞激活和耗竭的可能性。外周血中的白血病母细胞的存在可能会限制用于制造CAR T细胞产物可用的T细胞数量，从而潜在地导致制造失败。Sabatino M.等人，《血液》(Blood)，2016；128(22):1227。已经在Wang M.等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2020；382(14):1331-1342中描述了用于MCL的在本研究中使用的抗CD19 CAR T细胞产物。其不同于在Sabatino M.等人，《血液》(Blood)，2016；128(22):1227，Park J.H.等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2018；378(5):449-459；以及Lee D.W.等人，《柳叶刀》(Lancet.)2015；385(9967):517-528。这种抗CD19 CAR T细胞产物在T细胞表型方面具有与通过先前所述的方法制成的不同的产物特征。该抗CD19 CAR在本实施例中和本申请中别处也被称为KTE-X19。

在氟达拉滨/环磷酰胺淋巴细胞耗竭后，患者以2、1或0.5×10⁶个细胞/kg接受了抗CD19 CAR T细胞。在CAR T细胞输注后28天内的剂量限制性毒性(DLT)比率是主要终点。为54名登记的患者制造抗CD19 CAR T细胞并且施用于45名患者(中位年龄46岁[范围，18-77])。DLT可评估群组中未发生DLT。分别在31％和38％的患者中发生≥3级细胞因子释放综合征(CRS)和神经事件(NE)；为了优化益处风险比，以1×10⁶细胞/kg抗CD19 CAR T细胞评估对CRS和NE的修订的不良事件(AE)管理(早期类固醇使用用于NE和托珠单抗仅用于CRS)。在修订的AE管理下治疗的9名患者中，33％的患者具有3级CRS，并且11％的患者具有3级NE，没有4/5级NE。总体完全缓解率与CAR T细胞扩增相关，并且在用1×10⁶个细胞/kg治疗的患者中为83％和在所有患者中为69％。在所有反应的患者中不可检测到最小残留疾病。在22.1个月(范围，7.1-36.1)中值随访时，中值DOR在用1×10⁶个细胞/kg治疗的患者中为17.6个月(范围，5.8-17.6)和在所有患者中为14.5个月(范围，5.8-18.1)。抗CD19 CAR T细胞治疗在患有R/R B-ALL的成人中提供了高应答率和可耐受的安全性。2期以1×10⁶个细胞/kg用修订的AE管理进行。

患者

符合资格的患者的年龄≥18岁，患有R/R B细胞ALL，定义为对一线疗法是难治性的(即，原发性难治性)，在第一次缓解后≤12个月复发，在≥2个既往线的全身性疗法线之后是复发性或难治性的，或在同种异体干细胞移植(SCT)之后复发。需要患者具有≥5％的骨髓母细胞、0或1的美国东部肿瘤协作组体能状态以及足够的肾、肝和心脏功能。需要登记的前六名患者在骨髓中具有≥25％的母细胞。对于接受既往的博纳吐单抗的患者，需要具有CD19表达≥90％的白血病母细胞。具有费城染色体阳性(Ph+)疾病、共存的髓外疾病、没有神经学变化的中枢神经系统(CNS)-2疾病(脑脊髓液[CSF]母细胞具有<5个白细胞/mm³)患者和患有唐氏综合征的患者符合资格。与神经学变化无关的CNS-3疾病(CSF母细胞具有≥5个白细胞/mm³)和CNS障碍病史被排除。

附加符合资格标准包括：如果患有费城染色体(Ph)+疾病的受试者患有对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法不耐受的疾病，或者如果他们尽管用≥2种不同的TKI治疗但具有复发性/难治性疾病，那么他们是符合资格的；绝对嗜中性粒细胞计数≥500/μL，除非根据研究者的意见血细胞减少是由于潜在的白血病并且用白血病疗法的情况下可能是可逆的；血小板计数计数≥50,000/μL，除非根据研究者的意见血细胞减少是由于潜在的白血病并且用白血病疗法的情况下可能是可逆的；绝对淋巴细胞计数≥100/μL；定义了足够的肾、肝、肺和心脏功能[肌酐清除率(如通过Cockcroft Gault所估计)≥60cc/min；血清丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶≤2.5×正常上限；总胆红素≤1.5mg/dL，患有吉尔伯特综合征的受试者除外；左心室射血分数≥50％，没有如通过超声心动图确定的心包积液的证据，无纽约心脏协会III类或IV类功能分类，也没有临床上显著的心律失常。没有临床上显著的胸腔积液；室内空气中的基线氧饱和度>92％]；有生育潜力的女性必须具有阴性血清或尿液怀孕测试；有生育潜力的女性必须具有阴性血清或尿液怀孕测试。

附加排除标准包括：根据世界卫生组织分类的伯基特白血病/淋巴瘤或慢性骨髓性白血病淋巴样原始细胞危象的诊断；除非≥3年无疾病，否则除了非黑色素瘤皮肤癌或原位癌(例如，宫颈、膀胱、乳腺)之外的恶性肿瘤史；对氨基糖苷类或本研究中所使用的任何药剂的严重超敏反应的病史；中枢神经系统(CNS)异常[CNS-3疾病的存在定义为在脑脊液(CSF)样品中的可检测脑脊髓母细胞，具有≥5个白细胞(WBC)/mm³，有或没有神经变化；以及CNS-2疾病的存在定义为在CSF样品中的可检测脑脊髓母细胞，具有<5个WBC/mm³，有神经变化。注意：患有CNS-1(CSF中不可检测的白血病)和患有没有临床上明显的神经变化的CNS-2的受试者符合资格参与研究；任何CNS障碍的病史或存在，诸如癫痫发作障碍、脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病、具有CNS累及的任何自身免疫性疾病、可逆性后部脑病综合征或大脑水肿]；对氨基糖苷类或本研究中所使用的任何药剂的严重超敏反应的病史；与骨髓衰竭相关的伴随遗传综合征病史；在登记的12个月内临床上显著的心脏病病史；在登记的6个月内的症状性深静脉血栓形成或肺栓塞的病史；原发性免疫缺陷；已知感染有HIV、乙型肝炎或丙型肝炎病毒。如果根据定量聚合酶链反应和/或核酸测试无法检测到病毒负载，则允许乙型肝炎或丙型肝炎的病史；如果响应于活性治疗并且在用Kite医疗监测器会诊之后，允许简单的尿路感染(UTI)和不复杂的细菌性咽炎；通过国际骨髓移植注册表指数(International Bone Marrow Transplant Registry index)按照Glucksberg标准或严重程度B-D的II-IV级急性移植物抗宿主病(GVHD)；在登记前4周内需要全身性治疗的急性或慢性GVHD；既往药物[全身性挽救疗法(包括化学疗法、针对Ph+疾病的TKI和博纳吐单抗)≤1次博纳吐单抗)；常见不良事件术语标准史(在用既往CD19定向疗法的情况下的4级神经事件或4级细胞因子释放综合征)；在登记前≤6个月接受阿仑单抗、在登记前≤3个月接受氯法拉滨或克拉屈滨、在登记前≤3个月接受PEG-天冬酰胺酶的治疗；在登记前≤4周进行供体淋巴细胞输注；在登记前4周用针对GVHD的任何药物和任何免疫抑制抗体进行治疗；在登记之前至少3个半衰期必须从任何先前全身性抑制性/刺激性免疫检查点分子疗法复发；在登记之前1周必需避免在药理学剂量下的皮质类固醇治疗(>5mg/天的泼尼松或等效剂量的其他皮质类固醇)和其他免疫抑制药物；存在任何留置线或管。Ommaya储液器和专用中心静脉进入导管是允许的；在登记前≤4周的活疫苗；由于制备型化学疗法对胎儿或婴儿的潜在危险作用，怀孕或哺乳的有生育潜力的女性；从同意的时候到完成抗CD19 CAR-T细胞疗法后6个月，不愿意实践生育控制的有生育潜力的两个性别的受试者；在研究者的判断下受试者不太可能完成所有协议要求的研究访视或程序，或遵守对参与的研究要求[导致终末器官损伤或在过去2年内需要全身性免疫抑制或全身性疾病变调剂的自身免疫性疾病病史]。

研究设计和治疗

1期目标是评估抗CD19 CAR T细胞治疗的安全性，并且基于剂量限制性毒性(DLT)的发生率和总体安全性概况确定最佳2期剂量。DLT被定义为在抗CD19 CAR T细胞输注后的前28天内发生的抗CD19 CAR T细胞相关的不良事件(AE)，包括持续>7天的3级非血液AE、无论持续时间如何(预先指定的预期事件除外(例如，肿瘤消散综合征))的4级非血液AE以及持续>30天的4级血液AE(淋巴细胞减少除外)(表15)。

表15：剂量限制性毒性

CRS，细胞因子释放综合征；DLT，剂量限制性毒性；TLS，肿瘤消散综合征

初始患者以2×10⁶个CAR T细胞/kg的起始剂量登记(图3)。基于总体安全性概况，随后的患者接受2×10⁶、1×10⁶或0.5×10⁶个CAR T细胞/kg。在0.5×10⁶个CAR T细胞/kg下。探索了接受较低剂量0.5×10⁶个CAR T细胞/kg的患者的两种制剂，一种的总体积为40mL，另一种的体积为68mL。40mL制剂旨在在冷冻/解冻过程期间维持细胞密度和细胞活力。

为了减轻细胞因子释放综合征(CRS)和神经事件(NE)的风险，将AE管理指南修订为将托珠单抗限制于治疗CRS(而非孤立的神经毒性)，并且在2级而不是3级NE发作时启动皮质类固醇治疗(表16)。

表16：原始和修订的神经毒性管理指南

在用1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗的附加患者群组中实施修订的AE管理指南。安全性审查团队(SRT)以进行性的方式审查安全性和功效数据，并且在协议和SRT特许状中定义的里程碑上给出关于进一步的1期登记和建议的2期剂量(RP2D)的建议。

患者在登记时经历白细胞单采术以获得5-10×10⁹个单核细胞的目标用于抗CD19CAR T细胞制造。在白细胞单采术之后建议预定义的桥接化学疗法(表17)，特别是对于在基线处具有高疾病负荷的患者(在骨髓中>25％白血病母细胞或通过局部检查在外周循环中≥1,000个母细胞/mm³)。

表17：桥接化学疗法

BID，每天两次；CVAD，环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和地塞米松；DOMP，地塞米松、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤和长春新碱；FLAG，氟达拉滨、高剂量的阿糖胞苷和G-CSF；G-CSF，粒细胞集落刺激因子；IDA，伊达比星；IV，静脉内；MP，6-巯嘌呤；PO，口服；SC，皮下；VAD，长春新碱、多柔比星和地塞米松。

在从桥接化学疗法清除≥7天或5个半衰期(如果更短)后，患者接受在第-4天、第-3天和第-2天静脉内(IV)给予的每天25mg/m²氟达拉滨和在第-2天IV给予的每天900mg/m²环磷酰胺的淋巴耗竭方案。在第0天施用单次输注抗CD19 CAR T细胞。

结果和评估

主要1期终点是在DLT可评估患者中的DLT发生率。次要终点包括安全性、研究者评估的总体缓解率(CR+具有不完全血液学恢复的CR[CRi])、缓解持续时间(DOR)、无复发生存期、OS和骨髓中不可检测的最小残留疾病(MRD)的比率。血液中CAR T细胞和细胞因子的水平是探索性终点。根据常见AE术语标准版本4.03对包括CRS和NE的症状在内的AE进行分级。CRS根据Lee等人《血液》(Blood)，2014；124(2):188-195。对于患有结节外疾病的患者，根据修订的国际工作组恶性淋巴瘤标准中对髓外和CNS疾病的应答标准来评估应答。Cheson BD等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)，2007；25(5):579-586。使用流式细胞术(NeoGenomics公司，美国佛罗里达州迈尔斯堡)在中心评估不可检测的MRD，其定义为每10,000个活细胞有<1个白血病细胞。Borowitz MJ等人，《血液》(Blood.)，2015；126(8):964-971；Bruggemann M.等人，《血液进展》(Blood Adv.)2017；1(25):2456-2466；以及Gupta S.等人，《白血病》(Leukemia.)2018；32(6):1370-1379。

要求在输注后≥7天住院。在第14天和第28天以及第2个月和第3个月通过身体检查、生命体征测量和神经学和实验室评估来对患者进行评估。骨髓评估和应答评估在第7-14天(可选)和第28天以及第2个月和第3天进行。对于经历过抗CD19 CAR T细胞输注后SCT的患者，在SCT后的前100天期间不需要骨髓评估。对于患有基线CNS-2疾病的患者，需要采集和分析CSF以确认CR。每3个月直到第18个月和在第24-60个月之间每6个月以及每年持续长达15年跟踪完成第3个月治疗后评估的患者的生存期和疾病状态。如果在>3个月缓解之后进展，所提供的CD19表达已被保留并且中和针对所述CAR的抗体不是可疑的，则实现CR的患者可以接受抗CD19 CAR T细胞的第二次输注。

对血液和血清样品进行生物标志物分析，以评估抗CD19 CAR T细胞的预测药代动力学和药效学标志物。如先前所述，液滴数字聚合酶链反应用于测量血液中转导的CD19CAR+T细胞的存在、扩增和持久性。Locke FL等人，《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25(1):285-295。使用先前报告的方法评估血清的细胞因子、趋化因子、免疫效应分子和巨噬细胞激活综合征的标志物。Locke FL等人，《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25(1):285-295。

统计学分析

DLT可评估群组包括以2×10⁶剂量水平治疗的前3名患者。安全性和功效分析包括用任何剂量的抗CD19 CAR T细胞治疗的所有患者。产生至事件终点的时间的Kaplan-Meier估计值和双侧95％置信区间。DOR被定义为从CR到复发或没有记录的复发而死亡的时间。在移植日期当天检查经历同种异体SCT同时在缓解中的患者的DOR。OS被定义为从抗CD19 CART细胞输注到由于任何原因死亡的日期的时间。数据呈现到2019年4月1日。所有统计学分析均在SAS(版本9.4)中进行。

结果

患者

在2016年3月9日和2018年7月12日之间，登记54名患者，并且在1期中进行白细胞单采术(图4)。对所有54名患者成功地制造抗CD19CAR T细胞产物；1名患者需要2种白细胞单采术程序，1名患者需要3种产物制造的程序。从白细胞单采术至将抗CD19 CAR T细胞递送到研究站点的时间为15天。五名患者在淋巴细胞耗竭之前由于AE(n＝3；图4)、同意退出(n＝1)或白细胞单采术后不符合资格(n＝1)而中断。四名附加患者在淋巴细胞耗竭后中断。三名患者由于4级败血症(n＝1)、开始新疗法(n＝1)以及由于5级败血症引起死亡(n＝1)而不接受抗CD19 CAR T细胞。一名患者由于深静脉血栓形成(排除标准)而在输注之前中断，但在同情用药下接受了抗CD19 CAR T细胞。54名患者中的四十五名患者(83％)接受以下这些剂量水平下的抗CD19 CAR T细胞：2×10⁶(n＝6)、1×10⁶(n＝23)或0.5×10⁶个CAR T细胞/kg(n＝16)。在1×10⁶个CAR T细胞/kg群组中的23名患者中有九名患者在修订的AE管理指南下治疗，需要更早使用类固醇进行NE管理并且仅保留托珠单抗用于治疗CRS。四十四名患者接受其靶剂量的抗CD19 CAR T细胞；1名患者登记接受1×10⁶个抗CD19CAR T细胞/kg，并且修订的AE管理用0.5×10⁶个细胞/kg治疗，但包括在1×10⁶剂量水平的分析中。

所有治疗患者的中值年龄为46岁(范围，18-77)，并且67％的患者接受≥3个既往线的疗法(表18)。在登记之前，16名患者(40％)是原发性难治性，13名患者(29％)在SCT后复发，并且21名患者(47％)接受了既往博纳吐单抗。博纳吐单抗是在8名患者中研究进入之前所使用的最后一种疗法(18％)，其中仅1名患者实现对博纳吐单抗的应答(CR)。

表18：患者基线特征

BM，骨髓；CNS，中枢神经系统；ECOG，美国东部肿瘤协作组；SCT，干细胞移植

安全性

在DLT可评估集(n＝3)之中未观察到DLT。百分之九十八的患者经历了≥3级AE(表19)。最常见的任何级别AE为发热(89％)、低血压(69％)、腹泻(42％)和恶寒(42％)。常见的≥3级AE(≥20％的患者)为发热(42％)、低血压(40％)、血小板计数减少(33％)、贫血(31％)、低磷血症(31％)、缺氧(24％)、脑病(22％)、热病性中性粒细胞减少(22％)和嗜中性粒细胞计数减少(22％)。在84％的患者中发生的任何级别的严重AE。

表19：不良事件

*表格包括在≥25％的所有患者中发生的任何级别的不良事件

在42名患者(93％)中报告了CRS；14名患者(31％)经历了≥3级CRS(表19)。常见的CRS≥3级症状为发热(45％)、低血压(36％)和缺氧(17％)。在12名患者(27％)中将升压药用于治疗CRS。输注后至CRS发作的中值时间为2天(范围，1-12)；任何级别和≥3级CRS的中值持续时间分别是9天和4.5天。在所有患者中的CRS相关事件均消退，但2名患者经历了5级抗CD19 CAR T细胞相关的AE。用2×10⁶格CAR T细胞/kg治疗的患者继发于CRS具有多器官衰竭(第6天)。用0.5×10⁶格细胞/kg治疗的一名患者在CRS和NE的背景中发展出脑血管意外(中风)(第7天)。未报告其他抗CD19 CAR T细胞相关的5级AE。

在35名患者(78％)中报告了NE；≥3级事件发生于17名患者中(38％；表19)。≥5％患者中发生的≥3级NE是脑病(22％)、失语(16％)和意识错乱状态(9％)。没有大脑水肿的病例，也没有5级NE。在输注后至NE发作的中值时间为6天(范围，1-31)；任何级别和≥3级NE的中值持续时间分别是12天和9天。在35名患者中的31名患者(89％)中NE消退；在神经事件消退之前，1名患者死于进行性疾病并且3名患者死于考虑与抗CD19 CAR T细胞无关的AE(败血症[n＝1]、脑血管意外[n＝1]、单纯疱疹病毒血症[n＝1])。

所有患者的百分之五十三接受了托珠单抗，并且36％的患者还接受了类固醇用于CRS管理；对于NE，31％和44％的患者分别接受了托珠单抗和类固醇。相对于在原始指南下以相同剂量治疗的14名患者，观察到在修订的AE管理指南下治疗的9名患者的改善的总体安全性(表20)。在原始指南下以1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗的14名患者中有四名患者具有3级或4级CRS。利用修订的AE管理，以1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗的9名患者中的3名患者具有3级CRS，没有报告4级CRS。这些患者还具有比在原始AE指南下接受1×10⁶个CAR T细胞/kg的患者更短的≥3级级CRS中值持续时间(4天与7天)，并且更长的至≥3级症状发作的时间(分别为6天与4.5天)。值得注意的是，在用原始指南管理的1×10⁶个CAR T细胞/kg剂量群组中14名患者中有9名患者经历了3/4级NE，与在在修订的管理指南下接受相同剂量的患者中一名3级事件和没有4级事件形成对比(表20)。基于对所有可用安全性和功效数据的审查，益处/风险比被认为是在1×10⁶个CAR T细胞/kg的剂量下最有利，导致该剂量成为RP2D。在修订的AE管理指南下治疗所有2期名患者。

表20：在用修订的AE管理指南的情况下包括的细胞因子释放综合征和神经事件

AE，不良事件；CRS，细胞因子释放综合征；NE，神经事件

二十六名治疗的患者(58％)死于包括以下的原因：19名患者(42％)中的疾病进展和7名患者(16％)中的AE，包括2例上述治疗相关的死亡。其余的5例AE相关死亡发生在输注抗CD19 CAR T细胞之后的中值63天(范围，48-579)，并且被认为与抗CD19 CAR T细胞无关。他们包括败血症(n＝2)、脑血管意外(n＝1)、单纯疱疹病毒血症(n＝1)和菌血症(n＝1)。

功效

所有45名治疗的患者都符合资格进行功效分析。在22.1个月的中值随访(范围，7.1-36.1)时，总体缓解率(ORR)为69％，其中51％的患者实现CR和18％的患者实现CRi(表21)。在用1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗的23名患者中，ORR为83％，其中14名患者实现CR(61％)和5名患者(22％)实现CRi。9名接受修订的AE管理的患者中有六名患者实现CR/CRi(4名CR、2名CRi)。在剂量水平中至CR/CRi的中值时间为30天(范围，26-192)，包括在第28天患有无母细胞的骨髓发育不全/骨髓再生障碍的1名患者，其不符合CR标准直到第6个月。ORR在关键协变量之间通常一致，包括难治性患者(56％)、既往移植(77％)、既往博纳吐单抗(57％)或奥英妥珠单抗(50％)和Ph+疾病患者(100％)(图5)。在100％的应答者中在第28天实现不可检测的骨髓MRD，包括31名具有CR/CRi的患者、1名具有部分应答的患者和1名具有BFBM的患者。残留疾病评估在1名具有BFBM的患者中不可用。在第7-14天经历任选骨髓评估的6名患者中有两名患者具有不可检测的MRD；在第30天具有可用数据的5名患者具有不可检测的MRD。

表21：对抗CD19 CAR T细胞的应答

*患者在应答评估时具有髓外疾病。

患者由于继发于CRS的多器官衰竭在第6天死亡。

在CRS和神经事件的背景中患者由于脑血管意外(中风)在第7天死亡。

在用1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗的患者中，实现CR/CRi的31名患者的中值DOR为14.5个月(95％CI，5.8-18.1；图6A)和17.6个月(95％CI，5.8-17.6)。无论对抗CD19 CAR T细胞后的SCT的检查如何，中值DOR都相似(图6B)。在数据截止时，8名患者(26％)具有进行性CR，包括接受0.5×10⁶个CAR T细胞/kg的2名患者和接受1×10⁶个CAR T细胞/kg的6名患者，其中中值随访为6.3个月(范围，5.9-18.2)。六名患者(用1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗2名患者CR和1名患者部分应答；用0.5×10⁶个细胞/kg治疗3名患者CR)在输注后2.7个月中值(范围，1.7-4.3)时经历SCT。在该分析时，这些患者中有3名患者保持CR(2名患者用1×10⁶个CAR T细胞/kg治疗和1名患者用0.5×10⁶个细胞/kg治疗)。在所有剂量水平之中，无复发生存期的中值持续时间为7.3个月(95％CI，2.7-18.7)，而在接受1×10⁶个CAR T细胞/kg的患者中为7.7个月(95％CI，3.2-18.7)(图6C)。在所有剂量水平之中的中值OS为12.1个月(95％CI，6.1-19.1)跨所有剂量水平和在用1×10⁶个CAR T细胞/kg的情况下为16.1个月(95％CI，10.2-不可估计)(图6D)。

在数据截止时，1名患者(2％)撤回同意书，1名患者(2％)失去随访，并且17名名患者(38％)存活，包括用1×10⁶个细胞/kg治疗的23名患者中的11名患者(50％)。四名患者接受抗CD19 CAR T细胞的第二次输注；在重新给药后15个月时一名患者为CR，2名患者到第3个月评估时复发，并且1名患者在第一次应答评估之前撤回同意书。

临床药理学

对于大多数患者通过在血液中的CAR基因拷贝/μg DNA测量的CAR T细胞水平在抗CD19 CAR T细胞输注后7-14天达到峰值，并且在12个月时在12名可评估患者中的2名患者中保持可检测，两者均为CR(图7A；表22)。

表22：随时间推移在血液中的CAR基因拷贝

AE，不良事件；CAR，嵌合抗原受体

在复发时数据可用的5名患者中，CAR T细胞是不可检测的。中值峰值CAR T细胞水平在用1×10⁶个CAR T细胞/kg的情况下最高，并且在接受原始的与修订的AE管理的患者之间相似(图7B；图8)。实现CR/CRi的患者具有比无应答者更大的中值峰值扩增，如具有不可检测的MRD与可检测的MRD的患者那样(图7C-D；图84B-C)。与≤2级NE的患者相比，在≥3级NE的患者中还观察到较高的中值峰值扩增(图7E-F；图8D-E)。在复发的13名患者中，7名患者在复发时具有可检测的CD19阳性细胞，3名患者没有可检测的CD19阳性细胞，并且3名患者没有可用的数据。

到第7天发生了关键细胞因子、趋化因子和促炎症标志物的峰值水平，与1×10⁶个CAR T细胞/kg相比在给予2×10⁶个CAR T细胞/kg的患者中这些趋于更高(IL-15、CRP、SAA、CXCL10、IFNγ)，或者在用修订的AE管理的患者中比用原始的AE管理的患者中更低(IL-6、铁蛋白、IL-1RA、IFNγ、IL-8、CXCL10、MCP-1)(图9；图10)。虽然在具有≥3级CRS的患者中峰值IL-15血清水平出乎意料地更低，但是几种促炎症标志物的中值峰值水平在具有≥3级CRS的患者和具有≥3级NE的患者中趋于更高(IFNγ、IL-8、GM-CSF、IL-1RA、CXCL10、MCP-1、颗粒酶B；图11)。

在对抗CAR抗体进行筛选测定期间四名患者测试呈阳性，但在白细胞单采术的确认测定中全部都呈阴性。制造的CAR T细胞产物的特征如预期和先前报告的那样(表23)。

表23：产物特征

*使用以1:1比率与抗CD19 CAR T细胞产物混合的Toledo细胞进行共培养实验。使用合格的ELISA在孵育后24小时在细胞培养基中测量IFNγ。

AE，不良事件；IFNγ，干扰素γ

ZUMA-3是在将完成1期的成人R/R B-ALL中评估CAR T细胞疗法的首次多中心研究。在1期部分中，用抗CD19 CAR T细胞没有观察到协议定义的DLT，并且所报告的AE与抗CD19 CAR T细胞疗法的先前研究一致。Neelapu SS等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl JMed.)，2017；377(26):2531-2544；Maude SL等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl JMed.)，2018；378(5):439-448。与修订的AE管理指南配对的1×10⁶个CAR T细胞/kg剂量具有最有利的风险/益处比，而不会影响活性。尽管患者具有高疾病负荷并且进行了大量预治疗，但还是实现了高缓解率和不可检测的骨髓MRD，特别是在以1×10⁶剂量水平治疗的那些患者中；ORR为83％，包括61％CR和22％CRi，他们全部都具有不可检测的MRD。基于这些结果，表明抗CD19 CAR T细胞是安全的并且具有有前景的功效，选择1×10⁶个CAR T细胞/kg剂量用于在ZUMA-3的2期进行进一步评估。

使用抗CD19 CAR T细胞治疗成人R/R B-ALL已经证实由于这种疾病的高度增殖性质和无法耐受治疗相关的AE而困难。该群体中的既往CAR T细胞试验由于致命性NE(包括5例大脑水肿)而在早期完结。DeAngelo DJ,Ghobadi A,Park JH等人、《癌症免疫治疗杂志》(Journal for ImmunoTherapy of Cancer.)2017；5(增刊2):P217。在ZUMA-3中原始AE管理指南下，2名患者死于认为与继发于CRS或在DLT评估期限外的的CRS和NE的背景中与抗CD19CAR T细胞相关的5级AE。除了评估多个剂量以鉴定具有最多可管理毒性的剂量之外，在1×10⁶个CAR T细胞/kg剂量水平登记的9名患者中实施需要对神经毒性进行更早类固醇干预和使用仅用于CRS的托珠单抗的修订的AE管理指南。与在原始指南下以相同剂量治疗的14名患者相比，这导致CRS事件的持续时间更短和NE的发生率、严重程度和持续时间更低。

在22.1个月的中值随访时，在26％的患者中应答是进行性的，他们大部分接受了1×10⁶个CAR T细胞/kg(32％进行性CR/CRi)。应答趋于在治疗后早期发生。大多数发生在第一个月内，但是1名具有髓外疾病的患者在第6个月实现CR。在所有预先指定的亚组中观察到高应答率，包括在患有Ph+疾病的患者在的100％CR率。应答(CR/CRi)与治疗后2周内测量的CAR T细胞的较高扩增相关。类似地，在使用还含有CD3ζ和CD28共刺激结构域的抗CD19CAR T细胞疗法的单中心1期研究中(Park JH等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2018；378(5):449-459)，总体CR率为83％，但是在桥接疗法后，只有一半的患者在骨髓中具有≥5％的母细胞，28％的患者具有MRD，并且11％的患者具有不可检测的MRD。然而，这些试验结果很大程度上平行于本研究的那些结果，进一步支持了使用CD3ζ和CD28共刺激结构域的抗CD19 CAR T细胞疗法在成人R/R B-ALL中的潜在效用。

Tisagenlecleucel(一种含有CD3ζT细胞激活结构域和4-1BB共刺激结构域的抗CD19 CAR T细胞疗法)被批准用于治疗儿童和年轻成人(≤25岁)的R/R B-ALL。Maude SL等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2018；378(5):439-448；KYMRIAH(tisagenlecleucel)[包装说明书]，诺华公司(Novartis)，美国新泽西州东汉诺威(EastHanover,NJ)；2018年。然而，较年轻的患者中的tisagenlecleucel的给药方案导致患有R/RB-ALL的成人的实质性毒性和CRS相关死亡。Frey NV.等人，《临床肿瘤杂志》(JClinOncol.)，2020年；38(5):415-422。在两项临床试验之中的成人R/R B-ALL中的单中心研究中，按级分施用剂量导致可管理的CRS和90％CR率。Frey NV等人，《临床肿瘤杂志》(J ClinOncol.)，2020年；38(5):415-422。与ZUMA-3观察结果相似，优化的给药和毒性管理策略可能使患者能够易受危及生命的治疗相关毒性影响以受益于CAR T细胞疗法。

尽管试验设计、患者群体和OS方法有差异，但是本研究中用1×10⁶个CAR T细胞/kg的中值OS为16.1个月，然而先前用也靶向CD19的博纳吐单抗报告的中值OS在成人R/R B-ALL中为6.1-7.7个月。Topp MS等人，《柳叶刀肿瘤学》(Lancet Oncol.)，2015；16(1):57-66；Kantarjian H.等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2017；376(9):836-847。在复发时可评估CD19母细胞表达的10名患者中，3名患者显示出缺乏CD19表达，使人联想到将靶标损失归因于外显子剪接变体和突变的选择的其他报告。Sotillo E等人，《癌发现》(Cancer Discov.)2015；5(12):1282-1295。在本研究中，用博纳吐单抗作为最后一次既往疗法的8名患者中仅有1名患者(13％)对博纳吐单抗有反应。这可能提示在患有R/R ALL的一些患者中未经操纵的T细胞没有免疫活性，潜在地限制双特异性T细胞衔接子疗法的效用。在任何线中用既往博纳吐单抗的21名患者中，12名患者(57％)在抗CD19 CAR T细胞疗法后实现CR/CRi。如先前报告的(Shah BD.等人，《临床肿瘤杂志》(J Clin Oncol.)，2018；36(增刊):摘要7006)，对抗CD19 CAR T细胞的应答是类似的，而不管在具有持续CD19阳性的患者中的既往博纳吐单抗暴露如何。此外，实现CR的6名患者经历了SCT并且在SCT的时后进行检查；3名患者保持缓解。

患有R/R B-ALL的成人在用抗CD19 CAR T细胞治疗后实现了高CR率和不可检测的骨髓MRD，具有可耐受的安全性。对所有登记患者的成功制造和相对快速的周转时间支持向具有需要迅速治疗的快速进展的疾病的患者提供这种细胞疗法治疗的可行性。通过小心地评估一系列剂量并采用安全性策略，包括托珠单抗或类固醇的使用和应施用托珠单抗或类固醇以管理AE的条件，有可能将研究从1期的研究转变为国际2期研究。在1期中没有致命性大脑水肿病例(其在该群体中进行先前研究的限制)。ZUMA-3的2期以1×10⁶个CAR T细胞/kg剂量用修订的AE管理指南进行。

实施例10

本实施例描述了在B-ALL中CD19中的CD19ΔTyr260与对CAR T细胞疗法治疗的抗性相关的结果。在KTE-X19之前包括博纳吐单抗在内的几种疗法失败之后，B-ALL患者接受1×10⁶个CAR T细胞/kg的目标剂量。该患者在临床上没有反应；在第28天没有可检测的CART和表达CD19的淋巴细胞。在各个时间点在KTE-X19输注前后在患有B-ALL的患者中收集外周血单核细胞(PBMC)。将多色流式细胞术用于检查患者PBMC和工程改造为CD19野生型(WT)或表达CD19ΔTyr260的Jurkat细胞系上的CD19(克隆FMC63、HIB19、SJ25C1)表面表达。使用增强的全基因组和RNA测序(TruSeq Stranded Total RNA)评估遗传变体的存在。在用和不用去糖基化酶的情况下使用蛋白质印迹评估细胞蛋白表达的位置。

虽然局部病理学得出结论，预输注B淋巴母细胞一致地为CD19^dim，用FMC63(KTE-X19的单链可变片段)对相同样品的附加分析揭示在预输注B淋巴母细胞中不可检测到CD19。RNA测序的结果显示在循环白血病母细胞中在CD19的细胞内结构域内的Tyr260处的框内缺失(CD19ΔTyr260)。使用流式细胞术的附加分析表明，在Jurkat CD19ΔTyr260细胞上未检测到CD19表达，但在Jurkat CD19-WT细胞上存在，这表明缺乏携带这个点突变的细胞的可视化以及其对CAR T细胞疗法的抗性。纵向RNA和DNA测序分析表明，在输注CAR-T疗法之前已经发生突变。分级的细胞裂解物显示细胞膜中具有高和较低分子量条带的WTCD19、以及在表面上表达的具有单个低分子量条带的CD19ΔTyr260。在去糖基化条件下，在WT CD19和CD19ΔTyr260细胞级分中均只存在1个条带。不受任何科学理论或假设的束缚，或许CD19ΔTyr260突变可能导致缺乏合适的或功能性的CD19糖基化和/或抑制性检测。B-ALL恶性细胞中的突变对于其他抗CD19 CAR或非CD19 CAR细胞疗法可能具有潜在含义。

实施例11

BTKi疗法后进展的MCL患者通常具有不良预后，用挽救疗法仅具有5.8个月的总生存期。Martin P等人，《血液》(Blood)，2016；127:1559-1563。在2期ZUMA-2研究中，在对1至5种既往疗法(包括BTKi)是复发性/难治性的MCL患者中评估KTE-X19。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2020；382:1331-1342。在12.3个月的中值随访中，在ZUMA-2的主要功效分析(N＝60)中ORR为93％(67％完全应答)。侵袭性疾病变体(包括母细胞样或多形性MCL)通常与较差的临床结果相关，但是在ZUMA-2中具有各种组织学的患者中ORR是相当的。Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2020年；382:1331-1342；JainP和Wang M，《美国血液学杂志》(Am J Hematol.)，2019；94:710-725。在本研究中，比较了由MCL形态和ZUMA-2中的既往BTKi暴露限定的患者亚组中的药理学概况和临床结果，伴随产物属性和其他预治疗因素的表征。患者经历白细胞单采术和化学疗法，然后在第0天通过单次输注以2×10⁶个CAR T细胞/kg的目标剂量单次输注CD19 CAR-T细胞。一些患者接受与地塞米松(每天PO或IV给予的20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)、依鲁替尼(每天PO给予560mg)或阿卡替尼(每天两次PO给予的100mg)的桥接疗法，在白细胞单采术之后施用并且在起始调理性化学疗法之前完成≤5天；桥接后需要PET-CT。主要终点是客观应答率(ORR[完全应答(CR)+部分应答])。次要终点是应答的持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)、OS、不良事件(AE)的频率、血液中CAR T细胞的水平和血清中细胞因子的水平。功效和安全性分析包括接受CD19 CAR-T细胞疗法的所有患者。在第28天完成第一次肿瘤评估。在筛选时完成骨髓活检，并且如果阳性、未完成或不确定，需要活检以确认CR。

在ZUMA-2中中值随访为12.3个月的用KTE-X19治疗MCL的60名患者中，存在93％的ORR、67％的CR率，并且57％的所有患者和78％的CR患者具有进行性应答。CRS和神经事件大多数是可逆的(N＝68名治疗的患者)。约15％的患者具有≥3级CRS、31％的患者具有≥3级神经事件和2例5级AE(1例为KTE-X19相关)。患者亚组由形态学特征(经典的、母细胞样或多形性MCL)和有对仅依鲁替尼、仅阿卡替尼、或依鲁替尼和阿卡替尼两者的既往暴露来定义。表24：基线特征在这些组中通常相当。先前用依鲁替尼治疗的患者中有较高的治疗前肿瘤负荷的趋势。使用先前所述的方法分析血液中的产物属性、CAR T细胞水平和血清中细胞因子水平。Locke FL等人，《分子治疗》(Mol Ther.)，2017；25:285-295。产物T细胞属性在MCL形态亚组之间通常相当。在来自患有多形性形态的患者的产物中有增加的产物共培养物IFN-γ和CCR7+细胞百分比的趋势。表25：产物T细胞属性在既往BTKi亚组之间通常也是相当的。在先前用依鲁替尼治疗的患者中，有增加的产物共培养物IFN-γ的趋势。表26：

表24：患者基线特征。

^a如通过基线处所有目标病变的产物尺寸总和所测量。对于具有桥接疗法的受试者，将桥接疗法之后的测量值用作基线。

表25：细胞表征和MCL形态。

^a基于可用数据：经典的，n＝38；母细胞样，n＝16

表26：细胞表征和BTKi亚组。

^a基于可用数据：依鲁替尼，n＝49

在MCL形态和既往BTKi亚组之间实现了高应答率。表27：在由MCL形态或既往BTKi限定的所有亚组中观察到KTE-X19治疗的临床益处。在先前用依鲁替尼治疗的患者中观察到在6个月时具有更高进行性应答率的趋势。表27：CRS和神经事件在MCL形态和既往BTKi亚组之间通常相当。表28：在具有非母细胞样形态或先前用依鲁替尼治疗的患者中观察到增加的≥3级神经事件率的趋势。表28：

表27：应答率

¹Wang M等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)，2020年；382:1331-1342。CR，完全应答；MCL，套细胞淋巴瘤；NE，不可评估；ORR，客观应答率；OS，总生存期

表28：不良事件

使用Kruskal-Wallis检验进行亚组之间的比较；Dunn事后检验用于进行组之间的比较。报告用KTE-X19(2×10⁶个细胞/kg)治疗的所有68名患者的药理学概况、产物属性和安全性数据)。在MCL形态亚组之间KTE-X19的药理学和药效学概况表明与具有母细胞样形态的患者相比在具有经典的形态的患者中(图12和13)或者与单独阿卡替尼相比在先前用依鲁替尼治疗的患者中(图14和15)增加的CAR T细胞扩增和选择的促炎症细胞因子。治疗前患者和产物特征在MCL形态和具有不同既往疗法的亚组之间通常相当。具有母细胞样形态的患者表现出降低的CAR T细胞扩增、循环骨髓相关细胞因子和趋化因子、以及≥3级CRS和神经事件的比率，然而临床功效与具有经典形态的患者的临床功效相当。具有母细胞样形态的患者中的改善的安全性概况的趋势与较低的峰值CAR T细胞扩增和降低的与骨髓相关炎症相关的细胞因子的峰值水平相称。先前用依鲁替尼治疗的患者表现出增加的CAR T细胞扩增、循环炎症细胞因子和趋化因子以及≥3级神经事件的比率；以及在6个月时增加的进行性应答率和与先前用单独的阿卡替尼治疗的患者相当的ORR。先前用阿卡替尼治疗的患者表现出降低的CAR T细胞扩增和循环T1相关的细胞因子和趋化因子，这与改善的安全性概况一致。

实施例12

本实施例表征了两种抗CD19 CAR T疗法、根据实施例5制备的KTE-X19和阿基仑赛。将细胞用与CD3(泛T细胞标志物)、CD14、CD19(B细胞标志物)、CD45(泛白细胞标志物)和CD56(激活和NK标记)的荧光缀合抗体进行标记并且通过流式细胞术进行评估。使用活力染料(SYTOX近红外)的阴性染色评估细胞活力。测定的定量下限(LLOQ)为0.2％以及对于NK细胞和单核细胞为5％。确定NK细胞的百分比(NK细胞为CD45⁺、CD14^-、CD3^-和CD56⁺；T细胞为CD45⁺、CD14^-和CD3^-)。来自23批阿基仑赛和97批KTE-X19的NK细胞的中值百分比分别为1.9％(范围0.8％-3.2％)和0.1％(范围0.0％-2.8％)。来自同一批次的阿基仑赛和KTE-X19的CD3^-细胞杂质的中值百分比分别是2.4％(范围为0.9％-4.6％)和0.5％(范围0.3％-3.9％)。KTE-X19和阿基仑赛在细胞活力方面的结果分别为≥72％和≥80％；在抗CD19 CAR表达方面的结果分别为≥24％和≥15％；在IFN-γ产生方面的结果分别为≥190pg/mL和≥520pg/mL；以及在CD3⁺细胞百分比方面的结果分别为≥90％和≥85％。

实施例13

提供了在包括实施例2和实施例7的先前实施例中在单次输注中接受2×10⁶个KTE-X19细胞/kg的患者的附加结果。通过IRRC评估的ORR为92％(95％CI，82-97)并且CR率为67％(95％CI，53-78)。在17.5个月的中值随访(范围，12.3-37.6)时，29名患者保持进行性应答。在具有高风险疾病特征的患者之间，进行性应答率在很大程度上是一致的。前28名治疗的患者具有32.3个月的中值随访(范围，30.6-37.6)。39％的患者在没有进一步疗法的情况下保持持续缓解。在所有登记患者(N＝74)中，ORR为84％(59％CR率)。在17.5个月的中值随访后，未达到DOR、PFS和OS的中值。表29：进行性应答率在不良预后组之间是一致的。图16在17.5个月的中值随访时，ZUMA-2研究继续在患有R/R MCL的患者中显示KTE-X19疗法的明显且持久的临床益处。在附加随访的情况下没有观察到新的安全性信号。自先前报告开始未发生新的CRS或新的5级事件。表30：AE率随时间推移降低。KTE-X19疗法在延长随访的情况下显示出可管理的安全性概况。

表29：应答持续时间、无进展生存期和总生存期。

^a在55名总反应患者中。

表30：安全性分析

^a包括在≥10％患者中发生的任何级别的AE。

在57名功效可评估的具有可用数据的患者中，48名患者(84％)在基线处具有可检测的B细胞。在12个月时具有进行性应答的患者中，超过50％的可评估患者在第6个月、第12个月、第15个月和第24个月时具有可检测的B细胞和基因标记的CAR T细胞。在12个月时处于进行性应答的患者中，具有基因标记的CAR T细胞的患者百分比通常随时间推移而降低，在3个月、6个月、12个月、15个月、18个月和24个月时分别为100％、93％、82％、89％、80％和56％。在对KTE-X19无法作出反应的患者中存在减少的CAR T细胞峰值扩增。与非应答患者相比，在12个月时有进行性应答的患者或在12个月时复发的患者中，峰值CAR T细胞扩增增加。最初在稍后复发的患者中观察到升高的CAR T细胞水平，可能指向用于二级治疗失败的替代机制。在图17A(INV)和图17B(CEN)中显示了通过基线肿瘤负荷归一化的CAR T细胞峰值水平和在12个月数据截止时的进行性应答。

本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的据此全文以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独指示为处于所有目的以引用方式并入一样。

虽然已经说明和描述了各种具体实施方案，但是应当理解在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种改变。

Claims (36)

1.一种用于治疗对其有需要的受试者的套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的T细胞产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MCL和B细胞ALL是复发性或难治性MCL和B细胞ALL，任选地其中所述MCL是经典的、母细胞样和多形性MCL。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述MCL和B细胞ALL对化学疗法、放射疗法、免疫疗法(包括T细胞疗法和/或用抗体或抗体-药物缀合物治疗)、自体干细胞移植或它们的任何组合中的一种或多种疗法是难治性的，或已在所述一种或多种疗法之后复发。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受1至5种既往治疗，任选地其中所述既往治疗中的至少一种选自自体SCT、抗CD20抗体、含蒽环霉素或苯达莫司汀的化学疗法和/或Bruton酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述BTKi是依鲁替尼或阿卡替尼。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R/R B细胞ALL被定义为对一线疗法是难治性的(即，原发性难治性的)，在第一次缓解之后≤12个月复发，在全身性疗法的≥2个既往线之后复发或是难治性的，或者在同种异体干细胞移植(SCT)之后复发，任选地其中所述受试者需要具有≥5％的骨髓母细胞、0或1的美国东部肿瘤协作组体能状态和/或足够的肾、肝和心脏功能。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中如果所述B细胞ALL受试者已经接受既往博纳吐单抗，则所述受试者需要具有CD19表达≥90％的白血病母细胞(leukemicblast)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术之后和在调理性化学疗法/淋巴耗竭化学疗法之前接受桥接疗法。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述MCL受试者接受在T细胞输注之前的第五天、第四天和第三天中的每一天静脉内给予的500mg/m²环磷酰胺和静脉内给予的30mg/m²氟达拉滨两者的淋巴耗竭化学疗法方案。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者接受在T细胞输注前第四天、第三天、第二天中的每一天静脉内(IV)给予的每天25mg/m²氟达拉滨以及在输注前第二天IV给予的每天900mg/m²环磷酰胺的淋巴耗竭方案。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述MCL桥接疗法选自地塞米松(例如，每天PO或IV给予20mg至40mg或等效物，持续1天至4天)；甲泼尼龙、依鲁替尼(例如，每天PO给予560mg)和/或阿卡替尼(例如每天两次PO给予100mg)；免疫调节剂；R-CHOP，苯达莫司汀；烷化剂；和/或铂基药剂，其中所述桥接疗法在白细胞单采术之后施用，并且在例如调理性化学疗法之前5天或更短时间内完成。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者可以接受以下桥接化学疗法方案中的任何一种或多种：

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物包含通过阳性富集和随后对循环癌细胞进行部分或完全耗竭由外周血单核细胞(PBMC)制备的CD4+和CD8+CART细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述PBMC通过阳性选择CD4+和CD8+细胞来富集T细胞，在IL-2的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，然后用含有FMC63-28Z CAR的复制缺陷型病毒载体进行转导，所述FMC63-28Z CAR是一种包含抗CD19单链可变片段(scFv)、CD28和CD3-ζ结构域的嵌合抗原受体(CAR)。

15.根据权利要求13和14中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物包含比含有来自白细胞单采术产物的T细胞的T细胞产物更少的癌细胞，所述来自白细胞单采术产物的T细胞尚未对CD4+和CD8+T细胞进行阳性选择。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述T细胞产物相对于包含来自白细胞单采术产物的T细胞的T细胞产物具有其他优异的产物属性，所述来自白细胞单采术产物的T细胞尚未对CD4+和CD8+T细胞进行阳性选择/富集。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述优异的产物属性选自增加的CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞百分比、降低的分化的T细胞百分比、增加的CD3+细胞百分比、降低的IFN-γ产生、降低的CD3-细胞百分比。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中向所述MCL受试者施用一个或多个剂量的1.8×10⁶个、1.9×10⁶个或2×10⁶个CAR阳性活T细胞/kg体重，其中最大值为2×10⁸个CAR阳性活T细胞(对于100kg及以上的患者)，并且向所述B细胞ALL受试者施用0.5×10⁶个、1×10⁶个或2×10⁶个CAR阳性活T细胞/kg体重，其中最大值为2×10⁸个CAR阳性活T细胞(对于100kg及以上的患者)。

19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经对所述第一次输注实现完全应答，则所述受试者可以接受抗CD19CAR T细胞的第二次输注，如果在缓解>3个月后进展，则所提供的CD19表达已被保留并且中和针对所述CAR的抗体不是可疑的，其中使用Lugano分类评估应答。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在T细胞施用后监测所述受试者的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的体征和症状。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在输注后每天监测所述受试者的CRS和神经毒性的体征和症状，持续至少七天，优选持续四周。

22.根据权利要求20和21中任一项所述的方法，其中与CRS相关的体征或症状包括发烧、恶寒、疲劳、心动过速、恶心、缺氧和低血压，并且与神经事件相关的体征或症状包括脑病、癫痫发作、意识水平变化、言语障碍、震颤和意识错乱。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中MCL受试者中的细胞因子释放综合征根据以下方案进行管理：

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中MCL受试者中的神经毒性根据以下方案进行管理：

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述MCL受试者是通过Ki-67肿瘤增殖指数≥50％和/或TP53突变的存在确定的高风险患者。

26.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中B细胞ALL受试者中的CRS根据以下方案进行管理：

27.根据权利要求20至22和26中任一项所述的方法，其中B细胞ALL受试者中的神经毒性根据以下两种方案之一进行管理：

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述B细胞ALL受试者可以接受以下桥接化学疗法方案中的任何一种或多种：

29.表达抗CD19 CAR的自体T细胞，其用于根据权利要求1至28中任一项所述的用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的方法中。

30.表达抗CD19 CAR的自体T细胞在制造根据权利要求1至28中任一项所述的用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)或B细胞ALL的药物中的用途。

31.一种预测以下各项的方法：

(i)受试者对CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)的客观应答，所述预测方法包括测量峰值CAR T细胞水平并将它们与参考标准进行比较，其中客观应答与峰值CAR T细胞水平呈正相关，其中客观应答包括完全应答和部分应答两者，并且其中所有应答均使用Lugano分类进行评估；

(xii)响应于CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)的最小残留疾病(例如，在第4周)，所述预测方法包括测量峰值CAR T细胞水平并将它们与参考标准进行比较，其中阴性最小残留疾病与较高的峰值CAR T细胞水平相关；

(xiii)在接受CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)的受试者中≥3级CRS和/或≥3级神经事件(NE)，所述预测方法包括测量治疗后的峰值CAR T细胞扩增并将所述水平与参考值进行比较，其中所述CAR T细胞扩增越多，所述≥3级CRS和/或≥3级NE事件的机会越大；

(xiv)≥3级CRS和/或≥3级NE，所述预测方法包括测量在CART细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)后的GM-CSF和IL-6的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中这些细胞因子的峰值水平越高，≥3级CRS和/或≥3级NE的机会越大；

(xv)在接受CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)的受试者中的≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗后血清铁蛋白的峰值水平并将它与参考水平进行比较，其中所述铁蛋白的峰值水平越高，≥3级CRS的机会越大；

(xvi)≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗(任选地根据权利要求1至28中任一项所述的)后血清IL-2和IFN-γ的峰值水平并将它们与参考水平进行比较，其中IL-2和IFN-γ的峰值水平越高，≥3级NE的机会越大；

(xvii)≥3级CRS，所述预测方法包括测量CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的)后C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平并将它们与参考水平进行比较，其中C反应蛋白、铁蛋白、IL-6、IL-8和/或血管细胞粘附分子(VCAM)的脑脊液水平越高，≥3级NE的机会越大；

(xviii)CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)后的≥3级CRS，所述预测方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和/或穿孔素的峰值血清水平并且将所述水平与参考水平进行比较，其中所述IL-15、IL-2Rα、IL-6、TNFα、GM-CSF、铁蛋白、IL-10、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、颗粒酶A、颗粒酶B和/或穿孔素的峰值血清水平与≥3级CRS呈正相关；

(xix)在对B细胞ALL进行CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)后的≥3级CRS，所述预测方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后IL-15的峰值血清水平并将所述水平与参考水平进行比较，其中所述IL-15的峰值血清水平与≥3级CRS呈负相关；

(xx)CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的方法)后的≥3级CRS和/或≥3级NE，所述预测方法包括测量在抗CD19 CAR T治疗之后IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B的峰值血清水平并且将所述水平与参考水平进行比较，其中所述IL-6、TNFα、GM-CSF、IL-10、MIP-1b和颗粒酶B的峰值血清水平与≥3级CRS和≥3级NE呈正相关；

(xxi)在CAR T细胞治疗(任选地，根据权利要求1至28中任一项所述的)后4周/一个月时患者是否将呈MRD(10^-5的灵敏度)阴性，所述预测方法包括测量治疗之后IFN-γ、IL-6和/或IL-2的峰值血清水平并将所述水平与参考标准进行比较，其中所述IFN-γ、IL-6和/或IL-2的峰值血清水平与在一个月时的MRD阴性呈正相关。

32.根据权利要求20至24、26、27和30至31中任一项所述的方法，其中CRS和NE通过Lee等人,Blood 2014；124:188-195中所述的方法进行分级。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述参考标准通过在生物标志物领域中通常使用的任何方法诸如对具有已知应答、毒性等级和MRD水平的患者群体的四分位数(quartile)分析来建立。

34.根据权利要求31所述的方法，其中CAR T细胞水平通过血液中的CAR基因拷贝/微克DNA来测量。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，所述方法还包括CAR T细胞输注后降低与≥3级CRS和/或≥3级NE呈正相关的细胞因子的水平/活性以减少≥3级CRS和/或≥3级NE。

36.一种改善在对其有需要的受试者中CAR T细胞治疗(例如，经典的、母细胞样和多形性MCL和B细胞ALL)的有效性的方法，所述方法包括操纵施用于所述受试者的所述T细胞产物的T细胞表型，任选地其中所述操纵包括在生产期间增加所述CD3+T细胞的数量、减少CD3-细胞的数量、增加CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞的数量/百分比和/或降低在所述T细胞产物中的分化细胞的数量/百分比，降低所述T细胞的IFN-γ产生水平，其中所述改善是相对于在没有任何有意操纵CDRA45+CCR7+(幼稚样)T细胞的数量/百分比和/或在所述T细胞产物中的分化细胞的数量/百分比的情况下制备的T细胞产物的有效性而观察到的。

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