CN114894937A - 一种检测土壤中赤霉酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测土壤中赤霉酸的方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测定或分析材料领域，所述方法包括提取液配制、样品前处理、提取、测定。本发明的检测方法精密度高，精密度测定的RSD为1.59‑1.84%；本发明的检测方法的回收率为97.2‑102%。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测土壤中赤霉酸的方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测定或分析材料领域。
背景技术
1935年日本科学家薮田从诱发恶苗病的赤霉菌中分离得到了能促进生长的非结晶固体，并称之为赤霉酸。1938年薮田和住木又从赤霉菌培养基的过滤液中分离出了两种具有生物活性的结晶，命名为“赤霉素A”和“赤霉素B”。但由于1939年第二次世界大战的爆发，该项研究被迫停顿。直到20世纪50年代初，英、美科学家从真菌培养液中首次获得了这种物质的化学纯产品，英国科学家称之为赤霉酸(1954)，美国科学家称之为赤霉素X(1955)。后来证明赤霉酸和赤霉素X为同一物质，都是GA3。1955年日本东京大学的科学家对他们的赤霉素A进行了进一步的纯化，从中分离出了三种赤霉素，即赤霉素A1、赤霉素A2和赤霉素A3。通过比较发现赤霉素A3与赤霉酸和赤霉素X是同一物质。1957年东京大学的科学家又分离出了一种新的赤霉素A，叫赤霉素A4。此后，对赤霉素A系列(赤霉素An)就用缩写符号GAn表示。后来，很快又发现了几种新的GA，并在未受赤霉菌感染的高等植物中也发现了许多与GA有同样生理功能的物质。1959年克罗斯(B.E.Cross)等测出了GA3、GA1和GA5的化学结构。
赤霉酸在我国作为植物生长调节剂使用，主要用来促进植物的生长，另外还可用来改善水果品质，延长贮存期。目前，国内除了GB23200.21-2016这个标准用来检测水果外，暂时没有其他标准用来检测土壤中的赤霉酸。
目前国内赤霉酸的检测标准有《GB23200.21-2016食品安全国家标准 水果中赤霉酸残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》、《贵州省食品安全地方标准植物性农产品中赤霉酸残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱联用法》和《GB/T36204-2018肥料中赤霉酸含量的测定 高效液相色谱-质谱联用仪法》，以上3个标准适用于水果、蔬菜和肥料中赤霉酸的检测。国内尚无土壤中赤霉酸的检测标准。
现有检测赤霉酸的标准，称样量比较多（5-20g左右），前处理大都采用乙腈和乙酸乙酯，提取试剂用量较大，对检测人员和环境造成污染，操作步骤繁琐，用时长，并且检测的准确度、精密度较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，通过改进提取液，对样品进行前处理，进而对土壤进行测定，实现土壤中赤霉酸检测的准确度、精密度高。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种检测土壤中赤霉酸的方法，所述方法包括提取液配制、样品前处理、提取、测定。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述提取液配制的方法为，将色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇混合，得到氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，将色谱纯甲酸、去离子水混合，得到甲酸-水溶液，将氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合得到提取液；
所述氯乙酸异丙酯-甲醇溶液中，色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述提取液中，氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1。
所述样品前处理的方法包括初步研磨、后续研磨、超声震摇并干燥；
所述初步研磨的方法为，将通过0.8-1.5mm的筛孔的风干土壤样品送入球磨机，加入1.5-2.5mm陶瓷研磨球、去离子水，控制速度为200-300r/min，进行研磨，研磨时间25-40min，出料，在30-40℃的热风下干燥，干燥至无去离子水，得到初步研磨土壤；
所述风干土壤样品与1.5-2.5mm陶瓷研磨球的质量比为2:2.5-3.5；
所述风干土壤样品与去离子水的质量比为4:4.5-5.5；
所述后续研磨的方法为，将初步研磨土壤送入球磨机，加入0.8-1.5mm氧化锆研磨球、研磨介质，控制速度为300-400r/min，进行研磨，研磨时间100-150min，出料，得到研磨浆；
所述初步研磨土壤与0.8-1.5mm氧化锆研磨球的质量比为2:2.5-3.5；
所述研磨介质由乙醇、甲醇组成，所述乙醇、甲醇的质量比为3:6-8；
所述初步研磨土壤与研磨介质的质量比为3:4.5-5.5；
所述超声震摇并干燥的方法为，将研磨浆置于超声波处理器，控制超声波功率为70-80kHz，进行超声，超声时间为12-18min，置于摇床震摇，控制震摇品率为300-400rpm，震摇20-30min，在30-40℃的热风下干燥，干燥至无研磨介质，得到前处理土壤样品；
所述提取的方法为，称取2g（精确至0.01g）前处理土壤样品，置于50mL离心管中，加入10mL提取液，涡旋1min，室温下控制超声频率为45-55 kHz进行超声，超声时间为25-35min，然后以3800-4500r/min的速度进行离心，离心时间为4-6min，取1mL上清液过0.22μm有机微孔滤膜，得到待测液，供LCMSMS测定；
所述测定的方法为，将待测液上机测定，液相色谱-质谱/质谱参考条件为GB23200.21-2006中，7.2.1步骤中参考条件，其中流动相替换为流动相A、流动相B，进行测定。
所述流动相A为甲酸-水溶液，其中色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述流动相B为氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，其中氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000。
所述液相色谱洗脱条件为梯度洗脱，梯度洗脱参数为：
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间1min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间1.5min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间3.5min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间4min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间5.5min。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明的检测方法精密度高，精密度测定的RSD为1.59-1.84%；
本发明的检测方法的回收率为97.2-102%。
具体实施方式
实施例1
（1）提取液配制
将色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇混合，得到氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，将色谱纯甲酸、去离子水混合，得到甲酸-水溶液，将氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合得到提取液；
所述氯乙酸异丙酯-甲醇溶液中，色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述提取液中，氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1。
（2）样品前处理
a、初步研磨
将通过1mm的筛孔的风干土壤样品送入球磨机，加入2mm陶瓷研磨球、去离子水，控制速度为250r/min，进行研磨，研磨时间30min，出料，在35℃的热风下干燥，干燥至无去离子水，得到初步研磨土壤；
所述风干土壤样品与2mm陶瓷研磨球的质量比为2:3；
所述风干土壤样品与去离子水的质量比为4:5；
b、后续研磨
将初步研磨土壤送入球磨机，加入1mm氧化锆研磨球、研磨介质，控制速度为350r/min，进行研磨，研磨时间125min，出料，得到研磨浆；
所述初步研磨土壤与1mm氧化锆研磨球的质量比为2:3；
所述研磨介质由乙醇、甲醇组成，所述乙醇、甲醇的质量比为3:7；
所述初步研磨土壤与研磨介质的质量比为3:5；
c、超声震摇并干燥
将研磨浆置于超声波处理器，控制超声波功率为75kHz，进行超声，超声时间为15min，置于摇床震摇，控制震摇品率为350rpm，震摇25min，在35℃的热风下干燥，干燥至无研磨介质，得到前处理土壤样品。
（3）提取
称取2g（精确至0.01g）前处理土壤样品，置于50mL离心管中，加入10mL提取液，涡旋1min，室温下控制超声频率为50 kHz进行超声，超声时间为30min，然后以4000r/min的速度进行离心，离心时间为5min，取1mL上清液过0.22μm有机微孔滤膜，得到待测液，供LCMSMS测定。
（4）测定
将待测液上机测定，液相色谱-质谱/质谱参考条件为GB 23200.21-2006中，7.2.1步骤中参考条件，其中流动相替换为流动相A、流动相B，进行测定。
所述流动相A为甲酸-水溶液，其中色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述流动相B为氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，其中氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000。
所述液相色谱洗脱条件为梯度洗脱，梯度洗脱参数为：
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间1min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间1.5min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间3.5min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间4min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间5.5min。
实施例2
（1）提取液配制
将色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇混合，得到氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，将色谱纯甲酸、去离子水混合，得到甲酸-水溶液，将氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合得到提取液；
所述氯乙酸异丙酯-甲醇溶液中，色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述提取液中，氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1。
（2）样品前处理
a、初步研磨
将通过0.8mm的筛孔的风干土壤样品送入球磨机，加入1.5mm陶瓷研磨球、去离子水，控制速度为200r/min，进行研磨，研磨时间40min，出料，在30℃的热风下干燥，干燥至无去离子水，得到初步研磨土壤；
所述风干土壤样品与1.5mm陶瓷研磨球的质量比为2:2.5；
所述风干土壤样品与去离子水的质量比为4:4.5；
b、后续研磨
将初步研磨土壤送入球磨机，加入0.8mm氧化锆研磨球、研磨介质，控制速度为300r/min，进行研磨，研磨时间150min，出料，得到研磨浆；
所述初步研磨土壤与0.8mm氧化锆研磨球的质量比为2:2.5；
所述研磨介质由乙醇、甲醇组成，所述乙醇、甲醇的质量比为3:6；
所述初步研磨土壤与研磨介质的质量比为3:4.5；
将研磨浆置于超声波处理器，控制超声波功率为70kHz，进行超声，超声时间为18min，置于摇床震摇，控制震摇品率为300rpm，震摇30min，在30℃的热风下干燥，干燥至无研磨介质，得到前处理土壤样品。
（3）提取
称取2g（精确至0.01g）前处理土壤样品，置于50mL离心管中，加入10mL提取液，涡旋1min，室温下控制超声频率为45 kHz进行超声，超声时间为35min，然后以3800r/min的速度进行离心，离心时间为6min，取1mL上清液过0.22μm有机微孔滤膜，得到待测液，供LCMSMS测定。
（4）测定
将待测液上机测定，液相色谱-质谱/质谱参考条件为GB 23200.21-2006中，7.2.1步骤中参考条件，其中流动相替换为流动相A、流动相B，进行测定。
所述流动相A为甲酸-水溶液，其中色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述流动相B为氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，其中氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000。
所述液相色谱洗脱条件为梯度洗脱，梯度洗脱参数为：
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间1min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间1.5min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间3.5min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间4min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间5.5min。
实施例3
（1）提取液配制
将色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇混合，得到氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，将色谱纯甲酸、去离子水混合，得到甲酸-水溶液，将氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合得到提取液；
所述氯乙酸异丙酯-甲醇溶液中，色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述提取液中，氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1。
（2）样品前处理
a、初步研磨
将通过1.5mm的筛孔的风干土壤样品送入球磨机，加入2.5mm陶瓷研磨球、去离子水，控制速度为300r/min，进行研磨，研磨时间25min，出料，在40℃的热风下干燥，干燥至无去离子水，得到初步研磨土壤；
所述风干土壤样品与2.5mm陶瓷研磨球的质量比为2:3.5；
所述风干土壤样品与去离子水的质量比为4:5.5；
b、后续研磨
将初步研磨土壤送入球磨机，加入1.5mm氧化锆研磨球、研磨介质，控制速度为400r/min，进行研磨，研磨时间100min，出料，得到研磨浆；
所述初步研磨土壤与1.5mm氧化锆研磨球的质量比为2:3.5；
所述研磨介质由乙醇、甲醇组成，所述乙醇、甲醇的质量比为3:8；
所述初步研磨土壤与研磨介质的质量比为3:5.5；
c、超声震摇并干燥
将研磨浆置于超声波处理器，控制超声波功率为80kHz，进行超声，超声时间为12min，置于摇床震摇，控制震摇品率为400rpm，震摇20min，在40℃的热风下干燥，干燥至无研磨介质，得到前处理土壤样品。
（3）提取
称取2g（精确至0.01g）前处理土壤样品，置于50mL离心管中，加入10mL提取液，涡旋1min，室温下控制超声频率为50 kHz进行超声，超声时间为30min，然后以4000r/min的速度进行离心，离心时间为5min，取1mL上清液过0.22μm有机微孔滤膜，得到待测液，供LCMSMS测定。
（4）测定
将待测液上机测定，液相色谱-质谱/质谱参考条件为GB 23200.21-2006中，7.2.1步骤中参考条件，其中流动相替换为流动相A、流动相B，进行测定。
所述流动相A为甲酸-水溶液，其中色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述流动相B为氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，其中氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000。
所述液相色谱洗脱条件为梯度洗脱，梯度洗脱参数为：
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间1min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间1.5min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间3.5min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间4min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间5.5min。
对比例1
在实施例1的基础上，提取液配制步骤中，使用氯甲酸-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合，得到提取液，其余步骤相同，进行检测；
所述甲酸-甲醇溶液中，色谱纯甲酸、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:1000；
所述提取液中，甲酸-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1。
对比例2
在实施例1的基础上，省去样品前处理步骤，提取步骤直接使用未处理的土壤样品，其余步骤相同，进行检测。
实施例4精密度测定
测试样品为黑垆土土壤标准物质GBW07494(HTSB-2)，称取足量土壤成分分析标准物质，进行加标，赤霉酸加标量为0.125g/g，分别用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方法检测，平行测定6次，统计计算，测定结果见表1。
实施例5空白加标回收率测定
测试样品为黑垆土土壤标准物质GBW07494(HTSB-2)，称取足量土壤成分分析标准物质，分为5组，分别进行加标，赤霉酸加标量为0.025g/g、0.050 g/g 、0.100g/g、0.125g/g、0.250g/g，分别用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方法检测，测定其赤霉酸含量并统计计算，计算加标回收率，测定结果见表2。
Claims (3)
1.一种检测土壤中赤霉酸的方法，其特征在于，所述方法包括提取液配制、样品前处理、提取、测定；
所述提取液配制的方法为，将氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液混合得到提取液；
所述氯乙酸异丙酯-甲醇溶液中，色谱纯氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述甲酸-水溶液中，色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述提取液中，氯乙酸异丙酯-甲醇溶液、甲酸-水溶液的体积比为1:1；
所述样品前处理的方法包括初步研磨、后续研磨、超声震摇并干燥；
所述初步研磨的方法为，将通过0.8-1.5mm的筛孔的风干土壤样品加入1.5-2.5mm陶瓷研磨球、去离子水，控制速度为200-300r/min，进行球磨，球磨时间25-40min，出料，经热风干燥至无去离子水，得到初步研磨土壤；
所述后续研磨的方法为，将初步研磨土壤送入球磨机，加入0.8-1.5mm氧化锆研磨球、研磨介质，控制速度为300-400r/min，进行研磨，研磨时间100-150min，出料，得到研磨浆；
所述研磨介质由乙醇、甲醇组成，所述乙醇、甲醇的质量比为3:6-8；
所述超声震摇并干燥的方法为，将研磨浆在超声波功率为70-80kHz下，进行超声，超声时间为12-18min，超声后对研磨浆进行震摇，控制震摇品率为300-400rpm，震摇20-30min，经热风干燥至无研磨介质，得到前处理土壤样品；
所述提取的方法为，称取2g前处理土壤样品，置于离心管中，加入10mL提取液，涡旋1min，然后于室温下控制超声频率为45-55 kHz进行超声，超声时间为25-35min，再以3800-4500r/min的速度进行离心，离心时间为4-6min，取1mL上清液过0.22μm有机微孔滤膜，得到待测液，供LCMSMS测定；
所述测定的方法为，将待测液上机测定，液相色谱-质谱/质谱参考条件为GB23200.21-2006中，7.2.1步骤中参考条件，其中流动相替换为流动相A、流动相B，进行测定；
所述流动相A为甲酸-水溶液，其中色谱纯甲酸、去离子水的体积比为1:500；
所述流动相B为氯乙酸异丙酯-甲醇溶液，其中氯乙酸异丙酯、色谱纯甲醇的体积比为1:1000；
所述液相色谱洗脱条件为梯度洗脱，梯度洗脱参数为：
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间1min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间1.5min；
流动相A与流动相B的体积比为2:8，洗脱时间3.5min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间4min；
流动相A与流动相B的体积比为9:1，洗脱时间5.5min。
2.根据权利要求1所述的一种检测土壤中赤霉酸的方法，其特征在于：
所述初步研磨步骤中，风干土壤样品与1.5-2.5mm陶瓷研磨球的质量比为2:2.5-3.5，风干土壤样品与去离子水的质量比为4:4.5-5.5；
所述后续研磨步骤中，初步研磨土壤与0.8-1.5mm氧化锆研磨球的质量比为2:2.5-3.5，初步研磨土壤与研磨介质的质量比为3:4.5-5.5。
3.根据权利要求1所述的一种检测土壤中赤霉酸的方法，其特征在于：
所述初步研磨步骤中，热风干燥的温度为30-40℃；
所述超声震摇并干燥步骤中，热风干燥的温度为30-40℃。
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