CN114891896A - 一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的est-ssr标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST‑SSR标记Lv‑Vp051及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了如SEQ ID NO.1～3所示的EST‑SSR标记及其扩增引物。在凡纳滨对虾特定的抗病品系中可以扩增出144bp和145bp的特异条带，而在凡纳滨对虾普通品系中扩增出的条带为150bp。因此本发明的Lv‑Vp051标记可以用于凡纳滨对特定抗病品系的鉴定、遗传多样性评估，以及抗病育种的亲本选择等方面，为今后凡纳滨对虾抗病育种提供理论基础。

Description

一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记及 应用

技术领域

本发明涉及海洋动物分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记及应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，原种分布于中南美洲从墨西哥到智利的太平洋沿岸海域，是典型的热带性对虾。目前凡纳滨对虾是世界第一养殖虾类，占全球养殖对虾产量70％和我国对虾养殖产量80％以上。根据FAO统计，2018年凡纳滨对虾养殖总产量高达497多万吨，占所有养殖对虾总产量的80％以上(FAO,2018)。根据《2021中国渔业统计年鉴》，2020年我国凡纳滨对虾养殖年产量186万多吨，占全国对虾年产量的86％，虾苗生产量15000多亿尾，凡纳滨对虾养殖产业已成为我国渔业发展的支柱性产业。我国凡纳滨对虾的人工养殖近10年来受到病毒、细菌和寄生虫等病害的困扰，使得我国凡纳滨对虾养殖病害的防控更加困难。多数现有凡纳滨对虾抗病力显著偏低，死亡率居高不下，造成巨大经济损失，严重制约了我国凡纳滨对虾养殖产业的持续健康发展。因此，定向选择抗病力强的品系是我们选育的重要目标。

传统的育种方法周期长、效率低。随着现代生物技术和遗传学技术在水产领域的快速转化，以性状相关功能基因为基础的分子标记技术成为水产遗传育种的关键技术之一。表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)是对cDNA文库随机选择的cDNA克隆进行大规模测序所获得的SSR序列，反应mRNA的信息。EST-SSR标记的开发既可以节省传统SSR所需的人力物力，又可以结合功能基因的注释，从基因功能的角度开发标记。

因为EST-SSR来自于转录组数据，保守性比较高，具有方便、快捷、多态性分布等特点，因此广泛应用在动植物的物种鉴定、遗传分化等方面。本发明主要利用转录组开发的凡纳滨对虾EST-SSR标记，对抗病成活率表现不同的品系进行鉴定，对凡纳滨对虾的抗病育种具有重大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记，该EST-SSR标记的位点是Lv-Vp051，所述的EST-SSR标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记的检测引物，所述引物为：

Lv-Vp051-F：5'-AAACCAGATAATGCACTGGGAA-3'(SEQ ID NO.2所示)；

Lv-Vp051-R：5'-GTGGTAGTGCTGGTAGTGGTCAT-3'(SEQ ID NO.3所示)。

本发明的第三个目的是提供检测所述的EST-SSR标记的试剂在制备鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的EST-SSR标记或所述的检测引物在制备鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的检测试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的检测试剂盒，该试剂盒包含所述的检测引物。

本发明的第六个目的是提供所述的EST-SSR标记、所述的检测引物或所述的检测试剂盒在鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系中的应用。

本发明的第七个目的是提供所述的EST-SSR标记、所述的检测引物或所述的检测试剂盒在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。

本发明的第八个目的是提供所述的EST-SSR标记、所述的检测引物或所述的检测试剂盒在凡纳滨对虾种群遗传结构分析中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种鉴定凡纳滨对虾抗病品系的方法，其包括以下步骤：提取待检样品的DNA，使用所述的检测引物Lv-Vp051-F/Lv-Vp051-R进行PCR扩增，若扩增出144bp和145bp的特异条带，则判断待检样品是凡纳滨对虾特定抗病品系。

本发明的第十个目的是提供所述的鉴定方法在凡纳滨对虾种群遗传结构分析、分子标记辅助育种和/或凡纳滨对虾抗病性品种选育中的应用。

本发明首次开发出适用凡纳滨对虾特定抗病品系鉴定的EST-SSR分子标记，目前能从两个品系中鉴定出凡纳滨对虾特定抗病品系。本发明开发的EST-SSR分子标记可用于凡纳滨对虾遗传多样性分析等领域，为今后凡纳滨对虾抗病育种提供理论基础。

附图说明

图1是Lv-Vp051位点引物扩增凡纳滨对虾抗病品系STR分型图，圆圈是凡纳滨对虾个体编号，方框标注144bp和145bp特异条带。

图2是Lv-Vp051位点引物扩增凡纳滨对虾普通品系STR分型图，圆圈是凡纳滨对虾个体编号，扩增片段为150bp。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例1

1、凡纳滨对虾EST-STR标记引物的筛选及结果分析

1.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取

DNA样本是分别来自于湛江的凡纳滨对虾抗病品系个体22尾，凡纳滨对虾普通品系个体20尾，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。

1.2引物的初步筛选

从上述提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机抽取6份做模板，分别采用表1中的1对引物对该基因组DNA进行PCR梯度扩增，25μL反应体系，包括：含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5μL、10mM dNTPs 1μL、Taq酶2U、10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、DNA模板10ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。反应程序：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，50℃-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共10个循环；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，72℃再延伸5-8分钟。

PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳检测，显示有1对引物在特定退火温度下能稳定扩增出条带。位点为：Lv-Vp051(如SEQ ID NO.1所示)，筛选出来的引物为Lv-Vp051(表1)。

表1引物序列

1.3凡纳滨对虾特定抗病品系鉴定引物的检测

对上述初步筛选出的引物的上游引物的5'端分别用FAM和HEX进行荧光标记，以上述提取的42个凡纳滨对虾基因组DNA为模板，使用引物Lv-Vp051-F/Lv-Vp051-R进行PCR扩增。反应体系同步骤1.2，反应程序除退火温度为60℃外其它均与步骤1.2中所述一致。PCR扩增产物采用3730XL测序仪进行分型，并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值。

Lv-Vp051引物扩增结果：通过3730XL测序仪检测PCR扩增条带在两种凡纳滨对虾品系之间的差异，唯有凡纳滨对虾特定抗病品系扩增出144和145bp的特异条带(图1)，而其它凡纳滨对虾普通品系个体在144bp和145bp处均没有扩增出任何条带(图2)，因此Lv-Vp051标记可作为鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的特异标记。进一步测序，结果显示该84bp特异条带序列如SEQ ID NO.1所示。

上述内容表明Lv-Vp051标记可开发为鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR分子标记。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

atctcgcttt catagtggta acgttccaga actcgttttc ctctctctct ctctctcttc 60

tctctttctc tcttccccct taca 84

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaccagata atgcactggg aa 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggtagtgc tggtagtggt cat 23

Claims (10)

1.一种用于鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的EST-SSR标记，其特征在于，所述的EST-SSR标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的EST-SSR标记的检测引物，其特征在于，所述引物为：

Lv-Vp051-F：5'-AAACCAGATAATGCACTGGGAA-3'；

Lv-Vp051-R：5'-GTGGTAGTGCTGGTAGTGGTCAT-3'。

3.检测权利要求1所述的EST-SSR标记的试剂在制备鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的产品中的应用。

4.权利要求1所述的EST-SSR标记或权利要求2所述的检测引物在制备鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的检测试剂盒中的应用。

5.一种鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的检测引物。

6.权利要求1所述的EST-SSR标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求5所述的检测试剂盒在鉴定凡纳滨对虾特定抗病品系中的应用。

7.权利要求1所述的EST-SSR标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求5所述的检测试剂盒在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。

8.权利要求1所述的EST-SSR标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求5所述的检测试剂盒在凡纳滨对虾种群遗传结构分析中的应用。

9.一种鉴定凡纳滨对虾抗病品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检样品的DNA，使用权利要求2所述的检测引物Lv-Vp051-F/Lv-Vp051-R进行PCR扩增，若扩增出144bp和145bp的特异条带，则判断待检样品是凡纳滨对虾特定抗病品系。

10.权利要求9所述的鉴定方法在凡纳滨对虾种群遗传结构分析、分子标记辅助育种和/或凡纳滨对虾抗病性品种选育中的应用。

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