CN114891890A - 一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒，包括用于筛查PMEPA1、SULF1、MAD2L1、TRIP13基因拷贝数变异的核酸扩增试剂，通过本发明得到的扩增结果不易出现假阳性，有效地提高了样本的检测稳定性，同时省去了基因探针成本，可以直接判断上述与结直肠癌相关的基因表达是否有异。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种与人结直肠癌相关基因的筛查试剂盒。
背景技术
结直肠癌发展缓慢，一般会经历息肉、腺瘤、肠癌等过程，从腺瘤发展成为肠癌时间可长达5-10年。早期结直肠癌的5年存活率高达90%以上，而IV期的5年存活率仅为5%-7%，如在结直肠癌发展早期进行干预，可显著降低死亡率，结直肠癌的筛查不足，是造成我国结直肠癌五年生存期低的主要原因。
目前临床应用的影像学、实验室检查、肠镜等传统检测方法通常具有敏感性和特异性低，或花费高、有创、给患者带来不适等缺点。因此，临床亟需发展敏感、特异、经济、无创的方法，以方便结直肠癌的筛查，提高疾病诊断效率。
随着高通量技术的发展，越来越多的生物标志物被发现，以进行癌症的诊断和预测。研究表明，应用不同生物标志物对结直肠癌发生发展提供了早期诊断和预后方向，研究与早期结直肠癌相关的基因标志物，为实现早期结直肠癌的诊断、预测受试者发展成为结直肠癌的风险，进而实现早干预早治疗提供了新的手段和方向。
然而，癌症的机理相当复杂，相关基因数量巨大，不同患者发生变异的基因、其中变异的位点及变异形式不同，仅位点突变就有缺失、移码、插入等形式，一些基因的高表达或不表达也可能与癌症相关，因此很难选出有共性的基因，对全部相关基因进行检测也是一件几乎不能完成的任务。因此，通过有限数目的基因最大程度上判断出基因是否发生变化尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒，能筛查PMEPA1、SULF1、MAD2L1、TRIP13和CCNB1五个基因的表达情况。
本发明的另一目的在于提供一种使用结直肠癌筛查试剂盒的方法，能够通过简单操作得到特定基因表达量的变化情况，以此判断筛查结果。
本发明公开了一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒，包括用于扩增结直肠癌相关基因的核酸扩增试剂，其中所述试剂包括SEQ ID NO.1~10所示5对引物，用于筛查PMEPA1、SULF1、MAD2L1 TRIP13和CCNB1五个基因。
所述引物对分别用于扩增以下基因：
PMEPA1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；SULF1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；MAD2L1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ IDNO.6所示的下游引物；TRIP13基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQID NO.8所示的下游引物。CCNB1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
所述扩增试剂还包括15mM dATP、15mM dCTP、15mM dGTP、15mM dUTP、15mM dTTP，pH为7-9、浓度为10mM的Tris-HCl+甘油缓冲液，20mM的MgCl2，10mM的MnCl2，Taq酶和UNG酶。
优选地，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
为了便于对比出目的基因拷贝数增加的情况，所述的结直肠癌筛查试剂盒中还包括对照品和超纯水，所述对照品包括阴性对照品和阳性对照品。
本发明还公开了利用所述试剂盒筛查PMEPA1、SULF1、MAD2L1、TRIP13和CCNB1基因的方法，是将样品与试剂盒内的核酸扩增试剂混合，放入PCR仪中扩增后，拷贝数相较于正常人显著增高的样品为阳性结果。
所述扩增的循环体系为85-92℃ 15s，54-60℃ 60s, 51-59℃ 60s,循环45次。
进一步地，扩增循环前升温至88℃ 30s预变性，扩增循环结束后降温至35℃保温5min。
本发明基于机器学习和多种统计分析方法，从难以计数的结直肠癌相关基因中筛选出临床样本诊断高度相关的5个基因，并将其集合于一个试剂盒中，对于早期的结直肠癌样本的针对性很强，利用五种基因的集合检验对于结直肠癌（COAD）的筛查以及相应的监测技术开展结直肠癌的早筛早诊意义重大，具有广泛的临床应用前景。
此外，本发明利用的生物信息学方法，是基于现有的GEO数据库中的大量临床样本信息，在预测正常（Normal）和癌症（Tumor）结局的基础上，分析各变量预测能力的准确性。再根据DeLong's test检验，在预测正常（Normal）和癌症（Tumor）结局的基础上，综合分析各变量的诊断效能。对标志基因的联合诊断效能进行评估分析，利用SPSS对各基因的表达水平进行Logistics回归分析，通过拟合出的回归曲线计算出基因是否过量表达的概率。
因为本发明选择的肿瘤早筛基因的变异方式为拷贝数变异，不易出现假阴性，有效地提高了样本的检测稳定性，同时省去基因探针成本，PCR扩增程序简单，对结直肠癌临床早筛普及具有重要意义。
附图说明
图1是GEO数据库基因共表达Venn图。
图2是TCGA数据库和GTEx中5种基因表达差异柱状图。
图3是TCGA数据库中MAD2L1基因在癌症患者T和正常人N中表达差异柱状图。
图4是TCGA数据库中SULF1基因在癌症患者T和正常人N中表达差异柱状图。
图5是TCGA数据库中PMEPA1基因在癌症患者T和正常人N中表达差异柱状图。
图6是TCGA数据库中TRIP13基因在癌症患者T和正常人N中表达差异柱状图。
图7是TCGA数据库中CCNB1基因在癌症患者T和正常人N中表达差异柱状图。
图8是GEPIA2数据库中MAD2L1基因与结肠癌的总体生存曲线图。
图9是GEPIA2数据库中SULF1基因与结肠癌的总体生存曲线图。
图10是GEPIA2数据库中PMEPA1基因与结肠癌的总体生存曲线图。
图11是GEPIA2数据库中TRIP13基因与结肠癌的总体生存曲线图。
图12是GEPIA2数据库中CCNB1基因与结肠癌的总体生存曲线图。
图13是5种差异表达基因的在GEO数据库结直肠癌临床样本和正常样本中的聚类分析热图。
图14是5种基因对应GEO数据库的受试者工作曲线（ROC）。
图15是5种基因对应GSE110225数据集的受试者工作曲线（ROC）。
图16是Cbioportal数据库中PMEPA1基因在各数据集中基因突变概率柱状图。
图17是Cbioportal数据库中CCNB1基因在各数据集中基因突变概率柱状图。
图18是Cbioportal数据库中SULF1基因在各数据集中基因突变概率柱状图。
图19是Cbioportal数据库中MAD2L1基因在各数据集中基因突变概率柱状图。
图20是Cbioportal数据库中TTIP13基因在各数据集中基因突变概率柱状图。
图21是Cbioportal数据库中PMEPA1基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系图。
图22是Cbioportal数据库中CCNB1基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系图。
图23是Cbioportal数据库中SULF1基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系图。
图24是Cbioportal数据库中MAD2L1基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系图。
图25是Cbioportal数据库中TTIP13基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系图。
具体实施方式
实施例1。
从基因表达数据库——Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中以“coloncaner”结直肠癌为关键词，搜索与结直肠癌相关的公共基因表达数据及其完整的注释，根据公共基因表达数据中记载的临床信息，选择结直肠癌患者的临床样本信息。下载GSE166427, GSE110223 ,GSE110224，GSE113513，GSE110225数据集。其中GSE166427来自GPL13667平台,包含97例正常的组织样本，197例癌症样本：GSE110223来自GPL96平台包含13例正常组织和13例结肠癌组织：GSE110224来自GPL570平台，包含17例正常组织和17例结肠癌组织；GSE110513来自GPL15207平台，包含14例非癌性周围组织和14例结肠癌组织；GSE110225包含多子集，包含30例正常组织和30例结肠癌组织对于下载的数据集的基因表达矩阵文件，使用GPL平台注释文件对基因表达谱进行注释，将基因探针转换成genesymbol。选择GSE166427, GSE110223 ,GSE110224，GSE113513作为训练集，GSE110225作为验证集。利用R包“limma”分析训练集四个数据集进行差异表达分析，对每个数据集筛选符合修改后p值（adj.p.value）<0.05，LogFC>2条件的基因，如图1所示，去除非蛋白编码蛋白后，综合比对筛选后数据，最后得到86个共表达基因。
利用TCGA数据集与GTEx数据集，下载临床信息，采用R包“gGPLot2”，R包“pROC”，分析86种差异表达基因的差异表达与总体生存期，选择p-value Cutoff值:0.01，cut off值:4.5为条件。筛查得到PMEPA1、SULF1、MAD2L1、 TRIP13和CCNB1基因，所选5种基因在临床样本中的具体表达情况如图2-7所示，所选5种基因对应的结直肠癌患者总体生存曲线如图8-12所示，在结直肠癌临床样本数据中基因表达情况均为上调，且基因表达情况与结直肠癌患者总体生存期呈负相关，差异具有统计学意义（P<0.05）。
分析训练集中数据集表达谱矩阵。运用R包＂ComplexHeatmap"绘制差异表达基因（DEGs）在GEO数据库的表达情况热图，进行数据可视化，如图13表示，热图显示五种基因具有明显表达差异。为了进一步研究5种基因临床意义，对各基因的表达水平进行 Logistics回归分析，如图14所示，采用R包“pROC包”绘制选取的5种基因对应GEO数据库的受试者工作曲线（ROC）图，分析其诊断效能。得到结直肠癌靶向基因检测技术对结直肠癌和癌前病变的样本的检测结果对比，即表1、表2、表3。
表1 五种基因受试者工作曲线（ROC）样本参数
表2 五种基因受试者工作曲线（ROC）具体数值
表3 五种基因对应GEO数据库的受试者工作曲线（ROC）临床意义说明
综合表1至表3中的内容可以看出，在预测Normal和Tumor结局上，变量PMEPA1的预测能力有一定准确性（AUC = 0.831，CI = 0.799-0.864），变量SULF1的预测能力有较低准确性（AUC = 0.619，CI = 0.576-0.662），变量CCNB1的预测能力有较高准确性（AUC =0.980，CI = 0.972-0.989），变量MAD2L1的预测能力有较高准确性（AUC = 0.988，CI =0.983-0.994），变量TRIP13的预测能力有较高准确性（AUC = 0.996，CI = 0.993-0.999）。
根据诊断效能AUC值与置信区间，分析得到这5种基因对于结直肠癌预测均据有临床意义。
利用SPSS对各基因的表达水平进Logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性，绘制如图15所示的受试者工作曲线（ROC），其中验证集为GSE110225数据集。图15中包含了5个基因对应验证集GSE110225数据集的单独结果及部分优选组合方式的结果。
图15中每条曲线的具体数据对应表4，可以看出，在预测Normal和Tumor结局上，变量CCNB1、MAD2L1、TRIP13的预测能力有一定准确性（AUC = 0.830，CI = 0.696-0.975），PMEPA1、SULF1、MAD2L1、TRIP13四种基因组合检验有最高的准确性（AUC = 0.907，CI =0.808-1.000），上述4种基因与CCNB1综合5种基因联合检验的准确性也较高，（AUC＝0.893,CI＝0.784～1.000）。对比分析得PMEPA1、SULF1、MAD2L1 TRIP13四种基因或使用全部五个基因的集合检验诊断效能（AUC）值较大，具有优异性能，且设定的置信度相同时，总体稳定性好，可信度高。优于其他几种基因组合，因此，对结直肠癌colon cancer的筛查最具有临床意义。
表4 五种基因对应GSE110225数据集的受试者工作曲线（ROC）下面积（AUC）
实施例2。
运用Cbioportal生物信息分析网站，分析TCGA数据库，MSKCC数据库，DFCL数据库中结直肠癌患者PMEPA1,CCNB1,SULF1,MAD2L1,TRIP13基因突变情况，基因突变频率分别如图16-20所示，基因突变频率较低。
图16-20分别是基因PMEPA1,CCNB1,SULF1,MAD2L1,TRIP13在各数据集中基因突变概率，其中，横坐标为各数据库中基因研究数据集，纵坐标为对应基因突变概率。通过图16-20可以看出，本发明选中的5种基因基因突变频率较低，且主要为Amplification与Deletion的拷贝数变异。下面再进一步分析5种基因高表达究竟与哪种基因突变有关
分析选中的5种基因mRNA转录表达情况与基因突变之间的关系，PMEPA1, CCNB1,SULF1, MAD2L1, TRIP13基因的结果分别如图21-25所示。
图21-25是cbioportal数据库中基因转录mRNA表达量差异与基因突变情况之间的关系，其中横坐标为基因突变情况，纵坐标为基因转录mRNA差异表达情况。如图2-7所示，本发明选中的5种基因在结直肠癌临床样本与正常组织样本中基因表达对应的蛋白质含量差异明显，图21-25是对于这异常的高基因表达进行解释，5种基因对应的mRNA高转录量临床患者样本均为Amplification与Deletion的拷贝数变异。因为基因转录mRNA与基因表达蛋白质含量成正相关，因此可以得出：PMEPA1, CCNB1, SULF1, MAD2L1, TRIP13基因对应蛋白质高表达与突变基本无关系，其主要为基因拷贝数变异。在检测样本时，不需要考虑突变导致基因检测位点改变，可直接进行引物连接扩增，提高了检测的稳定性与简便性。
实施例3。
取血液作为样本，按下述方法使用结直肠癌筛查试剂盒：
1）配置如表5所示的15μL反应体系：
2）混匀后放入PCR仪中，设定如下循环体系后开始扩增：88℃ 30s预变性；90℃15s，57℃ 60s，55℃ 60s共45个循环；35℃ 5min后终止扩增。
3）扩增结束后将扩增产物转移至琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后观察样品条带，通过与对照组对比条带宽度及亮度的区别，判断拷贝数是否有变化，以此判断目标基因是否发生拷贝数变异。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 1
cgcctcctgc tacagttaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 2
gacagcttgt agtggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 3
agagtcgcag gcaatagaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 4
actggtcaca ctgaagaagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 5
atacggactc accttgcttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 6
accgtagctg tgatctgtct 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 7
cacagcctct tttctaagtg gt 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 8
cacttctcag ggaaaattgc t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 9
gacctgtgtc aggctttctc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequences)
<400> 10
atgtttccag tgacttcccg 20
Claims (9)
1.一种结直肠癌相关基因筛查试剂盒，包括用于扩增结直肠癌相关基因的核酸扩增试剂，其中所述试剂包括SEQ ID NO.1~8所示4对引物，用于扩增PMEPA1、SULF1、MAD2L1和TRIP13四个基因。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌相关基因筛查试剂盒，其中所述试剂还包括SEQ IDNO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物，用于扩增CCNB1基因。
3.根据权利要求1所述的结直肠癌相关基因筛查试剂盒，其中所述引物对分别用于扩增以下基因：
PMEPA1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
SULF1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；
MAD2L1基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；
TRIP13基因的PCR引物对为序列SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物。
4.根据权利要求1所述的结直肠癌相关基因筛查试剂盒，其中所述扩增试剂还包括15mM dATP、15mM dCTP、15mM dGTP、15mM dUTP、15mM dTTP，pH为7-9、浓度为10mM的Tris-HCl+甘油缓冲液，20mM的MgCl2，10mM的MnCl2，Taq酶和UNG酶。
5.根据权利要求4所述的结直肠癌相关基因筛查试剂盒，其中所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
6.根据权利要求1所述的结直肠癌相关基因筛查试剂盒，其中还包括对照品和超纯水，所述对照品包括阴性对照品和阳性对照品。
7.一种使用权利要求1至6任一项所述试剂盒筛查PMEPA1、SULF1、MAD2L1、TRIP13和CCNB1基因的方法，是将待测样品与试剂盒内的核酸扩增试剂混合，放入PCR仪中扩增后，拷贝数变多的样品为阳性结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述扩增的循环体系为85-92℃ 15s，54-60℃60s， 51-59℃ 60s，循环45次。
9.根据权利要求8所述的方法，其中扩增循环前升温至88℃ 30s预变性，扩增循环结束后降温至35℃保温5min。
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2022
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