CN114891654A - 鼠李糖乳杆菌lrh05分离株及其用途 - Google Patents

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林金生
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Abstract

本发明涉及鼠李糖乳杆菌LRH05分离株及其用途。本发明揭示一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH05，其以保藏编号DSM 33616被保藏于德国微生物保藏中心(DSMZ)。本发明亦揭示一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05供应用于制备用来治疗代谢症候群关联性疾病的组合物的用途，以及一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05供应用于制备用来改善肠道微生物相的组合物的用途。

Description

鼠李糖乳杆菌LRH05分离株及其用途
技术领域
本发明有关于一种鼠李糖乳杆菌LRH05分离株及其用途，它以保藏编号 DSM33616被保藏于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)。本发明亦有关于使用所述鼠李糖 乳杆菌LRH05来治疗代谢症候群关联性疾病(metabolic syndrome-related disorders)以及改善肠道微生物相(modifyinggut microbiota)。
背景技术
代谢症候群(metabolic syndrome)是个体中同时发生多种代谢异常 (metabolicabnormalities)的风险因子的情形。这些风险因子包含：肥胖[包括 中心型肥胖(centralobesity)，又称为腹部肥胖(abdominal obesity)]、葡萄糖代 谢异常[包括胰岛素抗性(insulin resistance)或葡萄糖耐受不良(glucose intolerance)]、高血压(hypertension)、血脂异常(dyslipidemia)[包括血中三酸甘 油酯(triglycerides)过高、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)胆固醇过 高、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)胆固醇过低等]、血栓形成前 状态(prothrombotic state)以及发炎前状态(proinflammatory state)。特别地，肥 胖已成为当今社会中最主要的风险因子。
带有代谢症候群的个体经常会发生心血管系统(cardiovascular system)、 胰脏(pancreas)以及肝脏等多种器官与组织的病变，进而发展出多种代谢症候 群关联性疾病(metabolic syndrome-related disorders)，例如高血脂症 (hyperlipidemia)、动脉粥样硬化(arteriosclerosis)、糖尿病(diabetes mellitus)以 及脂肪肝(fatty liverdisease)等。
目前针对代谢症候群关联性疾病的治疗方案，除了饮食与营养控制之外， 还包括服用多种抗肥胖药物(anti-obesity medication)、降血糖药物 (hypoglycemic agents)或降血脂药物(hypolipidemic agents)来控制相关症状。 然而，长期服用这些药物不但无法达到所欲的疗效，并且可能会导致患者产 生严重的副作用(side effects)与不良反应(adverse effect)。因此，本领域的相 关研究人员皆致力于发展出可以有效地治疗代谢症候群关联性疾病并且不 会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。 常见的乳酸菌包括：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片 球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双 歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属 (Leuconostoc)等。
目前已有研究指出，有多株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株 具有减重、改善葡萄糖与脂肪代谢以及改善胰岛素抗性等效用。例如，在K. Mazloom et al.(2019),Nutrients,11(2):258中，K.Mazloom等人回顾并整理出 多种具有抗肥胖效用的鼠李糖乳杆菌菌株，其中最被广为应用者为鼠李糖乳 杆菌GG(又被称为LGG)。LGG已经由动物实验而被证实能够有效地减轻体 重、提升个体对于胰岛素的敏感度，以及减少脂肪累积。
虽然已存在有上述文献报导，本领域中仍然存在有需要去筛选出可以有 效治疗代谢症候群关联性疾病的微生物以供产业界之所需。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH05，其以保藏编号BCRC 911013被保藏于财团法人食品工业 发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以保藏编号 DSM 33616被保藏于德国微生物保藏中心(DSMZ)。
在第二个方面，本发明提供一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)供应用于制备用来治疗代谢症候群关联性疾病的组合物的用途。
在第三个方面，本发明提供一种用于治疗具有或被怀疑具有代谢症候群 关联性疾病的个体的方法，其包括对该个体投予如上所述的鼠李糖乳杆菌 LRH05(DSM 33616)。
在第四个方面，本发明提供一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)供应用于制备用来改善肠道微生物相(gut microbiota)的组合物的用途。
在第五个方面，本发明提供一种用于改善个体的肠道微生物相的方法， 其包括对该个体投予如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)。
本发明所述的用途，所述代谢症候群关联性疾病选自于由下列所构成的 群组：肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病、脂肪肝，以及它们的组合。
本发明所述的用途，所述代谢症候群关联性疾病是第2型糖尿病。
本发明所述的用途，所述组合物是食品组合物。
本发明所述的用途，所述组合物是药学组合物。
本发明所述的用途，所述药学组合物呈供口服给药的剂型。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以 及其他目的与特征，可通过参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随 的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示3T3-L1细胞在分别被处理以不同乳杆菌分离株的胞内提取物之 后所测得的TG含量，其中空白对照组表示未经诱导分化或任何处理的细胞； 正对照组表示经诱导分化但未经乳杆菌分离株的胞内提取物处理的细胞；实 验组LA25、LA27、LRH69、LRH10、LRH05、LRH09以及LR47分别表示经 对应的乳杆菌分离株的胞内提取物处理的细胞；以及“****”表示当与正对照 组作比较，以ANOVA合并Dunnett’s事后检验进行分析，p＜0.0001；
图2显示鼠李糖乳杆菌LRH05、BCRC 10940、LGG、LRH69、LRH09以 及LRH10分别通过使用随机引物RAPD-A、RAPD-B、RAPD-C以及RAPD-1 的RAPD分析所得到的基因指纹图谱，其中泳道M表示DNA阶梯标记(DNA ladder marker)(100-3,000bp)；泳道1至泳道6分别表示鼠李糖乳杆菌LRH05、BCRC 10940、LGG、LRH69、LRH09以及LRH10的扩增产物；
图3显示在喂食HFD的10周期间各组小鼠的平均体重随着时间的变化， 其中正常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以 高脂肪饲料的小鼠；LRH05组以及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且 被管喂以对应的乳杆菌菌液的小鼠；
图4显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠的平均体重增加量，其中正 常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪 饲料的小鼠；LRH05组以及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂 以对应的乳杆菌菌液的小鼠；以及“***”表示当与病理对照组作比较，以 ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜0.001；
图5显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠所测得的血糖浓度，其中正 常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪 饲料的小鼠；LRH05组以及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂 以对应的乳杆菌菌液的小鼠；
图6显示正常对照组、病理对照组小鼠以及LRH05组小鼠在喂食HFD 10 周后通过口服葡萄糖耐受性试验所得到的血糖浓度-时间曲线，其中正常对 照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪饲料 的小鼠；LRH05组表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以鼠李糖乳杆菌 LRH05菌液的小鼠；以及“**”表示当与病理对照组作比较，以ANOVA合并 塔基事后检验进行分析，p＜0.01；
图7显示正常对照组、病理对照组小鼠以及LRH05组小鼠在喂食HFD 10 周后通过口服葡萄糖耐受性试验所得到的血糖浓度-时间曲线的AUC，其中 正常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂 肪饲料的小鼠；LRH05组表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以鼠李糖乳杆 菌LRH05菌液的小鼠；以及“#”表示当与正常对照组作比较，以ANOVA合并 塔基事后检验进行分析，p＜0.05，“*”表示当与病理对照组作比较，以ANOVA 合并塔基事后检验进行分析，p＜0.05
图8与图9分别显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠所测得的血清中 的TG含量与TC含量，其中正常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病 理对照组表示被喂食以高脂肪饲料的小鼠；LRH05组以及LR47组分别表示被 喂食以高脂肪饲料并且被管喂以对应的乳杆菌菌液的小鼠；以及“**”表示当 与病理对照组作比较，以ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜0.01，“****” 表示当与病理对照组作比较，以ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜ 0.0001；
图10、图11与图12分别显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠所测得的 附睪周边、腹膜后以及腹股沟的脂肪重量，其中正常对照组表示被喂食以低 脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪饲料的小鼠；LRH05组以 及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以对应的乳杆菌菌液的 小鼠；以及“*”表示当与病理对照组作比较，以ANOVA合并塔基事后检验进 行分析，p＜0.05，“****”表示当与病理对照组作比较，以ANOVA合并塔基 事后检验进行分析，p＜0.0001；
图13显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠的肝脏组织通过苏木精与 伊红染色而被观察到的结果，其中CD表示正常对照组中被喂食以低脂肪饲 料的小鼠；HFD表示病理对照组中被喂食以高脂肪饲料的小鼠；LRH05以及 LR47分别表示LRH05组以及LR47组中被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以对 应的乳杆菌菌液的小鼠；
图14显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠所测得的肝脏TG含量，其 中正常对照组表示被喂食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高 脂肪饲料的小鼠；LRH05组以及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被 管喂以对应的乳杆菌菌液的小鼠；以及“#”表示当与正常对照组作比较，以 ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜0.05，“*”表示当与病理对照组作比 较，以ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜0.05；
图15显示各组所测得的α-淀粉酶抑制活性，其中正对照组表示阿卡波糖 (浓度为30mg/mL，配于ddH2O中)；比较实验组表示LGG的胞内提取物；实 验组表示鼠李糖乳杆菌LRH05的胞内提取物；以及“***”表示当与比较实验 组作比较，以ANOVA合并塔基事后检验进行分析，p＜0.001；
图16与图17分别显示在喂食HFD历时10之周后各组小鼠通过肠道微生 物相分析所得到的α-多样性指标ACE以及Chao1，其中正常对照组表示被喂 食以低脂肪饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪饲料的小鼠； LRH05组以及LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以对应的乳 杆菌菌液的小鼠；以及
图18、图19以及图20分别显示在喂食HFD历时10周之后各组小鼠所测得 的粪便中的乙酸、丙酸以及丁酸含量，其中正常对照组表示被喂食以低脂肪 饲料的小鼠；病理对照组表示被喂食以高脂肪饲料的小鼠；LRH05组以及 LR47组分别表示被喂食以高脂肪饲料并且被管喂以对应的乳杆菌菌液的小 鼠；以及“****”表示当与正常对照组作比较，以ANOVA合并塔基事后检验 进行分析，p＜0.0001。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)” 意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领 域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述 于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本 发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
申请人分离并筛选出一株具有抑制脂肪生成活性(adipogenesis inhibitoryactivity)的乳杆菌分离株(Lactobacillus isolate)，并且经由特征鉴定将其归属 于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，它被申请人命名为“鼠李糖乳杆菌 LRH05”，并且已于公元2020年8月19日以保藏编号BCRC 911013被保藏于财 团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。这 个分离株亦有依据布达佩斯条约(theBudapest Treaty)的规定，于公元2020年8 月10日以保藏编号DSM 33616被保藏于德国微生物保藏中心(DSMZ)。
本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)经由活体外(in vitro)以及活 体内(in vivo)实验而被证实能够有效地抑制肠道上皮细胞对于脂肪的吸收、 降低代谢症候群个体的体重、血脂、体脂肪，同时其在抗糖尿病上的活性更 显著地优于已知可用于抗糖尿病的鼠李糖乳杆菌GG(LGG)。基于上述的有 利生物活性，申请人认为：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)具有 发展成为治疗代谢症候群关联性疾病(metabolic syndrome-related disorder)的 药物的高潜力。
于是，本发明提供一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)供 应用于制备用来治疗代谢症候群关联性疾病的组合物的用途。
如本文中所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指预防(preventing)、减少(reducing)、减轻(alleviating)、改善(ameliorating)、缓解(relieving)、或控制(controlling)疾病(disease)或障碍(disorder)的一个或多个临 床征兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing) 正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性(severity)的进展 (progression)。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物， 诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、 山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
如本文中所使用的，术语“代谢症候群(metabolic syndrome)”意指个体因 慢性代谢异常而导致一种或多种关联性疾病共同发生的情形。
依据本发明，该代谢症候群关联性疾病可包括，但不限于：代谢症候群 本身；肥胖(obesity)；高血压(hypertension)；血脂异常(dyslipidemia)[包括高 血脂症(hyperlipidemia)、高三酸甘油酯血症(hypertriglyceridemia)、高胆固醇 血症(hypercholesterolemia)以及高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)]；胰岛素 抗性(insulin resistance)或糖尿病(diabetes mellitus)[包括第2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM]；动脉粥样硬化(atherosclerosis)；心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)[诸如冠状动脉疾病(coronary artery diseases,CADs)、急性心肌梗塞(acute myocardial infarction)、中风(stroke)、心脏衰竭 (heartfailure)、心律不整(cardiac arrhythmias)、高血压性心脏病(hypertensive heartdisease)等]；以及脂肪肝(fatty liver disease)[又称肝脏脂肪变性(hepaticsteatosis)，包括急性脂肪肝(acute fatty liver)、慢性脂肪肝(chronic fatty liver)、大囊泡性脂肪肝(macrovesicular fatty liver)、小囊泡性脂肪肝(microvesicularfatty liver)，以及非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)]。 较佳地，该代谢症候群关联性疾病是第2型糖尿病。
另一方面，本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)亦经由实验而被 证实能够有效地改善代谢症候群个体的肠道微生物相组成(gut microbiota profile)并增加肠道微生物相的多样性(diversity)，进而提升肠道代谢能力。
因此，本发明亦提供一种如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616) 供应用于制备用来改善肠道微生物相(modifying gut microbiota)的组合物的 用途。
依据本发明，其中，鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)可以是浓缩的或 非浓缩的、液态(liquid)、糊状(paste)、半固态(semi-solid)，或固态(solid)[例 如，丸(pellet)、细颗粒(granule)或粉末(powder)]，并且可以是经冷冻的(frozen)、 经干燥的(dried)，或经冷冻干燥的(freeze-dried)[例如，可以呈冷冻干燥形式 或喷雾/流化床干燥(spray/fluid bed dried)形式]。在本发明的一个较佳具体例 中，鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM33616)呈液态的形式存在。
依据本发明，该组合物可以是食品组合物(food composition)，例如呈食 品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至可食性材料(edible material) 中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的实例可 包括，但不限于：流体乳品(fluid milk products)，例如牛奶(milk)以及浓缩牛 奶(concentrated milk)；发酵乳品(fermented milk)，例如优酪乳(yogurt)、酸乳 (sour milk)以及冷冻优格(frozenyogurt)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；干酪(drycheeses)；豆奶(soybean milk)；发酵 豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(fruit juices)； 运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jelly)；糖果(candies)；健 康食品(health foods)；动物饲料(animal feeds)；以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制 造成适合于口服给药(oral administration)的剂型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技 术之药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学 上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲 液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、 崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、 赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释 剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome) 以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养 与例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制 造成适合于口服给药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、 片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末 (dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂 (emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。
本发明亦提供一种用于治疗具有或被怀疑具有代谢症候群关联性疾病 的方法，其包括对该个体投予如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)。
依据本发明，鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)的给药剂量与给药次数 会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗 的个体的年龄、身体状况与反应。一般而言，鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)可呈单一剂量或分成多个剂量的形式而被口服地给药。
本发明亦提供一种用于改善个体的肠道微生物相的方法，其包括对该个 体投予如上所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例 只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.MRS肉汤培养基(MRS broth medium)：
在下面实施例中用来培养乳杆菌所使用的MRS肉汤培养基购自于启新 生物科技股份有限公司(Difco,Cat.No.288130)。
2.基础培养基(basal medium)：
若无特别说明，在下面实施例中用来培养小鼠胚胎纤维母细胞细胞系 (mouseembryonic fibroblast cell line)3T3-L1的基础培养基是高浓度葡萄糖杜 贝可氏改良的依格氏培养基(High Glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,high glucoseDMEM)(Sigma-Aldrich，货号D6429)，并补充有10％新 生小牛血清(newborn calf serum,NCS)(Gibco，货号16010159)、100U/mL的 盘尼西林-链霉素-两性霉素B(penicillin-streptomycin-amphotericin B)(Biological Industries，货号03-033-1B)。
3.小鼠胚胎纤维母细胞细胞系3T3-L1的来源以及培养：
在下面实施例中所使用的小鼠胚胎纤维母细胞细胞系3T3-L1(BCRC 60159，对应于
Figure RE-GDA0003232301820000101
CL-173TM)购自于中国台湾食品工业发展研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute,FIRDI,Taiwan,China)。3T3-L1细 胞被培养于DMEM[添加有10％NCS、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、 100U/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素以及0.25μg/mL两性霉素B]的10-cm培 养皿(10-cm petri dish)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养。当细胞密 度达到约70％汇聚(confluence)时，进行继代培养(subculture)步骤如下：首先， 移除培养基并以磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)(pH 7.4) 来清洗细胞1次，接着加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使细胞自培养皿 的底部脱离。之后，加入基础培养基来中和胰蛋白酶的活性并以量吸管 (pipette)反复地吸冲培养基以充分打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分 配到新的培养皿中，并在培养箱中进行培养。
4.实验动物：
在下面实施例中所使用的C57BL/6雄性小鼠(male mice)(8周大，平均体 重约22g)购自乐斯科生物科技股份有限公司。所有的实验动物被饲养于一个 光照与黑暗各为12小时、室温维持在22±2℃以及相对湿度维持在40-60％的独 立空调的动物房内，而且水分与饲料被充分地供给。有关实验动物的处理以 及一切实验程序均符合相关法规的规定并且依据中国台湾某机构准则来进 行。
一般实验方法：
1.统计学分析(statistical analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，所得到的实验数据以“平均 值(mean)±标准偏差(standard deviation,SD)”来表示，并且采用Graphpad prism 7软件来进行统计分析，其中所有的数据通过单因子变异数分析(one-way analysis of variance,ANOVA)合并塔基事后检验(Tukey’s post hoc test)或 Dunnett’s事后检验(Dunnett’s posthoc test)来进行分析，用来评估各组之间的 差异性。若所得到的分析结果是p＜0.05，代表有统计学显著性(statistical significance)。
实施例1.具有抑制脂肪生成活性(adipogenesis inhibitory activity)的乳 杆菌分离株(Lactobacillus isolates)的初步筛选
A、试验菌株的来源与分离：
申请人利用Difco Lactobacilli MRS琼脂(Difco Lactobacilli MRS Agar)来进行乳杆菌的分离与筛选而得到7株乳杆菌分离株，并将其分别命名为LA25、 LA27、LRH09、LRH10、LRH69、LRH05以及LR47。将所述乳杆菌分离株 接种至适量的MRS肉汤培养基中，并置于恒温培养箱(30℃)中进行培养历时 16小时。之后，将所得到的乳杆菌培养物分别添加以适量的甘油溶液(glycerol solution)至20％(v/v)的最终浓度，继而将之冷冻保存于-80℃下备用。
B、试验菌株的活化：
将依据上面第A项当中所得到的7株试验菌株接种至10mL的MRS肉汤 培养基中，继而于37℃下予以培养历时16小时，重复此接种-培养步骤2次， 用来活化菌株。
C、筛选具有抑制脂肪生成活性的试验菌株：
首先，申请人将依据上面第B项中所得到的7株经活化的乳杆菌分离株分 别接种至10mL的MRS肉汤培养基中，并置于恒温培养箱(37℃)中进行培养 历时18小时之后，对所得到的乳杆菌培养物在4℃下以3,000rpm予以离心历 时10分钟来收集菌体沉淀物(pellets)。之后，以适量的0.85％盐水溶液来重新 悬浮细胞，而使得所得到的悬浮液具有1×1010CFU/mL的菌数。接着，将各 乳杆菌分离株的悬浮液置于冰上，并通过使用MicrosonXL-2000超声波细胞 破碎仪(Misonix)来破碎菌体，接着在4℃下以12,000rpm予以离心历时10分钟， 继而收集上清液而得到各乳杆菌分离株的无细胞的胞内提取物(cell-freeintracellular extract)。
所述胞内提取物在下面被拿来评估在抑制3T3-L1细胞分化为脂肪细胞(adipocytes)上的效用，而3T3-L1细胞的分化参考K.Zebisch et al.(2012),Anal.Biochem.,(1):88-90当中所述的方法来进行诱导。
首先，将依据上面“一般实验材料”的第3项“小鼠胚胎纤维母细胞细胞 系3T3-L1的来源以及培养”来进行继代培养的3T3-L1细胞分为9组，其中包 括1个空白对照组、1个正对照组(positive control)，以及7个实验组(亦即实验 组LA25、LA27、LRH69、LRH10、LRH05、LRH09以及LR47)。将正对照组 以及7个实验组的3T3-L1细胞接种至含有1mL的基础培养基的24-井培养盘 (24-well plate)中，继而于培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养历时4天。
之后，将各井中的培养基更换以1mL的分化培养基I(differentiation medium I)[亦即，添加有1μg/mL的胰岛素(insulin)(Sigma-Aldrich，货号I9278)、 0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)(Sigma-Aldrich，货号I5879)以及0.25μM地塞米松 (dexamethasone)(Sigma-Aldrich，货号D2915)的基础培养基]，接着在培养箱 (37℃，5％CO2)中进行培养历时3天；接着，将培养基更换以1mL的分化培 养基II(differentiation medium II)[亦即，添加有1μg/mL的胰岛素的基础培养 基]继续培养历时3天，用来诱导3T3-L1细胞分化成脂肪细胞。
在诱导3T3-L1细胞分化的期间，每天对所述实验组的细胞培养物分别添 加10μL的对应的乳杆菌分离株的胞内提取物，以及对正对照组的细胞添加 10μL的0.85％盐水溶液。
至于空白对照组的细胞则被接种于含有1mL的基础培养基的24-井培养 盘中，在培养箱中进行培养历时6天，并且每2天更换以新鲜的基础培养基。
之后，收集各组的细胞培养物，继而依据制造商的操作指南而使用三酸 甘油酯比色分析试剂盒(Triglyceride Colormetric Assay Kit)(Cayman，USA， 货号10010303)来测定各组细胞培养物内的三酸甘油酯(triglycerides,TG)含 量。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方 法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图1中。
图1显示3T3-L1细胞在分别被处理以不同乳杆菌分离株的胞内提取物之 后所测得的TG含量。由图1可见，正对照组的TG含量显著地高于空白对照组 所具者，显示分化培养基成功地诱导3T3-L1细胞分化为脂肪细胞。而与正对 照组相比较，实验组LA25与LA27的TG含量几乎没有差异，而实验组LRH69、 LRH10、LRH05、LRH09以及LR47的TG含量皆有显著地降低，特别地，实 验组LRH05的TG含量不仅明显低于其他实验组所具者，甚至略低于空白对照组所具者。
根据上述实验结果，申请人认为乳杆菌分离株LRH69、LRH10、LRH05、 LRH09以及LR47具有抑制脂肪生成的活性而有开发潜力，因而将它们拿来进 行下面的特征鉴定以及进一步的效用评估。
实施例2.乳杆菌分离株的特征鉴定
为了确认在上面实施例1中所筛选出的5个乳杆菌分离株的所属菌种，所 述乳杆菌分离株被拿来进行下面的16S rDNA序列分析、随机扩增的多型性 DNA (RandomAmplified Polymorphic DNA,RAPD)分析，以及多基因座序列 分型(multilocus sequencetyping,MLST)。
A、16S rDNA序列分析：
使用基因组DNA微量提取试剂盒(Genomic DNA Mini kit)(Geneaid,Cat.No.GB100/GB300)来提取乳杆菌分离株LRH69、LRH10、LRH05、LRH09 以及LR47的基因组DNA，继而以所得到的基因组DNA作为模板(template)， 并使用一组针对细菌的16S rDNA基因而设计的具有下面所示的核苷酸序列 的引物对(primer pair)前向引物27F’与反向引物1492R’来进行聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)，用来扩增出所述乳杆菌分离株的16S rDNA 片段。
前向引物27F’
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(序列辨识编号：1)
反向引物1492R’
5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’(序列辨识编号：2)
完成PCR之后，委托基龙米克斯生物科技有限公司(Genomics Biosci& Tech Co.,Ltd)来进行测序分析，而得到所述乳杆菌分离株的部分16S rDNA序 列(序列辨识编号：3)。经与NCBI网站中的基因资料库比对后发现，乳杆菌 分离株LRH69、LRH10、LRH05以及LRH09的部分16S rDNA序列与鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的部分16S rDNA序列之间具有99.9％以上的 相同性(identity)；以及乳杆菌分离株LR47的部分16S rDNA序列与罗伊氏乳 杆菌(Lactobacillus reuteri)的部分16S rDNA序列之间具有99.0％以上的相同 性。
依据上面第A项的实验结果，本发明所分离得到的乳杆菌分离株LRH69、 LRH10、LRH05以及LRH09被初步鉴定为鼠李糖乳杆菌，而乳杆菌分离株LR47被初步鉴定为罗伊氏乳杆菌。而为了确认鼠李糖乳杆菌LRH69、LRH10、 LRH05以及LRH09是否为彼此不同的新颖分离株，所述分离株被进一步拿来 进行下面第B至D项的分析。
B、糖类发酵形态分析：
本实验使用
Figure BDA0002988561590000152
50CH微生物鉴定试剂盒(
Figure BDA0002988561590000153
50CH microbialidentification kit)(bioMérieux)并参照厂商所提供的操作指引来进行。此外， 由申请人自行分离并且经过鉴定的鼠李糖乳杆菌GG(下称LGG)亦被拿来进 行相同的糖类发酵形态分析以供比较。所试验的糖类以及分析结果被显示于 下面表1中。
表1.鼠李糖乳杆菌菌株的糖类发酵形态分析结果
Figure BDA0002988561590000151
Figure BDA0002988561590000161
Figure BDA0002988561590000171
注：+，阳性反应；－，阴性反应；/，无法判定。
依据表1的结果，鼠李糖乳杆菌LRH05、LRH09、LRH69、LRH10以及 LGG在糖类发酵形态上存在有明显的差异。
C、RAPD分析：
有关鼠李糖乳杆菌LRH69、LRH10、LRH05以及LRH09的RAPD分析主 要参考L.Rossetti et al.(2005),J.Microbiol.Methods,63:135-144当中所述的 方法来进行。简言之，首先，将在上面第A项当中所得到的鼠李糖乳杆菌 LRH69、LRH10、LRH05以及LRH09的基因组DNA作为模板，并且分别选用 4个针对细菌的基因组DNA而设计的具有下面所示的核苷酸序列的随机引物 (random primer)RAPD-1、RAPD-A、RAPD-B以及RAPD-C来进行PCR。
随机引物RAPD-A
5’-AACGCGCAAC-3’(序列辨识编号：4)
随机引物RAPD-B
5’-GCGGAAATAG-3’(序列辨识编号：5)
随机引物RAPD-C
5’-CTCAGGTCGC-3’(序列辨识编号：6)
随机引物RAPD-1
5’-CCGCAGCCAA-3’(序列辨识编号：7)
完成PCR之后，所得到的扩增产物通过1％琼脂糖凝胶(agarose gel)来进 行电泳(electrophoresis)以及染色，继而于紫外光下予以观察与拍照。
为供比较，申请人另外使用LGG以及先前自行分离并且经过鉴定的鼠李 糖乳杆菌BCRC 10940作为比较菌株来进行比对分析。所得到的电泳结果被 显示于图2中。
图2显示鼠李糖乳杆菌LRH05、BCRC 10940、LGG、LRH69、LRH09以 及LRH10分别通过使用随机引物RAPD-A、RAPD-B、RAPD-C以及RAPD-1 的RAPD分析所得到的基因指纹图谱。之后，依据不同随机引物的RAPD分 析所鉴别出的遗传变异来进行基因分型，而所得到的结果统整于下面的表2 中。从表2可见，结合使用不同随机引物的RAPD分析，该6株鼠李糖乳杆菌分离株被初步鉴别出4种不同的基因型。
表2.通过RAPD分析所鉴别出的基因型
Figure BDA0002988561590000181
注：每一行中不同的字母或符号代表通过对应的引物而被鉴别为不同的基因型。
D、多基因座序列分型(multilocus sequence typing,MLST)：
接着，申请人进一步参考E.U.Poluektova et al.(2017),Archives ofMicrobiology,199:683-690当中所述的方法来对鼠李糖乳杆菌LRH05、LRH69、 LRH09以及LRH10进行下面的MLST，并且使用鼠李糖乳杆菌BCRC 10940 以及LGG作为比较菌株。
首先，申请人以在上面第A项当中所得到的基因组DNA作为模板，并选 用下面表3中所示的针对细菌的8个内控基因(housekeeping genes)[包括lepA、 dnaK、ileS、leuS、parB、recA、recG以及pyrG]的引物对来进行PCR，用来 扩增出所述乳杆菌分离株的所述内控基因片段。
表3.用于扩增细菌内控基因的引物对
Figure BDA0002988561590000191
Figure BDA0002988561590000201
完成PCR之后，委托基龙米克斯生物科技有限公司来进行测序分析，而 得到所述乳杆菌分离株的多个内控基因序列片段。接着，使用DNASTAR SeqMan Pro软件第15版(DNASTAR)来进行序列片段的组合(assembly)，并继 而使用分子演化遗传学分析软件第7.0版(molecular evolutionary genetics analysis software version 7.0,MEGA 7.0)(Pennsylvania State University,USA) 来进行差异性比对分析。之后，依据不同的内控基因的遗传变异来进行基因 分型，而所得到的结果统整于下面的表4中。从表4可见，通过MLST分析， 该6株鼠李糖乳杆菌分离株被进一步鉴别出6种不同的基因型。
表4.通过MLST分析所鉴别出的基因型
Figure BDA0002988561590000202
注：每一行中不同的字母或符号代表通过对应的内控基因而被鉴别为不同的基因型。
申请人将上面第C至D项的基因分型结果合并呈现于下面表5中。由表5 可见，结合这两种基因分型方法，所述乳杆菌分离株被鉴别为具有不同基因 型的6种菌株。
表5.结合RAPD分析以及MLST分析所鉴别出的基因型
鼠李糖乳杆菌分离株 RAPD分析 MLST分析 综合
LRH05 I i 1
LRH69 II ii 2
LRH09 III iii 3
LRH10 IV iv 4
BCRC 10940 I v 5
LGG III vi 6
注：每一行中不同的字母或符号代表通过对应的方法而被鉴别为不同的基因型。
据此，综合以上各项的特征鉴定结果，申请人认为：最具开发潜力的鼠 李糖乳杆菌LRH05是一新颖的鼠李糖乳杆菌分离株，它已于公元2020年8月 19日以保藏编号BCRC911013被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所 (Food Industry Research andDevelopment Institute,FIRDI)的生物资源保存及 研究中心(Bioresource Collectionand Research Center,BCRC)(300新竹市食品 路331号，中国台湾)，亦于公元2020年8月10日以保藏编号DSM 33616被保藏 于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。接着，在下面的实验中，鼠李糖乳杆菌LRH05 (DSM 33616)被进一步拿来进行相关的活性评估。
实施例3.本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在改善饮食-诱发 的代谢症候群(diet-induced metabolic syndrome)上的效用评估
在本实施例中，使用高脂肪饲料(high-fat diet,HFD)来诱发小鼠产生代谢 症候群，用来评估鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)的治疗效用。另外，在 上面实施例1中所测得的亦具有良好的活体外抑制脂肪生成活性的罗伊氏乳 杆菌LR47被拿来进行比较。
实验材料：
1.乳杆菌菌液的制备：
将上面实施例1中所得到的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)以及罗伊 氏乳杆菌LR47分别接种至MRS肉汤培养基中，并于37℃下进行培养历时16 小时。之后，将各个培养物分别在4℃下以3,000rpm进行离心历时10分钟， 接着倒除上清液，而沉淀物(pellets)以适量的PBS予以洗涤，然后以适量的PBS予以散浮，而分别得到浓度为109CFU/mL(以平板计数培养基来进行菌 数计数)的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)菌液以及罗伊氏乳杆菌LR47菌 液。
实验方法：
A、代谢症候群的诱发以及乳杆菌菌株的管喂(oral gavage)：
首先，将小鼠随机地分为1个正常对照组、1个病理对照组、1个LRH05 组以及1个LR47组，每组共8只小鼠，其中，正常对照组的小鼠被任意采食地 (ad libitum)喂食以低脂肪饲料(Reasearch Diet,Inc.,D12450B)(其含有10kcal％ 的脂肪)以及0.85％的生理盐水(saline)，病理对照组、LRH05组以及LR47组的 小鼠则被任意采食地喂食以高脂肪饲料(Reasearch Diet,Inc.,D12492)(其含 有60kcal％的脂肪)以及0.85％的生理盐水(saline)，总共历时10周。
在开始喂食HFD之后的第1天，分别对LRH05组以及LR47组的小鼠管喂 以0.2mL的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)菌液以及0.2mL的罗伊氏乳杆 菌LR47菌液。至于正常对照组以及病理对照组的小鼠则被管喂以等体积的 0.85％盐水溶液。各组的小鼠每天被管喂一次，总共历时10周。
B、体重的测定：
在开始喂食HFD之前以及在开始喂食HFD之后的每周结束之时，纪录各 组小鼠的体重，直到第10周结束之时，计算各组小鼠的平均体重增加量。之 后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分 析所得到的实验数据。
C、血糖的测定与口服葡萄糖耐受性的评估：
首先，在开始喂食HFD之后的第10周结束之时，令各组小鼠经历至少12 小时的隔夜禁食(overnight fasting)，以玻璃毛细管来对各组小鼠的眼窝静脉 进行采血，并在4℃下以3,000rpm予以离心历时10分钟，继而收取各组小鼠 的血清样品。
接着，对各组小鼠口服投予葡萄糖溶液(Roquette,Cat.No.S8458)(剂量 为2g/kg)，并在投予葡萄糖溶液之后的第15、30、60以及120分钟再次进行 采血，并收集其血清样品。所得到的血清样品通过使用罗氏胜血糖机(Roche
Figure BDA0002988561590000231
Performa bloodglucose meter)来进行血清葡萄糖(blood glucose) 含量的测定。接着，将在该5个时间点所分别测得的血清葡萄糖含量(mg/dL) 相对于时间来作图，而绘制出血糖浓度-时间曲线(blood glucose concentration-time curve)。位于该曲线下的面积(area under thecurve,AUC)通 过使用梯形法则(trapezoidal rule)而被计算出来。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方 法来分析所得到的实验数据。
D、血脂的测定：
对在上面第C项中所得到的各组小鼠的血清样品进一步使用Roche全自 动模组化生化免疫分析仪(Roche,
Figure BDA0002988561590000232
modular analyzer)来进行TG以及总 胆固醇(totalcholesterol,TC)的含量测定。之后，依照上面“一般实验方法”的 第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
E、体脂肪的测定：
首先，以异氟醚(isoflurane)来麻醉并采血处死各组的小鼠，接着取出各 组小鼠的白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)[包括位于附睪周边 (epididymal)、腹膜后(retroperitoneal)以及腹股沟(inguinal)的脂肪组织]并测定 其重量。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述 的方法来分析所得到的实验数据。
F、肝脏脂肪(liver fat)的测定：
对在上面第E项当中所处死的各组小鼠取出大约0.2g的肝脏组织，并在 室温下以10％甲醛水溶液予以固定，继而对经固定的肝脏组织样品以石蜡 (paraffin)予以包埋(embedding)，然后进行切片处理。之后，通过使用苏木精 -伊红(hematoxylin-eosin)并且依据本领域技术人员所详知且惯用的技术来对 肝脏组织切片进行染色，继而使用Motic数位玻片扫描器(Motic Easy Scan Pro Digital Slide Scanner)(Motic)并在400倍的放大倍率下进行拍照。
另外，申请人进一步取0.2g的经固定的肝脏组织样品，并通过使用三酸 甘油酯比色分析试剂盒(同上述)来进行肝脏TG含量的测定。之后，依照上面 “一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实 验数据。
结果：
A、体重的测定：
图3显示在喂食HFD的10周期间各组小鼠的体重随着时间的变化，而图4 显示各组小鼠在第10周结束之时的平均体重增加量。由图3与图4可见，正常 对照组小鼠的体重呈现缓慢的增加，而病理对照组小鼠的体重则呈现快速的 上升，并且病理对照组小鼠的平均体重增加量显著高于正常对照组小鼠所具 者，这表示HFD已诱发小鼠产生肥胖。
而与病理对照组相比较，LRH05组小鼠的体重呈现缓慢的上升，并且平 均体重增加量有显著的降低。至于LR47组小鼠的体重则快速地增加，并且增 加的趋势与增加量几乎与病理对照组所具者没有明显差异。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有 效地减缓肥胖，而亦具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊氏乳杆菌LR47则无 此效用。
B、血糖的测定与口服葡萄糖耐受性的评估：
图5显示各组小鼠在喂食HFD 10周后所测得的血糖浓度。由图5可见，相 较于正常对照组，病理对照组小鼠的血糖浓度有增加的趋势，这表示HFD已 影响小鼠的血糖代谢。而相较于病理对照组，LRH05组小鼠的血糖浓度则有 下降的趋势，至于LR47组所具者则无明显的差异。
图6显示正常对照组、病理对照组小鼠以及LRH05组小鼠在喂食HFD 10 周后通过口服葡萄糖耐受性试验所得到的血糖浓度-时间曲线。由图6可见， 在口服葡萄糖溶液之后的第0分钟至第15分钟内，各组小鼠的血糖浓度皆快 速上升至约400mg/dl，而在第15分钟之后，正常对照组小鼠的血糖浓度开始 缓慢下降，而病理对照组小鼠的血糖浓度仍持续上升，并在第30分钟之后才 开始下降，这表示HFD已影响小鼠的葡萄糖耐受性。相对地，LRH05组小鼠 的血糖浓度-时间曲线则与正常对照组类似，在第30分钟时的血糖浓度已显 著地低于病理对照组所具者，甚至略低于正常对照组所具者。
图7显示正常对照组、病理对照组小鼠以及LRH05组小鼠在喂食HFD 10 周后通过口服葡萄糖耐受性试验所得到的血糖浓度-时间曲线的AUC。由图7 可见，与正常对照组相较之下，病理对照组的小鼠的AUC显著的升高，这表 示HFD已诱发小鼠产生第2型糖尿病(type 2diabetes mellitus)，而具有葡萄糖 耐受性不良(impaired glucose tolerance)的情形。而与病理对照组相较之下， LRH05组小鼠的AUC则有显著地降低。
这个实验结果显示：本发明鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有效 地降低血糖并且减缓葡萄糖耐受性不良，因而被预期能够改善第2型糖尿病。
C、血脂的测定：
图8与图9分别显示各组小鼠在喂食HFD 10周后所测得的血清中的TG含 量与TC含量。
由图8与图9可见，相较于正常对照组，病理对照组小鼠的血清中TG含 量有增加的趋势，并且血清中TC含量呈现出明显的上升，这表示HFD已影响 小鼠的血脂代谢。而相较于病理对照组，LRH05组小鼠的血清中的TG含量 与TC含量则有显著的下降，并且下降幅度明显高于LR47组所具者。特别地， LR47组的TC含量甚至略高于病理对照组所具者。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05具有降低血脂(特别 是三酸甘油酯以及总胆固醇)的效用，因而被预期能够治疗血脂异常，而亦 具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊氏乳杆菌LR47则无法展现相同的效用。
D、体脂肪的测定：
图10、图11与图12分别显示各组小鼠在喂食HFD 10周后所测得的附睪周 边、腹膜后以及腹股沟的脂肪组织重量。从图10、图11与图12可见，病理对 照组小鼠的体脂肪重量显著地高于正常对照组所具者，这表示HFD已诱导小 鼠的体脂肪累积。而相较于病理对照组，LRH05组小鼠的体脂肪重量有显 著地降低，LR47组小鼠的体脂肪重量则无明显差异。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有 效地减少体脂肪累积，而亦具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊氏乳杆菌 LR47则无此效用。
E、肝脏脂肪的测定：
图13显示在喂食HFD 10周后各组小鼠的肝脏组织通过苏木精与伊红染 色而被观察到的结果。从图13可见，相较于正常对照组，病理对照组的肝脏 组织有明显的脂肪累积的情形，这表示HFD已诱导小鼠的肝脏脂肪累积。 LR47组亦可观察到类似的肝脏脂肪累积。相对地，LRH05组的肝脏组织几乎 没有脂肪累积，而相似于正常对照组所观察到的情形。
图14显示各组小鼠在喂食HFD 10周后所测得的肝脏TG含量。从图14可 见，相较于正常对照组，病理对照组的肝脏TG含量有显著的上升，这表示 HFD已诱导小鼠的肝脏脂肪累积。而相较于病理对照组，LR47组没有明显的 差异，LRH05组小鼠的肝脏TG含量则有显著的下降，并且与正常对照组所 具者之间没有明显的差异存在。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有 效地减少肝脏脂肪累积并且改善肝脏脂肪变性(hepatic steatosis)，因而被预期 能够治疗脂肪肝，而亦具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊氏乳杆菌LR47 则无此效用。
实施例4.鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在抗糖尿病上的效用评估
基于本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在实施例3的第B项当 中展现出的降低血糖与减缓葡萄糖耐受性不良的效用以及改善第2型糖尿病 的潜力，申请人进一步将在上面实施例1中所得到的鼠李糖乳杆菌LRH05 (DSM 33616)的胞内提取物拿来进行活体外α-淀粉酶抑制活性(in vitro α-amylase inhibitory activity)的测定，用来评估本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05 (DSM 33616)在抗糖尿病上的效用。另外，现有的鼠李糖乳杆菌LGG以及口 服降血糖药物阿卡波糖(acarbose)被拿来进行比较。
实验方法：
关于活体外α-淀粉酶抑制活性的测定大体上参考M.N.Wickramaratne et al.(2016),BMC Complement.Altern.Med.,16(1):466当中所述的方法来进行， 并略做修改。首先，将12g的酒石酸钾钠(sodium potassium tartrate tetrahydrate) 溶于8mL的2M氢氧化钠水溶液中，继而添加20mL的96mM 3,5-二硝基水杨 酸水溶液以及12mL的ddH2O，借此而制得DNSA显色试剂。
另外，取50μL的鼠李糖乳杆菌LRH05的胞内提取物作为实验组的试验 样品，并将之与50μL的α-淀粉酶溶液(5U/mL)(购自于Sigma-Aldirch)在试管 内混合均匀以后，置于30℃下反应历时10分钟。接着，添加50μL的1％淀粉 溶液(配于PBS中)并置于30℃下进行反应历时3分钟。之后，添加50μL的 DNSA显色试剂并置于90℃水浴中进行反应历时10分钟。最后，令所得到的 反应混合物冷却至室温，继而添加1mL ddH2O予以稀释，然后使用分光光度计(TECAN，型号SUNRISE)并在540nm波长下测定该反应混合物的吸光值 (OD540)。
此外，依据上面实施例1的第C项当中所述的方法来制备LGG的胞内提取 物以作为比较实验组的试验样品，而阿卡波糖(浓度为30mg/mL，配于ddH2O 中)以及0.85％(w/v)食盐水分别作为正对照组以及对照组的试验样品，继而 进行相同的活体外α-淀粉酶抑制活性的测定。
α-淀粉酶抑制活性(％)是通过将所测得的吸光值(OD540)代入下列公式(I) 而被计算出的：
公式(I)：A＝[(B-C)/B]×100
其中：A＝α-淀粉酶抑制活性(％)
B＝对照组所测得的OD540
C＝正对照组、比较实验组或实验组所测得的OD540
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方 法来分析所得到的实验数据。
结果：
图15显示各组所测得的α-淀粉酶抑制活性。由图15可见，实验组的本发 明鼠李糖乳杆菌LRH05的胞内提取物具有优异的α-淀粉酶抑制活性，并且显 著地高于现有的鼠李糖乳杆菌LGG所具者。
综合上面实施例3的第B项的实验结果，本发明鼠李糖乳杆菌LRH05 (DSM 33616)被预期能够用于治疗糖尿病。
实施例5.鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在改善肠道微生物相(gutmicrobiota)组成上的效用评估
参考T.Torii et al.(2010),Ann.Clin.Biochem.,47(Pt 5):447-452，其中提及：人体肠道微生物所产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids)与大肠健康 以及代谢能力息息相关。人类粪便中的短链脂肪酸组成主要包括乙酸、丙酸 与丁酸，并且此三者呈60：24：16的比例；而大肠疾病病患经常被观察到具 有短链脂肪酸组成异常，特别是丁酸含量的减少以及乳酸含量的增加。
基于本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在实施例3中展现出的 改善代谢的效用，申请人将在实施例3的各组小鼠在处死前所收集到的粪便 样本拿来进行肠道微生物相(gut microbiota)分析以及粪便短链脂肪酸组成分 析，用来评估本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)在改善肠道微生物 相组成上的效用。
实验方法：
A、肠道微生物相分析：
关于肠道微生物相分析大体上参考X.P.Li et al.(2020),J.Funct.Foods, 73:104103来进行。首先，对各组各取6只小鼠的粪便样本，并使用QIAamp 粪便DNA微量提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini kit)(QIAGEN,Cat No. 51604)来提取肠道微生物群DNA，继而以所得到的肠道微生物群DNA作为模 板，并使用一组针对细菌的16S rDNA基因而设计的具有下面所示的核苷酸 序列的引物对前向引物F与反向引物R来进行聚合酶链式反应，用来扩增出肠 道微生物群的16S rDNA片段。
前向引物F
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNG GCWGCAG-3’(序列辨识编号：24)
反向引物R
5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVG GGTATCTAATCC-3’(序列辨识编号：25)
完成PCR之后，使用Illumina MiSeq系列测序系统(Illumina HiSeq sequencingsystem)(Illumina,Inc.,USA)来进行测序分析，而得到各组小鼠肠 道微生物群的部分16SrDNA序列。
接着，使用QIIME微生物体生物信息平台软件第1.9.1版(QIIME microbiomebioinformatics platform,version 1.9.1)(QIIME)以及USEARCH序 列分析软件第v7.0.1090版(USEARCH)来进行16S rDNA序列分析以及操作分 类单元(operationaltaxonomic unit,OTU)的分类。之后，使用核糖体资料库计 画(RDP)分类软件[RibosomalDatabase Project(RDP)Classifier](Michigan State University,USA)以及PyNAST序列比对工具第1.2版(Python Nearest Alignment Space Termination,PyNAST)并参考GreenGenes资料库(version gg_13_8)、Silva资料库(version 132)或NCBI网站中的基因资料库来进行16S rDNA序列比对，而得到小鼠肠道微生物群群体的物种分类注释。
之后，通过QIIME微生物体生物信息平台软件来分析物种丰富度(speciesrichness)指标Chao1与ACE(abundance-based coverage estimator)，继而绘制出 各组小鼠肠道微生物群群体内物种丰富度[亦即，α-多样性(α-diversity)]的组 间差异。
B、粪便短链脂肪酸组成分析：
有关各组小鼠的粪便样本中的短链脂肪酸组成分析大体上参考T.Torii et al.(2010)(同上述)当中所述的方法来进行。简言之，首先，取约70mg粪便 样本并混合以700μL的70％(v/v)乙醇水溶液。接着，加入直径0.1mm的研磨 珠并予以振荡研磨历时10分钟，之后，在4℃下以12,000rpm的转速予以离心 历时10分钟，接着收集上清液作为分析样品来进行后续衍生化反应 (derivitation)。
将0.3mL的分析样品与0.05mL的作为内部标准品(internal standard)的2- 乙基丁酸(2-ethlbutyric acid)(Sigma-Aldrich，货号109959)、0.3mL的3％吡啶 溶液(pyridine)(Sigma-Aldrich，货号270970)、0.3mL的250mmol/L 1-乙基 -3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride,EDC-HCl](Sigma-Aldrich，货号03449)以及0.3mL 的20mmol/L 2-硝基苯肼盐酸盐(2-nitrophenylhydrazine hydrochloride, NPH-HCl)(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.，货号N0231)进行混合，并置于 60℃下予以反应历时20分钟，之后加入0.2mL的反应终止液[其通过将15％ (w/v)氢氧化钾水溶液与甲醇以80：20(v/v)的比例混合而被制得]来终止反应。
待反应物冷却至室温后，加入3mL的0.5mol/L磷酸水溶液以及4mL的乙 醚，并摇晃历时3分钟进行提取。之后，收集乙醚层，并添加4mL的ddH2O， 摇晃历时3分钟进行提取。接着，在4℃下以3,000rpm的转速予以离心历时10 分钟而使混合物分层，收取乙醚层，并通以氮气来去除乙醚。由此所得到的 脂肪酸酰肼(fatty acid hydradize)继而被溶于适量的甲醇中作为待测样品，以 进行下面的高效能液相层析(high performance liquidchromatography,HPLC) 分析。
待测样品中所含有的短链脂肪酸浓度通过使用一个配备有一个 HITACHI L-7420UV检测器(HITACHI L-7420UV-VIS detector)的HPLC仪器 (HITACHI L-7300)来进行测定，其中所使用的管柱以及操作条件如下：分析 管柱为MN
Figure BDA0002988561590000301
C18 HTec管柱，温度设定为40℃；流动相：甲醇 /ddH2O[16：84(v/v)]；流速被控制为1.0mL/分钟；样品注射体积为20μL； 检测波长为UV-400nm。
此外，为供比对，分别使用不同浓度的乙酸(acetic acid)、丙酸(propionicaicd)以及丁酸(butyric acid)(Sigma-Aldrich)来分别作为对照标准品(controlstandard)并进行相同的衍生化反应以及HPLC分析。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方 法来分析所得到的实验数据。
结果：
A、肠道微生物相分析：
图16与图17分别显示在喂食HFD 10周后各组小鼠通过肠道微生物相分 析所得到的α-多样性指标ACE以及Chao1。由图16与图17可见，相较于正常 对照组，病理对照组的ACE以及Chao1有显著的降低，这表示HFD降低了肠 道微生物相的多样性。相较于病理对照组，LRH05组的ACE以及Chao1则有 明显的提升。至于LR47组的ACE以及Chao1则与病理对所具者没有明显的差 异。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有 效地改善肠道微生物相，而亦具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊氏乳杆菌 LR47则无此效用。
B、粪便短链脂肪酸组成分析：
图18、图19以及图20分别显示在喂食HFD 10周后各组小鼠所测得的粪便 中的乙酸、丙酸以及丁酸含量。由图18至20可见，相较于正常对照组，病理 对照组小鼠粪便中的乙酸含量有下降的趋势，丙酸与丁酸含量则显著地下降， 这表示HFD抑制了肠道微生物的代谢能力。相较于病理对照组，LRH05组小 鼠粪便中的乙酸、丙酸以及丁酸的含量皆有明显的回升，并且与正常对照组 所具者没有明显差异。至于LR47组小鼠的乙酸、丙酸以及丁酸的含量则与病 理对照组所具者没有明显差异。
这个实验结果显示：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)能够有 效地提升肠道微生物的代谢能力，而亦具有活体外脂肪生成抑制活性的罗伊 氏乳杆菌LR47则无此效用。
综合上面的实验结果，申请人认为：本发明的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)可用于治疗代谢症候群关联性疾病(metabolic syndrome-associated diseases)，特别是肥胖(obesity)、血脂异常(dyslipidemia)、糖尿病(diabetes mellitus)以及脂肪肝(fattyliver disease)。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参 考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的 范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随 文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：DSM 33616
分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH05
保藏日期：2020年8月10日
保藏单位：德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克
序列表
<110> 生合生物科技股份有限公司
<120> 鼠李糖乳杆菌LRH05分离株及其用途
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌16S rDNA的前向引物27F'
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌16S rDNA的反向引物1492R'
<400> 2
ggttaccttg ttacgact 18
<210> 3
<211> 1188
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌LRH05
<400> 3
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 60
gtcaccggca gtcttactag agtgcccaac taaatgctgg caactagtca taagggttgc 120
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 180
ctgtcatttt gcccccgaag gggaaacctg atctctcagg tgatcaaaag atgtcaagac 240
ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 300
cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga atgcttaatg 360
cgttagctgc ggcactgaag ggcggaaacc ctccaacacc tagcattcat cgtttacggc 420
atggactacc agggtatcta atcctgttcg ctacccatgc tttcgagcct cagcgtcagt 480
tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 540
ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 600
cctcggttaa gccgagggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 660
cccaataaat ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 720
agccgtggct ttctggttgg ataccgtcac gccgacaaca gttactctgc cgaccattct 780
tctccaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 840
cagacttgcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 900
gtctcagtcc caatgtggcc gatcaacctc tcagttcggc tacgtatcat tgccttggtg 960
agccgttacc tcaccaacta gctaatacgc cgcgggtcca tccaaaagcg atagcttacg 1020
ccatctttca gccaagaacc atgcggttct tggatttatg cggtattagc atctgtttcc 1080
aaatgttatc ccccacttaa gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccactcg 1140
ttcaaaatta aatcaagatg caagcacctt tcaataatca gaactcgt 1188
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于RAPD的随机引物RAPD-A
<400> 4
aacgcgcaac 10
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于RAPD的随机引物RAPD-B
<400> 5
gcggaaatag 10
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于RAPD的随机引物RAPD-C
<400> 6
ctcaggtcgc 10
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于RAPD的随机引物RAPD-1
<400> 7
ccgcagccaa 10
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌lepA基因的前向引物rhlepAF'
<400> 8
tagtgcccag cctgatgttg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌lepA基因的反向引物rhlepAR'
<400> 9
gccgcggaat ggtagttttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌dnaK基因的前向引物dK21F'
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2)
<223> w代表a或t/u
<220>
<221> misc_特征
<222> (5)..(5)
<223> w代表a或t/u
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(15)
<223> y代表t/u或c
<400> 10
cwgcwgttgc ggttytggaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌dnaK基因的反向引物dK21R'
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(12)
<223> y代表t/u或c
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(15)
<223> y代表t/u或c
<220>
<221> misc_特征
<222> (18)..(18)
<223> r代表g或a
<400> 11
aagcgaccaa gygtyttrtc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌ileS基因的前向引物rhileS_F
<400> 12
cgattgtgcc gtcaaccatt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌ileS基因的反向引物rhileS_R
<400> 13
taaactgtta ccgctgcctc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌leuS基因的前向引物rhLeuS_F
<400> 14
ataagttgcg tgactgggtc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌leuS基因的反向引物rhLeuS_R
<400> 15
cgaccgtcat taatggtggt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌parB基因的前向引物rhParB_F
<400> 16
gttggatgaa gcacaggcat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌parB基因的反向引物rhParB_R
<400> 17
gaagcgctca cctaactgat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌recA基因的前向引物rhRecA_F
<400> 18
gcagcttata ttgacgcgga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌recA基因的反向引物rhRecA_R
<400> 19
ccatagttgt accatgagcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌recG基因的前向引物rhRecG_F
<400> 20
caggtaggac aggtttatcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌recG基因的反向引物rhRecG_R
<400> 21
accggatcgg ccactttaaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌pyrG基因的前向引物rhPyrG_F
<400> 22
gtacagcaat gtcacaaccg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌pyrG基因的反向引物rhPyrG_R
<400> 23
ccagtagtaa ccagcatgct 20
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌16S rDNA的前向引物F
<220>
<221> misc_特征
<222> (42)..(42)
<223> n代表a或g或c或t/u
<220>
<221> misc_特征
<222> (46)..(46)
<223> w代表a或t/u
<400> 24
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 25
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增细菌16S rDNA的反向引物R
<220>
<221> misc_特征
<222> (41)..(41)
<223> h是a或c或t/u
<220>
<221> misc_特征
<222> (42)..(42)
<223> v是a或g或c
<400> 25
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (8)

1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH05，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌LRH05以保藏编号DSM 33616被保藏于德国微生物保藏中心。
2.一种根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)供应用于制备用来治疗代谢症候群关联性疾病的组合物的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述代谢症候群关联性疾病选自于由下列所构成的群组：肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病、脂肪肝，以及它们的组合。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述代谢症候群关联性疾病是第2型糖尿病。
5.一种根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LRH05(DSM 33616)供应用于制备用来改善肠道微生物相的组合物的用途。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物是食品组合物。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物是药学组合物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药学组合物呈供口服给药的剂型。
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