KR20230074739A - 락토바실러스 람노서스 lrh05 분리주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 람노서스 lrh05 분리주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230074739A
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lrh05
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lactobacillus rhamnosus
isolated strain
metabolic syndrome
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KR1020237011012A
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영-쑹 첸
진-성 린
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신바이오 테크 인코포레이티드
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Abstract

독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LRH05의 분리 균주가 본원에 개시된다. 또한, 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 대사증후군 관련 질환 치료용 및 장내 세균 변화용 조성물과 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 대사증후군 관련 질환의 치료 및 장내 세균 변화를 위한 용도가 본원에 개시된다.

Description

락토바실러스 람노서스 LRH05 분리주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
본 발명은 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LRH05의 분리 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 조성물, 및 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 대사증후군 관련 질환을 치료하고 장내 세균을 변화시키기 위한 용도에 관한 것이다.
대사증후군은 심혈관 질환 및 제2형 당뇨병 발병의 위험 증가와 연관된 복합적인 질환이다. 대사증후군의 증상, 특징 및 합병증은 제2형 당뇨병(T2DM), 인슐린 저항성, 고혈압, 중심성 비만, 고콜레스테롤, 결합성 고지혈증(증가된 저밀도 지단백(LDL), 감소된 고밀도 지단백(HDL) 및 증가된 중성지방을 포함) 및 지방간(특히, 비만과 동시에 유발된 지방간) 중 적어도 세 가지를 포함한다.
대사증후군을 퇴치하기 위해 식이조절 및 영양 관리, 항비만제, 저혈당제 및 고지혈증제의 사용과 같은 여러 예방 및 치료 전략이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 약물들은 원하는 치료 효과를 달성하지 못할 수 있으며, 심각한 부작용을 초래할 수도 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장내 상주하는 정상 세균총이며, 장내 미생물총(microflora)의 균형을 유지하여 적절한 장내 면역 및 소화 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이러한 유익한 미생물은 살아있는 미생물 식이 보충제로 널리 사용되며, 장내 미생물총 균형을 회복하는데 도움이 될 수 있다. 젖산균(lactic acid bacteria: LAB)의 많은 종은 GRAS(generally recognized as safe: 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질) 등급을 부여받았으며, 프로바이오틱스로 널리 사용되고 있다. 보통 LAB로는 락토바실러스속(Lactobacillus spp.), 락토코쿠스속(Lactococcus spp.), 페디오코쿠스속(Pediococcus spp.), 스트렙토코쿠스속(Streptococcus spp.), 엔테로코쿠스속(Enterococcus spp.), 비피도박테리움속(Bifidobacterium spp.), 바실러스속(Bacillus spp.), 류코노스톡속(Leuconostoc spp.) 등을 포함한다. LAB는 위장관에서 병원성 박테리아의 성장을 억제하고 유당 불내증(lactose intolerance, 유당 분해효소 결핍증)을 완화시킬 수 있으며, 항암, 항균, 항피로 및 혈압 강하 효과가 있는 것으로 나타났다.
이전 연구에서는 LAB의 특정 균주가 체중 감량, 포도당 및 지방 대사 촉진, 및 인슐린 저항성 개선에 효과적임을 입증한 바 있다. 예를 들어, K. Mazloom 등의 논문[Nutrients, 11(2):258 (2019)]에서는 고지방식이를 먹인 마우스에서 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)가 효과적으로 체중 증가를 줄이고 지방 축적을 감소시키며, 인슐린 민감성을 개선시킬 수 있음을 보여주었다.
상기에도 불구하고, 대사증후군 관련 질환을 치료하는데 만족스러운 효능을 나타낼 수 있는 LAB의 새로운 종 및/또는 균주를 스크리닝할 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있는 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주는 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁되었다.
제 2 양태에서, 본 발명은 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있고, 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 대사증후군 관련 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있고, 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사증후군 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
제 4 양태에서, 본 발명은 대상체의 대사증후군 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도를 제공한다. 이러한 용도는 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다.
제 5 양태에서, 본 발명은 대상체의 대사증후군 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공한다. 이러한 균주는 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다.
제 6 양태에서, 본 발명은 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있고, 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 장내 세균변화용 조성물을 제공한다.
제 7 양태에서, 본 발명은 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있고, 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 장내 세균(gut microbiota)을 변화시키는 방법을 제공한다.
제 8 양태에서, 본 발명은 대상체의 장내 세균 변화용 조성물의 제조에 있어서 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도를 제공한다. 이러한 용도는 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다.
제 9 양태에서, 본 발명은 대상체의 장내 세균을 변화시키는데 사용하기 위한 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공한다. 이러한 균주는 종래 기술의 문제점 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 본원에 첨부된 도면을 참고하여 하기 구현예의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.
도 1은 하기 실시예 1의 각 군에서의 중성지방(triglycerides; TG) 함량을 나타내는 것이며, "*" 기호는 p< 0.05(실험군 5 대비), "**" 기호는 p< 0.01(실험군 5 대비) 및 "****" 기호는 p< 0.0001(양성 대조군 대비)을 나타낸다.
도 2는 하기 실시예 3의 각 군에서의 체중을 나타낸 것이다.
도 3은 하기 실시예 3의 각 군에서의 체중 증가량을 나타내는 것이며, "***" 기호는 p< 0.001(병리학적 대조군 대비)을 나타낸다.
도 4는 하기 실시예 3의 각 군에서의 혈당량을 나타낸 것이다.
도 5는 하기 실시예 3의 각 군에서의 혈청 내 TG 함량을 나타내는 것이며, "**" 및 "****" 기호는 각각 p< 0.01 및 p< 0.0001(병리학적 대조군 대비)을 나타낸다.
도 6은 하기 실시예 3의 각 군의 혈청 내 총 콜레스테롤(TC) 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 하기 실시예 3의 각 군에서의 부고환(epididymal) 백색 지방 조직(white adipose tissue: WAT)의 중량을 나타낸 것이며, "*" 및 "****" 기호는 각각 p< 0.05 및 p< 0.0001(병리학적 대조군 대비)을 나타낸다.
도 8은 하기 실시예 3의 각 군에서의 후복막(retroperitoneal) WAT의 중량을 나타낸 것이며, "****" 기호는 p< 0.0001(병리학적 대조군 대비)을 나타낸다.
도 9는 하기 실시예 3의 각 군에서의 서혜부(inguinal) WAT의 중량을 나타낸 것이며, "*" 및 "****" 기호는 각각 p< 0.05 및 p< 0.0001(병리학적 대조군 대비)을 나타낸다.
도 10은 하기 실시예 3의 각 군의 조직학적 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 하기 실시예 3의 각 군의 간 조직에서의 TG 함량을 나타낸 것이며, "#" 기호는 p< 0.05(정상 대조군 대비)를 나타내고, "*" 기호는 p< 0.05(병리학적 대조군 대비)를 나타낸다.
도 12는 하기 실시예 4의 각 군의 α-아밀레이스 억제율을 나타낸 것이며, "***" 기호는 p< 0.001(비교군 대비)을 나타낸다.
도 13은 하기 실시예 5의 각 군의 ACE (abundance-based coverage estimator)를 나타낸 것이다.
도 14는 하기 실시예 5의 각 군의 Chao1을 나타낸 것이다.
도 15는 하기 실시예 5의 각 군에서의 아세트산 함량을 나타낸 것이다.
도 16은 하기 실시예 5의 각 군에서의 프로피온산 함량을 나타낸 것이며, "****" 기호는 p< 0.0001(정상 대조군 대비)을 나타낸 것이다.
도 17은 하기 실시예 5의 각 군에서의 부티르산 함량을 나타낸 것이며, "****" 기호는 p< 0.0001(정상 대조군 대비)을 나타낸다.
본원에 임의의 선행기술 간행물이 언급되는 경우, 이러한 참조는 상기 간행물이 대만 또는 기타 다른 국가에서 해당 기술 분야의 보통의 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것으로 인정하는 것은 아님을 이해해야 한다.
본 명세서의 목적을 위해, 단어 "포함하고 있는(comprising)"은 "포함하지만 이에 한정되지 않는"을 의미하며, 단어 "포함하는(comprises)"은 이에 상응하는 의미를 갖는다는 것을 명확하게 이해해야 할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 통상의 기술자는 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 재료를 인식할 수 있을 것이고, 이들은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명은 기술된 방법 및 재료에 결코 한정되지 않는다.
본 출원인은 연구 결과, 놀랍게도, 락토바실러스 람노서스 LRH05의 신규 균주가 장 상피세포에 의한 지방 흡수를 억제하고, 대사증후군이 있는 대상체에서의 체중, 혈중 지질 및 체지방을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 락토바실러스 람노서스 LRH05의 항당뇨 활성은 락토바실러스 람노서스 GG(LGG) 보다 현저히 높았다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공하며, 상기 분리 균주는 대만 식품산업연구개발원(FIRDI) 산하 BCRC(Biosource Collection and Research Center)에 2020년 7월 31일부터 수탁번호 BCRC 911013으로 기탁되었으며, 부다페스트 조약에 따라 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2020년 8월 10일부터 수탁번호 DSM 33616으로 기탁되었다.
본 발명에 따라 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주는 살아있는 세포 또는 죽은세포, 농축 또는 비농축, 액체, 페이스트, 반고체, 고체(예: 펠렛, 과립 또는 분말)일 수 있으며, 열-불활성화, 동결, 건조 또는 동결건조(예: 동결건조 형태 또는 분무/유동층 건조 형태)일 수 있다. 예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주는 액체 형태이다.
본 발명은 또한 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 대사증후군 관련 질환 치료용 조성물을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 식품으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 식용 재료에 직접적으로 첨가될 수 있으며, 식용 재료에 후속적으로 첨가되기에 적합한 중간 조성물(예: 프리믹스)을 제조하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "식품"은 대상체에 의해 체내로 섭취할 수 있는 임의의 물품 또는 물질을 의미한다. 상기 식품의 예로는, 유가공품(예: 우유 및 농축 우유), 발효유(예: 요거트, 사워밀크(sour milk) 및 냉동 요거트), 분유, 아이스크림, 크림 치즈, 건조 치즈, 두유, 발효 두유, 야채 과일 주스, 과일 주스, 스포츠 음료, 과자, 젤리, 사탕, 건강 식품, 동물 사료 및 건강 보조 식품을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 경구 투여에 적합한 제형으로 제조될 수 있다. 상기 경구 투여 제형의 예로는, 멸균 분말, 정제, 트로키(troches), 치료용 사탕(lozenges), 펠렛, 캡슐, 분산성 분말, 과립, 용액, 현탁액, 에멀젼, 점적제, 시럽, 엘릭서(elixirs), 슬러리(slurry) 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 용매, 완충액, 유화제, 현탁제, 분해제, 붕해제, 분산제, 결합제, 부형제, 안정제, 킬레이트제, 희석제, 겔화제, 방부제, 습윤제, 윤활제, 흡수 지연제, 리포솜 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 통상의 기술자의 전문 지식에 따라 선택되며, 그 양이 결정된다.
본 발명은 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사증후군 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 대사증후군 관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 의약은 경구 투여용 제형이다.
더 나아가, 본 발명은 대상체의 대사증후군 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 질환의 하나 이상의 임상적 징후를 예방, 감소, 완화, 개선, 경감 또는 제어함을 의미하며, 치료 중인 상태 또는 증상의 중증도의 진행을 감소, 중단 또는 역전시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 소정의 활성 성분의 의도된 기능을 수행하기 위해 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 도입, 제공 또는 전달하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간, 원숭이, 소, 양, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐 및 랫트와 같은 임의의 동물을 의미한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명에 따른 대사증후군 관련 질환의 예로는, 비만, 고혈압, 이상지질혈증(예컨대, 고지혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증 및 고지단백혈증), 인슐린 저항성 또는 당뇨병(예컨대, 제2형 당뇨병(T2DM)), 죽상경화증, 심혈관 질환(CVDs)(예컨대, 관상동맥 질환(CAD), 급성 심근경색, 뇌졸중, 심부전, 심부정맥 및 고혈압성 심장 질환) 및 지방간 질환(간 지방증이라고도 알려짐)(예컨대, 급성 지방간, 만성 지방간, 대수포성 지방간, 미세수포성 지방간 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD))을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물의 투여량 및 빈도는 치료될 질병 또는 질환의 중증도, 투여 경로 및 치료될 대상체의 연령, 신체 상태 및 반응과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 단일 용량 또는 다용량으로 투여될 수 있다.
추가적으로, 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주가 장내 세균을 변화시키는 데에 효과적임을 입증하였다. 이와 같이, 본 발명에서 제공되는 조성물은 장내 세균을 변화시키기 위해 사용될 수 있음이 고려된다.
따라서, 본 발명은 추가적으로 상기 기재된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 장내 세균을 변화시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 장내 세균 변화용 조성물은 약학 조성물이다. 상기 약학 조성물의 투여 경로, 투여량 및 약학적으로 허용가능한 담체는 상기 대사증후군 관련 질환 치료용 약학 조성물에 대해 기재한 것과 유사하다. 다른 구현예에 있어서, 상기 장내 세균 변화용 조성물은 상기 기재된 바와 같은 식품이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 대상체의 장내 세균 변화용 조성물의 제조에 있어서 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 기재된 바와 같이 경구 투여용 제형의 약학 조성물이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 기재된 바와 같은 식품이다.
본 발명은, 더 나아가, 대상체의 장내 세균을 변화시키는데 사용하기 위한 상기 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가적으로 설명될 것이다. 그러나, 하기 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 실시에 있어서 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
실시예
일반적 실험 재료:
1. 마우스 배아 섬유아세포 세포주 3T3-L1의 출처 및 배양
마우스 배아 섬유아세포 세포주인 3T3-L1(ATCC® CRL-173TM)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC, 머내서스, 미국 버지니아주)에서 구입하였다. 상기 3T3-L1 세포는 10% 신생 송아지 혈청(newborn calf serum: NCS)(Cat. No. 16010159, Gibco), 1.5 g/L 탄산수소나트륨, 100 U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 0.25 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B(Cat. No. 03-033-1B, Biological Industries)로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Cat. No. D6429, Sigma-Aldrich)을 포함하는 10-cm 페트리 디쉬에서 배양되었다. 상기 3T3-L1 세포는 37℃ 및 5% CO2로 배양 조건이 설정된 인큐베이터에서 배양되었다. 배양 배지 교체는 2~3일 간격으로 실시하였다. 배양된 세포가 약 70% 정도의 밀집도로 형성되었을 때 세포 계대배양을 수행하였다.
2. 실험용 마우스
하기 실험에 사용된 수컷 C57BL/6 마우스(약 22 g 체중의 8주령)는 바이오라스코 대만(BioLasco Taiwan Co., Ltd.)에서 구입하였다. 모든 실험용 마우스는 12시간 명암 주기의 교대, 22℃±2℃에서 유지된 온도 및 40% 내지 60%로 유지된 상대습도의 실험실 조건 하에 동물실에 수용되었다. 또한, 모든 실험용 마우스에게 물과 사료를 임의로 제공하였다. 실험용 마우스를 포함하는 모든 실험 과정는 대만 동물 보호법의 법적 조항을 준수 하였으며, 대만 농업위원회의 동물 보호 위원회의 지침에 따라 수행되었다.
일반적 과정:
1. 통계적 분석
하기에 설명된 모든 실험은 3회 수행되었다. 실험 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, 샌 디에고, 미국)을 사용하여 수행하였다. 모든 데이터는 군 사이 차이를 평가하기 위해 일원 분산 분석(one-way analysis of variance: ANOVA)에 이어 Tukey의 사후 테스트(post hoc test) 또는 Dunnett의 사후 테스트(post hoc test)를 사용하여 분석 하였다. 통계적 유의성은 p< 0.05로 표시된다.
실시예 1. 항지방생성 활성을 갖는 락토바실러스 분리주의 예비적 스크리닝
실험 재료 및 과정:
A. 시험 균주의 출처 및 분리
Difco 락토바실리(Lactobacilli) MRS(De Man, Rogosa 및 Sharpe) 한천을 이용한 스크리닝을 통해 LA25, LA27, LRH09, LRH10, LRH69, LRH05 및 LR47의 7종의 락토바실러스 분리주를 수득하였다. 상기 7종의 락토바실러스 분리주 각각을 MRS 브로쓰(broth)에 접종한 후 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
배양 후, 각각의 결과 배양물에 최종 농도가 20%(v/v)가 되도록 글리세롤 용액을 적당량 첨가하였다. 상기 결과 박테리아 용액은 후속 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다.
B. 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화를 억제할 수 있는 락토바실러스 분리주 스크리닝
본 실시예의 섹션 A에서 준비된 7개의 박테리아 용액 중 0.1 mL를 MRS 브로쓰 10 mL에 접종한 다음, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 접종 및 배양 단계를 2회 반복하였다. 상기 결과 배양물 각각의 0.1 mL를 MRS 브로쓰 10 mL에 접종한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 3,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리후, 생성된 세포 펠렛을 수득하고, 0.85% 염화나트륨 용액에 현탁시켜 1010 CFU/mL의 박테리아 농도를 갖는 박테리아 현탁액을 수득하였다. 각 박테리아 현탁액을 얼음 위에 놓고, XL-2000 Microson 초음파 균질기(Misonix Inc)를 사용하여 균질화하였다. 12,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 무세포(cell-free) 세포내 추출물을 수득하였다.
상기 무세포 세포내 추출물은 Katja Zebisch 등의 논문[Anal. Biochem.,(1):88-90 (2012)]에 기술된 일반적인 방법에 따라 3T3-L1 세포 분화의 분석에 사용되었다. 간략하게, 3T3-L1 세포를 1개의 정상 대조군, 1개의 양성 대조군 및 7개의 실험군(즉, 실험군 1 내지 7)을 포함하는 총 9개의 군으로 나누었다. 3T3-L1 세포의 각 군을 1 mL의 기본 배지(10% NCS 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B가 보충된 DMEM-고농도 글루코스(Cat. No. D6429, Sigma Aldrich))가 포함된 24-웰 배양 플레이트의 각각의 웰에서 1x104 세포/웰의 양으로 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 4일 동안 배양하였다.
이 후, 양성 대조군과 7개의 실험군의 경우, 각 웰의 배지를 1 mL의 분화 배지 I(즉, 1 μg/mL 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 및 0.25 μM 덱사메타손이 보충된 기본 배지)로 교체한 후, 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 3일 동안 배양하였다. 이어서, 각 웰의 배지를 1 mL의 분화 배지 II(즉, 1 μg/mL 인슐린이 보충된 기본 배지)로 교체한 후, 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 3일 동안 배양하여 3T3-L1 세포가 지방세포로 분화하도록 유도하였다.
상기 6일 간의 실험 기간 동안, 표 1과 같이 7개의 실험군의 각 세포 배양물에 각각의 무세포 세포내 추출물(10 μL/일)을 처리하였으며, 양성 대조군의 세포 배양물에는 0.85% 염화나트륨 용액(10 μL/일)을 처리하였다.
또한, 상기 6일 간의 실험 기간 동안, 정상 대조군의 경우, 2일 마다 각 웰의 배지를 1 mL의 새로운 기본 배지로 교체하였고, 정상 대조군의 세포 배양물에는 아무것도 처리하지 않았다.
군 처리제
정상 대조군 -
양성 대조군 0.85% 염화나트륨 용액
실험군 1 락토바실러스 분리주 LA25의
무세포 세포내 추출물
실험군 2 락토바실러스 분리주 LA27의
무세포 세포내 추출물
실험군 3 락토바실러스 분리주 LRH69의
무세포 세포내 추출물
실험군 4 락토바실러스 분리주 LRH10의
무세포 세포내 추출물
실험군 5 락토바실러스 분리주 LRH05의
무세포 세포내 추출물
실험군 6 락토바실러스 분리주 LRH09의
무세포 세포내 추출물
실험군 7 락토바실러스 분리주 LR47의
무세포 세포내 추출물
이 후, 각 군의 세포 배양물을 제조사의 지침에 따라 중성지방 비색 분석 키트(Cat. No. 10010303, Cayman, 미국)를 사용하여 중성지방(triglyceride: TG) 함량을 측정하였다. 이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정" 의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 실험군 3 내지 7에서 측정된 TG 함량은 실험군 1 내지 2 및 양성 대조군에서 측정된 함량보다 낮았다. 특히, 실험군 5에서의 TG 함량은 실험군 3 내지 4 및 6에서 보다 현저히 낮게 나타났으며, 이는 락토바실러스 분리주 LRH05가 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화 억제 능력이 가장 우수한 것을 나타낸다.
따라서, 락토바실러스 분리주 LRH05가 더 높은 개발 가능성을 보여주었으므로, 하기와 같은 특성 분석을 진행하였다.
실시예 2. 락토바실러스 분리주 LRH05의 특성 분석
락토바실러스 분리주 LRH05의 박테리아 종을 식별하기 위해, 하기와 같은 16S rDNA 서열 분석 및 탄수화물 발효 프로파일링 확인을 수행하였다.
A. 16S rDNA 서열 분석
락토바실러스 분리주 LRH05의 게놈 DNA를 게놈 DNA 미니 키트(Geneaid Biotech Ltd., Cat. No. GB100/GB300)를 사용하여 추출하였다. 이렇게 얻은 게놈 DNA를 주형으로 하고, 16S 리보솜 DNA(rDNA)에 특이적으로 설계된 프라이머 쌍과 표 2의 반응 조건을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 약 1,188 bp의 크기를 갖는 PCR 산물을 수득하였다.
항목 부피(μL)
락토바실러스 분리주 LRH05의 게놈 DNA
(50-100 ng)		 1
16S rDNA 특이적 프라이머 쌍 정방향 프라이머 27F' (10 μM)
5'-agagtttgatcctggctcag-3'
(서열번호 1)		 0.5
역방향 프라이머 1492R' (10 μM)
5'-ggttaccttgttacgact-3'
(서열번호 2)		 0.5
Fast-RunTM 2X Taq Master Mix
(Protech, Cat. No. SA-TMM228)		 10
ddH2O 8
수행조건: 95℃에서 5분 동안 변성 후, 다음 반응을 30회 반복 진행: 95℃에서 60초 동안 변성, 50℃에서 60초 동안 프라이머 접합 및 72℃에서 60초 동안 신장; 그리고 마지막
으로 72℃에서 8분 동안 신장.
상기 결과 PCR 산물은 분자량 확인을 위해 2% 아가로즈 겔 전기영동 분석을 진행 하였다.
이 후, 상기 PCR 산물을 대만의 Genomics Biosci & Tech Co., Ltd.에 위탁한 서열 분석으로 검증하여 락토바실러스 분리주 LRH05의 16S rNDA 서열(서열번호 3)을 수득하였다. NCBI의 유전자 데이터베이스 데이터와의 비교를 통해 락토바실러스 분리주 LRH05의 16S rDNA 서열이 락토바실러스 람노서스 균주 g26의 16S rDNA 서열(GenBank accession number: KF 554252.1)의 일부와 99.9% 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
상기 실험 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 분리주 LRH05를 락토바실러스 람노서스로 식별하였다. 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05(즉, 락토바실러스 분리주 LRH05)가 신규 락토바실러스 람노서스 균주인지 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
B. 탄수화물 발효 프로파일링
락토바실러스 람노서스 균주 LRH05의 탄수화물 발효 프로파일은 API® 50 CH 미생물 식별 키트(bioMerieux)를 사용하여 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
탄수화물 산을 생성하기 위해 시험된 탄수화물 발효능력
글리세롤 -
에리스리톨 -
D-아라비노스 -
L-아라비노스 -
D-리보스 +
D-자일로스 -
L-자일로스 -
D-아도니톨 -
메틸-β-D-자일로피라노사이드 -
D-갈락토스 -
D-글루코스 +
D-프럭토스 +
D-만노스 +
L-소르보스 +
L-람노스 /
둘시톨 -
이노시톨 -
D-만니톨 +
D-솔비톨 /
메틸-α-D-만노피라노사이드 -
메틸-α-D-글루코피라노사이드 /
N-아세틸글루코사민 +
아미그달린 +
알부틴 +
에스쿨린 +
살리신 +
D-셀로비오스 +
D-말토스 -
D-락토스 +
D-멜리비오스 -
D-사카로스 -
D-트레할로스 +
이눌린 -
D-멜레지토스 +
D-라피노스 -
아미돈 -
글리코겐 -
자일리톨 -
겐티오비오스 /
D-투라노스 +
D-릭소스 -
D-타가토스 +
D-푸코스 -
L-푸코스 -
D-아라비톨 -
L-아라비톨 -
포타슘 글루코네이트 -
포타슘 2-케토글루코네이트 -
포타슘 5-케토글루코네이트 -
참고: "+"는 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05가 시험된 탄수화물을 발효시켜 산을 생성할 수 있음을 나타내는 반면, "-"는 해당 균주에 그러한 능력이 없음을 나타낸다. "/"는 그러한 능력에 대해 확인할 수 없음을 나타낸다.
상기 결과를 APIWEBTM 온라인 박테리아 및 효모 데이터베이스의 데이터와 비교 한 결과, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05의 탄수화물 발효 프로파일은 락토바실러스 람노서스의 것과 99.9% 동일성을 갖는 것을 확인하였으며, 이는 출원인에 의해 지금까지 특성화된 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05가 통상적으로 알려진 락토바실러스 람노서스 균주와는 상이하다는 것을 의미한다.
상기 특성화 결과에 기초하여, 본 출원인은 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05가 락토바실러스 람노서스의 신규 균주임을 제시한다. 이에 따라, 락토바실러스 람노서스 균주 LRH05는 대만 식품산업연구개발원(FIRDI) 산하 BCRC(Biosource and Collection and Research Center)에 2020년 7월 31일부터 수탁번호 BCRC 911013으로 기탁되었으며, 부다페스트 조약에 따라 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2020년 8월 10일부터 수탁번호 DSM 33616으로 기탁되었다.
실시예 3. 락토바실러스 람노서스 LRH05의 비만 관련 대사증후군 완화 효과 평가
A. 젖산균(LAB) 균주의 액체 배양의 준비
락토바실러스 람노서스 LRH05 및 락토바실러스 분리주 LR47(락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri LR47로 식별 및 명명) 각각을 MRS 브로쓰에 접종한 후, 인큐베이터(37℃)에서 16시간 동안 배양하여 각각의 배양물을 수득하였다. 3,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 생성된 세포 펠렛을 모아 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 세척하고, PBS에 현탁하여 109 CFU/mL 박테리아 농도를 갖는 박테리아 현탁액을 수득하였다.
B. 비만 유도 및 체중과 체중 증가량의 확인
C57BL/6 마우스를 정상 대조군, 병리학적 대조군, 비교군 및 실험군(각 군당 n=8)의 4군으로 나누었다. 정상 대조군의 마우스에는 10 kcal% 지방(Research Diets, Inc., Cat. No. D12450B)과 0.85% 염화나트륨 용액을 포함하는 저지방식이를 급여하였다. 병리학적 대조군, 비교군 및 실험군의 마우스에는 60 kcal% 지방(Research Diets, Inc., Cat. No. D12492)과 0.85% 염화나트륨 용액을 포함하는 고지방식이를 임의로 급여하였다. 각 마우스에게 총 10주 동안 식이를 급여하였다.
각 군의 마우스에게 지방 함유 식이를 급여한 후 첫째 날, 실험군의 마우스에게는 경구 위관 영양(oral gavage)을 통해 본 실시예의 섹션 A에서 준비된 락토바실러스 람노서스 LRH05의 박테리아 현탁액 0.2 mL을 급여하였으며, 비교군의 마우스에게는 경구 위관 영양을 통해 본 실시예의 섹션 A에서 준비된 락토바실러스 루테리 LR47의 박테리아 현탁액 0.2 mL을 급여하였다. 또한, 정상 대조군 및 병리학적 대조군의 마우스에게는 경구 위관 영양을 통해 0.85% 염화나트륨 용액 0.2 mL을 급여하였다. 각 마우스에게 10주 간의 총 기간 동안 하루에 한 번씩 급여하였다.
지방 함유 식이를 급여하기 전과 지방 함유 식이를 급여한 후 각 주 말에 각 마우스의 체중을 측정하였다. 각 마우스의 체중 증가량은 지방 함유 식이를 급여하기 시작한 후 10주 째 말에 측정하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 정상 대조군과 비교하여 각각의 비교군 및 병리학적 대조군에서 체중 및 체중 증가량이 크게 증가된 반면, 실험군에서는 체중 및 체중 증가량이 미미하게 증가되었으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 비만을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
C. 생물학적 샘플의 준비
본 실시예의 섹션 B에서 기재된 바와 같이, 10주 째 말에 체중 및 체중 증가량 측정을 완료한 후, 각 군의 마우스를 적어도 12시간 동안 밤새 절식시켰다. 이 후, 이소플루란에 의해 모든 마우스를 희생시킨 다음, 혈액 샘플, 분변 샘플, 부고환(epididymal) 백색 지방 조직(white adipose tissue; WAT), 후복막(retroperitoneal) WAT, 서혜부(inguinal) WAT 및 간 조직을 각각의 마우스 사체로부터 수득하여 다음 실험에 사용하였다.
D. 혈당량의 측정
본 실시예의 섹션 C에서 얻은 각 마우스의 혈액 샘플을 3,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 혈청 샘플을 수득하였다. 이렇게 얻어진 혈청 샘플을 Accu-Chek® Performa 혈당 측정기(Roche)를 사용하여 혈당량을 측정하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 혈당량이 병리학적 대조군 및 비교군에서 측정된 혈당량보다 낮았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 혈당량을 조절할 수 있음을 나타낸다.
E. 혈청 샘플 내 TG 및 총 콜레스테롤(TC) 함량의 측정
본 실시예의 섹션 D에서 얻은 각각의 마우스의 혈청 샘플을 cobas® 800 모듈러 분석기(Roche)를 사용하여 TG 및 TC의 함량을 측정하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 TG 및 TC의 함량이 병리학적 대조군 및 비교군에서 측정된 함량보다 낮았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 이상지질혈증을 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
F. 체지방의 측정
본 실시예의 섹션 C에서 얻은 각각의 마우스의 부고환 WAT, 후복막 WAT 및 서혜부 WAT에 대한 중량을 측정하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 7 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 부고환 WAT, 후복막 WAT 및 서혜부 WAT의 중량은 병리학적 대조군 및 비교군에서 측정된 중량보다 낮았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 체지방을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
G. 간 조직에서의 조직병리학적 분석 및 TG 함량의 측정
본 실시예의 섹션 C에서 얻은 각 마우스의 간 조직 0.2 g을 10% 포름알데히드 수용액으로 실온에서 24시간 동안 고정시킨 후, 상기 고정된 조직 샘플을 파라핀에 포매시킨 다음 절단하여 조직 절편을 수득하였다. 통상의 기술자에게 잘 알려진 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin: H&E) 염색 프로토콜에 따라 상기 조직 절편을 염색한 후, Motic EasyScan 프로 디지털 슬라이드 스캐너(Motic Inc.)를 사용하여 400X 배율로 관찰하였다.
또한, 각각의 고정된 조직 샘플 0.2 g을 중성지방 비색 분석 키트(Cat. No. 10010303, Cayman, 미국)를 사용하여 TG 함량을 측정하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 병리학적 대조군 및 비교군 각각의 간 조직에서 심한 지방 축적이 관찰되었다. 반면, 실험군에서는 간 조직이 정상적인 구조를 갖고 있었으며, 지방 축적도 관찰되지 않았다.
도 11에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 간 TG 함량은 병리학적 대조군 및 비교군에서 측정된 함량보다 낮았다.
이러한 결과는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 간 조직에서 지방 축적을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 간 지방증을 개선하여 지방간 질환(fatty liver disease: FLD)을 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. 락토바실러스 람노서스 LRH05의 당뇨병 완화 효과 평가
실험 과정:
In vitro α-아밀레이스 억제 활성은 Μ.Ν. Wickramaratne 등의 논문[BMC Complement. Altern. Med., 16(1):466 (2016)]에 기재된 방법에서 약간 변형된 방법을 사용하여 분석하였다. 간략하게, 12 g의 포타슘 소듐 타르트레이트 테트라하이드레이트(potassium sodium tartrate tetrahydrate)를 8 mL의 2M 수산화나트륨 용액에 용해시킨 다음, 20 mL의 96 mM 3,5-디니트로살리실산(DNSA) 용액 및 12 mL의 ddH2O를 첨가하여 DNSA 시약을 수득하였다.
실시예 1에서 얻은 락토바실러스 람노서스 LRH05의 무세포 세포내 추출물(실험군으로 사용됨) 50 μL를 α-아밀레이스 용액(5 U/mL)(Sigma-Aldrich) 50 μL와 혼합한 후, 30℃에서 10분 동안 반응이 진행되도록 두었다. 이 후, 전분 용액(PBS 중 1% (w/v)) 50 μL를 결과 혼합물에 첨가하고, 30℃에서 3분 동안 반응이 진행되도록 두었다. 이어서, 50 μL의 DNSA 시약을 상기 결과 혼합물에 첨가하고, 90℃ 수조에서 10분 동안 가열하였다. 이 후, 상기 반응 혼합물을 상온에서 냉각시킨 다음, 1 mL의 ddH2O를 첨가하였다. 상기 결과 반응 혼합물은 분광광도계(TECAN, SUNRISE)를 사용하여 540 nm의 파장(OD540)에서 흡광도가 측정되었다.
또한, 실시예 1의 섹션 B에서 기재된 방법에 따라 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)의 무세포 세포내 추출물을 준비하여 비교군으로 사용하였다. 양성 대조군으로는 30 mg/mL의 아카보스(acarbose; ddH2O 중) 및 대조군으로는 0.85% (w/v) 염화나트륨 용액을 사용하였다. 상기 비교군, 양성 대조군 및 대조군에 대하여 상기에 기재된 동일한 실험을 진행하였다.
α-아밀레이스 억제율(%)은 하기 식(I)을 사용하여 계산하였다:
A=[(B-C)/B]x100 (I)
상기 A는 α-아밀레이스 억제율(%)
B는 대조군의 OD540 값
C는 실험군, 비교군 및 양성 대조군 각각의 OD540 값
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
결과:
도 12에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 α-아밀레이스 억제율은 비교군에서 측정된 억제율보다 높았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 당뇨병을 치료 및/또는 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. 락토바실러스 람노서스 LRH05의 장내 세균 변화에 대한 효과 평가
A. 장내 세균 조성의 분석
실시예 3의 섹션 C에서 얻은 각 군의 분변 샘플(n=6)은 Χ.Ρ. Li 등의 논문 [J. Funct. Foods, 73:104103 (2020)]에 기재된 방법에서 약간 변형된 방법을 사용하여 장내 세균 조성에 대한 분석을 진행하였다. 간략하게, 제조사의 지침에 따라 QIAmp DNA Stool 미니 키트(Cat. No. 51604, QIAGEN, 독일)를 사용하여 각각의 분변 샘플에서 장내 세균 DNA를 추출하였다.
이렇게 얻은 장내 세균 DNA를 주형으로 하여 하기의 염기 서열을 갖는 16S rDNA 서열용으로 설계된 프라이머 쌍(즉, 정방향 프라이머 F 및 역방향 프라이머 R)을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
정방향 프라이머 F
5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctacgggnggcwgcag-3'(서열번호 4)
역방향 프라이머 R
5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggactachvgggtatctaatcc-3'(서열번호 5)
이 후, Illumina MiSeq 시퀀싱 시스템(Illumina, Inc., 미국)을 사용하여 상기 PCR 산물의 서열 분석을 수행하였다. 이렇게 얻은 16S rDNA 서열에 대해 QIIME 마이크로바이옴 생물정보 플랫폼(버전 1.9.1, QIIME)을 이용하여 서열 분석을 진행하였으며, USEARCH(버전 7.0.1090)을 이용하여 조작분류단위(operational taxonomic units: OTUs)를 통해 분류하였다. 이 후, Greengenes 데이터베이스(버전 gg_13_8), SILVA 데이터베이스(버전 132) 또는 NCBI의 유전자 데이터베이스의 데이터에 따라 리보솜 데이터베이스 프로젝트(RDP) 분류기(미시간주립대학교, 미국) 및 Python 최근접 정렬 공간 종결(PyNAST)(버전 1.2)을 이용하여 16S rDNA 서열 정렬을 수행하였다.
QIIME 마이크로바이옴 생물정보 플랫폼을 사용하여 종 풍부도(즉, Chao1 및 abundance-base coverage estimator(ACE))를 분석한 후, 각 군에서 장내 세균의 α-다양성을 추정하였다.
도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 ChaoI 및 ACE는 비교군 및 병리학적 대조군에서 측정된 것보다 높았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 정상적인 위장관 미세균총의 균형을 효과적으로 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
B. 단쇄 지방산의 분석
실시예 3의 섹션 C에서 얻은 각 군의 분변 샘플을 Τ. Torii 등의 논문[Ann. Clin. Biochem., 47 (Pt 5):447-452 (2010)]에 기재된 방법에서 약간 변형된 방법을 사용하여 단쇄 지방산의 분석을 진행하였다. 간략하게, 각각의 분변 샘플 70 mg을 70% (v/v) 에탄올 용액 700 μl와 혼합하고, 적당량의 유리 비드(크기: 0.1 mm)를 상기 결과 혼합물에 첨가한 후, 10분 동안 진탕하였다. 12,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 결과 상층액을 수득하여 다음과 같은 유도체화 과정을 진행하였다.
각각의 상층액 0.3 mL를 2-에틸부티르산(내부 표준으로 사용)(Sigma-Aldrich, Cat. No. 109959) 0.05 mL, 3% 피리딘(Sigma-Aldrich, Cat. No. 270970) 0.3 mL, 250 mmol/L 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC-HCl) 0.3 mL 및 20 mmol/L 2-니트로페닐히드라진 염산염(NPH-HCl)(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Cat. No. N0231) 0.3 mL와 혼합한 후, 반응 진행을 위해 60℃에서 20분 동안 그대로 두었다. 이 후, 0.2 mL의 시약(15% (w/v) 수산화포타슘 용액과 메탄올을 80:20(v/v) 비율로 제조)을 상기 결과 혼합물에 가하여 반응을 종결시켰다.
그 다음, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 3 ml 의 0.5 mol/L 인산 용액과 4 mL의 에테르를 첨가하였다. 3분 동안 진탕한 후, 결과 에테르층을 수득하여 4 mL의 ddH2O와 혼합시킨 후, 3분 동안 진탕하였다. 3,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 결과 에테르층을 수득하였으며, 질소 가스를 이용하여 에테르를 제거하였다. 이렇게 얻어진 지방산 히드라지드를 적당량의 메탄올에 용해시켜 시험 샘플을 수득한 다음, 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하여 단쇄 지방산의 함량을 측정하였다.
HPLC 분석은 HITACHI L-7420 UV-VIS 검출기가 장착된 HPLC 시스템(HITACHI L-7300)과 하기 표 4에 나타낸 작동 조건을 사용하여 수행하였다.
칼럼 종류 MN NUCLEODUR® C18 HTec
칼럼 온도 40℃
이동상 메탄올/ddH2O (16:84, v/v)
유동률 1.0 mL/min
샘플 주입량 20 μL
검출 파장 400 nm
또한, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산을 표준 시료(Sigma-Aldrich 에서 구입)로 사용하였으며, 각각 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 mmol/L의 농도로 제공되었으며, 동일한 유도체화 공정 및 HPLC 분석을 진행하였다.
이렇게 얻은 데이터는 "일반적 과정"의 섹션 1에서 설명된 방법에 따라 분석하였다.
도 15 내지 도 17에 나타난 바와 같이, 실험군에서 측정된 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 함량이 비교군 및 병리학적 대조군에서 측정된 함량보다 높았으며, 이는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LRH05가 장내 세균에 의한 식이 섬유, 단백질 및 펩타이드의 소비를 효과적으로 개선시킬 수 있어 이에 따른 긍정적인 대사효과를 제공할 수 있음을 나타낸다.
본 발명이 예시적인 구현예로 간주되는 것과 관련지어 설명되었지만, 본 발명은 개시된 구현예에 한정되지 않으며, 가장 넓은 해석의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 방식을 포괄하여, 그러한 모든 변형과 등가 방식이 포함되도록 의도된다는 것을 이해해야한다.
SEQUENCE LISTING
<110> SYNBIO TECH INC.
<120> LACTOBACILLUS RHAMNOSUS LRH05 ISOLATE, AND COMPOSITION INCLUDING THE SAME AND USE THEREOF
<130> PE-67848-KO
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer 27F' for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer 1492R' for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment
<400> 2
ggttaccttg ttacgact 18
<210> 3
<211> 1188
<212> DNA
<213> 16S rDNA sequence of Lactobacillus rhamnosus LRH05
<400> 3
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 60
gtcaccggca gtcttactag agtgcccaac taaatgctgg caactagtca taagggttgc 120
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 180
ctgtcatttt gcccccgaag gggaaacctg atctctcagg tgatcaaaag atgtcaagac 240
ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 300
cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga atgcttaatg 360
cgttagctgc ggcactgaag ggcggaaacc ctccaacacc tagcattcat cgtttacggc 420
atggactacc agggtatcta atcctgttcg ctacccatgc tttcgagcct cagcgtcagt 480
tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 540
ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 600
cctcggttaa gccgagggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 660
cccaataaat ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 720
agccgtggct ttctggttgg ataccgtcac gccgacaaca gttactctgc cgaccattct 780
tctccaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 840
cagacttgcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 900
gtctcagtcc caatgtggcc gatcaacctc tcagttcggc tacgtatcat tgccttggtg 960
agccgttacc tcaccaacta gctaatacgc cgcgggtcca tccaaaagcg atagcttacg 1020
ccatctttca gccaagaacc atgcggttct tggatttatg cggtattagc atctgtttcc 1080
aaatgttatc ccccacttaa gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccactcg 1140
ttcaaaatta aatcaagatg caagcacctt tcaataatca gaactcgt 1188
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Forward primer for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n is a or g or c or t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> w is a or t/u
<400> 4
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Reverse primer for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> h is a or c or t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> v is a or g or c
<400> 5
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션 DSM33616 20200810
SEQUENCE LISTING <110> SYNBIO TECH INC. <120> LACTOBACILLUS RHAMNOSUS LRH05 ISOLATE, AND COMPOSITION INCLUDING THE SAME AND USE THEREOF <130> PE-64217-WO <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 27F' for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 1492R' for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment <400> 2 ggttaccttg ttacgact 18 <210> 3 <211> 1188 <212> DNA <213> 16S rDNA sequence of Lactobacillus rhamnosus LRH05 <400> 3 gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 60 gtcaccggca gtcttactag agtgcccaac taaatgctgg caactagtca taagggttgc 120 gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 180 ctgtcatttt gcccccgaag gggaaacctg atctctcagg tgatcaaaag atgtcaagac 240 ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 300 cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga atgcttaatg 360 cgttagctgc ggcactgaag ggcggaaacc ctccaacacc tagcattcat cgtttacggc 420 atggactacc agggtatcta atcctgttcg ctacccatgc tttcgagcct cagcgtcagt 480 tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 540 ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 600 cctcggttaa gccgagggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 660 cccaataaat ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 720 agccgtggct ttctggttgg ataccgtcac gccgacaaca gttactctgc cgaccattct 780 tctccaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 840 cagacttgcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 900 gtctcagtcc caatgtggcc gatcaacctc tcagttcggc tacgtatcat tgccttggtg 960 agccgttacc tcaccaacta gctaatacgc cgcgggtcca tccaaaagcg atagcttacg 1020 ccatctttca gccaagaacc atgcggttct tggatttatg cggtattagc atctgtttcc 1080 aaatgttatc ccccacttaa gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccactcg 1140 ttcaaaatta aatcaagatg caagcacctt tcaataatca gaactcgt 1188 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a or g or c or t/u <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> w is a or t/u <400> 4 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for PCR amplification of bacterial 16S rDNA fragment <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> h is a or c or t/u <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> v is a or g or c <400> 5 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (21)

  1. 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LRH05의 분리 균주.
  2. 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는, 대사증후군 관련 질환 치료용 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 대사증후군 관련 질환은 비만, 고혈압, 이상지질혈증, 당뇨병, 지방간질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 대사증후군 관련 질환이 제2형 당뇨병(T2DM)인, 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 식품으로 제제화되는 것인, 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물로 제제화되는 것인, 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여용 제형인, 조성물.
  8. 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 관련 질환의 치료 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여용 제형인, 방법.
  10. 대상체의 대사증후군 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 약제는 경구 투여용 제형인, 용도.
  12. 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁된, 대상체의 대사증후군 관련 질환 치료용 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주.
  13. 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는, 장내 세균 변화용 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물은 식품으로 제제화되는 것인, 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물로 제제화되는 것인, 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여용 제형인, 조성물.
  17. 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 장내 세균을 변화시키는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물은 식품 또는 경구 투여용 제형의 약학 조성물인, 방법.
  19. 대상체의 장내 세균 변화용 조성물의 제조에 있어서, 청구항 1의 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주의 용도.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 조성물은 식품 또는 경구 투여용 제형의 약학 조성물인, 용도.
  21. 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 33616으로 기탁된, 대상체의 장내 세균 변화용 락토바실러스 람노서스 LRH05의 분리 균주.
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