CN114891001B

CN114891001B - 一种槐果碱衍生物及其制备方法及其应用

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Publication number: CN114891001B
Application number: CN202210554396.9A
Authority: CN
Inventors: 王福玲; 崔琳琳; 高原; 雒江菡; 辛国松; 王昊; 王金宏; 李钧; 申光焕; 张文君; 杨波; 杨海娇
Original assignee: Harbin University of Commerce
Current assignee: Harbin University of Commerce
Priority date: 2022-05-20
Filing date: 2022-05-20
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2042-05-20
Also published as: CN114891001A

Abstract

一种槐果碱衍生物及其制备方法及其应用，它属于化学医药技术领域。本发明要解决的技术问题为制备新型的槐果碱衍生物。本发明称量一定质量的槐果碱，在超声波下溶于一定体积的二氯甲烷，得到第一混合物在磁力搅拌的条件下加热到一定温度，缓慢滴入硫醇类化合物溶液，再缓慢滴入一定体积的三乙胺，在薄层层析色谱的监测下反应一定时间，反应后得到第二混合物旋转蒸发仪后，得到的产物用二氯甲烷萃取2‑3次,合并有机相,旋转蒸发后，得到粗品产物用硅胶柱层析纯化，将硅胶湿法装柱，湿法上样，用甲醇‑二氯甲烷为洗脱剂进行梯度洗脱，得到一种槐果碱衍生物。本发明用于在治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肿瘤的药物中的应用。

Description

一种槐果碱衍生物及其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于化学医药技术领域；具体涉及一种槐果碱衍生物及其制备方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤的病因和发病机理尚不完全清楚。早期仍以传统的手术治疗为主，晚期多以放化疗为主，由于复发率高，大部分人不能支付起昂贵的医疗费用，而且对化疗过程的毒性反应不耐受，因此治疗效果未得到很大改善。中医药预防治疗肿瘤是综合治疗的重要部分，既有抗肿瘤作用又能调节免疫功能，达到毒副作用小、高效安全的目标，对肿瘤的治疗具有重要和现实的意义。

槐属植物是清热解毒方中治疗肿瘤的常用药物，苦豆子为我国西北干旱半干旱的荒漠、沙丘的沙质土地和盐碱地等特有的区域性药物植物，连片生长，对防风固沙、维护生态平衡具有重要的生态作用。苦豆子味苦性寒，具有清热解毒、消炎止痢和杀虫等功效，资源储量丰富，药用、农用及饲用价值均较高，但是分布零散、采集困难，很多被烧掉，资源极大浪费，也不利于生态环境保护。苦豆子主要有效成分有生物碱、黄酮、挥发油、有机酸、多糖、氨基酸、蛋白质、脂肪酸及矿物质元素等，其中生物碱具有较强的药理活性，而且含量较高。近年来，国内围绕苦豆子生物碱类资源性化学成分的产业化研究已较深入，已经开发出用于治疗乙型肝炎的苦参素胶囊、抗肿瘤新药盐酸槐定碱注射液、治疗肠道感染的克泻灵片。在农业方面，苦豆子中的苦豆碱已经用于防治线虫病。槐果碱 (Sophocarpine，SC)来源于豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuraides L.)地上部分，由于槐果碱安全性高、副作用小等优点，开发价值大，具有抗炎、镇痛、抗乙型肝炎病毒、抗肿瘤等药理作用。早在20世纪80年代有学者发现槐果碱对肿瘤的抑制作用。但是，和其它生物碱的结构和性质接近，也给分离纯化带来了一定困难，而且作用机制研究尚浅限制了其广泛应用。因此，为了保护药用资源，提高中药苦豆子的利用价值和经济价值，进一步充分开发利用价廉丰富的槐果碱资源作为治疗肿瘤的新药提供理论基础和实验依据，对保护人们健康、改善生态环境、提高经济发展都大有裨益。

发明内容

本发明目的是提供了一种槐果碱衍生物及其制备方法及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、称量一定质量的槐果碱，在超声波下溶于一定体积的二氯甲烷，得到第一混合物待用；

步骤2、将步骤1得到的第一混合物在磁力搅拌的条件下加热到一定温度，缓慢滴入硫醇类化合物溶液，再缓慢滴入一定体积的三乙胺，在薄层层析色谱的监测下反应一定时间，反应后得到第二混合物，待用；

步骤3、将步骤2得到的第二混合物，旋转蒸发仪后，得到的产物用二氯甲烷萃取2-3 次,合并有机相,旋转蒸发后，得到粗品产物；

步骤4、将步骤3得到的粗品产物用硅胶柱层析纯化，将硅胶湿法装柱，湿法上样，用甲醇-二氯甲烷为洗脱剂进行梯度洗脱，得到一种槐果碱衍生物。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤1中槐果碱和二氯甲烷的料液比为 1g:20-25ml。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中加入的硫醇类化合物和槐果碱的物质的量的比为18:4。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为1-硫代甘油、 1,6-己二硫醇、2-乙基苯硫酚、2,4-二甲基苯硫酚、3-巯基丙酸甲酯中的一种。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中混合物和三乙胺的体积比为10-12:1。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中薄层层析色谱展开剂为甲醇和二氯甲烷混合物，其中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:15，用紫外分析仪检视薄层色谱。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤3中旋转蒸发的温度为40-50℃。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤4中所述硅胶柱的规格为2cm×75cm,硅胶颗粒尺寸为200-300目,洗脱剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:15。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(3-硫基-1,2-丙二醇)-苦参碱、13-(1,6-己二硫基)-苦参碱、13-(2-乙基苯硫基)-苦参碱、13-(2,4-二甲基苯硫基)-苦参碱、13-(3-硫基丙酸甲酯) -苦参碱中的一种。

本发明所述的一种槐果碱衍生物的应用，所述的一种槐果碱衍生物在治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肿瘤的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，以槐果碱为原料药，在13位进行双键加成，并合成得到5个目标衍生物，分别经IR、1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS解析，结果表明，槐果碱(SC)、13-(3-硫基-1,2-丙二醇)-苦参碱(SCD-2a)、13-(1,6-己二硫基)-苦参碱(SCD-2b)、13-(2-乙基苯硫基)-苦参碱(SCD-2c)、13-(2,4-二甲基苯硫基)-苦参碱(SCD-2d)、13-(3-硫基丙酸甲酯)-苦参碱(SCD-2e)所有数据佐证了目标化合物的结构。MTT法检测槐果碱衍生物对肝癌SMMC-7721、肝癌HepG-2、胃癌 SGC-7901、乳腺癌MCF-7和肝正常LO2的细胞毒作用，分别作用48h后，发现槐果碱衍生物对肿瘤细胞有一定的增殖抑制作用，且呈剂量依赖关系。槐果碱衍生物对肝癌 SMMC-7721细胞的增殖抑制作用较好，其中，13-(2-乙基苯硫基)-苦参碱和13-(2,4- 二甲基苯硫基)-苦参碱的活性较高，但是，13-(2,4-二甲基苯硫基)-苦参碱对肝正常细胞LO2有一定的杀伤作用。

附图说明

图1为具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞生长抑制作用；

图2为具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物对HepG-2细胞生长抑制作用；

图3为具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物对SGC-7901细胞生长抑制作用；

图4为具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物对MCF-7细胞生长抑制作用；

图5为具体实施方式二至四制备的一种槐果碱衍生物对LO2细胞增殖的影响；

图6为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对H22荷瘤小鼠瘤重的影响；

图7为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对H22荷瘤小鼠瘤重的体积变化；

图8为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对H22荷瘤小鼠生存时间的影响；

图9为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对H22荷瘤小鼠体重变化；

图10为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对倒置显微镜观察SMMC-7721细胞形态照片，图中A为Control，B为1.7μg/mL HCPT，C为14.5μg/mL SCD-2c，D为29μg/mL SCD-2c，E为58μg/mL SCD-2c；

图11为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜总蛋白含量的影响；

图12为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜唾液酸含量的影响；

图13为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜胆固醇含量的影响；

图14为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜流动性的影响；

图15为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜封闭度的影响；

图16为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜Na⁺,K⁺-ATP酶活性的影响；

图17为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞膜Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性的影响；

图18为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721荧光显微镜观察SMMC-7721细胞凋亡形态照片，图中A.Control，B.1.7μg/mL HCPT，C.14.5μ g/mLSCD-2c，D.29μg/mL SCD-2c，E.58μg/mL SCD-2c；

图19为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞内线粒体膜电位变化的影响照片，图中A.Control，B.1.7μg/mL HCPT，C.14.5μg/mL SCD-2c，D.29μg/mL SCD-2c，E.58μg/mL SCD-2c；

图20为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞迁移的影响照片，图中A.Control，B.0.3μg/mL HCPT，C.7μg/mL SCD-2c，D.7μg/mL SC；

图21为对比例和具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721细胞迁移及侵袭的影响照片；A-D为各组Transwell迁移实验结果，E-H为各组Transwell侵袭实验结果(结晶紫染色)，A.Control；B.0.3μg/mL HCPT；C.7μg/mL SCD-2c；D.7μg/mL SC。

具体实施方式

具体实施方式一：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤1中槐果碱和二氯甲烷的料液比为1g:20ml。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中加入的硫醇类化合物和槐果碱的物质的量的比为18:4。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为1-硫代甘油。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中混合物和三乙胺的体积比为10:1。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中薄层层析色谱展开剂为甲醇和二氯甲烷混合物，其中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:15，用紫外分析仪检视薄层色谱。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤3中旋转蒸发的温度为40-50℃。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤4中所述硅胶柱的规格为2cm ×75cm,硅胶颗粒尺寸为200-300目,洗脱剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:15。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(3-硫基-1,2-丙二醇)-苦参碱：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，IRv： 3276.47，2938.98，1639.20，1463.71，1444.42，1203.36，1087.66，632.54cm^-1，如附录图5所示；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，TMS)δ：4.40(dd，J＝13.3，4.2Hz，1H，H-17β)，3.82(q，J＝9.2，6.8Hz，1H，H-21)，3.06(t，J＝13.0Hz，1H，H-17α)，2.88～2.76(m， 2H，H-10α/2α)，2.25(ddd，J＝16.9，10.8，5.4Hz，1H，H-11)，2.14～2.05(m，2H， H-14)，1.98(t，J＝13.1Hz，2H，H-20)，1.90(d，J＝14.8Hz，2H，H-10β/2β)，1.81 (ddd，J＝13.8，7.0，3.1Hz，2H，H-12)，1.74～1.58(m，5H，H-3/7/9)，1.53(d，J＝7.3Hz， 1H，H-13)，1.47～1.35(m，5H，H-4/5/8)，如附录图6所示；¹³C-NMR(126MHz， CDCl₃，TMS)δ：169.48(C-15)，63.80(C-21)，57.29(C-2)，57.21(C-10)，53.19 (C-11)，43.21(C-17)，41.44(C-13)，35.32(C-7)，32.85(C-5)，27.75(C-20)， 27.17(C-12)，26.45(C-4)，21.18(C-8)，20.77(C-3)，18.97(C-9)，如附录图7 所示；HR-ESI-MS：m/z 355.22[M+H]⁺，确定衍生物1为13-(3-硫基-1,2-丙二醇)-苦参碱(SCD-2a)。

具体实施方式二：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为1,6-己二硫醇。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(1,6-己二硫基)-苦参碱：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，IRv： 2933.20，1633.41，1467.56，1442.49，1087.66，634.47cm^-1，如附录图9所示；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，TMS)δ：4.35(dt，J＝12.8，3.6Hz，1H，H-17β)，4.05(dt，J＝12.5， 6.4Hz，1H，H-17α)，3.24～3.06(m，2H，H-20)，2.85(d，J＝11.6Hz，1H，H-13)， 2.83～2.73(m，2H，H-10α/2α)，2.73～2.64(m，2H，H-10β/2β)，2.46(dd，J＝17.2， 6.9Hz，1H，H-11)，2.28～2.18(m，1H，H-14α)，2.14(s，1H，H-14β)，2.09～1.89 (m，5H，H-25)，1.86(d，J＝14.1Hz，1H，H-6)，1.74～1.57(m，10H，H-3/4/5/7/8/9)， 1.53(dd，J＝12.3，7.6Hz，2H，H-12)，1.48～1.37(m，8H，H-21/22/23/24)，1.29～1.24 (m，1H，H-26)，如附录图10所示；¹³C-NMR(126MHz，CDCl₃，TMS)δ：166.86 (C-15)，63.85(C-6)，57.19(C-2/10)，51.06(C-11)，42.09(C-17)，41.83(C-7)， 38.88(C-13)，38.78(C-14)，35.61(C-5)，35.21(C-25)，33.78(C-20)，31.47(C-24)，31.18(C-21)，28.99(C-22)，28.49(C-23)，27.69(C-12)，27.54(C-4)， 26.61(C-8)，21.12(C-3)，20.52(C-9)，如附录图11所示；HR-ESI-MS：m/z 397.18 [M+H]⁺，确定衍生物2为13-(1,6-己二硫基)-苦参碱(SCD-2b)。

具体实施方式三：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为2-乙基苯硫酚。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(2-乙基苯硫基)-苦参碱：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，IRv： 2935.13，2863.77，1639.20，1467.56，1444.42，1087.58，634.47cm^-1，如附录图13所示；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，TMS)δ：7.40(d，J＝7.8Hz，1H，H-22)，7.25～7.16(m， 2H，H-23/25)，7.14(dd，J＝9.0，4.6Hz，1H，H-24)，4.35(td，J＝11.9，11.2，4.3Hz， 1H，H-17β)，4.07(dt，J＝11.9，6.4Hz，1H，H-17α)，3.53(dp，J＝7.6，3.7Hz，1H， H-11)，2.81(q，J＝7.3Hz，4H，H-2/10)，2.74～2.63(m，1H，H-14α)，2.51～2.40(m， 1H，H-14β)，1.94(ddq，J＝14.2，7.1，3.6Hz，3H，H-6)，1.77～1.63(m，4H，H-4/8)， 1.59～1.42(m，4H，H-3/9)，1.40(d，J＝11.8Hz，1H，H-5)，1.37(dd，J＝10.7，4.1Hz， 2H，H-CH ₂CH₃)，1.34～1.14(m，3H，H-CH₂CH₃)，如附录图14所示；¹³C-NMR(126MHz， CDCl₃，TMS)δ：166.62(C-15)，146.23(C-20)，132.82(C-21)，132.23(C-22)， 128.98(C-23)，127.78(C-24)，126.40(C-25)，63.77(C-6)，57.18(C-2/10)， 51.10(C-11)，42.19(C-17)，41.79(C-7)，38.70(C-13)，38.21(C-14)，35.61 (C-5)，31.22(-CH₂CH₃)，27.72(C-4)，27.21(C-12)，26.46(C-8)，21.14(C-3)， 20.61(C-9)，15.26(-CH₂ CH₃)，如附录图15所示；HR-ESI-MS：m/z 385.23[M+H]⁺，确定衍生物3为13-(2-乙基苯硫基)-苦参碱(SCD-2c)。

具体实施方式四：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为2,4-二甲基苯硫酚。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(2,4-二甲基苯硫基)-苦参碱：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，IRv： 2931.27，2856.06，1639.20，1465.63，1442.49，1087.66，634.47cm^-1，如附录图17所示；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，TMS)δ：7.29(dd，J＝7.8Hz，1H，H-25)，7.04(d，J＝2.0Hz，1H，H-22)，6.95(dd，J＝7.9，2.1Hz，1H，H-24)，4.36(dd，J＝12.6，4.4Hz，1H， H-17β)，4.08(dt，J＝12.0，6.3Hz，1H，H-17α)，3.44(tq，J＝7.8，4.8，4.0Hz，1H， H-11)，3.24～3.08(m，1H，H-2α)，2.86～2.73(m，2H，H-2β/10β)，2.69～2.59(m， 1H，H-10α)，2.47～2.38(m，4H，H-14)，2.29(s，3H，H-6)，2.13～1.99(m，2H，H-3)，1.99～1.94(m，1H，H-9)，1.90(ddd，J＝13.8，7.0，3.3Hz，2H，H-4)，1.79～1.70 (m，2H，H-8)，1.70～1.68(m，1H，H-5)，1.53(dtt，J＝22.0，8.5，4.3Hz，3H，H-26)， 1.46～1.30(m，3H，H-27)，如附录图18所示；¹³C-NMR(126MHz，CDCl₃，TMS)δ： 166.81(C-15)，140.79(C-20)，137.98(C-21)，133.96(C-23)，131.45(C-22)， 128.93(C-24)，127.26(C-25)，63.82(C-6)，57.22(C-2)，57.09(C-10)，51.10 (C-11)，42.24(C-17)，41.80(C-7)，38.64(C-13)，38.20(C-14)，35.62(C-5)， 31.23(C-4)，27.75(C-12)，26.50(C-8)，21.17(C-3)，21.08(C-9)，20.90(C-26)， 20.66(C-27)，如附录图19所示；HR-ESI-MS：m/z 385.24[M+H]⁺，确定衍生物4为13- (2,4-二甲基苯硫基)-苦参碱(SCD-2d)。

具体实施方式五：

一种槐果碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法，步骤2中硫醇类化合物为3-巯基丙酸甲酯。

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，所述的一种槐果碱衍生物为13-(3-硫基丙酸甲酯)-苦参碱：

本实施方式所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，IRv： 2933.20，2865.70，1633.41，1469.49，1442.49，1205.29，1085.73，632.54cm^-1，如附录图21所示；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，TMS)δ：4.32(dd，J＝12.8，4.4Hz，1H，H-17β)， 4.09～4.00(m，1H，H-17α)，3.70(s，3H，H-23)，3.24(dddd，J＝8.0，6.6，4.9，3.1Hz， 1H，H-11)，3.09(t，J＝12.6Hz，1H，H-2α)，2.91～2.77(m，5H，H-2β/10β)，2.70 (dd，J＝17.2，5.0Hz，1H，H-10α)，2.67～2.57(m，3H，H-14)，2.49～2.39(m，1H， H-6)，2.12～1.83(m，6H，H-3/4/8)，1.79～1.67(m，3H，H-9)，1.67～1.60(m，2H， H-5/7)，如附录所示；¹³C-NMR(126MHz，CDCl₃，TMS)δ：171.97(C-22)，166.47 (C-15)，63.61(C-6)，57.03(C-2/10)，51.72(C-23)，50.78(C-11)，41.99(C-17)， 41.61(C-7)，38.48(C-13/14)，35.45(C-5)，34.53(C-20)，31.25(C-4)，27.56 (C-12)，27.44(C-21)，25.43(C-8)，20.96(C-3)，20.49(C-9)，如附录所示；HR-ESI-MS：m/z 367.21[M+H]⁺，确定衍生物5为13-(3-硫基丙酸甲酯)-苦参碱(SCD-2e)。

对具体实施方式一至具体实施方式五制备的一种槐果碱衍生物进行如下实验：

细胞培养：

取出细胞株(肝癌HepG-2、肝癌SMMC-7721、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7、正常肝细胞LO2)冻存管，迅速放入37℃水浴中，不断晃动，融化后移入离心管，移入离心管，加入3mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，1000r/min离心5min，弃上清，用3mL培养液重悬，将细胞悬液转移到已有3mL培养液的培养瓶中，于37℃、5％CO2 培养箱中培养，次日更换一次培养液。细胞每2-3d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

细胞冻存：

细胞冻存液4℃预冷待用，将需冻存细胞按常规方法消化、收集和离心，离心后弃上清液，冻存液1mL混悬细胞，移至标记好的冻存管，4℃放置20min，-20℃放置1h，-80℃过夜后，-80℃短期保存或液氮中长期保存。

细胞计数：

取对数生长期细胞，倒弃培养液，用3mL PBS缓冲液十字花形洗涤2次，0.25％胰蛋白酶1mL消化1min左右，倒置显微镜下观察，待细胞边缘变亮时，用3mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化，将细胞吹打分散。血球计数板和盖玻片用75％酒精擦拭干净，盖玻片放在计数板上。摇匀细胞后，吸取10μL细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使细胞悬液自动充满盖玻片和计数板之间。显微镜下观察，计上不计下，计左不计右，重叠的细胞只计1个，计数四大格的细胞总数，按下式计算，稀释成浓度为5×104个/mL 的细胞悬液。

MTT法检测槐果碱衍生物对肿瘤细胞增殖抑制作用的影响：

每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板中，培养板四周孔内每孔加入100μL PBS，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后吸弃培养液，每孔加入槐果碱衍生物(终浓度5.9375、11.875、23.75、47.5、95、190、380μg/mL)，阳性药HCPT(终浓度1.25、2.5、 5、10、20μg/mL)，每孔100μL，空白对照组加等体积培养液，每组设6个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，吸弃上清，每孔加入200μL MTT溶液，继续培养4h，弃上清，尽量无液体残留，每孔再加入150μL DMSO溶液，微量震荡仪振荡5min，用酶标仪在570nm波长处测定OD值，并计算抑制率以及半数抑制浓度(IC50)。

MTT法检测槐果碱衍生物对LO2细胞增殖抑制作用的影响：

每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板中，培养板四周孔内每孔加入100μL PBS，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后吸弃培养液，每孔加入槐果碱衍生物(终浓度6.25、12.5、25、50、100μg/mL)，每孔100μL，空白对照组加等体积培养液，每组设6 个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，吸弃上清，每孔加入200μL MTT 溶液，继续培养4h，弃上清，尽量无液体残留，每孔再加入150μL DMSO溶液，微量震荡仪振荡5min，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度OD值，并计算各给药组的增殖率。

槐果碱衍生物对H22荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率的影响：

小鼠肿瘤模型的建立：

无菌条件下抽取生长良好的H22荷瘤小鼠腹水(活细胞数>97％，淡黄色半透明)，冰浴上保持活力，用生理盐水稀释，制得肿瘤细胞悬液(浓度约1×107/mL)。小鼠右前腋皮下/腹部经75％酒精消毒后，接种，0.2mL/只，每次抽吸前均混匀，建立实体瘤/腹水瘤模型。

实验动物分组与给药：

小鼠随机分为6组，每组10只。实验组：SC剂量20mg/(kg·d)；SCD-2c高、中、低剂量分别为40mg/(kg·d)、20mg/(kg·d)、10mg/(kg·d)；阳性对照组：HCPT剂量3mg/(kg·d)；模型对照组：给予等体积生理盐水。于接种后次日，ip给药，0.2mL/只，1次/d，连续10d。动物室通风良好，温度20-22℃，湿度45-50％，洁净，安静，自然昼夜节律。喂食普通饲料，食量相等3g/(只/d)，全天水供，每日换新鲜水1次，每2-3d换垫料1次。

槐果碱衍生物对荷瘤小鼠抑瘤率的影响：

停药后次日，将小鼠颈椎脱臼处死，剪开腋下皮肤，仔细剥取肿瘤，称瘤重。若模型对照组中20％小鼠的瘤重<400mg或平均重量<1g，则视为肿瘤生长不良，不能进行疗效评定，重复3批，计算抑瘤率。

肿瘤长起来后，每2天测量肿瘤的长径和宽径，根据公式估算肿瘤体积的变化。

槐果碱衍生物对荷瘤小鼠生命延长率的影响：

根据每只小鼠的体重给予不同剂量，于接种24h后，ip给药，连续7d，停药后观察小鼠生存时间，治疗组观察时间为30d(超过此时限者，按30d计算)，重复3批，计算生命延长率。

具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物对SMMC-7721、HepG-2细胞、SGC-7901 细胞、MCF-7细胞生长抑制作用如表1和附图1-4所示：

表1槐果碱及其衍生物作用肿瘤细胞48h后生长抑制作用(n＝6)/>

MTT法检测槐果碱衍生物对肝癌SMMC-7721、肝癌HepG-2、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7的细胞毒作用，分别作用48h后，计算得出羟基喜树碱、槐果碱及其5个衍生物的IC₅₀值和抑制率如表1所示。SC和SCD对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用较好， SC抑制SMMC-7721细胞的IC₅₀值为548.98μg/mL，SCD-2b抑制SMMC-7721细胞的IC₅₀值为44.43μg/mL，SCD-2c抑制SMMC-7721细胞的IC₅₀值为29.53μg/mL，SCD-2d抑制 SMMC-7721细胞的IC₅₀值为23.11μg/mL，SCD-2b和SCD-2e抑制SMMC-7721细胞的IC₅₀值均>100μg/mL，所以，选择SCD-2b、SCD-2c和SCD-2d下一步分别对正常肝细胞LO₂增殖的影响。

具体实施方式一至五制备的一种槐果碱衍生物的产率如表2所示：

表2衍生物产率

从图5能够看出，SCD-2b、SCD-2c和SCD-2d分别给予6.25、12.5、25、50、100μg/mL剂量对正常肝细胞LO₂增殖的影响中，SCD-2b和SCD-2d均对LO₂细胞有一定的毒性作用，SCD-2c对LO₂细胞的毒性作用不明显，虽然SCD-2d抑制SMMC-7721增殖的IC₅₀值较小，但还是选择SCD-2c用于下一步抗肿瘤机制研究。

表3 SC和SCD-2c对H₂₂荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响(n＝10)

由表3和图6可知，模型对照组平均瘤重大于1g，说明肿瘤生长良好，造模成功。具体实施方式三制备的一种槐果碱衍生物SCD-2c能够有效抑制H₂₂荷瘤小鼠的肿瘤细胞生长，明显改善生存状态，提高生存质量。与模型对照组相比，SCD-2c各剂量组小鼠平均瘤重均有显著性差异(P<0.01)，其中，高剂量组抑瘤效果最明显，抑瘤率为59.63％。

表4 H₂₂荷瘤小鼠瘤体积变化(n＝10)/>

表4和图7可知，SCD-2c能够抑制H22荷瘤小鼠瘤体积的增长，与模型对照组相比，均具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，其中，SCD-2c 40mg/mL剂量组的瘤体积最小。

表5 SC和SCD-2c对H₂₂荷瘤小鼠生存时间和生命延长率的影响(n＝10)

表5和图8可知，与模型对照组相比，各给药组H₂₂荷瘤小鼠生存时间均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，SCD-2c能够提高小鼠生命延长率，且呈剂量依赖性。

表6 H₂₂荷瘤小鼠体重变化(n＝10)

从表6和图9可知，模型组11天内小鼠体重有增加；HCPT组由于化疗药的毒副作用，小鼠体重下降；SCD-2c各剂量组小鼠体重维持稳定。与模型对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)。

通过以上实验，确定具体实施方式三制备的槐果碱衍生物SCD-2c高、中、低剂量分别为40mg/(kg·d)、20mg/(kg·d)、10mg/(kg·d)，以此做为体内实验的给药剂量。SCD-2c三个剂量均具有良好的抑制H₂₂荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，与模型对照组相比，各给药组荷瘤小鼠瘤重差异显著(P<0.01)，其中，高剂量组抑瘤效果最好，抑瘤率为59.63％。同时，SC选用20mg/(kg·d)剂量给予H₂₂荷瘤小鼠，抑瘤率为22.46％，抑瘤活性低于 SCD-2c。从生命延长率来看，与模型对照组相比，各给药组均有差异(P<0.01或P<0.05)，具有剂量依赖性，尤以高剂量组效果最明显，生命延长率为49.53％。提示SCD-2c具有一定的抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤的生长，延长生存期。

对具体实施方式三制备的槐果碱的衍生物SCD-2c进行以下进行细胞培养实验，实验方法具体为：

取出肿瘤细胞株冻存管，迅速放入37℃水浴中，不断晃动，融化后移入离心管，加入3mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，1000r/min离心5min，弃上清，用3mL培养液重悬，将细胞悬液转移到培养瓶中，再加3mL培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，次日更换一次培养液。复苏后的细胞每2-3d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

倒置显微镜观察SCD-2c对SMMC-7721细胞形态的影响：

取对数生长期细胞，倒弃培养液，用3mL PBS缓冲液十字花形洗涤2次，0.25％胰蛋白酶1mL消化后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化，稀释成5×104个/mL 的细胞悬液。

每孔1mL细胞悬液接种于6孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h 后每孔加入SCD-2c(终浓度14.5、29、58μg/mL)，阳性药HCPT(终浓度1.7μg/mL)，空白对照组加等体积培养液，每孔1mL，每组设3个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜蛋白含量的影响

取对数生长期细胞，倒弃培养液，用3mL PBS缓冲液十字花形洗涤2次，0.25％胰蛋白酶1mL消化后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化，稀释成5×104个/mL 的细胞悬液。每孔1mL细胞悬液接种于6孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后每孔加入槐果碱衍生物2c(终浓度14.5、29、58μg/mL)，阳性药HCPT(终浓度1.7μg/mL)，每孔1mL，空白对照组加等体积培养液，每组设3个平行孔，置于37℃、 5％CO2培养箱中培养48h后，使用胰蛋白酶消化收集各组肿瘤细胞于离心管中。用10mL 蒸馏水混匀，低渗破膜1h，3000r/min离心10min，洗涤2次，弃上清，用1mL生理盐水悬浮肿瘤细胞膜，按照BCA试剂盒说明操作。

表7膜蛋白含量的测定

混匀，静置10min后，蒸馏水调零，595nm波长处测定吸光度值。

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜胆固醇含量的影响：

用生理盐水悬浮收集的肿瘤细胞膜，按照胆固醇含量检测试剂盒说明操作。

表8胆固醇含量的测定

混匀后，37℃水浴5min，蒸馏水调零，546nm波长处测定吸光度值。

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜唾液酸含量的影响：

用生理盐水悬浮收集的肿瘤细胞膜，按照唾液酸含量检测试剂盒说明操作。

表9唾液酸含量的测定

混匀后，100℃水浴15min，流水冷却，3500r/min离心10min，取上清液，蒸馏水调零，560nm波长处测定吸光度值。

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜流动性的影响：

荧光标记：取收集的肿瘤细胞膜2mL(膜蛋白量0.5mg/mL)，加入2mL PBS混匀作为空白对照，另取加入新配好的2mmol/L DPH 2mL，快速混匀，37℃温育30min，3000r/min 离心10min，PBS洗2次，弃上清，用4mL PBS悬浮细胞膜。

采用荧光分光光度计，氙灯光源，荧光激发波长362nm，发射波长432nm，狭缝10nm，温度25℃。分别测定与激发偏振光振动方向平行和垂直时的荧光偏振光强度I11、I⊥。计算荧光偏振度P值，以及微黏度η和流动性LFU。

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜封闭度的影响：

将膜样本蛋白终浓度控制在0.6mg/mL，将沉淀的肿瘤细胞膜加入蒸馏水，即获得不封闭影泡，采用Zamudio法对细胞膜的封闭度进行测定。

放置10min后，分别在不加皂素及加皂素的样本中加入6mmol/L NaDH 0.1mL。从加入NaDH开始，420nm波长处，每隔1min测一次，连续测6min的OD值。不加入NaDH 外，其它操作同上，作为比色对照。

表10封闭度的测定

SCD-2c对SMMC-7721细胞膜离子通道Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase活性的影响：

用生理盐水悬浮收集的肿瘤细胞膜，按照ATP酶活性测定试剂盒说明操作。

表11 ATP酶活性的测定

混匀后，37℃水浴10min。向A、B、E管中分别加入50μL试剂7，再向A管中加入 100μL样本，混匀，3000-4000r/min离心10min，取100μL上清定磷。混匀后，45℃水浴 20min。冷却至室温，蒸馏水调零，在660nm处测定吸光度值。

以上实验结果分析如下：

如图10所示，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞状态良好，贴壁生长、细胞饱满、边缘清晰；HCPT组肝癌SMMC-7721细胞生长稀疏，可见大多数细胞悬浮于培养液中； SCD-2c组随着给药剂量的加大，肝癌SMMC-7721细胞生长稀疏，贴壁细胞逐渐减少，逐渐变圆变粗糙、体积变小、折光性减弱，高剂量这种作用最为明显，部分细胞出现破裂现象。

表12对SMMC-7721细胞膜总蛋白含量的影响(n＝10)

从表12和图11可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜总蛋白含量为 (1.2638±0.0197)g/L，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜总蛋白含量为(0.9389±0.0189) g/L，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜总蛋白含量分别为(1.0305±0.0137) g/L、(0.7975±0.0170)g/L、(0.4667±0.0172)g/L，随着给药剂量的增加而减少。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜总蛋白含量具有显著性差异，有统计学意义 (P<0.01)。

从表13和图12可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜唾液酸含量为 (3.5010±0.0354)mmol/L，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜唾液酸含量为 (1.5997±0.0361)mmol/L，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜唾液酸含量分别为(2.2832±0.0449)mmol/L、(1.9817±0.0599)mmol/L、(1.0764±0.0661)mmol/L，随着给药剂量的增加而减少。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜唾液酸含量具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

表13对SMMC-7721细胞膜唾液酸含量的影响(n＝10)

表14对SMMC-7721细胞膜胆固醇含量的影响(n＝10)

从表14和图13可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜胆固醇含量为 (5.6173±0.0961)mol/L，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜胆固醇含量为(3.0727±0.0821) mol/L，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜胆固醇含量分别为 (5.0896±0.0683)mol/L、(3.7906±0.0627)mol/L、(2.7042±0.0564)mol/L，随着给药剂量的增加而减少。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜胆固醇含量具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

从表15和图14可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜流动性为5.5792±0.1414，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜流动性为4.0473±0.1232，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜流动性分别为4.5358±0.1723、3.9293±0.2340、3.3240±0.2211，随着给药剂量的增加而降低。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜流动性具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

表15对SMMC-7721细胞膜流动性的影响(n＝10)

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从表16和图15可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜封闭度为27.1089±0.0681， HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜封闭度为12.5240±0.2895，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜封闭度分别为20.1205±0.1225、14.9675±0.1716、7.0988±0.1465，随着给药剂量的增加而降低。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜封闭度具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

表16对SMMC-7721细胞膜封闭度的影响(n＝3)

从表17和图16可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜Na⁺,K⁺-ATPase活性为(9.4056±0.0819)μmol/mg/h，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜Na⁺,K⁺-ATPase活性为 (3.5024±0.0717)μmol/mg/h，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜 Na⁺,K⁺-ATPase活性分别为(6.2505±0.0404)μmol/mg/h、(4.0161±0.0556)μmol/mg/h、(1.8305±0.0587)μmol/mg/h，随着给药剂量的增加而降低。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜Na⁺,K⁺-ATPase活性具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

表17对SMMC-7721细胞膜Na⁺,K⁺-ATP酶活性的影响(n＝10)

从表18和图17可知，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞膜Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase活性为(2.5967±0.0367)μmol/mg/h，HCPT组肝癌SMMC-7721细胞膜Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase活性为(0.7609±0.0458)μmol/mg/h，SCD-2c低、中、高剂量组肝癌SMMC-7721细胞膜 Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase活性分别为(2.1763±0.0142)μmol/mg/h、(1.3364±0.0259)μmol/mg/h、(0.5077±0.0126)μmol/mg/h，随着给药剂量的增加而降低。与空白对照组相比，各给药组SMMC-7721细胞膜Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase活性具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。

表18对SMMC-7721细胞膜Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性的影响(n＝10)

具体实施方式三制备的槐果碱衍生物不同剂量作用肝癌SMMC-7721细胞48h后，倒置显微镜观察，随着给药剂量的增加，细胞生长密度逐渐变疏，细胞变圆，出现漂浮，并有部分细胞出现碎裂。细胞膜总蛋白、糖类成分唾液酸和脂类成分胆固醇的含量均有明显的减少，存在一定的剂量依赖性。同时，细胞膜的流动性和封闭度也有所下降，导致细胞膜的组成结构发生改变，破坏细胞膜完整性。进而导致细胞膜表面离子通道Na⁺,K⁺-ATPase 活性和Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase活性降低，胞内离子环境失衡，细胞内外间的物质交换和信号转导受干扰。说明肿瘤细胞膜功能障碍可能会引起肿瘤细胞发生凋亡。

从图18可知，经Hoechst33258染色后，荧光显微镜观察，空白对照组肝癌SMMC-7721 细胞体积正常，染色质分布均匀。SCD-2c组细胞随着剂量增加，形态明显发生变化，染色质分布不均，出现起泡现象和凋亡小体。

表19对SMMC-7721细胞的凋亡率影响(n＝3)

流式细胞仪检测，从表19可知，结果表明，SCD-2c作用后，能够诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡，凋亡率分别为(16.59±0.61)％、(29.07±0.66)％、(60.23±1.25)％，呈剂量依赖性关系。

表20 SMMC-7721细胞内游离Ca²⁺浓度的影响(n＝20)

从表20可知，能够使细胞内游离Ca²⁺浓度上升，空白对照组肝癌SMMC-7721细胞荧光强度为15.02±0.35，HCPT组细胞荧光强度为20.74±1.31，SCD-2c低、中、高剂量组细胞荧光强度分别为19.52±1.12、23.41±0.65、34.95±2.17，随着给药剂量的增加而增强。与空白对照组相比，各给药组细胞荧光强度具有显著性差异，有统计学意义(P<0.01)。图19为共聚焦显微镜观察SCD-2c对SMMC-7721细胞内线粒体膜电位变化的影响，而且研究了SCD-2c依赖线粒体途径和内质网途径诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的机制作用，进行了Bip/GRP78、XBP1、Caspase-12和CHOP/GADD 153蛋白的表达量上调，同时线粒体膜电位降低，基质相对高渗，体积膨胀，外膜破裂，导致线粒体内的凋亡因子从中释放，促凋亡蛋白Bax的表达量上调，抑凋亡蛋白Bcl-2表达量下调，最终Bcl-2/Bax 的比值降低，进一步促进Cyt-c的释放，激活Caspase-9蛋白，再激活Caspase-3蛋白，启动了Caspase级联反应的凋亡程序。

从图20、图21可知，经划痕实验、Transwell小室迁移及侵袭实验，发现低剂量SCD-2c 组的运动细胞数和穿膜细胞数减少，SCD-2c还可能通过抑制SMMC-7721细胞分泌基质金属蛋白酶而降低其分解Matrigel胶的能力。经Western Blot实验研究SCD-2c抑制 SMMC-7721细胞迁移及侵袭的分子机制，发现SCD-2c能够使SMMC-7721细胞 E-cadherin蛋白的表达量上调，β-catenin蛋白的表达量下调，细胞间的黏附力增强，抑制 EMT发生；MMP-9蛋白的表达量下调，使得进入下室的细胞减少，进而SCD-2c具有抑制肿瘤细胞迁移及侵袭的能力。提示SCD-2c能够有效抑制SMMC-7721细胞的迁移及侵袭，而且其效应不是由于SCD-2c抑制SMMC-7721细胞增殖或诱导凋亡引起的。

Claims

1.一种槐果碱衍生物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤3、将步骤2得到的第二混合物，旋转蒸发仪后，得到的产物用二氯甲烷萃取2-3次,合并有机相, 旋转蒸发后，得到粗品产物；

步骤4、将步骤3得到的粗品产物用硅胶柱层析纯化，将硅胶湿法装柱，湿法上样，用甲醇-二氯甲烷为洗脱剂进行梯度洗脱，得到一种槐果碱衍生物；

步骤1中槐果碱和二氯甲烷的料液比为1g:20-25ml；

步骤2中加入的硫醇类化合物和槐果碱的物质的量的比为18:4；

步骤2中硫醇类化合物为1,6-己二硫醇；

步骤3中旋转蒸发的温度为40-50℃；

步骤2中混合物和三乙胺的体积比为10-12:1；

步骤2中薄层层析色谱展开剂为甲醇和二氯甲烷混合物，其中甲醇和二氯甲烷的体积比为1: 15，用紫外分析仪检视薄层色谱；

步骤4中所述硅胶柱的规格为2cm×75cm, 硅胶颗粒尺寸为200-300目, 洗脱剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1: 15。

2.一种权利要求1所述的一种槐果碱衍生物的制备方法制备的一种槐果碱衍生物，其特征在于：所述的一种槐果碱衍生物为13-（1,6-己二硫基）-苦参碱。

3.一种权利要求2所述的一种槐果碱衍生物的应用，其特征在于：所述的一种槐果碱衍生物在治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肿瘤的药物中的应用。