CN114874980B - 胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，将细胞在形成取向结构的纤维素纳米晶薄膜上进行培养，能够增强细胞黏附，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜通过如下方法制得：将纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液加入超纯水稀释成稀溶液，转移到放置多巴胺负载的玻片的称量皿中，室温下静置2‑3天，通过缓慢蒸发诱导纤维素纳米晶自组装，得到在玻片上具有取向结构的纤维素纳米晶薄膜。

Description

胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用
技术领域
本发明属于本发明属于生物医学领域，涉及胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用。
背景技术
随着天然多糖或多聚碳水化合物分子是由糖苷键连接的单糖长链，作为生物体来源的大分子化合物，具有无毒、生物相容好、生物可降解、可再生等特性，因此在生物医学领域等方面得到了广泛的应用。纤维素是天然可再生资源，作为植物细胞壁的主要成分广泛存在于各种植物体中。纤维素由于低成本、无毒、良好的生物相容性和易功能化改性等优点被广泛应用于组织工程支架、生物传感器、抗菌/抗病毒材料、油水分离材料和光电材料等各个领域。通过硫酸水解制备的纤维素纳米晶可以在水相中通过自组装形成溶致胆甾相液晶，并且通过蒸发诱导自组装可以将胆甾相结构保留在固体膜中，从而形成多层次结构。但对于胆甾相纤维素纳米晶的研究主要集中在药物递送，生物传感等方面，很少有研究涉及到其胆甾相结构中表面微纳结构对细胞黏附行为的调控。细胞外基质通常具有纳米-微米多层级组织结构，并且在体内不同组织和器官中细胞外基质的组成成分(如胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等)及空间分布都各不相同，并通过自组装过程获得特定组织形态和生理功能。在组织工程和再生医学中需要利用生物医用材料表面微纳结构与细胞直接接触，调控细胞行为，进一步促进组织愈合和再生。因此，生物医用材料应具有模拟细胞外基质的功能，从而促进组织细胞在材料表面的黏附、迁移和增殖。细胞黏附在胚胎发育、组织再生和伤口愈合等多种生物过程中发挥了重要作用。细胞与细胞的黏附作用以及细胞与细胞外基质的黏附作用能够调节细胞行为(如扩散、迁移、分化、聚集等)，以及组织的形成、组织结构和机械性质的完整性。因此，我们通过制备具有不同微纳结构的纤维素纳米晶薄膜实现对细胞黏附行为的调控。
发明内容
有鉴于此，本发明提供胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用。本发明具体提供了如下的技术方案：胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，将细胞在形成取向结构的纤维素纳米晶薄膜上进行培养，所述的取向结构能够增强细胞黏附，所述的薄膜通过如下方法制得：将纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液加入超纯水稀释成稀溶液，转移到放置多巴胺负载的玻片的称量皿中，室温下静置2～3天，通过缓慢蒸发诱导纤维素纳米晶自组装，得到在玻片上取向结构的纤维素纳米晶薄膜。
进一步，所述的纤维素纳米晶悬浮液的稀溶液的质量分数为1～8％。
进一步，所述的纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液的质量分数为4～8％。
进一步，维素纳米晶悬浮液的浓缩液的制备方法为：将棉花和浓硫酸在45～60℃反应2～4h，用超纯水终止反应，并静置过夜，获得的纤维素纳米晶悬浮液用离心/再分散的方法进行纯化，用超纯水透析2～4天，将悬浮液过滤去掉溶液中的杂质并使用旋蒸将悬浮液浓缩，在冰水浴中超声，得到纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液。
进一步，负载多巴胺的玻璃片的制备方法为：玻片用体积分数为3～6％的迪康90碱性清洗剂浸泡过夜，用超纯水清洗玻片，配置2～6wt％的多巴胺溶液，将玻片浸泡在多巴胺溶液中反应1～2h，将多巴胺负载的玻片用超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜的厚度为50～2000μm。
进一步，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜的厚度为300～400μm。
进一步，细胞在胆甾相纤维素纳米晶薄膜的黏附密度为858.3～1238.3numbers/mm2。
进一步，细胞在胆甾相纤维素纳米晶薄膜上的黏附力为70.3～295.8pN。
进一步，所述的细胞可以是小鼠成纤维细胞系(L929)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH/3T3)、小鼠胚胎成骨细胞系(MC3T3)、大鼠心肌细胞系(H9C2)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
本发明的有益效果在于：胆甾相纤维素纳米晶薄膜(L-CNC)表面的取向结构能够增强细胞的黏附。主要表现在：在L-CNC的取向结构表面，细胞黏附密度较高，为1103.4numbers/mm2，细胞铺展面积较大，为414.7μm2；同时，在L-CNC的取向结构表面，细胞具有较高水平的黏附，细胞典型黏附力曲线最大黏附力为133.2pN、细胞脱附距离为35.8um以及黏附能为2.2pJ。这主要是由于L-CNC表面的取向结构能够促进细胞内踝蛋白的表达，进一步促进细胞内肌动蛋白微丝汇集成束，呈有规律的平行排列，使细胞定向拉伸呈长条形，细胞铺展更为显著，进而细胞在L-CNC上形成了较完整的板状伪足和丝状伪足结构，建立起较完善的细胞黏附作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1纤维素纳米晶薄膜表面的微纳结构图。
图2L929细胞在纤维素纳米晶薄膜表面黏附状态图。
图3MC3T3细胞在纤维素纳米晶薄膜表面黏密度和铺展面积统计图。
图4L929细胞在纤维素纳米晶薄膜表面黏附力曲线。
图5纤维素纳米晶薄膜表面L929细胞内肌动蛋白丝免疫荧光染色图。
图6纤维素纳米晶薄膜表面L929细胞内踝蛋白表达量图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)称取5g的棉花烘干30min，加入75mL的浓硫酸在45℃反应2h。反应结束后，用过量的超纯水终止反应，并静置过夜。获得的纤维素纳米晶(CNC)悬浮液用离心/再分散的方法进行纯化，之后用超纯水透析2～4天直到悬浮液pH恒定。将悬浮液过滤去掉溶液中的杂质并使用旋蒸将悬浮液浓缩到质量分数为5～8％，在冰水浴中超声，用冻干法测量悬浮液的质量分数，得到纤维素纳米晶悬浮液。
(2)玻片用5％(体积分数)的迪康90碱性清洗剂(Decon 90)浸泡过夜，超声，随后用超纯水超声清洗两次，氮气吹干。配置4wt％的多巴胺溶液，将玻片浸泡在多巴胺溶液中反应1h，将多巴胺负载的玻片用超纯水冲洗三次，洗去表面未负载的多巴胺，并用氮气吹干，得到负载多巴胺的玻片。
(3)取步骤(1)中得到的纤维素纳米晶悬浮液，加超纯水配制成浓度为1～8％(质量分数)的纤维素纳米晶悬浮液，在聚苯乙烯的称量皿中放置步骤(2)制备的负载多巴胺的玻片，将纤维素纳米晶悬浮液转移到称量皿中，并室温下静置2～3天，通过缓慢蒸发诱导自组装，在玻片上形成厚度为50～2000μm的胆甾相纤维素纳米晶薄膜(L-CNC)。L-CNC的表面微纳结构如图1(a)。从图1(a)可以看出悬浮液中纤维素纳米晶的自组装使L-CNC薄膜表面的纤维素纳米晶定向排列，形成了表面取向的组装结构。
对比例1
(1)同实施例步骤(1)。
(2)同实施例步骤(2)。
(3)取步骤(1)中得到的纤维素纳米晶悬浮液，配制成浓度为1～8％(质量分数)的纤维素纳米晶悬浮液，加入5.2×10-3mmol的强电解质PBS，在室温下缓慢蒸发2～3天，在玻片上形成厚度为50～2000μm的无定形纤维素纳米晶薄膜(A-CNC)。A-CNC的表面微纳结构如图1(b)。从图1(b)可以看出该方法形成的A-CNC薄膜表面纤维素纳米晶无规排列，形成了无取向表面。
测试例1 L929细胞黏附效果测试
将实施例1得到的L-CNC和实施例2得到的A-CNC放置在24孔板中，材料灭菌处理。将培养好的L929细胞用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化2min，以每孔2.5×104进行铺板，细胞在材料表面培养24h，细胞黏附效果如图2所示。
图2(a)是L-CNC上L929细胞的黏附效果图，从图中可以看出，在L-CNC表面黏附的细胞密度较高，细胞黏附密度为1103.4numbers/mm2，且细胞铺展面积较大，为414.7μm2。L-CNC上细胞形成了较完整的板状伪足和丝状伪足结构，细胞铺展面积大，表明细胞在L-CNC表面建立起较完善的细胞黏附作用。这说明L-CNC薄膜表面取向的微纳结构对细胞的黏附行为产生了一定的影响，胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构有利于细胞的黏附和铺展。
图2(b)是A-CNC上L929细胞的黏附效果图，从图中可以看出，在无定形纤维素纳米晶薄膜A-CNC上细胞黏附密度仅为418.6numbers/mm2，显著低于L-CNC表面细胞黏附密度，伪足尤其是丝状伪足较少，细胞铺展面积较小，仅为340.1μm2。这说明无定形纤维素纳米晶薄膜表面的微纳结构不利于细胞的黏附和铺展，本发明实施例1的胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构才能产生有效的细胞黏附效果。
测试例2 MC3T3胞黏附效果测试
将实施例1得到的L-CNC和实施例2得到的A-CNC放置在24孔板中，材料灭菌处理。将培养好的MC3T3细胞用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化2min，以每孔1.2×104进行铺板，细胞在材料表面培养24h，细胞黏附效果如图3所示。
图3(a)是MC3T3细胞的黏附密度测定结果，L-CNC表面的MC3T3细胞黏附密度为172.2numbers/mm2，而A-CNC表面MC3T3细胞黏附密度为151.3numbers/mm2，L-CNC表面细胞黏附密度明显高于A-CNC表面，这说明L-CNC薄膜表面取向的微纳结构对细胞的黏附行为产生了一定的影响，相比于无定形纤维素纳米晶薄膜表面微纳结构，胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构有利于细胞的黏附。
图3(b)是MC3T3细胞的铺展面积测定结果，L-CNC表面培养的MC3T3细胞具有较高水平的铺展，铺展面积为2210.9μm2，而A-CNC表面上的细胞铺展面积为1415.6μm2，显著低于L-CNC表面上细胞的铺展面积。这说明，无定形纤维素纳米晶薄膜不能用于细胞的铺展，本发明实施例1的胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构有利于细胞的铺展。
测试例3黏附力测试
将实施例1得到的L-CNC和实施例2得到的A-CNC放置在24孔板中，材料灭菌处理。将培养好的细胞L929用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化2min，以每孔2.5×104进行铺板，细胞在材料表面培养24h，用单细胞力谱测试细胞黏附力。L929的全细胞黏附力典型曲线如图4所示。上曲线为L-CNC，下曲线为A-CNC，曲线的最低点为最大黏附力，曲线左端到水平线为细胞的脱附距离，曲线的积分面积为黏附能。
从图中可以看出，L-CNC表面的细胞典型黏附力曲线最大黏附力为133.2pN、细胞脱附距离为35.8um以及黏附能为2.2pJ。
从图中可以看出，A-CNC表面细胞黏附力曲线表现出较小的最大黏附力，仅为78.4pN，细胞脱附距离为15.2um以及黏附能为0.5pJ，细胞脱附过程中与底面没有明显的分离时间。
由此可见，L-CNC表面细胞的最大黏附力、细胞脱附距离和黏附能均远大于A-CNC表面的细胞，表明细胞在L-CNC表面黏附更好。因此，实施例1的胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构才能对细胞产生有效的黏附。
测试例4肌动蛋白免疫荧光染色测试
将实施例1得到的L-CNC和实施例2得到的A-CNC放置在24孔板中，材料灭菌处理。将培养好的细胞L929用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化2min，以每孔2.5×104进行铺板，细胞在材料表面培养24h，对细胞肌动蛋白进行染色，免疫荧光染色效果如图5所示。可以看到胆甾相纤维素纳米晶表面细胞铺展更为显著，可见清晰的肌动蛋白微丝汇集成束，呈有规律的平行排列，将细胞定向拉伸呈长条形，细胞形态更为典型。而无定形表面组细胞伸展较局限，肌动蛋白丝数量较少。这表明L-CNC更有利于细胞的黏附和进一步的铺展，而A-CNC不利于细胞黏附。综上所述，只有胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构才能产生有效的细胞黏附。
测试例5免疫印迹测试
将实施例1得到的L-CNC和实施例2得到的A-CNC放置在24孔板中，材料灭菌处理。将培养好的细胞L929用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化2min，以每孔2.5×104进行铺板，细胞在材料表面培养24h，提取细胞内踝蛋白，进行免疫印迹试验，效果如图6所示。通过对细胞黏附相关蛋白的表达情况进行了进一步的表征可以看到，在L-CNC表面，细胞踝蛋白的表达量明显高于A-CNC表面。这说明L-CNC表面微纳结构促进了细胞的黏附，A-CNC表面微纳结构对细胞的黏附行为没有促进作用。综上所述，只有胆甾相纤维素纳米晶薄膜表面取向的微纳结构才能产生有效的细胞黏附。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，将细胞在形成取向结构的纤维素纳米晶薄膜上进行培养，能够增强细胞黏附，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜通过如下方法制得：将纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液加入超纯水稀释成稀溶液，转移到放置多巴胺负载的玻片的称量皿中，室温下静置2-3天，通过缓慢蒸发诱导纤维素纳米晶自组装，得到在玻片上取向结构的纤维素纳米晶薄膜。
2.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，所述的纤维素纳米晶悬浮液的稀溶液的质量分数为1～8%。
3.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液的制备方法为：将棉花和浓硫酸在45～60℃反应2～4h，用超纯水终止反应，并静置过夜，获得的纤维素纳米晶悬浮液用离心/再分散的方法进行纯化，用超纯水透析2-4天，将悬浮液过滤去掉溶液中的杂质并使用旋蒸将悬浮液浓缩，在冰水浴中超声，得到纤维素纳米晶悬浮液的浓缩液。
4.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，负载多巴胺的玻璃片的制备方法为：玻片用体积分数为3～6%的迪康90碱性清洗剂浸泡过夜，用超纯水清洗玻片，配置2～6 wt%的多巴胺溶液，将玻片浸泡在多巴胺溶液中反应1~2 h，将多巴胺负载的玻片用超纯水冲洗，氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜的厚度为50~2000 μm。
6.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜的厚度为300~400μm。
7.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，将L细胞在胆甾相纤维素纳米晶薄膜的粘附密度为858.3~1238.3 numbers/mm2。
8.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，将细胞在胆甾相纤维素纳米晶薄膜上的粘附力为70.3~295.8 pN。
9.根据权利要求1所述的胆甾相纤维素纳米晶薄膜在增强细胞黏附上的应用，其特征在于，所述的细胞是小鼠成纤维细胞系、小鼠胚胎成纤维细胞系、小鼠胚胎成骨细胞系、大鼠心肌细胞系、人脐静脉内皮细胞。
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