CN114870090B - 功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜、制备方法及其应用 - Google Patents

功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种功能化nHA/明胶‑壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜、制备方法及其应用，所述功能化nHA是负载有双磷酸盐和纳米Fe3O4粒子的nHA晶体。所述复合仿生骨膜为双层，包括内层明胶纳米纤维支架层和外层壳聚糖纳米纤维支架层，所述功能化nHA和骨形态发生蛋白(BMP)分散于所述内层和外层中，且功能化nHA从内到外浓度梯度降低，而BMP与nHA具有反向梯度关系。本发明采用共混电纺方法将功能化nHA、骨形态发生蛋白BMP负载于电纺纤维中，随着纤维降解吸收逐渐释放；同时，外层高分子量壳聚糖纳米纤维膜对内层膜起保护和阻隔周围不利骨质重建环境干扰因素的作用，维持骨的生长空间，利于新骨质形成。本发明仿生骨膜对原位修复大段骨的缺损具有优异的效果。

Description

功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜、制备方法及 其应用
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜，及其制备方法和应用。
背景技术
目前常用的骨缺损修复技术(Ilizarov技术、带血管腓骨移植及自体松质骨移植等)均存在明显的不足。Ilizarov技术主要通过外固定架牵张成骨修复大段骨缺损，但治疗周期长，钉道感染、对接点骨不连等并发症发生率高，且患者在治疗过程中极为痛苦。带血管腓骨移植技术手术操作复杂，移植骨塑形缓慢、再骨折发生率高，该技术已不被建议用于下肢承重骨缺损的修复。自体松质骨具有骨诱导、骨传导、成骨等优点，但当骨缺损超过4cm时往往出现移植骨吸收及成骨不全。
针对大段骨缺损的修复重建这一难题，Masquelet利用骨水泥在骨缺损处诱导形成膜样组织，再将自体松质骨填充于膜腔内，成功治疗了35例大段骨缺损(5-22cm)患者，并于2010年提出了著名的诱导膜理念。前期研究发现，诱导膜在形成初期(术后2周)由纤维化组织和大量毛细血管组成，4-6周后膜的厚度逐渐变薄、血管数量随之减少，形成类似于天然骨膜的结构；ELISA分析显示，骨缺损修复过程中诱导膜内的生长因子水平与天然骨膜相当，两种膜在促进其内间充质干细胞增殖和成骨分化方面上具有类似的性能。因此，如果模拟天然骨膜的组织结构来设计构建生物膜材料，替代诱导膜用于骨缺损的修复，有望发挥骨膜内诱导成骨的作用。
骨膜是紧密贴附在骨表面的一层致密结缔组织膜，可分为两层：外层由胶原纤维紧密结合而成，富有血管、神经，有营养和感觉作用；内层也称形成层，胶原纤维疏松，并有成骨细胞和破骨细胞，对骨的生长发育、增生、愈合和改建有重要作用。天然骨膜孔径和孔隙率等几何参数显示非对称特点。随着细胞分子生物学和组织工程学等新理论、新技术的融入，引导骨再生(guided bone regeneration,GBR)技术逐渐发展起来，该技术采用天然高分子材料制成生物降解膜，依靠膜创造的独立空间引导内源性骨生成细胞在其表面贴附、增殖分化为成骨细胞，从而修复骨缺损。但这些产品均为单一成分的膜材，不具有生物复合材料的优势，对大段骨缺损的修复能力仍需提高。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜。
本发明提供的功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜是基于一种功能化纳米羟基磷灰石nHA材料制备的，所述功能化nHA是负载有双磷酸盐和纳米Fe3O4粒子的nHA晶体。
所述功能化nHA的制备方法包括步骤：
1)等体积8mM阿仑膦酸钠滴入至40mM nHA溶液中，37℃ 400rpm搅拌16小时后，6000rpm离心3分钟，去除上清并采用去离子水洗涤沉淀5-6次；再用去离子水重溶至5mM；
2)等体积5mM Fe3O4悬液滴入所述步骤1得到的溶液中，37℃ 400rpm搅拌3小时后，6000rpm离心3分钟，去除上清并采用去离子水洗涤5-6次，干燥后得到所述功能化nHA晶体。
进一步，所述nHA溶液的制备过程包括：
100mL(NH4)2HPO4溶液(0.3M)加入100mL Ca(NO3)2溶液(0.5M)；70℃搅拌2h，在此过程中，滴入25％的氨水，使pH值保持在12；在室温下静置72小时后，用去离子水洗涤沉积，直到pH值达到7，125mL去离子水重悬，得到40mM nHA溶液；
所述制备过程反应式为：10 Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8 NH4OH→Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O。
本发明还提供所述功能化nHA在制备仿生骨膜中的应用，所述应用包括如下步骤：
A.以六氟异丙醇为溶剂配制明胶溶液，并将所述功能化nHA和BMP分散于所述明胶溶液中；
B.以二氯甲烷和三氟乙酸混合液为溶剂配置壳聚糖溶液，并将所述功能化nHA和BMP分散于所述壳聚糖溶液中；
C.采用静电纺丝技术将所述步骤A、B得到的两种溶液电纺成功能化nHA/明胶-壳聚糖双层复合仿生骨膜。
进一步，所述步骤A:将明胶以4-8wt％添加于六氟异丙醇溶剂，并在室温下磁力搅拌过夜，以获得均匀明胶溶液；随后将匀质明胶溶液分为5等分，分别向所述溶液内加入12、14、16、18、20wt％的所述功能化nHA和0.4、0.3、0.2、0.1、0wt％的BMP并分别搅拌24小时；
所述步骤B:将6-10wt％的壳聚糖溶解在二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液，并搅拌48小时，然后分成6等分，分别将0、2、4、6、8、10wt％的所述功能化nHA和1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5wt％的BMP溶解在所述壳聚糖溶液中并分别搅拌24小时；
所述步骤C:将步骤A和步骤B配置好的溶液分别装入11个不同的注射器中，由注射泵控制注射器中溶液的流速，注射器的前端采用金属针头，在室温25℃、相对湿度30％-40％环境下进行静电纺丝，静电高压5-20kV，接收距离5-20cm，电纺速率0.8-5mL/h，接收滚筒转速50-600rpm；电纺得到内层疏松、外层致密的拓扑结构功能化nHA/明胶-壳聚糖双层复合仿生骨膜。
进一步，所述二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液中，二氯甲烷与三氟乙酸体积比为3：7。
进一步，所述BMP为BMP-2。
本发明提供的基于上述功能化nHA制备的功能化nHA/明胶-壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜，所述复合仿生骨膜为双层，包括内层明胶纳米纤维支架层和外层壳聚糖纳米纤维支架层，所述功能化nHA和骨形态发生蛋白BMP分散于所述内层和外层中，且功能化nHA从内到外浓度梯度降低，而BMP与nHA具有反向梯度关系。
本发明还提供上述功能化nHA/明胶-壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜在制备治疗骨缺损材料中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本发明从支架的化学组成、构造、细胞因子复合特征等层面出发，模拟自然骨膜的结构，通过静电纺丝制备得到一种全新的功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜。“生物梯度”的堆积构建：膜材料双层结构中，内层疏松，外层致密；采用共混电纺方法将功能化nHA、骨形态发生蛋白(BMP)负载于电纺纤维中，随着纤维降解吸收逐渐释放，且功能化nHA和BMP从内到外具有一个反向的梯度关系；同时，外层是高分子量壳聚糖纳米纤维膜，对内层膜起保护和阻隔周围环境不利骨质重建的干扰因素，维持骨的生长空间，利于新骨质形成。
2.在大鼠股骨骨缺损模型上验证了本发明仿生骨膜对于原位修复大段骨缺损具有优异效果。
附图说明
图1为本发明“生物梯度”仿生骨膜结构示意图
图2为本发明仿生骨膜电镜观察
其中：a.透射电镜观察Fe3O4纳米粒子；b.透射电镜观察nHA；c.透射电镜观察功能化nHA；d.扫描电镜观察“生物梯度”仿生骨膜内外层结构；e.统计仿生骨膜内外层孔径大小；f.透射电镜观察纳米纤维中的功能化nHA；
图3.大鼠股骨损伤修复后μCT结果
其中：control:对照组，GC-GC:本发明仿生骨膜中无BMP和功能化nHA,GC-N:本发明仿生骨膜中无BMP,GC-NB:本发明“生物梯度”仿生骨膜；
图4.HE染色结果分析：
其中：control:对照组，GC-GC:本发明仿生骨膜中无BMP和功能化nHA,GC-N:本发明仿生骨膜中无BMP,GC-NB:本发明“生物梯度”仿生骨膜。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。下述实施方式中，未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1：本发明功能化nHA的制备：
nHA晶体制备采用如下反应式进行：
10 Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8 NH4OH→Ca10(PO4)6(OH)2+20 NH4NO3+6 H2O。
具体步骤如下：100mL(NH4)2HPO4(0.3M)溶液加入100mL Ca(NO3)2(0.5M)溶液中。70℃搅拌2h，在此过程中，滴入25％的氨水，使pH值保持在12。在室温下静置72小时后，用去离子水冲洗沉积，直到pH值达到7，去离子水(125mL)重悬，得到40mM nHA溶液。接下来，8mM阿仑膦酸钠(10mL)滴入至10mL nHA(40mM)溶液中，37℃ 400rpm搅拌16小时后6000rpm离心3分钟，去除上清并采用去离子水洗涤5-6次，再用去离子水重溶至5mM。然后等体积5mMFe3O4悬液滴入上述溶液37℃ 400rpm搅拌3小时后6000rpm离心3分钟，去除上清并采用蒸馏水洗涤5-6次，干燥后得到所述功能化nHA晶体。
实施例2：本发明功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜的制备：
(1)制备明胶溶液：
以六氟异丙醇为溶剂来制备4-8wt％(即，100ml溶液中包括4-8g明胶)的明胶溶液，并在室温下磁力搅拌过夜，以获得均匀溶液。随后将匀质溶液分为5等分，分别向溶液内加入12、14、16、18、20wt％的功能化nHA和0.4、0.3、0.2、0.1、0wt％的BMP-2，并分别搅拌24小时。
(2)制备壳聚糖溶液：将6-10wt％的壳聚糖溶解在二氯甲烷和三氟乙酸体积比为3:7的混合溶剂中，并搅拌48小时，然后分成6等分，分别将0、2、4、6、8、10wt％的功能化nHA和1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5wt％的BMP-2溶解在壳聚糖溶液中，并分别搅拌24小时。
(3)制备本发明功能化nHA/明胶–壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜：静电纺丝溶液的配制如表1所示。将上述配置好的溶液分别装入11个不同的注射器中，由注射泵控制溶液的流速，注射器的前端采用金属针头，通过参数优化：静电高压5-20kV，接收距离5-20cm，电纺速率0.8-5mL/h，接收滚筒转速50-600rpm；筛选电纺液浓度：壳聚糖浓度6-10wt％，明胶浓度4-8wt％，实现内层疏松、外层致密的拓扑结构。电纺丝实验在室温(25℃)、相对湿度30％-40％的环境下进行。将制备的纳米纤维膜在真空烘箱中于室温下干燥1周，以除去残留的溶剂，然后再使用。(如图1所示)
表1
Figure BDA0003643400750000051
试验例1：扫描电镜观察
切取实施例2制备的功能化nHA/明胶-壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜10mm×5mm(纵向×横向)样条。用导电胶将材料的内表面和外表面分别固定在载物台上，用以观察外表面和内表面拓扑形貌。将样本置于25±2℃、50±3％相对湿度条件下平衡处理48h。喷金处理20s以增强材料表面的导电性，置于扫描电镜下进行形貌观察，电压设置为2kV。为了进一步定量纤维的孔径，用Image J软件测量每根纤维之间的距离，每个样本测量100根纤维。纤维孔径分布用高斯曲线进行拟合。(如图2所示)
试验例2：透射电镜观察
在静电纺丝过程中，采用铜网收集电纺纤维丝，使用透射电镜来观察纤维内部的功能化nHA结构。
采用透射电镜可观察到Fe3O4粒子和nHA晶体，电镜显示纳米颗粒大小均一；进一步修饰获得的功能化nHA中明显可以观察到Fe3O4粒子。
通过对静电纺丝参数筛选(明胶：浓度7％，静电高压18kV，接收距离17cm，电纺速率1.2mL/h，接收滚筒转速200rpm；壳聚糖：浓度8％，静电高压17kV，接收距离13cm，电纺速率1mL/h，接收滚筒转速150rpm)，通过对纤维孔径进行统计分析，发现上述技术参数可以实现“生物梯度”仿生骨膜呈现内层疏松、外层致密的拓扑结构。
采用透射电镜对纤维内部结构进行观察，发现纤维内功能化nHA分布均匀，且功能化nHA内部可明显观察到Fe3O4粒子，说明构建的“生物梯度”仿生骨膜符合预期要求。(如图2所示)
试验例3：大鼠股骨缺损修复实验
将40只SD大鼠(雄性，150g)随机分为4组：对照组，GC组(本发明仿生骨膜中无BMP和功能化nHA),GC-N组(本发明仿生骨膜中无BMP),and GC-NB组(本发明“生物梯度”仿生骨膜)。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，剃毛，消毒。右后肢作约20mm矢状切口，钝性剥离显露股骨。然后，使用直径为2.5mm的环钻在腿股骨中部制造圆形缺损。随后，将柱状胶原蛋白支架((2.5×2mm)植入空洞缺损内。然后用无菌GC、GC-n、GC-nb覆盖缺损区域，对照组无覆盖物。最后，使用5-0丝线缝合切口。移植6周后，CO2吸入处死大鼠，解剖股骨进行μCT成像、组织病理学染色。
μCT评估大鼠股骨缺损修复效果：为了骨形成成像，收集股骨样本，在4℃用4％多聚甲醛固定48小时，使用BrukerμCT Skyscan 1272系统(Skyscan,Antwerp,Belgium)扫描。x射线电压70kv，电流142A，分辨率为10m。对旋转中心进行校正和标定后进行感兴趣区域重建，重构使用Nrecon(版本1.6.10)完成。利用(CTvox，版本3.0.0)构建三维图像。
μCT结果显示，GC组、GC-N组和GC-NB组在3周、6周骨大鼠股骨缺损修复明显好于对照组；经过“生物梯度”仿生骨膜(GC-NB组)修复后，缺损处愈合效果最佳。说明“生物梯度”仿生骨膜具有良好的骨缺损修复效果。(如图3所示)
组织病理学染色评估大鼠股骨缺损修复效果：进行组织学分析时，将样品解剖，在室温下4％多聚甲醛中固定48h。10％EDTA溶液脱钙2周，石蜡包埋。垂直于钻孔的长轴获得5μm厚的组织学切片，进行常规HE染色。
HE染色结果显示：对照组缺损处周围有大量结缔组织，未见明显新骨形成。正如预期的那样，GC-NB组观察到成熟的板层骨，并在缺损部位形成封闭结构。此外，在GC和GC-N组中，纤维膜覆盖时形成少量的新生骨组织。GC-NB组的骨矿化量最大，其骨厚度和新生成的骨面积值明显高于其他组。组织病理学结果与μCT结果一致。(如图4所示)
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种功能化纳米羟基磷灰石nHA，其特征在于，所述功能化nHA是负载有双磷酸盐阿仑膦酸钠和纳米Fe3O4粒子的nHA晶体，所述双磷酸盐阿仑膦酸钠、纳米Fe3O4粒子及nHA的摩尔比为：1：5：5；
所述功能化nHA的制备方法，包括步骤：
1)等体积8mM阿仑膦酸钠滴入至40mM nHA溶液中，37℃ 400rpm搅拌16小时后，6000rpm离心3分钟，去除上清并采用去离子水洗涤沉淀5-6次；再用去离子水重溶至5mM；
2)等体积5mM Fe3O4悬液滴入所述步骤1)得到的溶液中，37℃ 400rpm搅拌3小时后，6000rpm离心3分钟，去除上清并采用去离子水洗涤5-6次，干燥后得到所述功能化nHA晶体；
所述nHA溶液的制备过程包括：
100mL 0.3M(NH4)2HPO4溶液加入100mL 0.5M Ca(NO3)2溶液；70℃搅拌2h，在此过程中，滴入25％的氨水，使pH值保持在12；在室温下静置72小时后，用去离子水洗涤沉积，直到pH值达到7，125mL去离子水重悬，得到40mM nHA溶液；
所述制备过程反应式为：10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH4OH→Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O。
2.根据权利要求1所述功能化nHA在制备仿生骨膜中的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
A.以六氟异丙醇为溶剂配制明胶溶液，并将所述功能化nHA和BMP分散于所述明胶溶液中；
B.以二氯甲烷和三氟乙酸混合液为溶剂配置壳聚糖溶液，并将所述功能化nHA和BMP分散于所述壳聚糖溶液中；
C.采用静电纺丝技术将所述步骤A、B得到的两种溶液电纺成功能化nHA/明胶-壳聚糖双层复合仿生骨膜。
3.根据权利要求2所述功能化nHA在制备仿生骨膜中的应用，其特征在于，
所述步骤A:将明胶以4-8wt％添加于六氟异丙醇溶剂，并在室温下磁力搅拌过夜，以获得均匀明胶溶液；随后将匀质明胶溶液分为5等分，分别向所述溶液内加入12、14、16、18、20wt％的所述功能化nHA和0.4、0.3、0.2、0.1、0wt％的BMP并分别搅拌24小时；
所述步骤B:将6-10wt％的壳聚糖溶解在二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液，并搅拌48小时，然后分成6等分，分别将0、2、4、6、8、10wt％的所述功能化nHA和1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5wt％的BMP溶解在所述壳聚糖溶液中并分别搅拌24小时；
所述步骤C:将步骤A和步骤B配置好的溶液分别装入11个不同的注射器中，由注射泵控制注射器中溶液的流速，注射器的前端采用金属针头，在室温25℃、相对湿度30％-40％环境下进行静电纺丝，静电高压5-20kV，接收距离5-20cm，电纺速率0.8-5mL/h，接收滚筒转速50-600rpm；电纺得到内层疏松、外层致密的拓扑结构功能化nHA/明胶-壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜。
4.根据权利要求3所述功能化nHA在制备仿生骨膜中的应用，其特征在于，所述二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液中，二氯甲烷与三氟乙酸体积比为3：7。
5.根据权利要求3、4所述功能化nHA在制备仿生骨膜中的应用，其特征在于，所述BMP为BMP-2。
6.基于权利要求1所述功能化nHA制备的功能化nHA/明胶-壳聚糖梯度纳米复合仿生骨膜，其特征在于，所述复合仿生骨膜为双层，包括内层明胶纳米纤维支架层和外层壳聚糖纳米纤维支架层，所述功能化nHA和骨形态发生蛋白BMP分散于所述内层和外层中，且功能化nHA从内到外浓度梯度降低，而BMP与nHA具有反向梯度关系。
7.权利要求6所述功能化nHA/明胶-壳聚糖双层复合仿生骨膜在制备治疗骨缺损材料中的应用。
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