CN102861362B - 一种连续梯度复合支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种连续梯度复合支架，涉及生物医学材料领域，由水凝胶和磁性复合纳米粒子组成，磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和10%~70%，磁性复合纳米粒子的重量百分含量从连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布，水凝胶为聚乙烯醇与天然多糖两者的水凝胶，磁性复合纳米粒子为纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子。本发明连续梯度复合支架通过添加天然多糖提高细胞相容性，具备高强度和较好生物相容性，能够很好地满足骨软骨天然结构的多层次要求。本发明还公开了一种连续梯度复合支架的制备方法，其易于实施和控制，并具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料及其制备领域，具体涉及用于骨软骨缺损修复的连续梯度复合支架及其制备方法。
背景技术
天然骨软骨为软骨层、钙化层和软骨下骨层的多层次结构，采用骨软骨组织工程的方法修复骨软骨缺损经历了单层支架、双层支架和三层支架三个阶段。单层支架的设计仅考虑到上层的软骨层，忽略了下层的骨层，难以满足天然骨软骨的结构要求，因此，构建双层支架修复骨软骨缺损成为必然。双层支架考虑到仿生模拟上层的软骨结构和下层的骨结构，在治疗骨软骨缺损方面取得了一定的疗效，但忽略了中间层—钙化层，双层支架缺少了钙化层这一中间层，很容易使软骨和软骨下骨分层，甚至使软骨从软骨下骨的骨面脱落，严重影响治疗效果。为了进一步完善支架的设计，研究者随即开始了三层支架的研究，三层支架更精确的模拟了软骨层-钙化层-软骨下骨层的结构，向生物仿生的方向又迈进了一步。
双层支架和三层支架的构建方法相似，各层支架分别制备，随后采用胶粘、缝合等方式结合在一起。由于支架层间存在物理界面的缺陷，支架不是一个连续的整体，难以承受关节运动时所产生的较大负荷，易使支架层间产生裂纹、剥落，进而影响支架的整体力学性能和界面的生物功能，最终影响支架与周围宿主组织之间的融合。
因此，如何从根本上克服层间存在的界面问题是当今多层支架面临的共同问题。聚乙烯醇（PVA）水凝胶具有与关节软骨相似的力学性能。但聚乙烯醇与周围软骨组织的整合性较差，制约了聚乙烯醇水凝胶的单独应用。羟基磷灰石（HAP）是骨组织中的主要无机成分，具有良好的骨传导性和生物活性，能够与骨组织形成骨键合，被广泛应用于骨软骨和骨修复。与羟基磷灰石（HAP）相比，纳米羟基磷灰石（nHAP）具有溶解度较高、表面能较大、吸附性更强、断裂韧性和力学性能增强以及更佳的成骨活性等优点。
公开号为CN 101020083A的中国发明专利申请公开了一种具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，从上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，软骨层由II型胶原和壳聚糖组成，II型胶原/壳聚糖以共价键形式连接，钙化层由II型胶原和羟基磷灰石组成，II型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接，软骨下骨层由I型胶原和羟基磷灰石组成，I型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接，在软骨层和软骨下骨层内都设置有一个以上的空隙，空隙的孔径为100μm~500μm，虽然该技术方案中软骨层材料具有较好的生物相容性，软骨下骨层中羟基磷灰石可以具有较好的机械强度，钙化层的材料加强了组织间的连接强度，但是II型胶原、壳聚糖、I型胶原均没有较好的力学性能，单纯地依靠羟基磷灰石以及层中组分的相应设置来增加力学强度，其仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架仍然会存在强度不佳的缺点。
发明内容
本发明提供了一种连续梯度复合支架，解决了传统多层支架的界面缺陷问题，能够使得支架具备高强度和较好生物相容性的同时，更好地满足骨软骨天然结构的多层次要求。
一种连续梯度复合支架，由水凝胶和磁性复合纳米粒子组成，其中，所述的磁性复合纳米粒子在所述连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和10%~70%，所述的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从所述连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布；
所述的水凝胶为聚乙烯醇与天然多糖两者的水凝胶；
所述的磁性复合纳米粒子为纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子（m-nHAP）。
所述的铁的氧化物为三氧化二铁（即氧化铁）或四氧化三铁。
当磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的底部的重量百分含量小于10%时，骨中的成骨细胞的粘附和增殖会明显降低，不利于成骨细胞的生长，当磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的底部的重量百分含量大于70%时，连续梯度复合支架的压缩强度会明显下降，孔径过大，不利于成骨细胞的生长。
所述连续梯度复合支架的顶部是指距离其顶面小于等于其高度15%的部分，所述连续梯度复合支架的底部是指距离其底面小于等于其高度15%的部分。
壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、甲壳素、葡聚糖等天然多糖是理想的细胞外基质材料，在组织工程支架中添加天然多糖的成分，有利于提高本发明连续梯度复合支架的细胞相容性。作为优选，所述的天然多糖为壳聚糖（Chitosan，CH）、透明质酸（Hyaluronic acid，HA）、硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）、藻酸盐（Alginate，Alg）、甲壳素（Chitin，Chi）、葡聚糖（Dextran，Dex）中的一种或两种以上，可以明显提高本发明连续梯度复合支架的细胞相容性。
本发明连续梯度复合支架从另一个角度出发，跳出了多层支架传统的构建思路，使磁性复合纳米粒子在本发明连续梯度复合支架内部形成连续梯度分布的结构。聚乙烯醇力学性能较佳，天然多糖具有较好的生物相容性以及促软骨活性，所述的磁性复合纳米粒子由具有较佳成骨活性的纳米羟基磷灰石（nHAP）与具有较好生物相容性和生物安全性的铁的氧化物（三氧化二铁或四氧化三铁）复合形成。本发明连续梯度复合支架以力学性能较好的聚乙烯醇为支架材料，添加了天然多糖，提高生物相容性，同时引入具有连续梯度分布的磁性复合纳米粒子共同构建骨软骨组织工程支架，使得本发明连续梯度复合支架在保持支架具备较好力学性能和较好生物相容性的同时，更好地满足了骨软骨天然结构（软骨层-钙化层-软骨下骨层）的多层次要求。
作为优选，所述的连续梯度复合支架上有孔径为1μm～50μm的孔，合适的孔径适合细胞生长，所述的连续梯度复合支架的吸水率为50%～90%。
本发明连续梯度复合支架中，由上至下，磁性复合纳米粒子从无到有，由少增多，形成连续梯度分布，其余为水凝胶，作为优选，所述的磁性复合纳米粒子在所述连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和35%~55%，能够具有较佳的力学性能和孔径，并且非常有利于成骨细胞的生长，在满足了骨软骨天然结构的多层次要求下，使得本发明连续梯度复合支架具有高强度的力学性能。本发明还提供了一种连续梯度复合支架的制备方法，避免了多层支架的传统构建方法导致的界面缺陷问题，采用磁场诱导的方法使纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子在本发明连续梯度复合支架内部形成连续的梯度分布。
一种连续梯度复合支架的制备方法，包括以下步骤：
1）将聚乙烯醇与天然多糖溶解于水中，得到聚合物溶液；
2）将纳米羟基磷灰石/铁的氧化物（三氧化二铁或四氧化三铁）的磁性复合纳米粒子分散在水中，经超声分散得到磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场诱导方法将混合液中的纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，得到连续梯度复合支架。
步骤1）中，作为优选，所述的聚合物溶液中聚乙烯醇的重量百分含量为2%~10%，能够有效提高连续梯度复合支架的力学强度。所述的聚合物溶液中天然多糖的重量百分含量为0.05%~2%，可以明显提高生物相容性。
在使用时，壳聚糖有两种，一种是直接可以用水溶解，另一种是需要水以及少量酸辅助溶解，甲壳素需要水以及少量酸辅助溶解，本发明的制备方法中，天然多糖都需溶解，形式聚合物溶液，可以根据需要加少量的酸，一般可选用酸与水的质量比为1:~3:100。
步骤2）中，纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子（m-nHAP）可参照现有公开文献“开发钌-羟基磷灰石封装的γ-Fe2O3的纳米晶作为一种有效的分子氧氧化催化剂”制备([1]Mori K,Kanai S,Hara T,Mizugaki T,Ebitani K,Jitsukawa K,et al.Development ofruthenium-hydroxyapatite-encapsulated superparamagnetic gamma-Fe2O3nanocrystallites as an efficient oxidation catalyst by molecular oxygen.ChemMater.2007;19:1249-56.)，可以通过控制反应温度的方式，将铁的氧化物控制生成为三氧化二铁或四氧化三铁，得到纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子（γ-Fe2O3/nHAP）或者纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子（Fe3O4/nHAP）。作为优选，所述的磁性复合纳米粒子悬浮液中纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子的重量百分含量为3%~8%，从而非常有利于纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子呈连续梯度分布。
步骤3）中，所述的聚合物溶液与磁性复合纳米粒子悬浮液的质量比为0.1~1.5：1。
步骤3）中，所述的磁场诱导方法为在磁场强度6000~10000高斯的磁场下诱导0.1h～240h，可以有效控制梯度水凝胶呈梯度的程度。
所述的循环冷冻解冻的方法中，冷冻的温度为-40℃～-5℃，冷冻的时间为5h～24h，解冻的温度为4℃～37℃，解冻的时间为5h～24h，循环冷冻解冻的次数为3次～15次，形成凝胶化的同时从而可以提高本发明连续梯度复合支架的力学强度。经循环冷冻解冻即可形成孔，孔径为1μm～50μm。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明连续梯度复合支架跳出了多层支架传统的构建思路，使磁性复合纳米粒子在本发明连续梯度复合支架内部形成连续梯度分布的结构。本发明连续梯度复合支架以力学性能较好的聚乙烯醇为支架材料，添加了壳聚糖（CH）、透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、藻酸盐（Alg）、甲壳素（Chi）、葡聚糖（Dex）等天然多糖中的一种或两种以上，提高生物相容性，同时引入具有连续梯度分布的磁性复合纳米粒子共同构建骨软骨组织工程支架，使得本发明连续梯度复合支架在保持支架具备较好的力学性能和较好的生物相容性的同时，更好的满足了骨软骨天然结构（软骨层-钙化层-软骨下骨层）的多层次要求。
本发明连续梯度复合支架的制备方法，该方法与多层支架的传统构建方法不同，避免了多层支架的传统构建方法导致的界面缺陷问题，采用磁场诱导的方法使纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子在本发明连续梯度复合支架内部形成连续的梯度分布，其易于实施和控制，有利于工业化生产，并具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步阐释。
实施例中的聚乙烯醇简写为PVA，壳聚糖简写为CH，透明质酸简写为HA，硫酸软骨素简写为CS，藻酸盐简写为Alg，纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子简写为m-nHAP，m-nHAP为γ-Fe2O3/nHAP或者Fe3O4/nHAP，纳米羟基磷灰石简写为nHAP。
制备例1
γ-Fe2O3/nHAP纳米粒子的制备：采用N2吹泡的方法将30ml去离子水中溶解的氧气去除，然后将1.85mmol FeCl2·4H2O和3.7mmol FeCl3·6H2O加入上述无氧的去离子水中至其完全溶解，形成铁盐水溶液，将铁盐水溶液加入至10ml NH4OH中，90℃水浴并持续磁力搅拌300r/min，1h后生成部分为γ-Fe2O3纳米粒子的原溶液。在部分为γ-Fe2O3纳米粒子的原溶液中，先后加入33.7mmol Ca(NO3)2·4H2O（调pH=11）和20mmol(NH4)2HPO4（调pH=11），90℃水浴并持续磁力搅拌300r/min，2h后，再经室温陈化72h得到纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液。
将磁铁放在盛有纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液的烧杯的底部，利用磁场将γ-Fe2O3/nHAP吸于杯底，将含有未与γ-Fe2O3反应的nHAP的上清液倾倒，并用去离子水将γ-Fe2O3/nHAP多次洗涤至中性，得到纯m-nHAP。
制备例2
Fe3O4/nHAP纳米粒子的制备：采用N2吹泡的方法将30ml去离子水中溶解的氧气去除，然后将1.85mmol FeCl2·4H2O和3.7mmol FeCl3·6H2O加入上述无氧的去离子水中至其完全溶解，形成铁盐水溶液，将铁盐水溶液加入至10ml NH4OH中，在常温25℃下磁力搅拌300r/min，1h后生成Fe3O4纳米粒子原溶液。在Fe3O4纳米粒子原溶液中，先后加入33.7mmol Ca(NO3)2·4H2O（调pH=11）和20mmol(NH4)2HPO4（调pH=11），在常温25℃下磁力搅拌300r/min，2h后，再经室温陈化24h得到纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子（Fe3O4/nHAP）溶液。
将磁铁放在盛有纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子溶液的烧杯的底部，利用磁场将Fe3O4/nHAP吸于杯底，将含有未反应的nHAP的上清液倾倒，并用去离子水将Fe3O4/nHAP多次洗涤至中性，得到纯m-nHAP。
实施例1
1）将5.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于40.0g去离子水中，加热使之溶解，得到A1溶液，再将0.5g CH溶解于25.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到70.5g的聚合物溶液；
2）将制备例1制备的5.5g纯m-nHAP分散在134.7g的去离子水中，经超声分散得到140.2g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导120h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-5℃，冷冻时间为24h，解冻温度为4℃，解冻时间为24h，循环冷冻解冻的次数为15次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。该连续梯度复合支架上有孔径为5μm～8μm的孔，吸水率为70%。
将步骤1）制备的聚合物溶液直接经步骤3）中的循环冷冻解冻的方法使其凝胶化，制得聚乙烯醇水凝胶支架，用作对比。将本实施例制备的聚乙烯醇水凝胶支架和连续梯度复合支架用型号为Instron5567万能材料试验机测试其压缩强度，压缩速度为1mm/min，最大压缩形变为98%，测得聚乙烯醇水凝胶支架的压缩强度为8.8±2.0MPa，本发明连续梯度复合支架的压缩强度为16.0±1.2MPa。
将本实施例的连续梯度复合支架用热失重（TGA）的方法测试在不同高度下测试其组成，具体方法：采用梅特勒TGA/DSC1仪器，25℃~800℃，加热速率20℃/min。将圆柱形连续梯度复合支架沿其轴向平均分成7份测试样品，每份测试样品大小：直径为8mm、高度为1mm，每份测试样品在梅特勒TGA/DSC1仪器中煅烧，PVA被烧掉，只剩下m-nHAP的质量，得到不同测试样品中m-nHAP的质量与每份测试样品的总质量之百分比。连续梯度复合支架整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和45%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。其他实施例在不同高度下测试其组成的方法同上。成骨细胞在连续梯度复合支架表面生长行为的定量评价方法：成骨细胞采用hFOB1.19人SV40转染成骨细胞，购自中国科学院细胞库，从37℃、5%CO2的孵箱中取出铺满成骨细胞的培养瓶，吸出旧培养液，PBS缓冲液清洗2次，加入0.25%胰酶（Gibco）后，在37℃、5%CO2的孵箱中作用4min，倒置光学显微镜下观察，见大部分（约80%）细胞开始回缩成球形，立即加入适量的全液[全液由重量百分含量89%DMEM nutrientmixF12培养基（Gibco）、10%胎牛血清（Gibco）以及1%青霉素-链霉素（Gibco）组成]终止消化，吹打使细胞分散均匀，细胞记数板记数（细胞密度1.0×105个/ml）后，将2ml细胞悬液（第8代）接种于24孔板中的连续梯度复合支架表面（直径8mm，厚度7mm）随后将样品放在37℃、5%CO2的孵箱中培养7天后，将样品换到新的24孔细胞培养板中，每孔加2ml全液，再加200μlCCK-8液（C008-3，上海七海复泰生物科技有限公司），在37℃、5%CO2的孵箱中孵化6h至溶液染色变深，每孔中取200μl反应液于96孔培养板中，450nm波长下用酶标仪（MD Spectra Max 190）测溶液的吸光度（OD）。实施例1制备的聚乙烯醇水凝胶支架的吸光度值为0.47±0.04，实施例1制备的连续梯度复合支架的吸光度值为1.56±0.03。其他实施例的连续梯度复合支架的吸光度值评价方法同上。
此外，本发明采用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）细胞核荧光染色的定性评价方法分别研究了成骨细胞在实施例1制备的聚乙烯醇水凝胶支架和连续梯度复合支架上培养3天的生长情况，实验结果表明细胞在本发明连续梯度复合支架上粘附的数量明显优于在聚乙烯醇水凝胶支架上粘附的数量，可见本发明连续梯度复合支架具有较好的生物相容性。
实施例2
1）将10.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于100.0g去离子水中，加热使之溶解，得到A1溶液，再将0.1g HA溶解于5.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到115.1g的聚合物溶液；
2）将制备例1制备的40.4g纯m-nHAP分散在990.8g的去离子水中，经超声分散得到1031.2g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为6000高斯的磁场诱导240h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-40℃，冷冻时间为5h，解冻温度为37℃，解冻时间为5h，循环冷冻解冻的次数为3次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。该连续梯度复合支架上有孔径为15μm～25μm的孔，吸水率为65%，压缩强度为14.0±1.5MPa。
将本实施例的连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和70%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例2制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为0.83±0.11。
实施例3
1）将10.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于100.0g去离子水中，加热使之溶解，得到A1溶液，再将0.1g HA溶解于5.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到115.1g的聚合物溶液；
2）将制备例2制备的40.4g纯m-nHAP分散在990.8g的去离子水中，经超声分散得到1031.2g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为6000高斯的磁场诱导240h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-40℃，冷冻时间为5h，解冻温度为37℃，解冻时间为5h，循环冷冻解冻的次数为3次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。该连续梯度复合支架上有孔径为15μm～25μm的孔，吸水率为66%，压缩强度为13.5±1.5MPa。
将本实施例的连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和68%，纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例3制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为0.80±0.10。
实施例4
1）将3.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于30.0g去离子水中，加热使之溶解，得到A1溶液，再将1.0g CS溶解于50.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到84g的聚合物溶液；
2）将制备例1制备的2.7g纯m-nHAP分散在65.4g的去离子水中，经超声分散得到68.1g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为10000高斯的磁场诱导1h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-22.5℃，冷冻时间为13h，解冻温度为20.5℃，解冻时间为13h，循环冷冻解冻的次数为8次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。该连续梯度复合支架上有孔径为1μm～5μm的孔，吸水率为80%，压缩强度为20.0±1.5MPa。
将本实施例的连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和38%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例4制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为1.42±0.13。
实施例5
1）将2.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于20.0g去离子水中，加热使之溶解，得到A1溶液，再将0.2g CS溶解于10.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到32.2g的聚合物溶液；
2）将制备例1制备的3.3g纯m-nHAP分散在80.9g的去离子水中，经超声分散得到84.2g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导100h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-30℃，冷冻时间为15h，解冻温度为30℃，解冻时间为15h，循环冷冻解冻的次数为9次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。连续梯度复合支架上有孔径为7μm～15μm的孔，吸水率为67%，压缩强度为15.0±2.6MPa。
将本实施例的连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和50%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例5制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为1.47±0.09。
对比例1
1）将5.0g PVA（聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司）溶解于65.5g去离子水中，加热使之溶解，得到70.5g的聚合物溶液；
2）将制备例1制备的5.5g纯m-nHAP分散在134.7g的去离子水中，经超声分散得到140.2g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3）将步骤1）中的聚合物溶液和步骤2）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导120h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-5℃，冷冻时间为24h，解冻温度为4℃，解冻时间为24h，循环冷冻解冻的次数为15次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。该连续梯度复合支架上有孔径为3μm～7μm的孔，吸水率为75%，压缩强度为16.5±1.5MPa。
将本对比例的连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和43%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。对比例1制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为0.61±0.07。
通过对比例1和实施例1得到的连续梯度复合支架的吸光度值进行比较，可见，实施例1中添加壳聚糖（CH）后，非常有利于成骨细胞的生长，其生物相容性明显提高，并且仍具有较佳的力学性能，结合实施例2~5的连续梯度复合支架的吸光度值可知，磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和35%~55%，非常有利于成骨细胞的生长，并且从压缩强度的力学数据可知，具有较佳的力学性能。
Claims (1)
1.一种连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）γ-Fe2O3/nHAP纳米粒子的制备：采用N2吹泡的方法将30ml去离子水中溶解的氧气去除，然后将1.85mmol FeCl2·4H2O和3.7mmol FeCl3·6H2O加入上述无氧的去离子水中至其完全溶解，形成铁盐水溶液，将铁盐水溶液加入至10ml NH4OH中，90℃水浴并持续磁力搅拌300r/min，1h后生成部分为γ-Fe2O3纳米粒子的原溶液；在部分为γ-Fe2O3纳米粒子的原溶液中，先后加入33.7mmol Ca(NO3)2·4H2O调pH=11和20mmol(NH4)2HPO4调pH=11，90℃水浴并持续磁力搅拌300r/min，2h后，再经室温陈化72h得到纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液；
将磁铁放在盛有纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液的烧杯的底部，利用磁场将γ-Fe2O3/nHAP吸于杯底，将含有未与γ-Fe2O3反应的nHAP的上清液倾倒，并用去离子水将γ-Fe2O3/nHAP多次洗涤至中性，得到纯m-nHAP；
2）将3.0g聚乙烯醇PVA溶解于30.0g去离子水中，PVA采用聚合度1750±50、国药集团化学试剂上海有限公司的产品，加热使之溶解，得到A1溶液，再将1.0g硫酸软骨素CS溶解于50.0g去离子水中得到A2溶液，将A1溶液和A2溶液混合，得到84g的聚合物溶液；
3）将制备的2.7g纯m-nHAP分散在65.4g的去离子水中，经超声分散得到68.1g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
4）将步骤2）中的聚合物溶液和步骤3）中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为10000高斯的磁场诱导1h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-22.5℃，冷冻时间为13h，解冻温度为20.5℃，解冻时间为13h，循环冷冻解冻的次数为8次，混合液凝胶化后得到连续梯度复合支架，该连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm；该连续梯度复合支架上有孔径为1μm～5μm的孔，吸水率为80%，压缩强度为20.0±1.5MPa；
将该连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和38%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布，制备的连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为1.42±0.13。
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