CN114869894A

CN114869894A - 一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用

Info

Publication number: CN114869894A
Application number: CN202210503271.3A
Authority: CN
Inventors: 李金宇; 徐芃; 周阳; 宋美如; 谢道情; 鄢树枫; 黄明东
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-08-09

Abstract

本发明公开了一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用。所述的小分子化合物为地尔硫卓或格列本脲。本发明首次发现地尔硫卓和格列本脲具有尿激酶受体（uPAR）抑制活性，可应用于制备用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物，具有广泛的应用前景。

Description

一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用。

背景技术

尿激酶受体，也被称为尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR），是一种膜锚定糖蛋白，已被证实与多种疾病如肿瘤发展、转移的多个过程密切相关。具体的，uPAR与它的配体尿激酶型血浆蛋白原激活剂（uPA）一起被发现在大多数肿瘤细胞的表面过度表达，包括前列腺、乳腺等恶性肿瘤细胞。uPAR包括一个膜系糖基磷酰肌醇锚和三个Ly6/uPAR/α-神经毒素样结构域，它们形成了一个容纳uPA的口袋。uPA已被证实负责激活肿瘤微环境中的细胞外纤维蛋白溶解系统。激活多种促肿瘤生长因子，降解细胞外基质（ECM），促进血管生成和上皮-间质转化（EMT），从而在各方面促进肿瘤的生长和转移。在实验模型或临床前研究中，对肿瘤细胞表面uPA-uPAR相互作用的干预已被证明可以抑制肿瘤的增殖和侵袭。因此，破坏uPA-uPAR相互作用的分子被认为是有效的抗肿瘤和抗肿瘤转移药物。然而，目前还没有已批准上市的uPAR靶向药物。一种uPAR靶向多肽示踪剂在已完成的临床I期和II期试验中取得了令人鼓舞的结果，其可用于前列腺癌患者uPAR的预后成像（NCT02930724）。

地尔硫卓（Diltiazem，附图中备注为22），其结构式为：

，又名硫氮卓酮或哈氮卓，作为一种选择性非二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，可缓解心绞痛，可使血压降低，有负性肌力作用，并可减慢窦房结和房室结的传导，其在治疗心血管疾病方面应用范围较广，疗效较显著。通过抑制钙离子向末梢血管、冠状血管平滑肌细胞及房室结细胞内流而达到扩张血管、松弛周围动脉血管的平滑肌，使外周血管阻力下降而发挥其降压作用，临床可用于各种性质高血压，尤其对高血压急症合并心律失常、心绞痛患者尤为适用，钙通道阻滞对缺血性急性肾衰有防治作用，在高血压患者中对肾脏有一定保护作用。格列本脲（Glibenclamide，附图中备注为26），其结构式为：

，又名优降糖、达安疗，属于第二代口服磺脲类降糖药，作用机理同甲苯磺丁脲，其降血糖作用为磺酰脲类中最强，作用强度为甲苯磺丁脲的200～250倍。可选择性作用于胰腺β细胞、促进胰岛素的分泌，可增强外源性胰岛素的降血糖作用，加强胰岛素的受体后作用。临床上主要用于治疗轻度、中度非胰岛素依赖型糖尿病。

到目前为止，从未发现任何关于地尔硫卓或格列本脲具有尿激酶受体uPAR抑制活性的相关报道。本发明首次发现了地尔硫卓和格列本脲对uPAR的抑制作用，并提出将地尔硫卓和格列本脲通过靶向作用于uPAR用于制备用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子化合物地尔硫卓和格列本脲的新应用，即在制备作为尿激酶受体uPAR抑制剂药物中的应用，众多类型的疾病如某些类型肿瘤细胞过量表达uPAR，这两种小分子化合物可通过靶向作用于肿瘤细胞表面的uPAR起到抗肿瘤和抗肿瘤转移作用。因而，地尔硫卓和格列本脲为临床中尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的治疗提供了两款安全有效的小分子化合物，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用，所述的小分子化合物为地尔硫卓或格列本脲。

进一步的，上述的地尔硫卓的化学结构式为：

；上述的格列本脲的化学结构式为：

。

进一步的，上述的应用为在制备用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物中的应用。

进一步的，上述的用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物中含有浓度为30~100 μM的地尔硫卓或浓度为50~300 μM格列本脲。

进一步的，上述的用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物可制成药学上可接受的任一剂型。

进一步的，上述的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂。

本发明通过表面等离子体共振（SPR）分析发现，地尔硫卓和格列本脲与uPAR均具有较高的结合强度，解离常数K_D值分别为39±8 μM和40±2 μM，这为该制剂在作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用提供了理论依据；Transwell侵袭实验结果显示，地尔硫卓和格列本脲在体外均能明显抑制uPAR高表达细胞系的侵袭作用，而对低表达uPAR的细胞系没有明显抑制作用；小鼠CT-26肿瘤模型结果显示地尔硫卓和格列本脲在体内能够有效地抑制高表达uPAR的CT-26肿瘤的生长，而且对小鼠没有明显毒副作用；小鼠肺转移模型结果也显示地尔硫卓和格列本脲对uPAR高表达CT-26癌细胞肺转移具有明显抑制作用。以上结果充分说明，地尔硫卓和格列本脲能够用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病，这表明其在临床研究中的潜在用途。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

地尔硫卓和格列本脲是临床处方药，分别用于日常调节心律和血糖水平，其安全性经过大量实践验证，具有明确的药物代谢动力学等临床数据。本发明首次发现了地尔硫卓和格列本脲具有uPAR抑制剂的功能，在临床使用的剂量下（地尔硫卓：30~100 mg/kg；格列本脲：50~300 mg/kg）可抑制uPAR高表达细胞系的侵袭作用，并抑制高表达uPAR的肿瘤的生长和转移，可用于制备开发用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物，这为地尔硫卓和格列本脲提供了一种新的用途。以细胞表面高表达uPAR的肿瘤为例，地尔硫卓和格列本脲可抑制uPAR-uPA的结合，这并不影响肿瘤细胞的生存能力，但其二者可干预癌症发展的多个过程，包括抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭、抑制促癌因子（MMPs、生长因子等）的生成，通过多种途径达到抗肿瘤作用，这比常规化疗药更加温和，具有更小的副作用。

附图说明

图1为SPR方法测定的地尔硫卓（NO.22）和格列本脲（NO.26）与uPAR的解离常数K_D值。

图2为Transwell侵袭实验测定的地尔硫卓（NO.22）和格列本脲（NO.26）对uPAR高表达细胞侵袭作用的影响。

图3为小鼠CT-26肿瘤模型验证的地尔硫卓（NO.22）和格列本脲（NO.26）在体内的抗肿瘤作用统计图。

图4为小鼠肺转移模型验证的地尔硫卓（NO.22）和格列本脲（NO.26）对uPAR高表达癌细胞系肺转移的抑制作用统计图。

具体实施方式

为更好地理解本发明的内容，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围不局限于实施例表述的范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。以下实施例中，地尔硫卓的化学结构式为：

；

格列本脲的化学结构式为：

。

实施例1：通过表面等离子体共振（SPR）测定地尔硫卓和格列本脲对uPAR的结合强度。

实验方法：

为了确定地尔硫卓和格列本脲与稳定的uPAR变体uPAR（H47C/N259C）结合的平衡解离常数（K_D），在BIACORE T200仪器（BIACORE, Uppsala, Sweden）上进行表面等离子体共振分析。将uPAR（H47C/N259C）耦合到CM5芯片上，在耦合缓冲液（10 mM乙酸钠，pH 5.0）中注入浓度为30 μg/mL的uPAR（H47C/N259C）蛋白，目的是使耦合水平达到约500反应单位（RU）。耦合后用乙醇胺进行表面封闭。用同样的方法制备一个参照通道，不耦合uPAR（H47C/N259C）。在25℃下，以每分钟30 μL的流速注入含有浓度为100 μM小分子化合物地尔硫卓或格列本脲的运行缓冲液（20 mM pH7.5 HEPES + 0.15 M NaCl + 0.005% (w/v) Tween20）。随后，在300秒内监测解离情况。记录增加的RU减去空白。选择RU值超过10的化合物来测定K_D值。K_D值的测定是在浓度为0~100 μM的情况下通过上述设置条件进行的。K_D值的计算是基于稳态亲和力的调制。

实验结果：

SPR分析表明，地尔硫卓和格列本脲均可与uPAR（H47C/N259C）结合，K_D值分别为39±8 μM和40±2 μM，如图1所示。

实施例2：Transwell侵袭实验鉴定地尔硫卓和格列本脲体外抗肿瘤转移功效。

实验方法：

对于迁移实验，将无血清培养基中的5×10⁴个细胞（HEK-293T-uPAR细胞，或PC-3细胞或Caco-2细胞）置于带有8 μm孔的细胞培养插件的Transwell渗透性支架的上腔中。PC-3细胞和Caco-2细胞购于中科院上海细胞所。HEK-293T-uPAR细胞高表达尿激酶受体（uPAR），其由福州大学化学学院提供。对于侵袭实验，BD Matrigel涂层室的制备严格按照康宁供应商提供的操作说明完成。简而言之，将100 μL稀释50倍、浓度约为0.2~0.3 mg/mL的BD Matrigel涂布在康宁Transwell小室的上室，并置于37℃的恒温培养箱中2小时。使用不含胎牛血清的DMEM培养基将100 μL的5×10⁴个细胞接种到上腔，然后加入不同浓度（0，25，50，100μM）的地尔硫卓或格列本脲。在24孔板的下腔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培养基，并在细胞培养箱（37℃，5% CO₂）中培养24小时。然后，用棉签清除膜上侧的剩余细胞，将迁移或侵入膜下侧的细胞固定在甲醇中15分钟，将膜风干后用结晶紫染色15分钟，用显微镜对膜下侧的细胞进行成像。最后，用33%乙酸/水（V/V）洗脱结晶紫，用酶标仪测量570nm处的吸光度，即可计算出侵袭率。

实验结果：

如图2所示，地尔硫卓和格列本脲以剂量依赖的方式抑制了HEK-293T-uPAR细胞的侵袭（图2A）；在野生型癌症细胞系中，地尔硫卓和格列本脲也都以剂量依赖的方式明显抑制了uPAR表达水平较高的PC-3细胞的侵袭（图2B），而对其他uPAR表达水平低的肿瘤细胞没有明显抑制作用（图2C）。因此，地尔硫卓和格列本脲具有uPAR抑制剂的功能，进而可抑制uPAR高表达的癌细胞的侵袭。

实施例3：小鼠CT-26肿瘤模型验证地尔硫卓和格列本脲在体内的抗肿瘤作用。

实验方法：

将大约10⁷个有活力的CT-26细胞（ CT-26细胞购于中科院上海细胞所）悬浮在200μL灭菌生理盐水中，接种到每只Balb/c小鼠的背部右下侧。当检测到可触及的肿瘤时，每天用游标卡尺监测肿瘤的大小。肿瘤的体积是用修改后的椭圆体公式1/2×（长×宽²）计算的。当肿瘤体积在接种后3-5天内达到80~100 mm³时，将小鼠随机分为三组（每组5只），平均起始肿瘤大小（80~120 mm³）和体重（20~25克）相当。小鼠口服生理盐水、100 mg/kg地尔硫卓或300 mg/kg格列本脲，每两天一次，持续14天。每隔两天继续记录小鼠的体重和肿瘤体积。在第15天将小鼠麻醉并处死，对肿瘤组织进行切除和称重。

实验结果：

如图3所示，在14天的观察期内，地尔硫卓和格列本脲在抑制肿瘤生长方面表现出相当但明显的疗效（图3A），而对治疗小鼠的体重没有明显的影响（图3B）；通过基于肿瘤组织重量的量化（图3C），地尔硫卓和格列本脲分别抑制了73.2%（P = 0.063）和62.8%（P =0.055）肿瘤的生长。因此，地尔硫卓和格列本脲在体内具有良好的抑制尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的肿瘤的增殖效果。

实施例4：小鼠肺转移模型验证地尔硫卓和格列本脲对uPAR高表达癌细胞系肺转移的抑制作用。

实验方法：

建立了一个基于CT-26细胞的肺转移小鼠模型，其中含有稳定转染的小鼠uPAR（muPAR）和mCherry基因，以评估地尔硫卓和格列本脲在体内的抗转移效果。将体重在20克左右的雄性Balb/c小鼠分为5组，每组6只小鼠。在第1天将200 μL含有10⁶个CT-26-muPAR-mCherry细胞（CT-26-muPAR-mCherry细胞高表达uPAR，其由福州大学化学学院提供）的细胞悬液静脉植入雄性Balb/c小鼠体内，同时对小鼠静脉注射地尔硫卓或格列本脲。每两天连续给药一次地尔硫卓（大剂量：100 mg/kg，小剂量：30 mg/kg）或格列本脲（大剂量：300 mg/kg，小剂量：50 mg/kg），直到第15天，将小鼠麻醉处死，肺部被切除进行分析。小鼠处死后立即对肺部进行称重。用Amersham Imager 600荧光分析仪（GE Healthcare Bio-SciencesAB）对转移性肺部的mCherry荧光进行成像，用488 nm激光二极管进行激发。荧光信号通过收集20×20 mm²范围内的荧光信号进行量化。肺部表面的肿瘤结节在用甲醛浸泡后进行计数。因此，评估转移水平的方法是：1）肺部转移的CT-26-muPAR-mCherry细胞的mCherry荧光；2）肺表面的增生结节；以及3）增生引起的肺部重量增加。

实验结果：

如图4所示，地尔硫卓在低剂量或高剂量时分别抑制了61%或76%的肺毛细血管荧光，格列本脲在低剂量或高剂量下分别抑制了70%或83%的肺毛细血管荧光（图4A），肺部重量（图4B）和结节数量（图4C）的增加也受到明显的抑制。因此，地尔硫卓或格列本脲都具有明显抑制体内与尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的肿瘤生长和转移的效力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用，其特征在于：所述的小分子化合物为地尔硫卓或格列本脲。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的地尔硫卓的化学结构式为：

；所述的格列本脲的化学结构式为：

。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于在制备用于治疗尿激酶和/或尿激酶受体的病理性过度表达有关的疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物中含有浓度为30~100 μM的地尔硫卓或浓度为50~300 μM的格列本脲。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物制成药学上可接受的任一剂型。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂。