CN114848796A - Lsr在制备预防和治疗ibd的药物中的应用 - Google Patents

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CN114848796A CN202210279701.8A CN202210279701A CN114848796A CN 114848796 A CN114848796 A CN 114848796A CN 202210279701 A CN202210279701 A CN 202210279701A CN 114848796 A CN114848796 A CN 114848796A
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Abstract

本发明公开了LSR(脂代谢激活脂蛋白受体)在制备预防和治疗IBD(炎症性肠病)的药物中的应用，通过设计和构建敲除Lsr基因的小鼠模型和过表达LSR的小鼠模型，研究LSR与机体肠道内IBD炎症的发生发展关系，结果表明：LSR本身对于IBD的发生和发展具有保护和改善作用，LSR具有预防和治疗IBD的新用途，并且其没有副作用，治疗效果显著，无并发症的发生，可以从根本上治愈IBD以及预防IBD的发生。

Description

LSR在制备预防和治疗IBD的药物中的应用
技术领域
本发明涉及LSR的新应用，具体涉及LSR在制备预防和治疗IBD的药物中的应用，属于药物技术领域。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是发生于胃肠道且由多种因素相互作用导致的一种慢性、复发性、非特异性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，也包括病理学不能确定为UC或CD的未定型结肠炎(Indeterminate colitis，IC)以及新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)，其中，UC主要累及结直肠，CD则任何消化道均可受累。此外，IBD还可以有一些肠道外的临床表现，但临床特征较为隐匿，根据具体病变部位可能表现为发热、粘膜炎症、腹痛、腹泻及血便等。
针对IBD的治疗，目前的策略主要是诱导缓解(消除症状)和维持缓解(预防复发)。IBD的传统治疗药物包括：氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂等，其中：
(1)氨基水杨酸制剂：5-氨基水杨酸通过抑制NF-kB及清除自由基而发挥作用，临床用于治疗结核病、轻度和中度溃疡性结肠炎，以及溃疡性结肠炎的维持治疗；
(2)糖皮质激素：皮质类固醇激素具有抑制炎症反应、缓解临床症状的作用，可用于IBD急性发作期，不作为维持治疗方案，常用药物包括泼尼松、甲泼尼松、氢化可的松、地塞米松、布地奈德等；
(3)免疫抑制剂：主要用于激素无效或依赖以及激素诱导缓解后的维持治疗，临床上常用的免疫抑制剂药物包括硫唑嘌呤、硫嘌呤、环孢索及他克莫司等。
除氨基水杨酸制剂外，糖皮质激素和免疫抑制剂的副作用都较多，且治疗效果个体差异性较大，常伴有多种肠内及肠外并发症，更重要的是治疗效果有限。
据不完全统计，全球超过500万人患有IBD，其发病率因地区、种族的不同而存在差异，流行病学调查显示，世界范围内IBD的发病率和患病率逐年升高，且在我国IBD的发病率也呈现逐年升高的趋势，已经成为了我国的常见消化系统疾病。IBD作为肠道的慢性、特发性疾病，其病因病理尚未明了，临床疗效尚不够理想。目前，IBD己被列为世界难治性疾病。IBD由于病程长、难治愈、费用高、难以控制、易恶化、甚至会致残，给患者带来了巨大的精神压力和经济负担。因此，早发现、早治疗是目前改善IBD预后的关键，深入探讨IBD的发生机制，寻找有效的干预治疗靶点，不仅具有重要的理论价值，同样也具有十分迫切的现实意义。
脂代谢激活脂蛋白受体(lipolysis stimulated receptor，LSR)为定位于大多数上皮组织中的三细胞紧密连接(tTJ)分子。LSR是angulin家族的成员，也称为angulin-1，是新发现的tTJ分子。LSR包含一个胞外N端Ig样结构域、一个跨膜区和一个胞质C端尾部。
截至目前，LSR已被发现的功能包括：作为细胞之间的屏障和栅栏；参与肝脏脂质代谢；参与细胞迁移、浸润和增殖；作为血脑屏障的组成部分。而LSR在肠道中的作用尚未见报道，其是否参与IBD的发生发展也尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于：通过研究LSR与机体肠道内IBD炎症的发生发展关系，探索LSR在预防和治疗IBD这一方面的新用途。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
通过设计和构建敲除Lsr基因的小鼠模型和过表达LSR的小鼠模型，研究LSR与机体肠道内IBD炎症的发生发展关系，结果表明：
(1)敲除Lsr基因：可以显著增加IBD中的炎性因子的水平，明显增强IBD的炎性细胞浸润水平，同时增加IBD中肠道组织形态的损伤、破坏IBD中潘氏细胞的功能和分布以及增加IBD的发生率；
(2)过表达LSR：可以显著的逆转上述现象，具体的，能够显著降低IBD中的炎性因子的水平，显著减弱IBD的炎性细胞浸润水平，同时改善IBD中肠道组织形态的损伤、改善IBD中潘氏细胞的功能和分布以及显著降低IBD的发生率。
可见，LSR本身对于IBD的发生和发展具有保护和改善作用，LSR具有预防和治疗IBD的新用途。
本发明的有益之处在于：通过研究发现，LSR可以显著改善IBD的病理特征，并且没有副作用，治疗效果显著，无并发症的发生，可以从根本上治愈IBD以及预防IBD的发生。
附图说明
图1(a)是三组小鼠的体重变化情况图；
图1(b)是三组小鼠的疾病活动指数评分结果图；
图1(c)是三组小鼠的结肠的长度的测量结果图；
图2是DSS WT组小鼠和对照组小鼠的结肠组织中Lsr基因的相对表达情况图；
图3是三组小鼠的血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况图；
图4是三组小鼠的结肠组织HE染色结果图；
图5(a)是三组小鼠的结肠组织中Lsr基因的相对表达情况图；
图5(b)是三组小鼠的体重变化情况图；
图5(c)是三组小鼠的疾病活动指数评分结果图；
图5(d)是三组小鼠的结肠的长度的测量结果图；
图6是三组小鼠的血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况图；
图7是三组小鼠的结肠组织HE染色结果图；
图8是三组小鼠的肠道组织中Lsr基因以及IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ基因的相对表达情况图；
图9是三组小鼠的小肠组织HE染色结果图；
图10是三组小鼠的小肠组织中潘氏细胞的免疫荧光染色结果图；
图11是三组小鼠的肠道组织中Lsr基因以及IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ基因的相对表达情况图；
图12是三组小鼠的小肠组织HE染色结果图；
图13是三组小鼠的小肠组织中潘氏细胞的免疫荧光染色结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、实验动物
1、C57BL/6J小鼠
C57BL/6J小鼠购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
2、LsrloxP/loxP小鼠
LsrloxP/loxP小鼠由发明人应用CRISPR Cas9技术构建获得，构建过程具体如下：
在体外在Lsr基因的第一个外显子的两侧各插入一个含有loxP位点的基因序列，随后将构建好的重组基因序列通过电穿孔技术转入C57BL/6J小鼠的胚胎干细胞内，然后将该胚胎干细胞重新植入到假孕小鼠的子宫中，使其发育成为一个完整的胚胎并产生一只转基因小鼠，随后让该转基因小鼠与C57BL/6J小鼠进行杂交(杂交的目的是去除Neo转基因)，获得LsrloxP/-小鼠，之后让LsrloxP/-小鼠进行自交，最终产生LsrloxP/loxP小鼠。
3、villin-Cre小鼠
villin-Cre小鼠购买自Jackson Laboratory。
4、villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)和villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)
villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)和villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)均由发明人通过让LsrloxP/loxP小鼠和villin-Cre小鼠进行杂交获得，获得过程具体如下：
让villin-Cre小鼠与LsrloxP/loxP小鼠进行杂交，获得villin-Cre+/-/LsrloxP/-小鼠，随后让villin-Cre+/-/LsrloxP/-与LsrloxP/loxP小鼠进行杂交，获得villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)；
让villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)与LsrloxP/loxP小鼠进行杂交，获得villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)。
二、研究敲除Lsr基因对溃疡性结肠炎(UC)的影响
1、实验动物分组及给药方法
(1)对照组
villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)，雄性，8周龄，8只，自由饮用蒸馏水，连续给予6天。
(2)DSS WT组
与对照组同窝的villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)，雄性，8周龄，8只，自由饮用用蒸馏水配制的浓度为3％(w/v)的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液(用来诱导小鼠急性结肠炎模型)，连续给予6天。
(3)DSS KO组
与对照组同窝的villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)，雄性，8周龄，8只，自由饮用用蒸馏水配制的浓度为3％(w/v)的葡聚糖硫酸钠溶液，连续给予6天。
2、疾病活动指数评分
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分是一种基于体重变化、粪便硬度和直肠出血情况的综合性的评分，可用于评估肠炎严重程度。
每日对各组小鼠进行称重，记录体重，以第0天的体重为基准，计算体重变化情况，其中，体重下降＜1％计为0分，体重下降1％(含)～5％计为1分，体重下降5％(含)～10％计为2分，体重下降10％(含)～20％计为3分，体重下降≥20％计为4分。
每日对各组小鼠的粪便状态进行观察，其中，粪便形态正常计为0分，粪便较软但可以成型计为1分，粪便为软便且不能成型计为2分，粪便呈腹泻状计为3分。
每日对各组小鼠的直肠的出血情况进行统计，其中，结果为阴性计为0分，结果为阳性但目测不到血迹计为1分，结果为阳性且粪便里可看到血迹计为2分，结果为阳性且有明显出血现象计为3分。
3、取材与样本处理
将各组小鼠用异氟烷醚麻醉后摘眼球采血，4500g/min离心15min，收集血清，保存在-80℃待用。
摘眼球采血后脱颈处死各组小鼠，立即剖开腹腔，暴露腹腔，找到结肠组织(从盲肠末端-肛门部位的肠段)，剪下结肠组织并进行长度测量。
将各组小鼠的完整的结肠制作成“瑞士卷”，用浓度为4％(w/v)的多聚甲醛溶液在4℃下固定24h，用酒精梯度脱水，然后对小鼠的结肠组织进行石蜡包埋，连续切片5μm后进行HE染色，光学显微镜下观察结肠组织的病理学变化。
4、酶联免疫吸附试验
取上述各组小鼠的血清，按照试剂盒中的说明书的记载，对炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6进行检测。
5、RNA提取及实时定量PCR
将小肠样品置于Trizol(Ambion，USA)中进行均质化，获得总RNA。根据制造商(Takara，日本)提供的说明书，使用逆转录系统试剂盒对RNA进行逆转录，然后使用ThermoFisher QS3 PCR仪按照SYBR Green PCR Master Mix(ABI，USA)试剂盒中的说明书的记载进行荧光定量PCR。内参基因为β-actin，基于ΔCT＝Ctgene-Ctβ-actin计算各个目的基因mRNA的相对表达水平，结果用2-ΔCt值表示。
6、数据分析
采用Prism 8软件统计分析实验数据，两组比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，当P＜0.05时被解释为具有统计学意义。
7、实验结果
(1)体重变化情况
三组小鼠的体重变化情况如图1(a)所示，由图1(a)可知：
随着时间的延长，对照组小鼠的体重呈现出比较平稳的上升趋势，DSS WT组小鼠和DSS KO组小鼠的体重均呈现出下降趋势，其中，DSS KO组小鼠体重下降的更显著(P<0.001)。
(2)DAI评分情况
由于DAI是一种对肠炎严重程度的评估方式，是一种基于体重变化、粪便硬度和粪便出血情况的综合评分，所以我们每日对各组小鼠的体重、粪便硬度及出血情况进行记录与评分，最终得到的DAI评分结果如图1(b)所示，由图1(b)可知：
从第3天开始，DSS WT组小鼠和DSS KO组小鼠的DAI均开始上升，但DSS WT组小鼠的上升速度低于DSS KO组小鼠的上升速度。
(3)结肠长度变化情况
结肠缩短是结肠炎病程的间接反映，各组小鼠处死后剪下来的结肠的长度的测量结果如图1(c)所示，由图1(c)可知：
与对照组小鼠相比，DSS WT组小鼠和DSS KO组小鼠结肠均显著缩短，其中，DSS KO组小鼠结肠缩短得尤其严重。
图1(a)、图1(b)和图1(c)所示的结果初步说明：LSR在维持肠道稳态过程中起重要作用，Lsr基因缺失能够加重炎症性肠病的发展。
(4)Lsr基因的相对表达情况
DSS WT组小鼠和对照组小鼠结肠组织中Lsr基因的相对表达情况的检测结果如图2所示，由图2可知：
DSS WT组小鼠结肠组织中Lsr基因的相对表达量显著降低。
图2所示的结果进一步说明：LSR在维持肠道稳态过程中起重要作用，Lsr基因缺失能够加重炎症性肠病的发展。
(5)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况
各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况的检测结果如图3所示，由图3可知：
与对照组小鼠相比，DSS WT组小鼠和DSS KO组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量水平均显著上调，其中，DSS KO组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量水平上调得更显著。
(6)HE染色情况
各组小鼠的结肠组织HE染色结果如图4所示，由图4可知：
(i)对照组小鼠的结肠组织结构完整，肠道粘膜完整，杯状细胞、隐窝形态及数量均正常，少见炎症细胞；
(ii)DSS WT组小鼠和DSS KO组小鼠的结肠组织结构受损，粘膜受损严重，杯状细胞、隐窝数量减少，隐窝形态受损，存在大量炎性细胞浸润，且DSS KO组小鼠的症状更显著。
三、研究过表达LSR对溃疡性结肠炎(UC)的影响
1、实验动物分组及给药方法
C57BL/6小鼠，雄性，7周龄，24只，随机分成三组：对照组、DSS+AAV-CTL组、DSS+AAV-Lsr组，每组8只。
(1)对照组
让C57BL/6小鼠自由饮用蒸馏水，连续给予6天。
(2)DSS+AAV-Lsr组
7周龄C57BL/6J小鼠通过腹腔注射1×109MOI LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr，饲养一周后，让小鼠自由饮用用蒸馏水配制的浓度为3％(w/v)的葡聚糖硫酸钠溶液，连续给予6天。
LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr是采用如下方法构建而成的：
(一)质粒的构建
(1)Lsr目的基因全长扩增
从NCBI数据库获取鼠源Lsr基因的全长编码序列，基因编号为：NM_001164184.1，设计出目的基因的引物序列，其中：
AAV-m-Lsr-B/K-F：
ttgacctccatagaagacaccgggatccAAGCTTGCCACCATGGCGCC；
AAV-m-Lsr-B/K-R：
tgtagtcgttaattaaggtacCGAATTCGACGACTAAACTTTCCCGACT。
该引物的设计包含交换配对碱基、BamHI酶切位点、KpnI酶切位点及表达增强序列和目的基因的5’端部分序列。
提取小鼠组织总RNA并反转录成cDNA，将此cDNA作为模板，经过PCR扩增(PCR循环参数：95℃，5min，进行1个循环；接着95℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，进行30个循环，再次72℃，10min，进行一个循环；最后4℃，∞，进行一个循环)后，电泳并切胶回收小鼠Lsr基因片段。
(2)重组质粒的构建和提取
首先，用限制性内切酶BamHI和KpnI对载体pHBAAV-CMV-MCS-3flag-T2A-ZsGreen和回收的小鼠Lsr基因片段行双酶切，最终酶切体系共50μl，其中：10×CutSmart Buffer 5μl，载体10μl，BamHI 1μl，KpnI 1μl，剩余体系用双蒸水补齐。
接着，将线性化载体DNA与纯化的PCR产物按1∶2(摩尔比)混合，采用HB infusionTM一步克隆连接体系，在HB infusionTM Master mix的作用下于50℃反应30min，接着在冰水浴中冷却5min，然后进行转化。在100μl的DH5α感受态细胞中加入上述反应产物10μl，混匀后在冰上放置30min，然后于42℃热激90s，再于冰上孵育3min后加入200μl LB培养基，在37℃的摇床中摇晃培养1h。
最后，将上述全部菌液均匀涂布在含氨苄抗生素的平板上，于培养箱中孵育12h。
(3)重组质粒的鉴定
从平板上挑取5个单菌落，分别置于5个含有氨苄抗生素的LB培养基中，于37℃摇床上进行菌液摇晃培养，12h后从每个培养基中各吸取1ml菌液送生工生物工程有限公司进行测序，鉴定重组质粒的准确性，剩余菌液用30％甘油进行保菌并储存于-80℃冰箱，待用。
(二)AAV-293细胞培养
(1)AAV-293细胞的复苏：
①设置水浴温度为37℃；
②从液氮罐中取出冻存的AAV-293细胞，迅速丢入水浴锅中并快速摇动，尽量在1min内使细胞溶液完全溶解；
③将细胞溶液转移到15ml离心管中，并向离心管中加上5ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm离心5min；
④去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后转移入T225培养瓶中，加入DMEM完全培养基(DMEM+青霉素+链霉素+10％胎牛血清)，将培养瓶平稳放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。
(2)将上述细胞用0.25％的胰酶消化5min，然后去除胰酶，并加入新鲜的完全培养基吹打混匀，之后移入15ml离心管中1000rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入5ml完全培养基进行重悬。
(3)取50μl混匀后的细胞于1.5ml EP管中，加入450μl DMEM完全培养基，混匀，取10μl细胞于计数板中计数，将AAV-293细胞传代到100mm培养皿中(用于转染)，铺板当天记作第一天。
(4)将上述培养皿放入到37℃、5％CO2的培养箱中培养，培养两天后观察细胞密度，当培养皿达到80％～90％满即可进行转染。
(三)AAV包装和浓缩
(1)质粒扩增
将构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒(分别为携带目的基因的载体质粒、pAAV-RC、pHelper)使用Qiagen大抽试剂盒进行大量抽提，浓度大于1μg/μl，A260/280在1.7～1.8间即可用以包装病毒。
(2)将上述装有AAV-293细胞的培养皿(细胞量达到80％～90％单层形态的汇合)进行换液，后用LipofiterTM转染试剂(购买自汉恒生物，使用说明参考LipofiterTM说明书)进行细胞转染。
(3)将LipofiterTM转染试剂与无双抗和血清的DMEM培养基按照1：25的体积比进行混合得到混合液1，将上述AAV载体、包装质粒和辅助质粒按照1:2:1的质量比进行混合得到混合液2，将混合液2与无双抗和血清的DMEM培养基按照1：25的体积比进行混合得到混合液3，将混合液1和混合液3按照1：1的体积比进行混匀，并逐滴添加到预先铺板的AAV-293细胞中，37℃、5％CO2培养，6h后更换DMEM完全培养基，将加入转染质粒的培养皿放入培养箱中，继续培养72h。
(4)AAV病毒收毒：转染72h后，用细胞刮刀从150mm培养皿中收获细胞，以150g离心3min，收集细胞沉淀，然后将细胞沉淀重悬于300μl PBS中，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次，之后在4℃以2000g离心5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清(病毒粗提物)。
(5)AAV的纯化：
①全能核酸酶处理：每1ml病毒粗提物中加入0.1μl Benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒粗提物中的细胞基因组及残留的质粒DNA，然后在4℃以600g离心10min，取上清；
②柱纯化：根据Biomiga腺相关病毒纯化试剂盒V1469-01操作说明书进行AAV病毒柱纯化；
③离心：将柱纯化得到的AAV病毒样品液体(4ml)加入到超滤管中，以1400g离心30min，得到AAV病毒(约1ml)，收集最终得到的纯化后的AAV病毒，于﹣80℃保存。
(6)AAV病毒包装滴度测定(采用qRT-PCR法)：
取3μlAAV病毒，加入10μl DNAse、41μl高压水以及6μl Dilution Buffer，混匀后于37℃水浴1h，然后置于金属浴中100℃加热处理10min，自然冷却至室温后加入2μl蛋白酶K，于55℃水浴1h，之后迅速置于金属浴中100℃加热处理10min，再次自然冷却至室温后离心使管壁液体汇聚于管底部，处理完成后10倍稀释后用于qRT-PCR检测滴度。
(3)DSS+AAV-CTL组
7周龄C57BL/6J小鼠通过腹腔注射1×109MOI对照病毒颗粒AAV-CTL，饲养一周后，让小鼠自由饮用用蒸馏水配制的浓度为3％(w/v)的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液(用来诱导小鼠急性结肠炎模型)，连续给予6天。
对照病毒颗粒AAV-CTL的构建过程与LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr的构建过程基本相同，不同之处仅在于：构建对照病毒颗粒AAV-CTL时，使用不经过修饰的质粒pHBAAV-CMV-MCS-3flag-T2A-ZsGreen，不使用重组质粒，以该不经过修饰的质粒为AAV载体，按照与构建LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr相同的方法进行AAV包装、浓缩和纯化等操作。
2、疾病活动指数评分
同上。
3、取材与样本处理
同上。
4、酶联免疫吸附试验
同上。
5、RNA提取及实时定量PCR
同上。
6、数据分析
同上。
7、实验结果
(1)Lsr基因的相对表达情况
各组小鼠结肠组织中Lsr基因的相对表达情况的检测结果如图5(a)所示，由图5(a)可知：
与对照组小鼠相比，DSS+AAV-CTL组小鼠结肠组织中Lsr基因的相对表达量显著降低，DSS+AAV-Lsr组小鼠结肠组织中Lsr基因的相对表达量显著升高(P<0.001)。
(2)体重变化情况
各组小鼠的体重变化情况如图5(b)所示，由图5(b)可知：
随着时间的延长，对照组小鼠的体重呈现出比较平稳的上升趋势，DSS+AAV-CTL组小鼠和DSS+AAV-Lsr组小鼠的体重均呈现出下降趋势，其中，DSS+AAV-Lsr组小鼠体重下降得较为缓慢。
(3)DAI评分情况
各组小鼠的DAI评分结果如图5(c)所示，由图5(c)可知：
从第2天开始，DSS+AAV-CTL组小鼠和DSS+AAV-Lsr组小鼠的DAI均开始上升，其中，DSS+AAV-Lsr组小鼠的DAI上升得较缓慢。
(4)结肠长度变化情况
各组小鼠处死后剪下来的结肠的长度的测量结果如图5(d)所示，由图5(d)可知：
与对照组小鼠相比，DSS+AAV-CTL组小鼠和DSS+AAV-Lsr组小鼠结肠均显著缩短，其中，DSS+AAV-Lsr组小鼠结肠缩短现象较轻。
图5(a)、图5(b)、图5(c)和图5(d)所示的结果初步说明：过表达LSR可以减轻小鼠IBD的发展。
(5)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况
各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量情况的检测结果如图6所示，由图6可知：
与对照组小鼠相比，DSS+AAV-CTL组小鼠和DSS+AAV-Lsr组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量水平均显著上调，其中，DSS+AAV-Lsr组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量水平上调得均较为缓慢。
可见，过表达LSR抑制了DSS诱导的IBD小鼠血清中各炎性因子的表达。
(6)HE染色情况
各组小鼠的结肠组织HE染色结果如图7所示，由图7可知：
(i)对照组小鼠的结肠组织结构完整，肠道粘膜完整，杯状细胞、隐窝形态及数量均正常，少见炎症细胞；
(ii)DSS+AAV-CTL组小鼠的结肠组织结构受损，粘膜受损严重，杯状细胞、隐窝数量减少，隐窝形态受损，存在大量炎性细胞浸润；
(iii)与DSS+AAV-CTL组小鼠相比，DSS+AAV-Lsr组小鼠的这些症状得到缓解。
可见，过表达LSR后，DSS诱导的IBD小鼠的症状得到缓解。
四、研究敲除Lsr基因对新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)的影响
1、实验动物分组及给药方法
(1)对照组
villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)，雄性，14天，5只，不做任何处理。
(2)TNBS WT组
与对照组同窝的villin-Cre-/-/LsrloxP/loxP野生型小鼠(WT)，雄性，14天，5只，同时使用管饲法和灌肠法以50mg/kg的量将2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，用于发展NEC样损伤)作用于该组小鼠。
(3)TNBS KO组
与对照组同窝的villin-Cre+/-/LsrloxP/loxP LSR条件性敲除小鼠(KO)，雄性，14天，5只，同时使用管饲法和灌肠法以50mg/kg的量将2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，用于发展NEC样损伤)作用于该组小鼠。
2、取材与样本处理
TNBS WT组小鼠和TNBS KO组小鼠用药48h后脱颈处死，与此同时，脱颈处死对照组小鼠，各组小鼠脱颈处死后，立即剖开腹腔，暴露腹腔，找到小肠组织并取下完整的小肠，然后按照不同的节段分成三部分(依次为十二指肠、空肠、回肠)并制作成“瑞士卷”，之后用浓度为4％(w/v)的多聚甲醛溶液在4℃下固定24h，后用酒精梯度脱水，对一部分小鼠的小肠组织进行石蜡包埋，连续切片5μm后进行HE染色，光学显微镜下观察小肠组织的病理学变化，肠损伤通过组织病理学分级确认，并由不知情的评审员指定：(1)无损伤；(2)轻度损伤：小肠绒毛尖端破裂或固有层轻度分离；(3)中度损伤：绒毛破裂、固有层明显分离和/或粘膜下层水肿；(4)严重损伤：小肠透壁损伤；对另一部分小鼠的小肠组织进行OCT包埋，并进行冰冻切片，用于免疫荧光染色。
3、RNA提取及实时定量PCR
同上。
4、免疫荧光染色
免疫荧光染色的过程具体如下：
(1)固定：将各组组织切片在-20℃用甲醇进行固定，取出，PBS冲去固定液，组化笔画疏水圈，后用PBS洗两次，每次5min；
(2)血清封闭：5％血清，室温封闭1h；
(3)孵育一抗：将兔抗MPTX2抗体进行100倍稀释，每个组织加50μL稀释后的一抗，4℃孵育12h；
(4)洗涤一抗：使用封闭液室温洗三次，每次10min；
(5)孵育二抗：将罗丹明(TRITC)偶联的山羊抗兔二抗进行300倍稀释，每个组织加50μL稀释后的二抗，室温孵育90min；
(6)洗涤二抗：使用封闭液室温洗三次，每次10min；
(7)孵育DAPI：室温孵育DAPI 5min，洗涤4次，每次5min；
(8)封片：moviol封片，拍照。
5、数据分析
同上。
6、实验结果
(1)Lsr基因以及IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达情况
各组小鼠肠道组织中Lsr基因以及IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达情况的检测结果如图8所示，由图8可知：
(i)与对照组小鼠相比，TNBS WT组小鼠和TNBS KO组小鼠肠道组织中IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达水平均显著上调(P<0.001)，其中，TNBS KO组小鼠IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达水平均上调得更显著(P<0.001)；
(ii)与对照组小鼠相比，TNBS WT组小鼠肠道组织中Lsr基因的相对表达量显著下调(P<0.001)，TNBS KO组小鼠肠道组织中无Lsr基因表达。
可见，Lsr基因的缺失加重了小鼠NEC的发展。
(2)HE染色情况
各组小鼠的小肠组织HE染色结果如图9所示，由图9可知：
与对照组小鼠相比，TNBS WT组小鼠和TNBS KO组小鼠的各段肠道均出现了不同程度的损伤，其中，TNBS KO组小鼠的各段肠道损伤更严重。
(3)免疫荧光染色
潘氏细胞在维持婴儿肠道环境稳定方面发挥着不可或缺的作用，NEC可能与潘氏细胞的丢失有关。为了证明该现象，我们对各组小肠组织中的潘氏细胞进行了免疫荧光染色，染色结果如图10所示，由图10可知：
与对照组小鼠相比，TNBS WT组小鼠和TNBS KO组小鼠各段肠道组织中潘氏细胞的数量均显著减少，其中，TNBS KO组小鼠各段肠道组织中几乎没有潘氏细胞的存在。
五、研究过表达LSR对新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)的影响
1、实验动物分组及给药方法
C57BL/6小鼠，雄性，7天，24只，随机分成三组：对照组、TNBS+AAV-CTL组、TNBS+AAV-Lsr组，每组8只。
(1)对照组
不做任何处理。
(2)DSS+AAV-Lsr组
7日龄C57BL/6J小鼠通过腹腔注射1×108MOI LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr，饲养一周后同时使用管饲法和灌肠法以50mg/kg的量将2,4,6-三硝基苯磺酸作用于该组小鼠。
LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr的构建方法同上，不再赘述。
(3)TNBS+AAV-CTL组
7日龄C57BL/6J小鼠通过腹腔注射1×108MOI对照病毒颗粒AAV-CTL，饲养一周后同时使用管饲法和灌肠法以50mg/kg的量将2,4,6-三硝基苯磺酸作用于该组小鼠。
对照病毒颗粒AAV-CTL的构建方法同上，不再赘述。
2、取材与样本处理
TNBS+AAV-CTL组小鼠和TNBS+AAV-Lsr组小鼠用药48h后脱颈处死，与此同时，脱颈处死对照组小鼠，后取材与样本处理方法同上。
3、RNA提取及实时定量PCR
同上。
4、免疫荧光染色
同上。
5、数据分析
同上。
6、实验结果
(1)LSR以及各炎症因子的表达情况
各组小鼠肠道组织中Lsr基因以及IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达情况的检测结果如图11所示，由图11可知：
(i)与对照组小鼠相比，TNBS+AAV-CTL组小鼠肠道组织中Lsr基因的相对表达水平显著下调(P<0.001)，而TNBS+AAV-Lsr组小鼠肠道组织中Lsr基因的相对表达水平则显著上调(P<0.001)，可见，TNBS+AAV-Lsr组小鼠过表达了LSR；
(ii)与TNBS+AAV-CTL组小鼠相比，TNBS+AAV-Lsr组小鼠肠道组织中IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α基因的相对表达水平均显著下调(P<0.001)，可见，LSR过表达可以减轻小鼠NEC的发展。
(2)HE染色
各组小鼠的小肠组织HE染色结果如图12所示，由图12可知：
与对照组小鼠相比，TNBS+AAV-CTL组小鼠和TNBS+AAV-Lsr组小鼠的各段肠道均出现了不同程度的损伤，其中，TNBS+AAV-Lsr组小鼠的各段肠道的损伤更轻一些。
可见，过表达LSR可以显著缓解各段肠道中出现的炎症损伤。
(3)免疫荧光染色
各组小鼠的小肠组织中的潘氏细胞的免疫荧光染色结果如图13所示，由图13可知：
与对照组小鼠相比，TNBS+AAV-CTL组小鼠和TNBS+AAV-Lsr组小鼠各段肠道组织中潘氏细胞的数量均显著减少，其中，TNBS+AAV-CTL组小鼠各段肠道组织中潘氏细胞的数量减少得尤其显著，从免疫荧光染色图片上几乎看不到。
可见，过表达LSR可以显著恢复小鼠各个肠段组织中的潘氏细胞的数量。
综上，过表达LSR能够显著降低IBD中的炎性因子的水平，显著减弱IBD的炎性细胞浸润水平，同时改善IBD中肠道组织形态的损伤、改善IBD中潘氏细胞的功能和分布以及显著降低IBD的发生率。所以，将LSR制成药剂(例如：LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr)，以合适的方式给药(例如：血管内注射、肌肉注射、组织原位注射和口服给药)，能够显著改善IBD的病理特征，并且没有副作用，治疗效果显著，无并发症发生，可以从根本上治愈IBD以及预防IBD的发生。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引伸出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.LSR在制备预防和治疗IBD的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IBD包括：UC、CD、IC和NEC。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LSR过表达病毒颗粒AAV-Lsr的给药方式包括：血管内注射、肌肉注射、组织原位注射和口服。
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